CN106957822B - 体外扩增基因编辑活化t细胞的培养方法、试剂盒及应用 - Google Patents

体外扩增基因编辑活化t细胞的培养方法、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种体外扩增基因编辑活化T细胞的培养基，其特征在于，所述培养基包含T细胞基础培养基，还包含：白细胞介素7(IL‑7)200‑1000IU/ml、白细胞介素21(IL‑21)300‑1000IU/ml、抗CD40单克隆抗体80‑120ng/ml、丝氨酸0.2‑1.0mmol/ml和S‑2‑羟戊二酸0.3‑1.0mmol/ml。本发明还提供了含上述培养基的试剂盒以及利用上述培养基进行体外扩增基因编辑活化T细胞的方法以及在培养T细胞方面的应用。利用本发明的培养基，在无需加入异体血清及其他活化T细胞因子的条件下可以大量扩增基因编辑活化T细胞。本发明方法能够激活扩增T细胞500‑1000倍，明显高于现有技术。

Description

体外扩增基因编辑活化T细胞的培养方法、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种体外扩增基因编辑活化T细胞的培养方法、试剂盒及其应用。包括但不限于采用ZFN、TALEN、CRISPR-CAS9等基因组编辑技术所构建的功能活化的T细胞培养方法、试剂盒及其应用。
背景技术
随着免疫学研究的不断深入，肿瘤免疫治疗取得巨大进展。肿瘤免疫治疗通过激发或调动患者自身的免疫***，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞，肿瘤免疫治疗也被认为是继手术、放疗、化疗后第四大肿瘤治疗技术。近十年来，以过继细胞免疫疗法(adoptive cell therapy，ACT)和免疫检查点疗法(immune checkpointtherapy)为代表的肿瘤免疫治疗方法取得了突破性进展，显示出良好的应用前景，标志着肿瘤治疗新时代的开启。
在肿瘤免疫治疗方案中，T淋巴细胞处于中心地位。体内肿瘤特异性的细胞免疫功能的低下是肿瘤逃避免疫***的监视无限制生长的重要原因之一。细胞生物治疗技术将自体免疫细胞经过体外诱导、分化、扩增再回输至体内，绕过体内肿瘤免疫屏障机制，通过激发机体的免疫反应来对抗、抑制和杀灭癌细胞。如何在体外获得足够量可供临床应用的T细胞是肿瘤过继免疫疗法中首要面临的问题。
基因组编辑(Genome editing)技术是在基因组水平上对DNA序列进行定点改造修饰的遗传操作技术，该技术被誉为“后基因组时代生命科学研究的助力器”。基因组编辑技术的原理是通过构建一个人工内切酶，在靶位点切断DNA，产生DNA双链断裂(Double-strand break，DSB)，进而诱导细胞内的DNA修复***进行非同源末端连接(Nonhomologousend joining，NHEJ)和同源重组修复(Homologous recombination，HR)。通过这两种修复途径，基因组编辑技术可以实现定点基因敲除、特异突变引入和定点修饰。但在基因组编辑技术未被发现之前，科学家们只能通过同源重组的方式对基因组进行定向修饰。但是这种方式过度依赖自然重组，效率极低，不能满足人类日益发展的科研需求。在此情况下，基因编辑技术应运而生。在近几年中，人工核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)技术的兴起使得基因编辑变得简单可行，现常用的EEN技术主要为锌指核酸酶(zinc fingernuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN)和成簇规律间隔短回文重复技术(Clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat，CRISPR)。
目前，在肿瘤细胞免疫治疗中，T细胞是抗肿瘤细胞免疫的核心角色，然而，肿瘤细胞往往表达一些配体与T细胞结合后，抑制T细胞的活化、增殖及对肿瘤的杀伤，使其功能发生紊乱和枯竭，从而达到免疫逃避的目的。通过基因编辑技术将T细胞中的特定基因或者基因群敲除掉，从而能够更好的起到杀伤肿瘤细胞的目的。
发明内容
本发明的目的在于提高经过基因编辑技术处理过的T细胞的扩增速度、减少扩增时间、提供一种能够经济、简单、高效地扩增基因编辑活化T细胞的培养方法、培养基及其应用，从而提高该基因编辑活化T细胞对肿瘤或其它疾病的治疗作用。
本发明提供的一种体外扩增基因编辑活化T细胞的培养基，包含T细胞基础培养基，还包含：白细胞介素7(IL-7)200-1000IU/ml、白细胞介素21(IL-21)300-1000IU/ml、抗CD40单克隆抗体80-120ng/ml、丝氨酸0.2-1.0mmol/ml和S-2-羟戊二酸0.3-1.0mmol/ml。
作为优选方案，所述培养基包含T细胞基础培养基，还包含：白细胞介素7(IL-7)500IU/ml、白细胞介素21(IL-21)550IU/ml、抗CD40单克隆抗体100ng/ml、丝氨酸0.45mmol/ml和S-2-羟戊二酸0.5mmol/ml。
作为优选方案，所述基础培养基为RPMI-1640培养基。
本发明上述培养基不仅可以用于培养基因编辑活化T细胞，也可以用于培养普通的T细胞。
因此本发明还有一个目的在于提供利用所述培养基在培养T细胞方面的应用。
本发明提供的一种体外扩增基因编辑活化T细胞的方法，包括如下步骤：
(1)对经基因修饰后的T细胞进行预培养，培养时，所用培养基包含基础培养基，还包含抗CD40单克隆抗体80-120ng/ml；
(2)预培养后，向步骤(1)培养基中加入白细胞介素7(IL-7)200-1000IU/ml、白细胞介素21(IL-21)300-1000IU/ml、抗CD40单克隆抗体80-120ng/ml、丝氨酸0.2-1.0mmol/ml和S-2-羟戊二酸0.3-1.0mmol/ml，进行高效扩增培养。
作为优选方案，步骤(1)中，基础培养基为RPMI-1640培养基。
作为优选方案，步骤(1)中，培养时间为48小时。
