CN102579601A - 一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，它是由以下重量配比的原料药制备而成的制剂：黑骨藤2.5-10份，秦艽1-4份，元胡1-4份。本发明还公开了上述药物组合物的制备方法、质量检测方法及用途。本发明药物组合物通过将黑骨藤与秦艽、元胡合理配伍后，对完全弗氏佐剂诱导的关节炎有显著治疗作用，其抗炎、镇痛效果良好，其药效显著优于单味药材和其他配伍组合，发挥了协同增效作用，且毒副作用较低，表明本发明药物组合能够安全有效地治疗类风湿性关节炎，为临床用药提供了一种新的选择。

Description

一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物及其制备方法和用途。属于药物领域。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症疾病，目前公认类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病，发病2～3年后致残率极高，在我国至少有400万患者。可能与内分泌、代谢、营养、地理、职业、心理和社会环境的差异、细菌和病毒感染及遗传因素等方面有关系。

类风湿关节炎属于中医痹证范畴，历代医家称之为历节、鹤膝风、顽痹、筋痹、骨痹、肾痹等。其内因是素体虚弱、气血不足、腠理空虚、肝肾亏虚，外因是风寒湿热之邪人侵，内外之因相合而致本病。本病的病机为本虚标实，风寒湿热之邪乘虚而人，走窜经络、肌肉、筋脉、关节，导致气滞血瘀，痰浊阻滞关节络脉，络脉不通则导致关节疼痛。久病则伤及脾、肝、肾三脏，致关节、肌肤失养，而逐渐引起肌肉萎缩、筋脉拘挛、骨质疏松，继则关节变形，最终关节结构严重破坏，而导致关节疼痛、屈伸不利等功能障碍。中医药治疗类风湿关节炎具有悠久的历史，近年来，一些疗效好、副作用少的药物与方法不断出现，显示出了中医药治疗本病的特色和优势，因此，利用中药治疗类风湿关节炎已成为当前治疗RA的研究方向。

黑骨藤，为萝摩科杠柳属植物黑骨藤Periploca forrestil Schltr.的根或全株，性热，味苦，具有祛风除湿、舒筋活血、止痛的功效，主治风湿麻木疼痛，跌打损伤、骨折、骨痛等。黑骨藤中含有杠柳苷、胡萝卜苷、熊果酸、北五加皮苷以及大量的挥发油类化合物。现代药理研究表明，黑骨藤具有强心、镇痛及抗炎的作用。专利号：02127953.5，专利名称：一种治疗痹证的药物，该发明公开了一种治疗痹症的药物，它是以青风藤60份、黑骨藤40份、追风伞34份为原料，按常规制剂工艺制备成的中成药，有祛风除湿，通络止痛的功能，对于风寒湿痹和因其引起的肩臂腰腿疼痛有独特的治疗效果。

秦艽，为龙胆科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.、麻花秦艽Gentianastraminea Maxim.、粗茎秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.或小秦艽Gentiana dahurica Fisch.的干燥根，性平，味辛、苦，入胃、肝、胆经，具有祛风湿，清湿热，止痹痛，主治风湿痹痛，筋脉拘挛，骨节酸痛，日晡潮热，小儿疳积发热。秦艽中含有龙胆苦苷、齐墩果酸、β-谷甾醇、獐牙菜苷、红金白花酸等化学成分。现代药理研究表明，秦艽具有抗炎、镇痛、抗风湿、保肝、利胆、抗菌等作用。勒皓文，等，甘肃秦艽提取物抗类风湿性关节炎作用及其机制探究，甘肃科技纵横，2006年35卷2期，实验表明，秦艽提取物对大鼠佐剂性关节炎及耳部红斑、尾部结节具有明显的预防和治疗作用。

元胡，又称延胡索，为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥块茎，性温，味辛、苦，入肝、脾经，具有活血，利气，止痛的功效，主治胸胁、脘腹疼痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌扑肿痛。元胡中含有延胡索甲素、延胡索乙素、四氢黄连碱、去氢紫堇碱、原阿片碱等化学成分。现代药理研究表明，延胡索具有镇痛、镇静、催眠、动脉扩张、松弛肌肉等作用。“元胡止痛片”由延胡索、白芷配伍制成，具有理气、活血、止痛的功效，主治气滞血瘀的胃痛、胁痛、头痛及痛经。(《中国药典》2005版一部362-363页)

目前，还未见将黑骨藤、秦艽、元胡组方治疗类风湿性关节炎的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够有效治疗类风湿性关节炎的药物。

本发明提供了一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，它是由以下重量配比的原料药制备而成的制剂：

黑骨藤2.5-10份，秦艽1-4份，元胡1-4份。

进一步地，它是由以下重量配比的原料药制备而成的制剂：

黑骨藤2.5份，秦艽1份，元胡1份；或黑骨藤2.5份，秦艽2份，元胡2份；或黑骨藤2.5份，秦艽4份，元胡4份；或黑骨藤5份，秦艽1份，元胡2份；或黑骨藤5份，秦艽2份，元胡4份；或黑骨藤5份，秦艽4份，元胡1份；或黑骨藤10份，秦艽1份，元胡4份；或黑骨藤10份，秦艽2份，元胡1份；或黑骨藤10份，秦艽4份，元胡2份；或黑骨藤2.5份，秦艽2.5份，元胡2.5份。

更进一步地，它是由以下重量配比的原料药制备而成的制剂：

黑骨藤2.5份，秦艽1份，元胡1份；或黑骨藤2.5份，秦艽2份，元胡2份；或黑骨藤5份，秦艽2份，元胡4份；或黑骨藤10份，秦艽1份，元胡4份；或黑骨藤10份，秦艽2份，元胡1份。

其中，它是由所述处方量的原料药的水或有机溶剂提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。所述制剂为口服制剂。

进一步地，所述提取物中，含有总黄酮2-4％w/w、总甾体皂苷3-6％w/w、总生物碱0.1-0.3％w/w、龙胆苦苷1-3％w/w、延胡索乙素0.04-0.06％w/w、杠柳苷0.1-0.2％w/w。

