CN105505871B - 一种有效扩增cik且提高其特异性杀瘤能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种扩增CIK细胞且提高其特异性杀瘤的培养方法，所述的方法包括分离获得单个核细胞，将其转至培养瓶中，加入终浓度为400‑600ng/ml CD3mAb、1400‑1600 ng/ml CD28mAb、4000‑4800IU/ml IFN‑γ、4000‑4800IU/ml IL‑2、140‑160ng/ml IL‑15，第4天补加600‑1000IU/ml IL‑2、20‑30ng/ml IL‑15的新鲜培养液，第6天分瓶培养，第8、9天分别将瓶中的细胞转至1.8L细胞培养袋内，补加600‑1000IU/ml IL‑2、20‑30ng/ml IL‑15的新鲜培养液，第11天将细胞分袋培养补加600‑1000IU/ml IL‑2、20‑30ng/ml IL‑15的新鲜培养液，继续诱导扩增，第15‑21天内收获细胞；将收获的细胞用抗EGFR×抗CD3双功能抗体常温下孵育30‑40分钟后，用生理盐水洗涤后收集细胞，即制成特异性杀瘤的CIK细胞制剂。

Description

一种有效扩增CIK且提高其特异性杀瘤能力的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种有效扩增CIK细胞且提高其特异性杀瘤的方法。
背景技术
恶性肿瘤是继心血管疾病之后的危害人类健康的第二号杀手，近年来，肿瘤的发生率和死亡率呈逐年上升的趋势，且肿瘤发病成年轻化趋势。随着分子生物学和免疫学等学科的快速发展，肿瘤的生物免疫治疗已成为继手术、放疗、化疗之后的第四种疗法。其中，肿瘤过继性免疫细胞治疗成为当前研究的热点，其是指将人体外扩增的具有抗肿瘤活性的免疫细胞回输至患者体内，从而直接或间接激发机体免疫应答以杀伤肿瘤细胞的一种细胞疗法。它具有个体性、安全性、靶向性和高效性等优势。
细胞因子诱导的杀伤性细胞(Cytokine-Induced Killer cells，CIK)属于肿瘤过继性免疫细胞治疗中的一种，由美国斯坦福大学的Schmidt Wolf于1991 年首次报道，他们发现人外周血单个核细胞于多种细胞因子(如IFN-γ、抗CD3McAb、IL-1α和IL-2) 作用一段时间后，被定向诱导并大量增殖成为可同时表达CD3 和CD56 两种膜蛋白分子, 且兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC 限制性杀瘤优点的异质细胞群。CIK 细胞具有体外增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、不良反应少、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、可提高患者免疫功能等特点，是临床应用中的一类较为理想的效应细胞，被认为是肿瘤过继免疫治疗的希望。
然而，此类效应细胞在人正常外周血中数量极少，仅占1％～5％。目前，人们虽能通过常规的CIK 制备方法获得一定数量的CIK细胞，但获得的CIK 细胞的细胞毒性和增殖倍数均不够理想。由此可见，如何获得数量足够、细胞毒性强的效应细胞是保证治疗效果的必备条件。此外，CIK细胞的一个特点是杀瘤谱广，意味着它的特异性杀瘤能力较差，就某种特定的肿瘤而言，如表皮生长因子受体（EGFR）阳性肿瘤，如何提高其特异性杀伤EGFR阳性肿瘤细胞的能力是提升CIK细胞治疗效果所不得不考虑的又一个现实问题。EGFR对肿瘤的生长、发展及肿瘤干细胞的维持都有着非常重要的作用，且在多种实体瘤中存在过表达或异常表达，因此在本专利研究中可作为一个重要的靶标。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效扩增CIK且提高其特异性杀瘤能力的方法，解决了目前获得的CIK 细胞的增殖倍数不够理想；CIK诱导过程中需持续补充各种细胞因子，较为繁琐；CIK细胞广谱杀瘤的特点所导致其特异性杀瘤能力弱等缺点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
