CN103243072B

CN103243072B - CD8α-白介素21片段-CD137复合物扩增激活淋巴细胞的方法

Info

Publication number: CN103243072B
Application number: CN201310173235.6A
Authority: CN
Inventors: 吴忠福; 徐以兵; 董生聚
Original assignee: Hangzhou Zhongying Bio-Medical Technology Ltd Co
Current assignee: Hangzhou Zhongying bio-medical technology limited company
Priority date: 2013-05-09
Filing date: 2013-05-09
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2033-05-09
Also published as: CN103243072A

Abstract

本发明涉及一种免疫学领域，具体是指使用CD8α-白介素21片段-CD137复合物经作用扩增、激活自然杀伤细胞(NK)成为淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)细胞。本发明的优点是：通过CD8α-白介素21片段-CD137复合物与现有的类似复合物相比，扩增和激活淋巴细胞的能力更强，效率更高。本发明在免疫治疗方面具有广阔的前景。

Description

CD8α-白介素21片段-CD137复合物扩增激活淋巴细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种免疫学领域，具体是指使用CD8α-白介素21片段-CD137复合物转染的K562细胞和低浓度白介素2共同作用扩增激活自然杀伤细胞(NK)成为淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)细胞。

背景技术

1982年Grimm等首先报道外周血淋巴细胞中加入白介素2体外培养4-6天，能诱导出一种非特异的杀伤细胞，这类细胞可以杀伤多种对NK不敏感的肿瘤细胞。这类细胞被称为淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)。1984年11月Rosenberg研究组经美国食品和药品检验局(FDA)批准下，首次应用IL-2与LAK协同治疗25例肾细胞癌、黑素瘤、肺癌、结肠癌等肿瘤患者。其中11例肿瘤缩小超过50％，1例黑素瘤完全消退。1988年该研究组总结了IL-2与LAK细胞协同治疗222例肿瘤患者，其中16例患者肿瘤转移灶完全消退，26例患者肿瘤消退50％以上，该疗法对转移性肾细胞癌、黑素瘤、结肠癌和非何杰金氏淋巴瘤患者的疗效较显著。随后的研究表明LAK细胞对乳腺癌、膀胱癌，肝癌和急性白血病进行治疗也有明显疗效。目前LAK细胞治疗在美国主要用来和化疗、放疗联合使用。

LAK细胞数量与疗效直接相关，治疗中存在的问题是获得大量LAK细胞非常困难。通常采用的高剂量白介素2激活生长的方法能够扩增的倍数有限(100倍)，而且需要从病人身体中采集大量的外周血(500亳升)才能够初步达到治疗的剂量，这对病人是一个很大的生理负担。高剂量的白介素2费用昂贵，对病人又是很大的经济负担。目前的研究表明白介素2激活生长的LAK细胞倍数有限与白介素2扩增后的细胞端粒酶活性降低有关。端粒酶活性降低也可能是高剂量白介素2激活生长的LAK细胞输入病人体内后作用有限的重要原因。本发明解决了这一问题，本发明提供了一种可以在体外扩增和激活NK的方法。该方法所需的白介素2只有通常采用方法的十分之一，扩增的效率高10-100倍，扩增后的LAK细胞端粒酶活性是通常采用方法的五倍。用该方法扩增的LAK细胞比用通常采用的方法扩增的细胞纯度和活性显著增强，数量上可以达到临床治疗的需要，可以用来帮助病人抵抗肿瘤、病毒和细菌。

CN201110075736.1.公开了一种采用CD8α-白介素21-CD137复合物扩增激活淋巴细胞的方法，但是其扩增和激活效果还有待提高。而且这一发明中所采用的CD8α和白介素21片段较长，其在实际应用中容易出现蛋白变性失活、免疫刺激性较高等问题，而且在大规模表达生产时生产效率较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效扩增淋巴细胞的方法。

本发明是通过下述技术方案得以实现的：

本发明提供了一种扩增激活淋巴细胞的方法，所述方法使用CD8α-白介素21片段-CD137复合物和白介素2共同作用扩增激活淋巴细胞，优选地，所述CD8α-白介素21-CD137复合物中的CD8α、白介素21片段和CD137分别包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:1和CD137的完整氨基酸序列。