进一步优选地，该提取物的HPLC指纹图谱如图2所示。

本发明还提供了上述的药物组合物的制备方法，它是采用以下步骤实施的：

(1)按重量配比称取各药材；

(2)将药材粉碎，加入水或有机溶剂提取，提取所得的活性成分备用；

(3)取步骤(2)中的活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

其中，所述的有机溶剂为乙酸乙酯或乙醇。

进一步地，所述乙醇的浓度为30-80％v/v。

进一步优选地，所述乙醇的浓度为50％v/v。

其中，它是采用以下步骤实施的：

(1)按重量配比称取各药材；

(2)取步骤(1)的药材，粉碎，加入乙醇，固液比为1∶5-20W/V，超声功率60-1000W，超声5-10s间隙3-5s，超声提取1-3次，每次10-40min，提取温度40-80℃，合并提取液，过滤，将滤液回收溶剂、浓缩、干燥后，所得提取物备用；

(3)取步骤(1)所得的提取物，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

本发明还提供了上述的药物组合物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。

本发明还提供了上药物组合物质量检测方法，它是采用HPLC指纹图谱进行检测，具体检测步骤如下：

a、供试品的制备方法：将药物组合物用水或有机溶剂提取后，定容，制备成供试品溶液；

b、取龙胆苦苷、延胡索乙素和杠柳苷，精密称定，制备成参照物溶液；

c、分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，测定，即得；

色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相：0-10min  甲醇∶2‰醋酸水溶液＝35∶65；

11-42min甲醇∶2‰醋酸水溶液＝65∶35；

检测波长：龙胆苦苷270nm；延胡索乙素230nm；杠柳苷230nm。

本发明药物组合物通过将黑骨藤与秦艽、元胡合理配伍后，对完全弗氏佐剂诱导的关节炎有显著治疗作用，其抗炎、镇痛效果良好，其药效显著优于单味药材和其他配伍组合，发挥了协同增效作用，且毒副作用较低，表明本发明药物组合能够安全有效地治疗类风湿性关节炎，为临床用药提供了一种新的选择。

附图说明

图1对照品HPLC图谱

图2供试品HPLC图谱

图3致炎右足趾容积变化曲线

具体实施方式

实施例1本发明药物组合物胶囊剂的制备

取黑骨藤25g、秦艽10g、元胡10g，分别粉碎过60目筛，用50％乙醇，按料液比1∶8，60℃水浴回流提取2次，每次2h。提取液用离心机高速离心(离心条件为3600r/min，10～15℃，10min)，上清液转至圆底烧瓶，用旋转蒸发器减压干燥(干燥条件为-0.085MPa，50℃)回收溶剂，至稠流浸膏状，用减压干燥箱(干燥条件为-0.05MPa，60℃，24h)干燥，加入适量微晶纤维素，粉碎，混匀，制备胶囊剂。

实施例2本发明药物组合物颗粒剂的制备

取黑骨藤100g、秦艽10g、元胡10g，分别粉碎过40目筛，加入20倍重量的50％乙醇，功率800W，超声间隙时间8s/2s，温度50℃，提取2次，每次30min。合并提取液，过滤，滤液减压回收溶剂，至稠流浸膏状，加入适量的糊精，制粒，得本发明颗粒剂。

实施例3本发明药物组合物口服液的制备

取黑骨藤25g、秦艽40g、元胡40g，分别粉碎过80目筛，加入10倍50％乙醇浸渍48小时后，渗漉，收集渗漉液，再用适量50％乙醇继续渗漉至漉液无色或微黄色为止，合并漉液，滤过，滤液减压回收乙醇后，加入防腐剂和适量甜菊素，搅匀，即得本发明口服液。

实施例4本发明药物组合物的质量检测方法

1、标准曲线的绘制

1.1对照品溶液的制备

精密称取延胡索乙素对照品，用甲醇配制成0.998mg/ml的对照品储备液。

精密称取龙胆苦苷，用甲醇配制成浓度为554.00mg/L的对照品溶液。

精密称取延胡索乙素，用甲醇配制成浓度为448.00mg/L的对照品溶液。

精密称取杠柳苷，用甲醇配制成浓度为470.00mg/L的对照品溶液。

精密移取龙胆苦苷对照品溶液5ml，延胡索乙素对照品溶液1ml，杠柳苷对照品溶液1ml至10ml容量瓶中，用甲醇定容，龙胆苦苷、延胡索乙素、杠柳苷浓度分别为277.00mg/L，48.40mg/L，47.00mg/L。

1.2标准曲线的绘制

杠柳苷、龙胆苦苷、延胡索乙素标准曲线绘制

色谱条件：

色谱柱：Alltech Apollo C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：0-10min  甲醇∶水(2‰醋酸水溶液pH＝5.56)＝35∶65；

11-42min甲醇∶水(2‰醋酸水溶液pH＝5.56)＝65∶35；

流速：1.0ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：龙胆苦苷270nm；延胡索乙素230nm；杠柳苷230nm；

进样量：10μl

分别从“1.1”的对照品混合液中精密移取0.1ml、0.2ml、0.4ml、1.0ml、2.0ml、4.0ml于10ml容量瓶中，用甲醇定容。在以上色谱条件下分别进样三针，进样量为10μl。以峰面积(A)为纵坐标，进样浓度(mg/L)为横坐标，绘制标准曲线，对照品色谱图见图1。

采用逐步稀释法测得杠柳苷、龙胆苦苷、延胡索乙素检测限。标准曲线回归方程、相关系数、线性范围、检测限见表1。

表1 线性范围及检测限(n＝7)

1.3样品测定

杠柳苷、龙胆苦苷、延胡索乙素样品测定：取样品液至进样瓶中，在1.2色谱条件下进样，进样量为10μl，供试品色谱图见图2。

1.4精密度和检测限的测定

分别选取“1.1”的对照品溶液中低、中、高三种浓度的溶液，在“1.2”色谱条件下分别测定日内和日间精密度。精密度用相对标准差(RSD)表示，其计算方法如下：RSD＝[标准偏差/平均值]×100％。

精密量取“1.2”标准曲线中浓度最小的混合对照品溶液5ml至10ml容量瓶中，甲醇定容；再从10ml溶液中精密量取5ml至10ml容量瓶中，甲醇定容；以此类推，包括原始浓度共得6个样品，每个样品进三针，进样量为10μl，直到龙胆苦苷、延胡索乙素、杠柳苷不能检出，得到龙胆苦苷、延胡索乙素、杠柳苷检测限。