用Ficoll 淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞，将其转至T175培养瓶中，加入CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ、IL-2、IL-15，第4天补加IL-2和IL-15，第6天分瓶培养，第8、9天分别将瓶中的细胞转至1.8L细胞培养袋内，补加IL-2和IL-15，第11天将细胞分袋培养，补加IL-2和IL-15，继续诱导扩增，第15-21天内收获细胞。将收获的细胞用一种抗EGFR×抗CD3双功能抗体常温下孵育30-40分钟后，用生理盐水洗涤后收集细胞，即可制成特异性杀伤EGFR阳性肿瘤细胞的CIK细胞制剂。
无菌采集健康人或患者外周血60ml，2 小时内运送到实验室制备，在洁净区进行PBMC 的分离和CIK 的体外培养。全血经微生物免疫检测合格后方可进行后续分离培养操作。
1. 单核细胞（PBMC）分离
（a）取500ul 外周血用血细胞分析仪计数、活性检测：将外周血与生理盐水等体积混合，之后加入40ml Ficoll 淋巴细胞分离液离心分离单核细胞；离心参数：1600rpm、20摄氏度、20 分钟；
（b）取白膜，加入生理盐水至总体积80ml，离心洗涤两次；离心参数：2000rpm、20摄氏度、8分钟；
（c）细胞用无血清基础培养基重悬细胞沉淀，利用细胞计数仪进行细胞计数，计算细胞得率。
2. CIK 诱导培养
（1）分离的PBMC 计数后，按8-10×105个/ml 密度接种于T175培养瓶中，补加终浓度 400-600ng/ml CD3mAb、1400-1600 ng/ml CD28mAb、4000-4800IU/ml IFN-γ、4000-4800IU/ml IL-2、140-160ng/ml IL-15，补充无血清培养基至50ml。
（2）第3天，细胞计数，加入600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液50ml。
（3）第4天，细胞计数，加入600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液50ml。
（4）第6天分瓶培养，细胞计数，将原培养瓶中的细胞悬液混匀后按体积比1.4:1分别转移至两新T175培养瓶中，分别标记为a.b和c.d，两瓶分别补加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液至240ml；
（5）第8天装袋培养，细胞计数，将a.b培养瓶中细胞悬液装入1.8L细胞培养袋（袋a）中，补加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。
（6）第9天装袋培养，细胞计数，将c.d培养瓶中细胞悬液装入1.8L细胞培养袋（袋c）中，补加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。
（7）第11天分袋培养，细胞计数后，将原培养袋（袋a和袋c）中的细胞悬液分别按1.4:1比例分至两新培养袋（袋b和袋d）中，四个细胞培养袋分别补加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。
（8）第15、17、19、21天，细胞计数，检测细胞活性，收获细胞（袋a、袋b、袋c、袋d）。所收获的细胞分别用抗EGFR×抗CD3双功能抗体在常温下孵育30-40分钟后，用生理盐水洗涤细胞备用。
3. CIK 细胞对EGFR阳性肿瘤细胞的体外杀伤率
（1）将抗EGFR×抗CD3双功能抗体 处理组与未处理组CIK细胞与靶细胞，按5︰1、10︰1、20︰1、比例加入96孔培养板，同时设效应细胞组、靶细胞组和空白组，每组设3个平行孔，置于37℃，5％ CO2，培养箱培养。
（2）20h后，每孔取出100μl上清，再加入10μl CCK8，继续孵育4-6h。
（3）在酶联免疫检测仪上选择450nm波长测各孔OD值。
（4）平行孔平均OD值计算结果：
杀伤活性(％) ＝1－(实验组OD值一效应组OD值/靶细胞组OD值)×100％。
本发明的优点在于：
现有技术缺陷：最终获得的CIK 细胞的增殖倍数不够理想；CIK诱导过程中需持续补充各种细胞因子，较为繁琐；其杀瘤谱广的特点必然导致其缺乏特异性杀瘤的能力（针对特定肿瘤的杀伤能力较差）。