本发明的扩增激活淋巴细胞的方法中，可以加入两次或更多次所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物，优选地，所述的CD8α-白介素21-CD137复合物的剂量在50pM～1nM。

本发明的扩增激活淋巴细胞的方法中，所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物可以为纯化的或由宿主细胞即时表达。

本发明的扩增激活淋巴细胞的方法中，所述淋巴细胞可以为纯化的或未纯化的，优选地，所述淋巴细胞是外周血淋巴细胞、纯化的NK细胞、纯化的NK细胞和外周血淋巴细胞的组合、纯化的NK细胞或外周血淋巴细胞和别的淋巴细胞的组合、或白介素2和/或白介素21和/或CD137混合物注射进人体血管后作用的血液中所有白细胞，优选地所述纯化是指NK细胞为细胞总数的50％以上。

本发明的扩增激活淋巴细胞的方法中，所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物可以采用蛋白稳定表达***，优选地，所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物的表达载体中含有病毒启动子和选择标记基因。

本发明的扩增激活淋巴细胞的方法中，所述宿主细胞可以为K562细胞；优选地，当所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物由K562细胞即时表达时，所述K562细胞与淋巴细胞的用量比例为K562细胞：淋巴细胞=1～10：1，更优选地，所述K562细胞与淋巴细胞的用量比例为K562细胞：淋巴细胞=1～4：1。

本发明的扩增激活淋巴细胞的方法中，所述白介素2的最低剂量可以为50单位/毫升，优选地，加入两次或更多次所述白介素2。

本发明的扩增激活淋巴细胞的方法可以包括：

（1）在含有所述淋巴细胞的培养液中，加入表达所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物的经过辐照的K562细胞以及白介素2共同培养7天；

（2）将培养后的培养液离心，获取细胞沉淀，并用与步骤（1）中等量的培养液重悬；和

（3）加入所述K562细胞，培养7天；

其中，优选地，所述培养液为：Eagle培养液加入10％人血清或10％小牛血清；或RPMI1640加入10％人血清或10％小牛血清；或F-10(Ham’s)Nutrientmixtures加入10％人血清或10％小牛血清；优选地，所述辐照的剂量为100Gy-1000Gy。

本发明的扩增激活淋巴细胞的方法中，通过所述方法扩增的淋巴细胞可以溶于生理盐水溶液，优选地用于静脉滴注。

作为优选，上述方法中所述的白介素2、白介素21片段和CD137从人体分离的细胞。

作为优选，上述方法中所述的扩增的淋巴细胞是外周血淋巴细胞、纯化的NK细胞、纯化的NK细胞和外周血淋巴细胞的组合、纯化的NK细胞或外周血淋巴细胞和别的淋巴细胞的组合、或白介素2和/或白介素21片段和/或CD137混合物注射进人体血管后作用的血液中所有白细胞；

其中纯化是指NK细胞代表总数的50％以上。

作为优选，上述方法中所述的培养液为：Eagle’s培养液加入10％人血清或10％小牛血清；或RPMI1640加入10％人血清或10％小牛血清；或F-10(Ham’s)Nutrientmixtures加入10％人血清或10％小牛血清。

作为优选，上述方法中所述的跨膜白介素21片段-CD137复合物的剂量在50pM～1nM；其中K562细胞与淋巴细胞的用量比例如下为，K562细胞∶淋巴细胞＝1～10∶1；作为更佳选择，所述的K562细胞中加入跨膜白介素21片段-CD137复合物；K562细胞∶淋巴细胞＝1～4∶1。

作为优选，上述方法中所述的宿主K562细胞经过强酸、强碱或高剂量辐照后即得到用来扩增淋巴细胞的跨膜白介素21片段-CD137复合物，本发明中所述的强酸、强碱为浓硫酸、盐酸、硝酸等一般技术人员认为酸性足够强的酸即可，而高剂量辐照也为本行业内的普通技术人员所熟知的辐照剂量，一般是指辐照100Gy以上1000Gy以下。