1.5日内日间精密度

在“1.2”色谱条件下，分别以混合标准溶液低、中、高三种浓度测定日内日间精密度，结果见表2、3。

表2 日间精密度的测定结果

表3 日内精密度的测定结果

1.6加标回收率

分别准确称取粒度过10目筛未过24目筛的黑骨藤5g，延胡索2g，秦艽2g，共六个样，三个样加入对照品混合溶液1ml，龙胆苦苷950.00mg/L，延胡索乙素16.30mg/L，杠柳苷71.20mg/L。在50℃，超声功率800W，固液比1∶20，超声间隙时间8s/2s下超声提取1次，每次10min。提取后，抽滤，浓缩至一定量后定容于100ml容量瓶中，得样品溶液，在“1.2”色谱条件下进样，进样体积为10μl。根据测定结果计算得出加样回收率。

测得龙胆苦苷回收率在98.92％～103.12％之间，RSD为2.81％；延胡索乙素回收率在97.63％～103.66％之间，RSD为3.01％；杠柳苷回收率在98.12％～102.89％之间，RSD为4.23％，表明该方法的测定结果具有较高的准确度。回收率(％)＝(测得量-样品中总黄酮的量)/加入对照品的量×100％。

本发明中涉及的总黄酮、总生物碱、总甾体皂苷的测定方法可按照本领域常用的测定方法，如紫外-可见分光光度法等。

实施例5本发明药物组合物提取方法的选择

1、实验方法及结果

1.1单因素实验

以总黄酮、总甾体皂苷、总生物碱、龙胆苦苷、延胡索乙素、杠柳苷含量为考察指标，准确称取黑骨藤5g，延胡索2g，秦艽2g(n＝3)在不同条件下用50％乙醇提取后，抽滤，浓缩至一定量后定容于100ml容量瓶中，然后测定样品中总黄酮、总甾体皂苷、总生物碱、龙胆苦苷、延胡索乙素、杠柳苷含量。

1.1.1药材粒度

将药材粉碎，准确分别称取未过10目、过10目未过24目、过24目未过50目的样品，在50℃，固液比1∶20，超声功率800W，超声间隙时间8s/2s下超声提取1次，每次10min。

1.1.2提取次数

将药材粉碎，准确称取过10目未过24目的样品，在50℃，固液比1∶20，超声功率800W，超声间隙时间5s/2s下超声提取4次，每次10min。

1.1.3提取温度

将药材粉碎，准确称取过10目未过24目的样品，分别在30℃、50℃、60℃、80℃下以固液比1∶20，超声功率800W，超声间隙时间8s/2s超声提取1次，每次10min。

1.1.4固液比

将药材粉碎，准确称取过10目未过24目的样品，分别按固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶30加入50％乙醇在50℃，固液比1∶20，超声功率800W，超声间隙时间8s/2s下超声提取1次，每次10min。

1.1.5提取时间

将药材粉碎，准确称取过10目未过24目的样品，在50℃，固液比1∶20，超声功率800W，超声间隙时间8s/2s下超声提取1次，每次提取时间分别为5min、10min、20min、30min。

1.1.6超声功率

将药材粉碎，准确称取过10目未过24目的样品，在50℃，固液比1∶20，超声间隙时间8s/2s下超声提取1次，每次10min，超声功率分别为400W、600W、800W、1000W。

1.1.7浸泡时间

将药材粉碎，准确称取过10目未过24目的样品，分别浸泡0h、2h、6h、12h、24h后，在50℃，固液比1∶20，超声功率800W，超声间隙时间8s/2s下超声提取1次，每次10min。

1.1.8超声间隙时间

将药材粉碎，准确称取过10目未过24目的样品，在50℃，固液比1∶20，超声功率800W下超声提取1次，每次10min，超声间隙时间分别为5s/2s(超声5s，间隔2s)、5s/3s、8s/2s、8s/3s、10s/2s、10s/3s。

1.2正交实验

精密称取黑骨藤15g，延胡索6g，秦艽6g进行正交试验。根据单因素实验结果，选取温度、时间、提取次数、料液比四个影响总黄酮、总甾体皂苷、总生物碱、龙胆苦苷、延胡索乙素、杠柳苷含量的主要因素，每个因素实验3个水平，进行L8(27)正交试验确定最佳工艺条件。提取后，抽滤，浓缩至一定量后定容于100ml容量瓶中，得样品溶液。因素水平见表4。

表4 因素水平表

最佳工艺条件验证实验

利用正交实验设计所优化的最佳工艺条件进行验证实验(n＝3)，测定最佳工艺条件下的总黄酮、总甾体皂苷、总生物碱、龙胆苦苷、延胡索乙素、杠柳苷含量。

2.3实验结果与讨论

2.3.1总生物碱标准曲线

标准曲线的回归方程为：Y＝0.05627A-0.02608，r＝0.99607。在0.824mg\L～19.776mg\L范围内，浓度Y与吸光值A之间呈良好的线性关系。

2.3.2杠柳苷、龙胆苦苷、延胡索乙素含量测定

2.3.2.1杠柳苷、龙胆苦苷、延胡索乙素标准曲线和检测限

在“2.2.3.2”色谱条件下，采用逐步稀释法测得杠柳苷、龙胆苦苷、延胡索乙素检测限。结果见表5。

表5 线性范围及检出限(n＝7)

2.3.2.2对照品色谱图，见图1。

2.3.2.3日内日间精密度

在“2.2.3.2”色谱条件下，分别以混合标准溶液低、中、高三种浓度测定日内日间精密度，结果见表6，7。

表6 日内精密度的测定结果

表7 日间精密度的测定结果

2.3.2.4加标回收率

测得龙胆苦苷回收率在98.92％～103.12％之间，RSD为2.81％；延胡索乙素回收率在97.63％～103.66％，RSD为3.01％；之间，杠柳苷回收率在98.12％～102.89％之间RSD为4.23％，表明该方法的测定结果具有较高的准确度。回收率(％)＝(测得量-样品中总黄酮的量)/加入对照品的量×100％。