本发明在传统CIK诱导培养液中新增添IL-15及CD28mAb两种因子（CD3mAb 在CD28mAb 的协同作用下，其刺激活性明显提高。IL-2在IL-15 的协同作用下，其刺激活性也可明显提高。），且在培养工艺上设计分瓶、转袋、分袋等步骤，高效扩增CIK细胞数。
本发明在分离获得单个核细胞后，一次性补加CD3 单克隆抗体(CD3mAb)、CD28 单克隆抗体(CD28mAb)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、白介素-15 (IL-15)，后续培养过程中补液除添加基础培养基外，只需添加IL-2和IL-15即可，省去较为繁琐的操作。
本发明将诱导培养15-21天收获的细胞用一种抗EGFR×抗CD3双功能抗体在常温下孵育30-40分钟后，用生理盐水洗涤后收集细胞，制成特异性杀伤EGFR阳性肿瘤细胞的CIK细胞制剂。
CIK细胞培养体系：无血清基础培养基、CD3单克隆抗体(CD3mAb)、CD28单克隆抗体(CD28mAb)、干扰素-γ (IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、白介素-15 (IL-15)。
CIK细胞培养工艺：首次加入上述因子后，后续补液只需加无血清基础培养基、IL-2和IL-15即可。此外，培养工艺上设计分瓶、转袋、分袋等步骤也与他人不同。
提高特异性杀瘤能力的方法：将诱导培养15-21天收获的细胞，用一种双特异性抗体EGFR×CD3在常温下孵育制成最终的CIK细胞制剂，从而提高其特异性杀瘤能力。
在CIK细胞诱导过程中，加入CD3 单克隆抗体(CD3mAb)、CD28单克隆抗体(CD28mAb)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、白介素-15(IL-15)，且除IL-2和IL-15外，其余因子只需在首次加入即可，减少繁琐操作。工艺流程上设计分瓶、转袋、分袋等步骤，较大规模扩大CIK培养体系，从而达到扩增CIK数量的目的。培养15-21天收获细胞，并用一种抗EGFR×抗CD3双功能抗体在常温下孵育30-40分钟，从而制备具有特异性杀伤EGFR阳性肿瘤细胞的CIK 细胞制剂。将最终获得的CIK细胞进行流式细胞学检测和微生物学检测。本发明提供的CIK培养方法可以在2-3周的时间内将CIK 数量提高至8×109以上、细胞活率98％以上，其中CD3+CD56+双阳性细胞比例达30％以上，对EGFR阳性肿瘤细胞的体外杀伤率可高达到90％以上。
附图说明
图1 CIK细胞诱导培养过程的细胞形态学观察，图分别为CIK细胞诱导培养第2天、第6天、第8天和第9天的细胞形态，由图可知细胞生长状态良好。
图2 不同效靶比的抗EGFR×抗CD3双功能抗体 CIK和Control CIK对Hela细胞的体外杀伤率，由图可知经抗EGFR×抗CD3双功能抗体孵育后的CIK对Hela肿瘤细胞的杀伤作用较未孵育组显著增强，效靶比仅为5︰1时，对Hela肿瘤细胞的杀伤率即可达到60.67％，当效靶比为10:1时，对Hela肿瘤细胞的杀伤率可高达91.26%。
具体实施方式
实施例1
用Ficoll 淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞，将其转至T175培养瓶中，加入CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ、IL-2、IL-15，第4天补加IL-2和IL-15，第6天分瓶培养，第8、9天分别将瓶中的细胞转至1.8L细胞培养袋内，补加IL-2和IL-15，第11天将细胞分袋培养补加IL-2和IL-15，继续诱导扩增，第15-21天内收获细胞。将收获的细胞用一种抗EGFR×抗CD3双功能抗体常温下孵育30分钟后，用PBS洗涤后收集细胞，即可制成特异性杀伤EGFR阳性肿瘤细胞的CIK细胞制剂。
无菌采集健康人或患者外周血60ml，2 小时内运送到实验室制备，在洁净区进行PBMC 的分离和CIK 的体外培养。全血经微生物免疫检测合格后方可进行后续分离培养操作。
1. 单核细胞（PBMC）分离