作为优选，上述方法中所述的跨膜白介素21片段-CD137复合物扩增的LAK细胞通过溶于生理盐水溶液，再用于静脉滴注。

CD8α-白介素21片段-CD137转染的K562细胞对淋巴细胞和NK扩增和激活有重要的作用。扩增和激活后产生的LAK细胞有重要的医疗作用。本发明利用的方法可以得到的足够数量和质量的LAK细胞，是理想的识别和摧毁肿瘤细胞和病原体感染的细胞，增强病人免疫反应的方法。LAK细胞可以识别和摧毁肿瘤细胞和病原体感染的细胞，其中包括病毒感染，如乙肝病毒、甲肝病毒和艾滋病毒。肿瘤的类型包括但不限于：急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、艾滋病相关的癌症、***癌、星形细胞瘤、非典型畸胎/横纹肌样瘤、中楸神经***瘤、基底细胞癌-皮肤癌(非黑色素瘤)、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、中枢神经***肿瘤、子***、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、大肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤-蕈样肉芽肿、乳腺导管原位癌、胚胎性肿瘤、中枢神经***瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞、尤因肉瘤家族肿瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管肿瘤、眼癌、骨纤维组织细胞瘤、骨肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤-成人软组织肉瘤、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈部癌症、心脏肿瘤、肝癌、组织细胞增多症、朗格汉斯细胞、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)，卡波西氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、白血病、唇及口腔癌、肝癌、小叶原位癌、肿癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、恶性间皮瘤、转移性鳞癌颈部肿瘤、口腔癌、多发性内分泌瘤综合症、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合症、骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤、慢性粒细胞性白血病、髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生性疾病、鼻腔鼻窦肿瘤、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、唇口咽癌、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤骨、卵巢癌胰腺癌、***状瘤、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺肿瘤、***癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体实质肿瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经***(CNS)淋巴瘤、***癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌症、肾盂和输尿管、移行细胞癌、呼吸道癌症、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、涎腺肿瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠肿瘤、软组织肉瘤、鳞癌颈部肿瘤、原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤、输尿管及肾盂移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、***癌、外阴癌、瓦尔登斯特巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。

本发明中的白介素21片段、CD137、CD8α和白介素2是该蛋白质的全部多肽，其中也包括这些蛋白质中具备功能的多肽成分。本发明中的外周血淋巴细胞来自于外周血、脐带血和骨髓。本发明中的外周血淋巴细胞可以是NK细胞；也可以是NK细胞和外周血淋巴细胞的不同组合；也可以是NK细胞或外周血淋巴细胞和别的淋巴细胞的不同组合；也可以是白介素2和/或白介素21片段和/或CD137混合物注射进人体血管后所作用的血液中所有白细胞的总和。

本发明提供了一个可以用来制成药物的方案，按照这个方案制成的药物可以有下面所描述的多种用途。这个方案包括白介素2、白介素21片段和CD137。利用本方案扩增的LAK细胞适用与需要增强病人免疫力的各种情景。例如，扩增NK细胞对***特别有效，如急性髓细胞性白血病、慢性淋巴瘤白血病、***肿瘤、恶性黑色素瘤和肾细胞恶性肿瘤，但不仅仅限于上述肿瘤。例如，扩增LAK细胞对治疗细菌、真菌或寄生虫内感染特别有效。扩增的LAK细胞对治疗病毒感染特别有效，如乙肝病毒、甲肝病毒和艾滋病毒但不仅仅限于上述病毒感染。扩增的LAK细胞可以显著提高抗原的作用效果。

除非另有说明，本发明中所有的技术和科学词汇的含义是本行业内的具有普通技能的人士通常理解的含义。常用术语的定义在所有分子生物学书中可以找到，例如，BenjaminLewin，GenesVIII，OxfordUniversityPress，2004(ISBN0-13-145140-5)；

