CN102532137A - 8-吡唑取代黄嘌呤类a2b腺苷受体拮抗剂及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种8-吡唑取代黄嘌呤类a2b腺苷受体拮抗剂及其合成方法和应用。该a2b腺苷受体拮抗剂的结构式是
，是以1,3-二烃基-5,6-二氨基脲嘧啶和硝基苄基吡唑-4-甲酸为原料，通过对traube反应的改进合成的。本发明的合成方法条件温和，容易操作，成本低，收率高，适于工业化生产。8-吡唑取代黄嘌呤通过药理实验证明黄嘌呤的8-位被硝基苄基吡唑取代增加了a2b受体的亲和性和选择性，且它能抑制il-8的分泌，减少炎症因子的释放，适用于治疗支气管哮喘。
Description
技术领域
本发明涉及药物合成领域，特别涉及一种8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂及其合成方法和应用。
背景技术
支气管哮喘是世界范围内最为常见的慢性呼吸道疾病，其主要特点是慢性气道炎症和气道对多种刺激因子反应性增高，临床常反复发作，严重地威胁着人们的健康,是世界公认的医学难题，被世界卫生组织列为疾病中四大顽疾之一，据调查，全世界至少有1亿人以上患有哮喘病。近年来研究发现腺苷是一种有效的支气管收缩因子，通过与特异性的A2B腺苷受体相互作用，可收缩支气管平滑肌，促进炎症细胞释放炎症因子，参与支气管哮喘急性和慢性炎症的病理生理过程，在哮喘发病机制中起重要作用。
A2B腺苷受体是致炎受体，研究HML-1细胞，发现非选择性A2A腺苷受体激动剂能刺激白细胞介素IL-8分泌，选择性A2A腺苷受体激动剂则不刺激IL-8分泌，而肥大细胞分泌IL-8只与A2B腺苷受体活性有关。2006年报道的8-(间三氟苄基-1H-吡唑) -1,3-二甲基黄嘌呤就对A2B受体具有较高的亲和力和选择性。A2B腺苷受体是腺苷促进肥大细胞产生细胞因子和炎症介质的主要受体之一，选择性地阻断A2B腺苷受体可有效抑制炎症细胞的活动，能有效阻断气道炎症介质释放及支气管痉挛而达到治疗哮喘的目的。
根据化学结构的特点，A2B受体拮抗剂可分为8-取代黄嘌呤类和8-取代非黄嘌呤类。
US20070219221和J. Med. Chem. 2008, 51, 2267–2278等对8-取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂的合成方法和药理作用进行了研究，合成路线如下：
R1,R2为烷基，R3取代苯或间三氟甲基苄基。
以1,3-取代-4,5-二氨基脲嘧啶与1-取代吡唑-4-甲酸的羧基反应环合得到不同的8-取代基的嘌呤。该方法需要较剧烈的反应条件，且反应时间长，特别是间三氟甲基苄基合成条件复杂，成本高，反应过程中产生有毒物质，不易制备。
发明内容
本发明是要解决的技术问题是提供一种合成方法简单，容易制备，制得的化合物可抑制IL-8的分泌，减少炎症因子的释放，对治疗哮喘有很好的疗效作用的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂及其合成方法和应用。
本发明的技术解决方案是：
一种8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂，其结构式如下：
其中R1,R2分别为氢、烷基、取代的烷基、烯烃中的一种或二种；R3为硝基苄基吡唑取代基。
上述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂，其特征是：R1,R2为氢、甲基，且R1,R2相同或不同。
上述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂， R1,R2为相同的取代基。
一种8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂的合成方法，其特殊之处在于：
将等摩尔量的硝基苄基吡唑-4-甲酸和碳二亚胺盐酸盐溶解在甲醇中，分5次加入与硝基苄基吡唑-4-甲酸等摩尔量的式2，搅拌8～16h，过滤，除去溶剂，水洗，将其溶解在甲醇和氢氧化钠溶液中，使混合溶液PH=8～12，搅拌溶解后置300～400W微波中反应10～50 min，冷却至室温，以盐酸在冰浴中酸化到pH=2～5，析出8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂。
上述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂的合成方法，以盐酸在冰浴中酸化后pH=3～4。
上述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂的合成方法，所述的式2中R1、R2为甲基，反应式为：
将二甲基脲0.18mol、氰乙酸0.15～0.2mol，在90～110℃下于乙酸酐中搅拌1～2h，减压蒸除乙酸、乙酸酐，剩余物加水，加活性炭脱色，过滤，冷却，以NaOH调pH=8～10，抽滤，得1,3-二甲基-6-氨基脲嘧啶；1,3-二甲基-6-氨基脲嘧啶溶解于醋酸溶液中，平均分5次加入与1,3-二甲基-6-氨基脲嘧啶等摩尔量的亚硝酸钠，加完后冷却至室温，搅拌1～3h，过滤，得1,3-二甲基-5-亚硝基-6-氨基脲嘧啶；将1,3-二甲基-5-亚硝基-6-氨基脲嘧啶溶解在氨水中，平均分5次加入连二亚硫酸钠0.1～0.3 mol，降至室温继续搅拌10～30min，在冰浴中冷却，过滤收集沉淀，水洗得1,3-二甲基-5,6-二氨基脲嘧啶；Mp：210～214℃。
上述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂的合成方法， 1,3-二甲基-6-氨基脲嘧啶溶解时的温度为50～75℃，然后降温至50℃。
上述的-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂的合成方法，减压蒸除乙酸、乙酸酐后剩余物加水时加水量为20～100mL。
上述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂的合成方法，制备硝基苄基吡唑-4-甲酸的反应式为：