2.3.3单因素实验结果

2.3.3.1药材粒度

表8 粒度对有效成分的影响

可看出：过24目未过50目的药材有效成分含量最高，此工序将药材细胞壁部分破坏，同时使药材与提取溶剂的接触面积增大使其有效成分便于提取。药材有效成分含量随药材粉碎程度的增大而增大，但从工艺方面考虑，粒度越细，对设备的要求越高，不利于放大生产，故选用过24目未过50目的药材。

2.3.3.2提取次数

表9 提取次数对有效成分的影响

第四次提取龙胆苦苷、延胡索乙素、杠柳苷含量过低，HPLC无法检测，视为第四次，此三种成分无法提出，含量为0。药材有效成分含量第二次提取率明显低于第一次，经SPSS软件分析，第二次与第一次有显著性差异；从生产工艺角度的角度考虑，提取次数选择1次。

2.3.3.3提取温度

表10 温度对有效成分的影响

可看出，药材有效成分含量随温度升高而增大。经SPSS软件分析，结果如下：

总黄酮：60℃与50℃无显著性差异，与80℃有显著性差异，但从超声波提取低温节能特点和工艺角度考虑，温度选择60℃；总甾体皂苷：60℃与50℃、80℃有显著性差异，但从上述因素考虑，温度选择60℃；龙胆苦苷：30℃、50℃、60℃、180℃间没有显著性差异。任一温度均可；总生物碱：60℃与50℃有显著性差异，与80℃无显著性差异，故温度选择60℃；延胡索乙素：60℃时提取率最高，与50℃有显著性差异，故温度选择60℃；杠柳苷：60℃与80℃无显著性差异，与50℃有显著性差异。故温度选择60℃。

根据以上分析，药材提取温度选择60℃。

2.3.3.4固液比

表11 固液比对有效成分的影响

可看出，药材有效成分含量随固液比升高而降低。固液比1∶10时，有效成分已大部分提出，含量不随固液比的增大上升。故1∶10为最佳固液比。

2.3.3.5提取时间

表12 提取时间对有效成分的影响

可见，药材有效成分随提取时间延长而增加，超声波处理药材数分钟，细胞破碎程度增大后，细胞内部有效成分向外扩散，有效成分含量上升，30min时，药材有效成分含量达到最高，故提取时间选择为30min。

2.3.3.6超声功率

表13 超声功率对有效成分的影响

看出，药材有效成分含量在超声提取功率为800W时达到最大，而提取功率继续增大后含量下降，是由于随超声功率增大，超声波对细胞的破碎作用增强，细胞内有效成分溶出速率增大，有效成分提取率上升；在功率1000W时，有效成分化学结构被破坏，含量降低。故租价超声功率为800W。

2.3.3.7浸泡时间

表14 浸泡时间对有效成分的影响

表15 浸泡时间对有效成分的影响

可见，总黄酮、总甾体皂苷、龙胆苦苷、杠柳苷含量浸泡后比未浸泡的黑骨藤有效成分含量降低，是由于在浸泡过程中有效成分间发生了反应。总生物碱与延胡索乙素含量含量升高，但就所有含量综合考虑，浸泡时间选择为0h。

2.3.3.8超声间隙时间

表16 间隙时间对有效成分的影响

表17 间隙时间对有效成分的影响

当间隙时间为2s时，总黄酮、杠柳苷含量含量较高；经SPSS软件分析，总甾体皂苷，5s与8s没有显著性差异，5s与10s有显著性差异，故选择5s、10s均可。龙胆苦苷含量随超声时间增长变化不大。生物碱类(总生物碱、延胡索乙素)含量随超声时间的增长而升高。生物碱类含量在药材中含量不高，故最佳工艺的选择以含量高的总黄酮，总甾体皂苷、龙胆苦苷为主，综合考虑，最佳超声时间为5s。

当超声时间为5s时，间隙时间3s时甾体皂苷含量明显高于2s，其余成分含量3s与2s没有显著性差异，且有利于超声波提取的使用和维护，故最佳间隙时间为3s。

2.3.4正交实验结果

按照正交实验方法操作，正交实验结果见表18，19，20，21，22，23，正交方差分析见表24-29。

表18 总黄酮正交试验结果

表19 总甾体皂苷正交试验结果

表20 龙胆苦苷正交试验结果

年

表21 总生物碱正交试验结果

表22 延胡索乙素正交试验结果

表23 杠柳苷正交试验结果

表24 总黄酮方差分析结果

a R Squared＝.999(Adjusted R Squared＝.994)

表25 总皂苷方差分析结果

a R Squared＝.999(Adjusted R Squared＝.994)

表26 龙胆苦苷方差分析结果

表27 总生物碱方差分析结果

a R Squared＝.999(Adjusted R Squared＝.994)

表28 延胡索乙素方差分析结果

a R Squared＝.999(Adjusted R Squared＝.994)

表29 杠柳苷方差分析结果

a R Squared＝.999(Adjusted R Squared＝.994)

经极差分析，SPSS软件方差分析，各因素对本发明组合物有效成分含量影响结果如下：

总黄酮：温度*固液比＞次数＞提取时间＝温度＞提取时间*固液比＞固液比＞温度*时间。

总甾体皂苷：提取时间＞次数＞温度＞提取时间*温度＞固液比＞提取时间*固液比＞温度*固液比，提取时间、提取时间*温度、固液比、次数影响显著。

龙胆苦苷：次数＞提取时间＞温度*固液比＞固液比＞提取时间*温度＞提取时间*固液比＞温度。

总生物碱：提取时间＞温度＞固液比＞次数＞提取时间*温度＝提取时间*固液比＞温度*固液比。提取时间、温度、固液比影响显著。

延胡索乙素：提取时间＝次数＞提取时间*固液比＞温度＞提取时间*温度＞固液比＝温度*固液比。

杠柳苷：温度*固液比＞温度＞提取时间＞次数＞固液比＞温度*固液比＞提取时间*温度。

由于总生物碱，延胡索乙素、杠柳苷提取率较低，总甾体皂苷、总黄酮、龙胆苦苷提取率较高，尤其是总甾体皂苷，故最佳工艺条件的选择以总甾体皂苷、总黄酮、龙胆苦苷为主，总生物碱，延胡索乙素、杠柳苷为辅，进行最佳工艺的优化，依次为次数、提取时间、温度、温度*固液比、固液比、提取时间*温度、提取时间*固液比。本实验的最佳条件为A₂B₂C₁D₁，即用过24目未过50目，加10倍量的50％乙醇，功率800W，超声间隙时间5s/3s，温度80℃，提取1次，每次30min。