作为优选方案，步骤(2)中，向步骤(1)培养基中加入白细胞介素7(IL-7)500IU/ml、白细胞介素21(IL-21)550IU/ml、抗CD40单克隆抗体100ng/ml、丝氨酸0.45mmol/ml和S-2-羟戊二酸0.5mmol/ml，进行高效扩增培养。
可选的，所述基因修饰的技术包括ZEN，TALE N或CRISPR/Cas9。
进行所述基因修饰时，是修饰T细胞中的相关激活和/或抑制基因。
CD40是T细胞表面膜蛋白受体之一，CD40与其配体结合可以通过激活mTORC1通路，起到PD-1拮抗剂的作用，从而起到促进T细胞快速增殖的作用，本发明利用抗CD40抗体与CD40结合从而激活mTORC1通路，促进T细胞快速增殖。
本发明培养基中加入的丝氨酸和S-2-羟戊二酸都是T细胞在快速增殖过程中进行能量代谢所必须的物质，额外添加一定量的丝氨酸和S-2-羟戊二酸可以大大提高T细胞的增殖速度。
利用本发明的培养基，在无需加入异体血清及其他活化T细胞因子的条件下可以大量扩增基因编辑活化T细胞，该培养基的诱导方法快速高效、经济简单、效果稳定。另外，根据行业通用的流式细胞仪检测结果表明，所述体外扩增基因编辑活化T细胞的方法能够激活扩增T细胞500-1000倍，明显高于现有技术。
具体实施方式
下述实施例是对于本发明内容的进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。本发明所述基因编辑活化T细胞中所用的基因编辑技术主要包括ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9等，但本发明不限于使用以上三种基因编辑技术。本发明所述一种体外扩增基因编辑活化T细胞的培养方法、试剂盒及其应用主要用于T细胞体外分离、诱导、分化、培养、扩增等；其处理的生物制品包括人外周血、脐带血、胸水、腹水等；可以应用于临床细胞生物治疗，包括肺癌、肾癌、黑色素瘤、白血病、乳腺癌、直肠癌、胃癌、食道癌、***、卵巢癌、骨髓癌、恶性淋巴瘤等恶性肿瘤疾病，也可以应用于基础医学研究、临床应用研究及生物技术研究，尤其可以应用于免疫***研究和肿瘤杀伤作用的研究。具体实施例如下：
实施例1(实验组)
运用CRISPR-Cas9技术敲除人PD-1基因T细胞分离和高效扩增培养
现以人外周血为处理样品，运用CRISPR-Cas9技术敲除人PD-1基因，构建PD-1基因敲除T细胞，并对该基因编辑活化T细胞进行体外高效扩增培养。具体步骤如下：
步骤一：从血液中分离出外周血单个核细胞
直接抽取供者静脉血80～100ml，加入抗凝剂--肝素；
将采集的血样在室温下2000rpm离心10min，小心吸取上层血浆层培养时备用；血样样本还原至原体积，混匀；稀释血缓慢加在Ficoll上，1000rpm离心20min；吸取分离液界面乳白色单个核细胞层，离心洗涤2次，得到PBMC。
步骤二：从PBMC中分离T细胞
取分离的PBMC，加入基础培养基RPMI-1640配成细胞悬液，调整细胞浓度为1～2×106个/ml，37℃，5％CO2孵育2小时后搜集悬浮细胞即为T细胞。
步骤三：运用CRISPR-Cas9技术敲除T细胞上的人PD-1基因
构建携带PD-1基因sgRNA寡聚核苷酸病毒载体
根据sgRNA的设计原则，设计sgRNA在PD-1基因上的靶序列，合成sgRNA寡聚核苷酸双链，混合后于95℃退火5min，之后与线性化的慢病毒载体连接，获得携带PD-1基因sgRNA寡聚核苷酸病毒载体；
构建携带Cas9-核酸酶相关载体
将Cas9核酸酶克隆进相关载体中，获得Cas9-核酸酶载体；
转导T细胞
采用特定方式将对应的sgRNA和Cas9-核酸酶同步转导步骤二收集的T细胞，完成敲除人PD-1基因，即获得敲除PD-1基因T细胞。
步骤四：预培养PD-1基因敲除T细胞
收集PD-1基因敲除T细胞，悬浮培养于基础培养基RPMI-1640中，加入抗CD40抗体80～120ng/ml，37℃，5％CO2孵育培养48h。
步骤五：PD-1基因敲除T细胞的高效扩增培养
向步骤四培养48h后的T细胞培养液中加入白细胞介素7(IL-7)500IU/ml、白细胞介素21(IL-21)550IU/ml、抗CD40单克隆抗体100ng/ml、丝氨酸0.45mmol/ml和S-2-羟戊二酸0.5mmol/ml继续培养。每隔两天用培养液半量换液，所述半量换液为取一半含细胞的培养基，离心收集细胞后去除培养基，加入含有白细胞介素7(IL-7)500IU/ml、白细胞介素21(IL-21)550IU/ml、抗CD40单克隆抗体100ng/ml、丝氨酸0.45mmol/ml和S-2-羟戊二酸0.5mmol/ml的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1×106个/ml。
从步骤五开始，培养48h后，将T细胞转移至T175培养瓶中继续培养。以保证细胞有充足的生长空间。
从步骤五开始，培养14～21天后，收集T细胞，将T细胞离心后，使用生理盐水洗涤三次，即得到活化的T细胞。
对比实施例1：未添加抗CD40单克隆抗体、丝氨酸、S-2-羟戊二酸(对照组1)
除了实施例1中步骤四和步骤五中不添加抗CD40单克隆抗体、丝氨酸、S-2-羟戊二酸以外，其他具体操作步骤如实施例1。
对比实施例2(对照组2)：
除了实施例1中步骤四和步骤五中添加的抗CD40单克隆抗体的浓度为70ng/ml、丝氨酸的浓度为1.1mmol/ml以外，其他具体操作步骤如实施例1。
对比实施例3(对照组3)
除了实施例1中步骤四和步骤五中添加的抗CD40单克隆抗体的浓度为130ng/ml、S-2-羟戊二酸的浓度为0.25mmol/ml以外，其他具体操作步骤如实施例1。对实施例1的实验组和对照组1～3所得的基因编辑T细胞进行扩增倍数检测。
在第1、7、14、21天取200μl细胞，吹打成单个细胞，利用Counterstar自动血细胞计数仪进行计数，细胞扩增倍数＝当天计数的细胞总数/第1天培养前的细胞总数。实验结果如表1。
表1 T细胞在不同时间细胞数量的变化(×108/L)
Figure BDA0001291195770000081