为了确保长期，高收益的生产重组白介素21片段和CD137，本发明采用了蛋白稳定表达***。首先构建CD8α-白介素21片段-CD137的表达载体，这个载体中同时含有病毒启动子和选择标记基因，如抗生素抗性基因。CD8α是一种在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接白介素21片段和CD137基因后使得白介素21片段和CD137同时表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白(以下统称为跨膜白介素21片段-CD137复合物)。然后用该表达载体转录K562细胞系，用恰当的方法激活启动子，培养K562细胞一段时间后即可以得到在细胞膜上高水平表达的CD8α-白介素21片段-CD137复合物。构建CD8α-白介素21片段-CD137的表达载体，转录细胞系的方法是本行业内的具有普通技能的人士通常理解的方法。其中构建CD8α-白介素21片段-CD137的表达载体的方法参考下面的文献：Wu.et.al.，JMolCellBiol(2010)2(4)：217-222；构建蛋白稳定表达***是本行业内的具有普通技能的人士所通常采用的技术。例如，细胞系转录了稳定表达CD8α-白介素21片段-CD137的表达载体，这个载体中含有病毒启动子和选择标记基因，如抗生素抗性基因。CD8α是一种在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接白介素21片段和CD137基因后使得白介素21片段和CD137同时表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白(以下统称为跨膜白介素21片段-CD137复合物)。外源表达载体进入宿主细胞后，用恰当的方法激活启动子，培养细胞一段时间后即可以得到在细胞膜上高水平表达的多肽。这些方法是本行业内的具有普通技能的人士通常理解的方法。

在细胞膜上高水平表达跨膜白介素21片段-CD137复合物的细胞可以通过高速离心的方法收集。细胞可以通过这些技术包括但不限于下面所列的方法处理：强酸、强碱和辐照。在细胞膜上的跨膜白介素21片段-CD137复合物可以直接与外周血淋巴细胞或NK细胞共同培养，激活扩增LAK细胞，也可以纯化分离后与外周血淋巴细胞共同培养，激活扩增LAK细胞。

在细胞膜上高水平表达的跨膜白介素21片段-CD137复合物可以通过本行业内的具有普通技能的人士所熟悉的技术来纯化和分离。这些技术包括但不限于下面所列的方法：硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石色谱法，色谱法和凝集素。如有必要，蛋白质复性的方案可用来帮助纯化表达的蛋白多肽。如果有必要，高效液相色谱法(HPLC)可作最后的纯化步骤进一步纯化蛋白质。本发明中的宿主细胞内表达的跨膜白介素21片段-CD137复合物会有一部分分泌到细胞培养上清液中。本行业内的具有普通技能的人士都可以根据普通的生物化学技术来验证。分泌到细胞培养上清液中的跨膜白介素21片段-CD137复合物也可以通过上述方法纯化和分离。

本发明中的跨膜白介素21片段-CD137复合物可用来扩增LAK细胞。体外扩增的LAK细胞可移植病人。例如，跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2按照顺序依次扩增激活LAK细胞的方法比通常所用的高剂量白介素2扩增激活LAK细胞更有效120倍以上。跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用扩增后的LAK细胞端粒酶活性是采用高剂量白介素2扩增激活LAK细胞的5.2倍以上。端粒酶活性检测采用端粒重复序列扩增法(TRAP)(详见KimNW，PiatyszekMA，prowseKR，etal.Science，1994；266：2011)。跨膜白介素21片段-CD137复合物扩增激活的LAK细胞比用高剂量白介素2扩增激活的LAK细胞活性高4.7倍以上。跨膜白介素21片段-CD137复合物扩增三个星期后，LAK细胞的纯度可以达到95％，细胞的数量可以达到1.0×10¹⁰以上，满足临床治疗的需求。可见本发明的扩增方法各项指标均优于CN201110075736.1.中公开的方法，

跨膜白介素21片段-CD137复合物扩增的LAK细胞，可以用来进行自体移植，也可以进行异体移植。在受捐助人(成年人或者未成年人)的组织相容性抗原以及血液抗原与捐助人(成年人或者未成年人)的组织相容性抗原以及血液抗原相匹配的前提下，捐助人被激活和扩增的细胞可以通过静脉滴注的方式注入到被捐助人的血管中。在某些应用中，细胞系(例如，NK细胞系、NKT细胞系)也可以通过跨膜白介素21片段-CD137复合物激活和扩增。扩增的细胞系用于临床治疗目的也是本发明的保护范围。