2.3.5验证实验

按A2B2C1D1即过24目未过50目，加10倍量的50％乙醇，功率800W，超声间隙时间5s/3s，温度60℃，提取1次，每次30min这一最佳条件下进行重复性试验。结果如表30。

表30 验证实验

本实验采用超声波提取法提取本发明组合物中的总黄酮、总甾体皂苷，龙胆苦苷、总生物碱、延胡索乙素、杠柳苷等，利用单因素及正交实验法，确定了最佳工艺条件，即过24目未过50目，固液比1∶10，功率800W，超声间隙时间5s/3s，温度60℃，提取1次，每次30min。本发明组合物配伍药材为秦艽和延胡索，在治疗风湿及类风湿疾病方面有很好疗效。因此本实验确定的最佳工艺条件可为本发明组合物有效成分提取的工业化生产提供实验依据，为本发明组合物研发为中药制剂提供可靠理论基础。

以下通过药效试验具体说明本发明药物的有益效果。

试验例1本发明药物组合物配比的筛选

1、提取溶剂的选择

以相同的生药量给予小鼠，选用二甲苯致小鼠耳肿胀药效实验考察，以选择合适的提取溶剂。实验结果见表31、表32。

表31 浸提溶剂选择的耳肿胀药效实验结果

注：与模型对照组比较：^＊-P＜0.05；^＊＊-P＜0.01；

表32 乙醇浓度选择的耳肿胀药效实验结果

注：与模型对照组比较：^*-P＜0.05；^**-P＜0.01；

结果表明50％乙醇提取物给药组及乙酸乙酯提取物给药组之耳肿胀度与模型对照组相比均有极显著性差异，50％乙醇提取物抗炎药效最好，乙酸乙酯提取物次之，故初步确定乙醇作为提取溶剂。

由上述实验结果可知乙酸乙酯提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀有统计学意义上极显著性差异，抗炎药效显著，但由于乙酸乙酯对眼、鼻、咽喉有刺激作用，高浓度吸入可引起进行性麻醉作用，急性肺水肿，肝、肾损害，持续大量吸入，可致呼吸麻痹，误服者可产生恶心、呕吐、腹痛、腹泻等。相比较，乙醇的毒性较小，故确定乙醇作为后续制剂开发的提取溶剂。

因上述实验只考察了50％乙醇提取物效果，对于乙醇浓度对提取物药效的影响可做继续考察。以二甲苯致小鼠耳肿胀实验方法对比各浓度乙醇提取物的抗炎药效，数据结果显示30％～80％浓度乙醇提取的本发明组合物药材提取物给药组与模型组相比均具有显著性差异，其中以50％乙醇提取最佳，选择50％乙醇为提取溶剂。

2、本发明药物组合物用量配比最佳配比筛选

以二甲苯致小鼠耳肿胀实验耳廓肿胀抑制率为指标，将组方中三味药材以不同配比用量配伍，比较各配伍用量对抗炎药效的影响，实验结果见表33。

表33 复方配比选择之小鼠耳肿胀实验结果

与模型对照组比较：^*-p＜0.05；^**-p＜0.01.由上表可知，当黑骨藤∶秦艽∶元胡＝2.5∶1∶1时，抑制肿胀效果最佳，表明该配比下，组方具有最好的抗炎效果。并且，第2、5、7、8组配伍时与该最佳配比药效相当。

试验例2本发明药物组合物与单味药材的药效比较

1、本发明药物组合物与黑骨藤单方的比较

以二甲苯致小鼠耳肿胀模型对比黑骨藤与本发明药物组合物(实施例1中的复方配比)的提取物(提取方式按实施例1)的药效，结果见表34。

取健康18～22g雄性小鼠，适应性喂养两至三天后，经口灌胃给予各受试药物，连续给药三天，最后一次给药后1h于每只小鼠右耳正反面均匀涂抹致炎剂二甲苯，30min后断颈处死小鼠，剪刀剪下左右耳片，用打孔器(直径6mm)分别在左、右耳同一部位打下等大的圆形耳片，分别在电子天平上称重后，计算耳廓肿胀度。

耳廓肿胀度＝致炎耳重量-未致炎耳重量

耳廓肿胀率(％)＝[(致炎耳重量-未致炎耳重量)/未致炎耳重量]×100％。肿胀抑制率(％)＝[(对照组肿胀度-给药组肿胀度)/对照组肿胀度]×100％。

表34 单方、复药材50％乙醇提取物抗炎药效实验结果

注：与模型对照组比较：^＊-P＜0.05；^＊＊-P＜0.01；

上表中，单用黑骨藤时与模型组相比，肿胀率有显差(P＜0.05)，但其药效低于阳性药物；而使用本发明药物组合物时，与模型组相比，肿胀率有极显著差异(P＜0.01)，且药效与阳性药物相当。上述结果表明，本发明药物组合物比单独使用黑骨藤时，药效更好。

2、本发明药物组合物与两两组合的药物之间的比较

材料：成年昆明种雄性小白鼠6*10只，0.5％羧甲基纤维素钠溶液，0.25mg/ml醋酸***羧甲基纤维素钠溶液100ml，黑骨藤秦艽(1∶1)提取物(简称黑秦)的25mg/ml羧甲基纤维素钠溶液，黑骨藤元胡(1∶1)提取物(简称黑元)的25mg/ml羧甲基纤维素钠溶液，元胡秦艽(1∶1)提取物(简称秦元)的25mg/ml羧甲基纤维素钠溶液，黑骨藤秦艽元胡(1∶1∶1)(请贵方核对该处使用的配比。)提取物(简称秦元黑)的25mg/ml羧甲基纤维素钠溶液。二甲苯，6mm打孔器。

步骤：每只0.2ml，每12小时一次，连续灌胃6次。末次给药1小时后给小鼠右耳均匀涂上二甲苯，半个小时后断椎处死，剪下左右二耳，用打孔器在左右二耳同一位置打下等大耳片称重。