（a）取500ul 外周血用血细胞分析仪计数、活性检测：将外周血与生理盐水等体积混合，之后加入40ml Ficoll 淋巴细胞分离液离心分离单核细胞；离心参数：1600rpm、20摄氏度、20 分钟；
（b）取白膜，加入生理盐水至总体积80ml，离心洗涤两次；离心参数：2000rpm、20摄氏度、8分钟；
（c）细胞用无血清基础培养基重悬细胞沉淀，利用细胞计数仪进行细胞计数，计算细胞得率。
2. CIK 诱导培养
（1）分离的PBMC 计数后，按8×105个/ml 密度接种于T175培养瓶中，补加终浓度为400ng/ml CD3mAb、1400 ng/ml CD28mAb、4000IU/ml IFN-γ、4000IU/ml IL-2、140ng/mlIL-15，补充无血清培养基至50ml。
（2）第3天，细胞计数，加入600IU/ml IL-2、20ng/ml IL-15的新鲜培养液50ml。
（3）第4天，细胞计数，加入600IU/ml IL-2、20ng/ml IL-15的新鲜培养液50ml。
（4）第6天分瓶培养，细胞计数，将原培养瓶中的细胞悬液混匀后按体积比1.4:1分别转移至两新T175培养瓶中，分别标记为a.b和c.d，两瓶分别补加600IU/ml IL-2、20ng/mlIL-15的新鲜培养液至240ml；
（5）第8天装袋培养，细胞计数，将a.b培养瓶中细胞悬液装入1.8L细胞培养袋（袋a）中，补加600IU/ml IL-2、20ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。
（6）第9天装袋培养，细胞计数，将c.d培养瓶中细胞悬液装入1.8L细胞培养袋（袋c）中，补加600IU/ml IL-2、20ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。
（7）第11天分袋培养，细胞计数后，将原培养袋（袋a和袋c）中的细胞悬液分别按1.4:1比例分至两新培养袋（袋b和袋d）中，四个细胞培养袋分别补加600IU/ml IL-2、20ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。
（8）第15、17、19、21天，细胞计数，检测细胞活性，收获细胞（袋a、袋b、袋c、袋d）。所收获的细胞分别用抗EGFR×抗CD3双功能抗体在常温下孵育30分钟后，用生理盐水洗涤细胞备用。
注：以上细胞均在37℃ 5%CO2培养箱内进行培养。
实施例2
1. 单核细胞（PBMC）分离
（a）取500ul 外周血用血细胞分析仪计数、活性检测：将外周血与生理盐水等体积混合，之后加入40ml Ficoll 淋巴细胞分离液离心分离单核细胞；离心参数：1600rpm、20摄氏度、20 分钟；
（b）取白膜，加入生理盐水至总体积80ml，离心洗涤两次；离心参数：2000rpm、20摄氏度、8分钟；
（c）细胞用无血清基础培养基重悬细胞沉淀，利用细胞计数仪进行细胞计数，计算细胞得率。
2. CIK 诱导培养
（1）分离的PBMC 计数后，按9×105个/ml 密度接种于T175培养瓶中，补加 终浓度为500ng/ml CD3mAb、1500 ng/ml CD28mAb、4400IU/ml IFN-γ、4400IU/ml IL-2、150ng/mlIL-15，补充无血清培养基至50ml。
（2）第3天，细胞计数，加入800IU/ml IL-2、25ng/ml IL-15的新鲜培养液50ml。
（3）第4天，细胞计数，加入800IU/ml IL-2、25ng/ml IL-15的新鲜培养液50ml。
（4）第6天分瓶培养，细胞计数，将原培养瓶中的细胞悬液混匀后按体积比1.4:1分别转移至两新T175培养瓶中，分别标记为a.b和c.d，两瓶分别补加800IU/ml IL-2、25ng/mlIL-15的新鲜培养液至240ml；
（5）第8天装袋培养，细胞计数，将a.b培养瓶中细胞悬液装入1.8L细胞培养袋（袋a）中，补加800IU/ml IL-2、25ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。
（6）第9天装袋培养，细胞计数，将c.d培养瓶中细胞悬液装入1.8L细胞培养袋（袋c）中，补加800IU/ml IL-2、25ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。