淋巴细胞或淋巴细胞前体细胞可从来源于包含有大量淋巴细胞和前体细胞的任何组织。例如，外周血(包括脐带血)、骨髓、脾脏和***。淋巴细胞或淋巴细胞前体细胞通常取自于外周血或骨髓。在其他应用中(例如，实验研究)，脾脏和/或***也是合适的来源。

例如，淋巴细胞可以通过抽外周血和/或骨髓来获得。淋巴细胞可以进一步经过纯化得到NK细胞和NKT细胞。纯化NK细胞，NKT细胞的步骤和工艺是本行业内的具有普通技能的人士所熟悉的。淋巴细胞可以通过密度梯度离心的方式来分离血液或骨髓中的血红细胞，淋巴细胞和其他细胞。NK细胞和NKT细胞可以利用抗体介导的亲和制备方法进一步纯化，例如抗体结合磁珠法。纯化淋巴细胞并不要求纯化的淋巴细胞绝对纯，而是指纯化的细胞比其在来源组织中所占的比例更高。通常情况下，纯化的淋巴细胞至少代表总数的50％，或者60％，或者更高。纯化的NK细胞和NKT细胞悬浮在一个合适的生理缓冲溶液中，然后悬浮生长于但不局限于下列培养液中，Eagle′s培养液加入10％人血清，RPMI1640加入10％人血清，F-10(Ham’s)Nutrientmixtures加入10％人血清。人血清也可以用10％胎牛血清取代，但人血清对LAK细胞的扩增效果更好。

淋巴细胞和/或纯化的淋巴细胞和/或淋巴细胞前体细胞悬浮生长于细胞培养液中，加入跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2培养，每周加入新的跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2培养。通常情况下为了降低成本和避免感染，本发明采用最小的剂量来扩增淋巴细胞。白介素2的剂量在50单位/亳升到1000单位/毫升之间。在某些情况下，白介素2复合物的剂量至少在500单位/毫升以上。在某些情况下，有必要进行高剂量的处理，激活浓度约为500单位/毫升或1000单位/毫升。另外，跨膜白介素21片段-CD137复合物直接注射入人体，用来在体内扩增LAK细胞时，所用剂量在0.5皮摩到0.5钠摩之间。跨膜白介素21片段-CD137复合物的采用剂量按照跨膜白介素21片段-CD137复合物在K562中的表达剂量来确定。在某些情况下，按照K562∶淋巴细胞＝1∶1，2∶1，3∶1，4∶1或以上加入跨膜白介素21片段-CD137复合物。在某些情况下，有必要进行高剂量的处理，按照K562∶淋巴细胞＝10∶1或以上加入跨膜白介素21片段-CD137复合物。在体外扩增的LAK细胞可以移植给淋巴细胞的捐助人本身或者受捐助人，以加强天生或抗原特异性免疫反应。通常情况下，扩增的LAK细胞通过溶于生理盐水溶液的方法静脉滴注。

有益效果：本发明通过跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2培养扩增的LAK，其扩增效率更高，且所获得的LAK活性更高。

附图说明

图1跨膜白介素21片段-CD137复合物示意图，显示CD8α-白介素21片段-CD137复合物的结构和依次构建的顺序；

图2A.LAK细胞体外扩增线性图显示淋巴细胞在跨膜白介素21片段-CD137复合物、跨膜白介素21-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下线性增长

B.外周血淋巴细胞细胞体外扩增线性图显示淋巴细胞在跨膜白介素21片段-CD137复合物、跨膜白介素21-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下线性增长。高剂量白介素2处理的细胞作为阴性对照。