结果：由下表可知，阳性组、秦元黑组、黑元组与空白组有极显著差异；而黑秦组、秦元组与空白组无显差；秦元黑组效果同阳性组相似，更优于黑元组。

表35

综合上述实验可知，将黑骨藤同时与秦艽、元胡配伍使用时，其药效比单用或两味药材合用更好，发挥了协同增效作用。

试验例3本发明药物组合物抗类风湿性关节炎药效试验

选择小鼠棉球肉芽肿模型、腹腔通透性增加模型以及大鼠佐剂性关节炎模型验证本发明药物组合物抗炎药效。

1材料

1.1实验动物

普通级昆明系健康小鼠，体重18～22g，60日龄，雌雄皆有，依实验定。清洁级健康SD大鼠，体重200～250g，70日龄，全为雄性。均购自成都达硕动物饲养中心。

1.2药材、试剂和仪器

本发明药物：各单味药材经中药粉碎机粉碎至60目细粉，按黑骨藤∶秦艽∶元胡＝2.5∶1∶1各精确称取一定量至圆底烧瓶，用50％乙醇，按料液比1∶8，60℃水浴回流提取2次，每次2h。提取液用离心机高速离心(离心条件为3600r/min，10～15℃，10min)，上清液转至圆底烧瓶，用旋转蒸发器减压干燥(干燥条件为-0.085MPa，50℃)回收溶剂，至稠流浸膏状，用减压干燥箱(干燥条件为-0.05MPa，60℃，24h)干燥。提取物浸膏用5‰CMC-Na配制成高中低三个给药浓度的给药药液，其中高剂量浓度(0.8g生药/ml)、中剂量浓度(0.4g生药/ml)、低剂量浓度(0.2g生药/ml)。

阳性对照药***购于成都太极大药房，伊文思蓝、香草醛，羧甲基纤维素钠，无水乙醇等均为分析纯试剂，购于成都科龙化工试剂厂。水为蒸馏水。

UV-1700紫外-可见分光光度计(日本岛津)；PV-200足趾肿胀测定仪(成都泰盟科技发展有限公司)。

2方法

2.1小鼠棉球肉芽肿实验

取小鼠40只，雌雄各半，按体重随机均分为4组，每组10只，即生理盐水对照组、醋酸***阳性对照组、本发明药物组合物提取物高、低剂量组。小鼠***麻醉后，左腹股沟处消毒，切开皮肤，埋入等重灭菌棉球。每日经口灌胃给药1次，连续7天，给药期间每天称一次体重，并按体重调整给药量，第8天处死小鼠，取出棉球和其上的肉芽组织，将其置于80℃恒温干燥箱中干燥24小时，取出称重，即为干重，以干重减去棉球重量即为肉芽组织净重，除以体重后得单位体重的肉芽组织重量。

2.2小鼠腹腔通透性增加实验

取小鼠50只，雌雄各半，按体重随机均分为5组，每组10只，即模型对照组，***阳性对照组，高、中、低剂量组。各组动物均每日灌胃给予相应药液一次，模型对照组相应给予生理盐水，连续3天。末次给药后40分钟，各鼠均按10ml·Kg-1尾静脉注射1％伊文斯蓝，随即按0.2ml/只腹腔注射0.6％醋酸，注射醋酸20分钟后颈椎脱臼处死，剪开腹腔，腹腔注射约8ml生理盐水冲洗，用滴管吸取洗涤液至10ml容量瓶中，定容后转至离心管，将洗涤液以3000r/min离心5分钟，取上清液在590nm处测定吸光度。

2.3大鼠佐剂性关节炎抗炎实验

取SD大鼠，雄性，体重200～250g。60只随机均分为6组，每组10只，即生理盐水正常对照组，模型对照组，***阳性对照组，本发明药物组合物提取物高、中、低剂量组。各组动物均按10ml/Kg每天灌胃给予相应药液1次，正常对照组和模型对照组相应给予等体积的生理盐水。

药物对佐剂性关节炎大鼠原发病变的影响：致炎前先用PV-200足趾容积测量仪测量大鼠左、右后踝关节体积作为基础值，除正常对照组外每只大鼠均于右后足跎皮内注射0.1ml完全弗氏佐剂致炎，正常对照组注射等量生理盐水。然后各组动物分别灌胃给予相应药液，正常对照组给予等体积生理盐水，连续23天。致炎后第二天开始测量致炎侧踝关节体积，每两天测量一次，以致炎后体积减去致炎前体积作为肿胀值，观察佐剂性关节炎大鼠原发性炎症的变化情况。

药物对佐剂性关节炎大鼠继发病变的影响：于致炎后第8天开始，观察其脚爪、耳及尾部出现红斑、结节情况，计算其在不同时间内的左后踝关节足跎肿胀率，并记录其全身关节病变程度，并以脚爪、耳及尾部的病变程度累计积分，按5级评分法评价关节炎指数(AI)。评分标准：0分，无红肿；1分，趾关节红肿；2分，趾关节和足跎肿胀；3分，踝关节以下的足爪肿胀；4分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀。

2.4统计学分析

所有数据用

表达。用SPSS13.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05表示具有统计学显著性意义，P＜0.01表示具有统计学极显著性意义。

3结果与讨论

3.1小鼠棉球肉芽肿实验

小鼠棉球肉芽肿实验结果见表36。结果表明，阳性对照药***给药组及实施例1药物高低剂量组与模型对照组相比均具有显著差异，应用小鼠棉球肉芽肿抗炎模型验证本发明药物组合物提取物抗炎效果显著。

表36 小鼠棉球肉芽肿实验结果

与模型组比较：^＊-P＜0.05；^＊＊-P＜0.01

棉球肉芽肿炎症模型属慢性炎症模型，是研究药物对炎症增殖期疗效的常用筛选模型，应用该实验方法，验证了本发明药物组合物提取物抗炎药效显著。

3.2小鼠腹腔通透性增加实验

小鼠腹腔通透性增加实验结果见表37，结果表明，阳性对照药***给药组及本发明药物组合物50％乙醇提取物高中剂量组与空白对照组相比均具有极显著差异，低剂量组无显著性差异，抗炎药效不明显，且从数据可知，本发明药物组合物提取物对小鼠腹腔通透性模型的抗炎疗效呈现剂量依赖性，剂量越高，效果越明显，应用小鼠腹腔通透性增加抗炎模型验证本发明药物组合物提取物抗炎效果显著。