Claims (8)

1.一种体外扩增基因编辑活化T细胞的培养基，其特征在于，所述培养基为RPMI-1640培养基、白细胞介素7(IL-7)200-1000IU/ml、白细胞介素21(IL-21)300-1000IU/ml、抗CD40单克隆抗体80-120ng/ml、丝氨酸0.2-1.0mmol/ml和S-2-羟戊二酸0.3-1.0mmol/ml。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基为RPMI-1640培养基、白细胞介素7(IL-7)500IU/ml、白细胞介素21(IL-21)550IU/ml、抗CD40单克隆抗体100ng/ml、丝氨酸0.45mmol/ml和S-2-羟戊二酸0.5mmol/ml。
3.包含权利要求1～2所述的培养基的试剂盒。
4.一种体外扩增基因编辑活化T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)对经基因修饰后的T细胞进行预培养，培养时，所用培养基为RPMI-1640培养基和抗CD40单克隆抗体80-120ng/ml；
(2)预培养后，向步骤(1)培养基中加入白细胞介素7(IL-7)200-1000IU/ml、白细胞介素21(IL-21)300-1000IU/ml、抗CD40单克隆抗体80-120ng/ml、丝氨酸0.2-1.0mmol/ml和S-2-羟戊二酸0.3-1.0mmol/ml，进行高效扩增培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，培养时间为48小时。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，向步骤(1)培养基中加入白细胞介素7(IL-7)500IU/ml、白细胞介素21(IL-21)550IU/ml、抗CD40单克隆抗体100ng/ml、丝氨酸0.45mmol/ml和S-2-羟戊二酸0.5mmol/ml，进行高效扩增培养。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因修饰的技术包括ZEN、TALEN或CRISPR/Cas9；进行所述基因修饰时，是修饰T细胞中的相关激活和/或抑制基因。
8.权利要求1～2任一项所述培养基在培养T细胞方面的应用。
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