（7）第11天分袋培养，细胞计数后，检测细胞活性，将原培养袋（袋a和袋c）中的细胞悬液分别按1.4:1比例分至两新培养袋（袋b和袋d）中，四个细胞培养袋分别补加800IU/ml IL-2、25ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。
（8）第15、17、19、21天，细胞计数，收获细胞（袋a、袋b、袋c、袋d）。所收获的细胞分别用抗EGFR×抗CD3双功能抗体在常温下孵育40分钟后，用生理盐水洗涤细胞备用。
注：以上细胞均在37℃ 5%CO2培养箱内进行培养。
实施例3
1. 单核细胞（PBMC）分离
（a）取500ul 外周血用血细胞分析仪计数、活性检测：将外周血与生理盐水等体积混合，之后加入40ml Ficoll 淋巴细胞分离液离心分离单核细胞；离心参数：1600rpm、20摄氏度、20 分钟；
（b）取白膜，加入生理盐水至总体积80ml，离心洗涤两次；离心参数：2000rpm、20摄氏度、8分钟；
（c）细胞用无血清基础培养基重悬细胞沉淀，利用细胞计数仪进行细胞计数，计算细胞得率。
2. CIK 诱导培养
（1）分离的PBMC 计数后，按10×105个/ml 密度接种于T175培养瓶中，补加 终浓度为600ng/ml CD3mAb、1600 ng/ml CD28mAb、4800IU/ml IFN-γ、4800IU/ml IL-2、160ng/ml IL-15，补充无血清培养基至50ml。
（2）第3天，细胞计数，加入1000IU/ml IL-2、30ng/ml IL-15的新鲜培养液50ml。
（3）第4天，细胞计数，加入1000IU/ml IL-2、30ng/ml IL-15的新鲜培养液50ml。
（4）第6天分瓶培养，细胞计数，将原培养瓶中的细胞悬液混匀后按体积比1.4:1分别转移至两新T175培养瓶中，分别标记为a.b和c.d，两瓶分别补加1000IU/ml IL-2、30ng/ml IL-15的新鲜培养液至240ml；
（5）第8天装袋培养，细胞计数，将a.b培养瓶中细胞悬液装入1.8L细胞培养袋（袋a）中，补加1000IU/ml IL-2、30ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。
（6）第9天装袋培养，细胞计数，将c.d培养瓶中细胞悬液装入1.8L细胞培养袋（袋c）中，补加1000IU/ml IL-2、30ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。
（7）第11天分袋培养，细胞计数后，将原培养袋（袋a和袋c）中的细胞悬液分别按1.4:1比例分至两新培养袋（袋b和袋d）中，四个细胞培养袋分别补加1000IU/ml IL-2、30ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。
（8）第15、17、19、21天，细胞计数，检测细胞活性，收获细胞（袋a、袋b、袋c、袋d）。所收获的细胞分别用抗EGFR×抗CD3双功能抗体在常温下孵育35分钟后，用生理盐水洗涤细胞备用。
注：以上细胞均在37℃ 5%CO2培养箱内进行培养。
实施例4
实施例1-3培养所得CIK 细胞对EGFR阳性肿瘤细胞的体外杀伤率
（1）将抗EGFR×抗CD3双功能抗体 （60ng/106 cells）处理组与未处理组ControlCIK与靶细胞，按5︰1、10︰1、20︰1比例加入96孔培养板，同时设效应细胞组、靶细胞组和空白组，每组设3个平行孔，置于37℃，5％ CO2，培养箱培养。
注：抗EGFR×抗CD3双功能抗体是由EGFR抗体和CD3抗体通过化学偶联法制备所得。
（2）20h后，每孔取出100μl上清，再加入10μl CCK8，继续孵育4-6h。
（3）在酶联免疫检测仪上选择450nm波长测各孔OD值。
（4）平行孔平均OD值计算结果：
杀伤活性(％) ＝1－(实验组OD值一效应组OD值/靶细胞组OD值)×100％。由图2可知，经抗EGFR×抗CD3双功能抗体孵育后的CIK对Hela肿瘤细胞的杀伤作用较未处理组显著增强，效靶比仅为5︰1时，对Hela肿瘤细胞的杀伤率即可达到60.67％；当效靶比为10:1时，对Hela肿瘤细胞的杀伤率可高达91.26%。