腹腔通透性增加模型属急性炎症模型，本章应用该模型验证本发明药物组合物提取物抗炎药效时，低剂量组与模型对照组比较无显著差异，但相同剂量对其他炎症模型如二甲苯致耳廓肿胀、棉球肉芽肿等却有显著抗炎药效，因此，不同模型所需给药剂量不同，依具体模型而定，实验时可设预实验或将剂量组间距扩大。

表37 小鼠腹腔通透性抗炎实验结果

与空白对照组比较：^**-p＜0.01

3.3大鼠佐剂性关节炎抗炎实验

大鼠致炎右足趾容积测定结果见表38，肿胀变化曲线见图3，继发病变期足趾肿胀评分结果见表39，结果表明，大鼠致炎足在24h内即达到峰值，各给药组与模型组比较均具有统计学意义上极显著性差异，本发明药物组合物提取物对完全弗氏佐剂诱导的大鼠关节炎急性局部炎症期有显著抑制效果。

表38 本发明药物组合物对SD大鼠踝关节原发病变的影响

与模型组比较：^＊-P＜0.05；^＊＊-P＜0.01；

表39 本发明药物组合物对SD大鼠踝关节继发病变的影响

与模型组比较：^＊-P＜0.05；^＊＊-P＜0.01；

综上所述，本发明药物组合物能够抗炎功效，能够有效对抗佐剂性关节炎，表明本发明药物组合物对类风湿性关节炎有良好的治疗作用。

试验例4本发明组合物的急性毒性动物实验

急性毒性试验是在24小时内给药1次或多次(间隔6-8小时)，观察动物接受过量的受试药物所产生的急性中毒反应。急性毒性实验能够为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析毒性作用的主要靶器官、分析人体过量时可能出现的毒性反应、I期临床的剂量选择和观察指标的设计提供参考信息等。

1材料

1.1实验动物

普通级昆明系健康小鼠，体重18～22g，60日龄，雌雄各半，分笼饲养。清洁级健康SD大鼠，体重200～250g，70日龄，雌雄各半，分笼饲养。均购自成都达硕动物饲养中心。

1.2药材、药品和试剂

黑骨藤药材购于贵州药材市场，经四川师范大学生命科学院植物学老师于树华鉴定，秦艽(批号：061118)及元胡(批号：061113)均购于四川中药饮片有限责任公司。

阳性对照药***购于成都太极大药房，香草醛，羧甲基纤维素钠，无水乙醇等均为分析纯试剂，购于成都科龙化工试剂厂。水为蒸馏水。

2方法

2.1动物饲养、给药及观察

实验动物购入实验室后，调整环境温度20～22℃，环境湿度为65％～80％，自由饮食、饮水，适应性喂养一周。

待实验动物适应环境及体重合格后于给药前禁食16h，自由饮水，给药方法采用经口分三次灌胃给药，小鼠每次给药体积0.4ml/20g·BW，大鼠每次给药体积2ml/200g·BW，每次间隔4h，给药后自由采食，饮水。

实验动物给药后观察其临床症状，时间为一周，记录动物死亡数量和死亡时间，并将死亡动物解剖，观察其主要实质器官的病理变化。

2.2给药药物配制

药材细粉给药药液配制：各药材(按实施例1配伍称取)经WK-1000A高速中药粉碎机打磨成60目粗粉，再经超微粉碎机打磨至超微粉，超微粉用5‰羧甲基纤维素钠(CMC-Na)在超声波清洗器中配制成能便于经口灌胃给药的最大浓度。

提取物给药药液配制：依据二甲苯致小鼠耳肿胀药效预实验和民间用药经验，60目药材粗粉按本发明药物组合物(实施例1配比)精密称取一定量，用50％乙醇，按料液比1∶8，60℃水浴回流提取2次，每次2h。提取液用离心机高速离心(离心条件为3600r/min，10-15℃，10min)，上清液转至圆底烧瓶，用旋转蒸发器减压干燥(干燥条件为-0.085MPa，50℃)回收溶剂，至稠浸膏状，用减压干燥箱(干燥条件为-0.05MPa，60℃，24h)干燥。浸膏用5‰CMC-Na配制成能便于经口灌胃给药的最大浓度，从中取一定量稀释成若干等梯度低浓度的给药药液。

2.3LD₅₀值计算及毒性评价方法

本实验半数致死量LD₅₀值计算采用改良寇氏法，并计算其95％可信区间。

利用保健食品安全性毒理学评价规范中的急性毒性(LD₅₀值)剂量分级表(见表40)来评价药物毒性大小。

表40 急性毒性(LD₅₀值)剂量分级表

2.4急毒实验

药材超微粉：通过预实验得到，单味药材和本发明药物组合物的超微粉所配制的最大浓度混悬液经口灌胃给药后，观察一周时间，小鼠表现无异样，死亡数为零，故超微粉不再进行改良寇氏法急性毒性实验。

本发明药物组合物(实施例1)：采用递减法预试验(30只小鼠)确定本发明药物组合物药材50％乙醇提取物小鼠LD₁₀₀和LD₀值分别为30.79g·Kg^-1BW(生药量)和3.08g·Kg^-1BW(生药量)。根据预实验的结果用寇氏法将50只小鼠随机分成5组，每组10只，雌雄各半，按剂量对数差均匀设置5个剂量组，经口分三次灌胃给药，每次间隔4h，给药后自由采食，饮水，给药后观察其临床症状，时间为一周，记录动物死亡数量和死亡时间，按改良寇氏法计算公式计算各半数致死量LD₅₀值。

3结果与讨论

3.1药材超微粉末急毒实验

超微粉给药药液急毒实验统计结果见表41。

根据国家保健食品安全性毒理学评价规范中的急性毒性(LD₅₀值)剂量分级表可评定口服本发明药物组合物药材细粉实际无毒或无毒。

表41 超微粉药材对小鼠的口服急性毒性实验结果

3.2提取物急毒实验

本发明药物组合物50％乙醇提取物(实施例1)急毒实验结果均见表42。

根据国家保健食品安全性毒理学评价规范中的急性毒性(LD₅₀值)剂量分级表可评定口服本发明药物组合物50％乙醇提取物LD₅₀值按毒性分级标准为低毒。

3.3大鼠急毒验证试验

各药材超微粉及提取物所配制的最大给药浓度药液，大鼠经口灌胃给药后与小鼠相似，均未出现异常反应，一周内死亡率为零。

本发明药物组合物，小鼠LD₁₀₀和LD₀值浓度药液，经口灌胃给予大鼠，其死亡情况与小鼠一致，LD₁₀₀浓度药液给药的10只大鼠全死亡，LD₀值浓度药液给药的10只大鼠均未死亡，该急毒实验得以验证。