具体实施方式

下面对本发明的实施作具体说明：

实施例1

跨膜白介素21片段-CD137复合物体外扩增LAK细胞。

健康捐献人的NK细胞培养在RPMI1640中，辅以10％的人血清。在培养液中分别加入表达跨膜白介素21-CD137复合物的K562细胞（对照）和表达跨膜白介素21片段-CD137复合物的K562细胞(辐照，100Gy)和低剂量白介素2后培养7天。7天后离心，用等量的培养液重悬，加入经过辐照的K562细胞，再培养7天(图1)。高剂量白介素2(200单位/毫升)也作为对照组。如图2A所示，LAK细胞在跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2的共同作用下，数量显著增加。细胞数量的增加可以通过***胸苷的方法来测定。胸苷***之后细胞继续培养12小时，然后再开始测量细胞数量的变化。在K562∶淋巴细胞＝1∶1浓度的跨膜白介素21片段-CD137复合物作用下LAK细胞数量在7天时进入对数生长期，14天的时约增长了1000倍。在加入跨膜白介素21片段-CD137复合物的条件下，LAK细胞最低在50单位/毫升的白介素2作用下即可开始增长。而对照组细胞在高剂量白介素2单独作用下LAK细胞的生长显著低于跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下的细胞生长速度。

实施例2

跨膜白介素21片段-CD137复合物扩增未经纯化的外周血淋巴细胞

跨膜白介素21片段-CD137复合物不仅可以扩增纯化的NK细胞，还可以扩增未经过纯化的淋巴细胞。健康捐献人的PBM培养在RPMI1640中，辅以10％的人血清。在培养液中分别加入表达跨膜白介素21-CD137复合物的K562细胞（对照）和表达跨膜白介素21片段-CD137复合物的K562细胞(辐照，100Gy)和低剂量白介素2后共同培养7天。7天后离心，用等量的培养液重悬，加入经过100Gy辐照的K562细胞，再培养7天(图1)。高剂量白介素2(200单位/毫升)也作为对照组。如图2B所示，LAK细胞在跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2的共同作用下，数量显著增加。LAK细胞数量在7天时进入对数生长期，14天的时约增长了1200倍。在加入跨膜白介素21片段-CD137复合物的条件下，LAK细胞最低在50单位/毫升的白介素2作用下即可开始增长。而对照组细胞在高剂量白介素2单独作用下LAK细胞的生长显著低于跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下的细胞生长速度。

在跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下，第12天时93％的淋巴细胞变成LAK细胞。对照组在高剂量白介素2(200单位/毫升)作用下，外周血淋巴细胞仅有14％细胞变成LAK细胞(CD56+，CD16+，CD56+/CD16+)。

实施例3

LAK细胞端粒酶的活性和STAT3磷酸化检测

用液氮反复冻融的方法破碎扩增后的细胞，10000g离心，取上清，用TRAP方法检测扩增后LAK细胞端粒酶的活性。50微升TRAP体系中包含20毫摩/升Tris-HCl(pH8.3)，1.5毫摩/升MgCl，63毫摩/升，KCl，0.005％Tween-20，1毫摩/升EDTA，50毫摩/升dNTP，0.1微克tS，1微克T4，0.1毫克/毫升牛血清白蛋白，1～2微升CHAPS，细胞提取液(含6微克)蛋白，0.2～0.4微升[α-³²P]dGTP。反应条件：23℃10分钟，94℃3秒钟后，加入Taq酶，94℃30秒钟，50℃30秒钟，72℃1.5分钟，扩增27个循环，取25微升产物进行15％PAGE凝胶电泳。PAGE凝胶电泳后在X-光片上放射自显影8小时至两天以上。与扩增前相比，对照组高剂量白介素2显著激活端粒酶的活性。而跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下扩增的LAK细胞端粒酶的活性显著高于跨膜白介素21-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用（高出8.5%）以及对照组高剂量白介素2单独作用下LAK细胞端粒酶的活性（高出5倍）。

实施例4

LAK细胞对肿瘤的抑制作用

跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下扩增的LAK细胞对肿瘤细胞的裂解作用。

以前的研究表明给患肿瘤的小鼠注射白介素2能够增强小鼠的抗肿瘤能力，延缓小鼠的寿命。本实施例采用跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下扩增的LAK细胞与肿瘤细胞共同培养的方法，来研究用扩增的LAK细胞进行抗肿瘤的可行性。本实施例采用跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下扩增的LAK细胞注射小鼠体内治疗小鼠体内肿瘤的方法，来研究扩增的LAK细胞抗肿瘤的效果。