注：以上细胞均在37℃ 5%CO2培养箱内进行培养。
表1 实施例1-3培养所得CIK细胞数及细胞活率表，从此表格可以看出实施例1～3所收获的细胞数扩增倍数达190倍以上，细胞的活率均大于98%，尤其以实施例3的结果最佳。说明，采用本发明实施例提供的培养方法进行CIK细胞诱导培养可以有效促进CIK细胞的增殖。
表1 实施例1-3培养所得CIK细胞数及细胞活率表
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种扩增CIK细胞且提高其特异性杀瘤的培养方法，其特征在于：所述的方法包括分离获得单个核细胞，将其转至培养瓶中，加入CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ、IL-2、IL-15，第3、4天分别补加IL-2和IL-15，第6天分瓶培养并补加IL-2和IL-15，第8、9天分别将瓶中的细胞转至1.8L细胞培养袋内，各自补加IL-2和IL-15，第11天将细胞分袋培养补加IL-2和IL-15，继续诱导扩增，第15-21天内收获细胞；将收获的细胞用抗EGFR×抗CD3双特异性抗体常温下孵育30-40分钟后，用生理盐水洗涤后收集细胞，即制成特异性杀瘤的CIK细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的一种扩增CIK细胞且提高其特异性杀瘤的培养方法，其特征在于：所述方法具体包括如下：
（1）单核细胞分离：
（a）取500ul 外周血用血细胞分析仪计数、活性检测：将外周血与生理盐水等体积混合，之后加入40ml Ficoll 淋巴细胞分离液离心分离单核细胞；离心参数：1600rpm、20 摄氏度、20 分钟；
（b）取白膜，加入生理盐水至总体积80ml，离心洗涤两次；离心参数：2000rpm、20摄氏度、8分钟；
（c）细胞用无血清基础培养基重悬细胞沉淀，利用细胞计数仪进行细胞计数；
（2）CIK 诱导培养：
（a）分离的单核细胞计数后，按8-10×105个/ml 密度接种于培养瓶中，补加终浓度为400-600ng/ml CD3mAb、1400-1600 ng/ml CD28mAb、4000-4800IU/ml IFN-γ、4000-4800IU/ml IL-2、140-160ng/ml IL-15，补充无血清培养基至50ml；
（b）第3天，细胞计数，加入600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液50ml；
（c）第4天，细胞计数，加入600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液50ml；
（d）第6天分瓶培养，细胞计数，将原培养瓶中的细胞悬液混匀后按体积比1.4:1分别转移至两新T175培养瓶中，分别标记为a.b和c.d，两瓶分别补加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液至240ml；
（e）第8天装袋培养，细胞计数，将a.b培养瓶中细胞悬液装入1.8L细胞培养袋-袋a中，补加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml；
（f）第9天装袋培养，细胞计数，将c.d培养瓶中细胞悬液装入1.8L细胞培养袋-袋c中，补加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml；
（g）第11天分袋培养，细胞计数后，将原培养袋-袋a和袋c中的细胞悬液分别按1.4:1比例分至两新培养袋-袋b和袋d中，四个细胞培养袋分别补加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液至终体积1000ml；
（h）第15、17、19、21天，细胞计数，收获袋a、袋b、袋c、袋d细胞，所收获的细胞分别用抗EGFR×抗CD3双特异性抗体在常温下孵育30-40分钟后，用生理盐水洗涤后收集细胞，即制成特异性杀瘤的CIK细胞制剂。
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