3.4临床症状、小鼠死亡时间统计及剖检病理变化

经口灌胃给各超微粉药液的大小鼠在给药后除饮食略微减小外，其余临床表现均与正常大小鼠无异样，各组均未出现死亡。

经口灌胃给本发明药物组合物的大小鼠所有剂量组均出现四肢、***、尾巴青紫，全身颤抖，翘尾，腹部贴地等症状，但出现的时间不同，剂量越高出现症状的时间越短；继而出现流涎、眼睛充血、流泪、腹泻等症状；高剂量组腹痛症状更为明显，表现为两前肢趴在笼壁上或其他动物身上，弓腰缩腹，打滚，上窜下跳，躁动不安等。随着时间的推移，症状加重，出现精神沉郁，呼吸短促，张口呼吸，犬坐姿式，或躺卧或俯卧，对惊吓及疼痛等刺激反应迟钝，体温明显下降，毛发变得杂乱，逐渐衰竭而死，死前无明显的挣扎现象。耐过的受试动物，一般在给药后48h～72h恢复饮食欲，被毛及活动亦逐渐恢复正常。

小鼠死亡时间集中在给药后6h～36h，正式试验受试的100只小鼠共死亡66只，给药后0h～12h内死亡11只，12h～24h内死亡28只，24h～36h内死亡27只，分别占16.7％、42.4％和40.9％，给药后36h不再出现死亡，耐过的受试小鼠逐渐恢复正常。

对所有死亡动物进行剖检，可见被毛燥乱，眼睛干瘪塌陷，***、四肢、尾巴青紫，肝脏颜色变为深褐色或土黄色，有针尖状散在的出血点，质脆易碎；脾脏颜色变深，体积增大；胃、十二指肠，甚至整个小肠充血、出血、肠壁水肿，内容物呈煤焦油状，胃肠黏膜糜烂易脱落；肺脏气肿；有出血斑点；有的布满针尖状的出血点。盲肠、直肠、肾、膀胱等器官没有明显的眼观病理变化。

灌胃给予本发明药物组合物的动物中毒主要表现在消化***，死亡动物都有胃肠道充血、出血，肝、脾变色，体积增大，肺脏出血，说明中毒后，上述组织器官均有不同程度的受损和病变，最终使呼吸器官麻痹而致动物死亡。

表42 提取物对小鼠的口服急性毒性实验结果

综上所述，小鼠棉球肉芽肿慢性炎症模型、小鼠腹腔通透性增加急性炎症模型和大鼠佐剂性关节炎模型验证了本发明药物组合物的抗炎药效，结果表明，本发明药物组合物与模型对照组相比均具有统计学意义中显著性差异，抗炎药效明显，其中，大鼠佐剂性关节炎模型是考察药物抗类风湿性关节炎药效实验的常用模型，试验结果表明本发明药物组合物对完全弗氏佐剂诱导的大鼠关节炎急性局部炎症期有显著抗炎药效，即本发明药物组合能够有效治疗类风湿性关节炎，且毒副作用较低，为临床用药提供了一种新的选择。

Claims (10)

1.一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，其特征在于：它是由以下重量配比的原料药制备而成的制剂：

黑骨藤2.5-10份，秦艽1-4份，元胡1-4份。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：它是由以下重量配比的原料药制备而成的制剂：

黑骨藤2.5份，秦艽1份，元胡1份；或黑骨藤2.5份，秦艽2份，元胡2份；或黑骨藤2.5份，秦艽4份，元胡4份；或黑骨藤5份，秦艽1份，元胡2份；或黑骨藤5份，秦艽2份，元胡4份；或黑骨藤5份，秦艽4份，元胡1份；或黑骨藤10份，秦艽1份，元胡4份；或黑骨藤10份，秦艽2份，元胡1份；或黑骨藤10份，秦艽4份，元胡2份；或黑骨藤2.5份，秦艽2.5份，元胡2.5份。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于：它是由所述处方量的原料药的水或有机溶剂提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备而成的制剂；优选地，所述制剂为口服制剂。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：所述提取物中，含有总黄酮2-4％w/w、总甾体皂苷3-6％w/w、总生物碱0.1-0.3％w/w、龙胆苦苷1-3％w/w、延胡索乙素0.04-0.06％w/w、杠柳苷0.1-0.2％w/w。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于：该提取物的HPLC指纹图谱如图2所示。

6.权利要求1-5任意一项所述的药物组合物的制备方法，其特征在于：它是采用以下步骤实施的：

(1)按重量配比称取各药材；

(2)将药材粉碎，加入水或有机溶剂提取，提取所得的活性成分备用；

(3)取步骤(2)中的活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为乙酸乙酯、或乙醇；优选地，乙醇的浓度为30-80％v/v。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于：它是采用以下步骤实施的：

(1)按重量配比称取各药材；

(2)取步骤(1)的药材，粉碎，加入乙醇，固液比为1∶5-20W/V，超声功率60-1000W，超声5-10s间隙3-5s，超声提取1-3次，每次10-40min，提取温度40-80℃，合并提取液，过滤，将滤液回收溶剂、浓缩、干燥后，所得提取物备用；

(3)取步骤(1)所得的提取物，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

9.权利要求1-5任意一项所述的药物组合物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。

10.权利要求1-5任意一项所述的药物组合物的质量检测方法，其特征在于：它是采用HPLC进行检测，具体检测步骤如下：

a、供试品的制备方法：将药物组合物用水或有机溶剂提取后，定容，制备成供试品溶液；

b、取龙胆苦苷、延胡索乙素和杠柳苷，精密称定，制备成参照物溶液；

c、分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，测定，即得；

色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相：0-10min  甲醇∶2‰醋酸水溶液＝35∶65；

11-42min甲醇∶2‰醋酸水溶液＝65∶35；

检测波长：龙胆苦苷270nm；延胡索乙素230nm；杠柳苷230nm。

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