将健康捐献者的淋巴细胞中分离出来后，加入跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下扩增的LAK细胞生长14天。K562、PC3、A549和HepG2被用来作为裂解的靶细胞。K562是B细胞肿瘤细胞系，该细胞系是血液肿瘤细胞系。PC3是***肿瘤细胞系，A549是肺肿瘤细胞系，HepG2是肝肿瘤细胞系。PC3，A549和HepG2是固体肿瘤细胞系。扩增的LAK细胞和靶细胞按照适当的比例共同培养6小时后检测存活的靶细胞。高剂量白介素2扩增的LAK细胞作为对照组。跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下扩增的LAK细胞比对照组高剂量白介素2扩增的LAK细胞对靶细胞的杀伤作用显著增强。(表1)

体外用Lentivirus***构建Fluc报告基因稳定表达的PC3细胞系。FlucLentivirus***购自SystemBiosciences(美国，加州)，具体构建方法详见产品介绍。PC3-Fluc细胞皮下注射进严重免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)32只，三天后荧光检测器检测肿瘤的生长情况，随机分组。扩增后的LAK细胞按照1×10⁷细胞/每只小鼠自尾静脉注射，一周两次。连续治疗四周后停止治疗，观察治疗效果。高剂量白介素2扩增的LAK对肿瘤的生长有一定的抑制作用（平均肿瘤大小为6mm。跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下扩增的LAK细胞比高剂量白介素2扩增的LAK细胞对PC3肿瘤细胞的杀伤作用强（平均肿瘤大小为5.3mm）。白介素2扩增的LAK细胞对延长小鼠的存活率有一定的作用。而与白介素2扩增的LAK细胞相比，跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下扩增的LAK显著提高了对肿瘤的治愈率（提高6%），显著延长了小鼠的存活率（提高12%）。这提示跨膜白介素21片段-CD137复合物和低剂量白介素2共同作用下扩增的LAK细胞可以用于临床的肿瘤治疗。

Claims

1.一种扩增激活淋巴细胞的方法，其特征在于，使用CD8α-白介素21片段-CD137复合物和白介素2共同作用扩增激活淋巴细胞，所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物中的CD8α、白介素21片段和CD137分别为CD8α的完整片段、SEQIDNO:1和CD137的完整氨基酸序列，所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物由K562细胞作为宿主细胞即时表达，所述淋巴细胞是NK细胞和/或未经纯化的外周血淋巴细胞；所述方法包括：

(1)在含有所述淋巴细胞的培养液中，加入表达所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物的经过辐照的K562细胞以及白介素2共同培养7天；

(2)将培养后的培养液离心，获取细胞沉淀，并用与步骤(1)中等量的培养液重悬；和

(3)加入所述K562细胞，培养7天。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中加入两次或更多次所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的CD8α-白介素21-CD137复合物的剂量在50pM～1nM。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化是指NK细胞为细胞总数的50％以上。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物采用蛋白稳定表达***。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物的表达载体中含有病毒启动子和选择标记基因。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，即时表达所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物的所述K562细胞与淋巴细胞的用量比例为K562细胞：淋巴细胞＝1～10：1。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，即时表达所述CD8α-白介素21片段-CD137复合物的所述K562细胞与淋巴细胞的用量比例为K562细胞：淋巴细胞＝1～4：1。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述白介素2的最低剂量为50单位/毫升。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，加入两次或更多次所述白介素2。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，所述培养液为：Eagle培养液加入10％人血清或10％小牛血清；或RPMI1640加入10％人血清或10％小牛血清；或F-10(Ham’s)Nutrientmixtures加入10％人血清或10％小牛血清。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，所述辐照的剂量为100Gy-1000Gy。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，通过所述方法扩增的淋巴细胞溶于生理盐水溶液，用于静脉滴注。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法在用于治疗白血病、***癌、肺癌或肝癌的药物的制备中的用途。