加入0.1mol氰乙酸乙酯、0.1～0.15mol原甲酸三乙酯、乙酸酐0.1～1g及氯化锌催化剂0.1～0.2g，搅拌，100～120℃回流1～2h，通过Claisen酯缩合，继续加热升温至130～140℃使之反应完全，并从分馏柱上口蒸出反应时生成的低沸点物；反应液经冷却析出结晶，过滤并用乙醇洗涤，得乙氧基亚甲基氰乙酸乙酯，Mp:50～51℃；0.1mol乙氧基亚甲基氰乙酸乙酯和0.1mol水合肼在溶解在乙醇中搅拌10～14h，减压旋蒸除去乙醇，得3-氨基吡唑-4-甲酸乙酯，Mp:102℃；将3-氨基吡唑-4-甲酸乙酯溶解在冰乙酸中，搅拌下加入0.1～0.2mol的稀HCl溶液和0.1～0.3mol亚硝酸钠溶液，反应混合物在-5～0℃搅拌10～30min，加入乙醇，回流0.5～1.5h，减压旋蒸除去乙醇，残渣用水洗，过滤，用二氯甲烷提取水溶液, 用硫酸镁干燥有机相，过滤，减压浓缩得到吡唑-4-甲酸乙酯，Mp:69℃；将吡唑-4-甲酸乙酯溶解在丙酮溶液中，加入碳酸钾和0.1～0.15mol硝基苄基溴，在40～70℃，反应12～20h，过滤除去碳酸钾，加入固体氢氧化钾0.02mol，回流反应12～20h，甲醇减压蒸馏过滤，残渣溶解于水并且用乙酸乙酯洗涤，水层用盐酸酸化至析出硝基苄基吡唑-4-甲酸。
上述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂在治疗哮喘病的药物中应用。
本发明的有益效果在于：
1、首次合成了8-(硝基苄基-1H-吡唑) -1, 3-二甲基黄嘌呤，反应步骤相对较少，易于工业化生产，成本降低，环境友好，总收率在89.3%以上。
2、硝基苄基吡唑-4-甲酸自行制备，而且制备完成后直接投入8-(硝基苄基-1H-吡唑) -1, 3-二甲基黄嘌呤的合成中，不必再储存，使收率提高，成本降低。
3、在乙氧基亚甲基氰乙酸乙酯的合成中，原甲酸三乙酯和氰乙酸乙酯的投料摩尔比美国专利3515715中报道为1：3，收率为93～94%，但存在溶剂回收、后处理繁琐的问题。本发明采用原甲酸三乙酯和氰乙酸乙酯的投料摩尔比为1～1:1.5，并且采用分二段加热升温，在反应过程中及时将低沸点生成物蒸出。因为开始温度过高导致原甲酸三乙酯分解，物料减少，分段升温能够使生成的乙氧甲基氰乙酸乙酯脱醇生成氰乙酸，分馏装置确保了物料的不损失；且温度不能高于140℃，若高于140℃氰乙酸乙酯蒸出，反而降低了收率。反应完毕后，通过放置12小时，延长反应时间可以使收率有明显的提高，否则会有一部分乙氧基亚甲基氰乙酸乙酯溶解在溶液中。在3-氨基吡唑-4-甲酸乙酯的合成中，文献Ackermann Otto and Bretzinger. 2'-Phenylhydrazino-2-cyanoacrylic acid esters and herbicides containing these compounds:DE, 2635841[P],1978.中报道反应温度为回流温度，虽然反应时间缩短了，但由于肼不稳定，收率并不高，本实验采用了在室温下搅拌的方法，避免了副反应的发生，3-氨基吡唑-4-甲酸乙酯直接过滤即可得到一部分，滤液减压回收乙醇又获得了一部分，这样使收率提高到92%以上。在吡唑-4-甲酸乙酯的合成中，要充分的搅拌以确保吡唑-4-甲酸乙酯能完全溶在乙酸中，进而与亚硝酸盐发生加成反应，以避免盐酸直接与亚硝酸钠反应，且控制反应温度在-5～0℃，避免反应剧烈，生成大量一氧化氮气体，既污染环境，又对操作者身体造成伤害。
4、在8-(硝基苄基-1H-吡唑)-1,3-二甲基黄嘌呤的合成中，采用了在微波中反应，反应快速，比Traube反应时间节约了8h左右。
5、本发明所述的8-(硝基苄基-1H-吡唑) -1, 3-二甲基黄嘌呤，选择吡唑基团在8-位取代，因为8-吡唑取代有着较强的A2B 受体亲和力和选择性。而1,3-位的甲基具有很好的疏水作用，吡唑的1-位用间硝基苄基取代时增加了氢键作用，间位用硝基取代使其具有脂溶性结构。
6、本发明中合成的化合物是最新的治疗哮喘方面的药物应用，是国内首次以A2B腺苷受体拮抗剂治疗哮喘为研究方向，在组合化学和生物电子等排原理的指导下合成了8-(硝基苄基-1H-吡唑) -1, 3-二甲基黄嘌呤。
7、本发明是以基本的化学原料通过一系列化学反应合成8-(硝基苄基-1H-吡唑) -1, 3-二甲基黄嘌呤，通过大鼠药理实验证明该药物具有抗哮喘作用，适用于治疗支气管哮喘。
附图说明
图1是8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的1H NMR图谱；
图2是8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的LC-MS图谱；
图3是8-(邻间基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的1H NMR图谱；
图4是8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的LC-MS图谱；
图5是8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的1H NMR图谱；
图6是 8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的LC-MS图谱；
图7是1-甲基-8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的1H NMR图谱；
图8是1-甲基-8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的LC-MS图谱；
图9是1-甲基-8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的1H NMR图谱；
图10是1-甲基-8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的LC-MS图谱；
图11是1-甲基-8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的1H NMR图谱；
图12是1-甲基-8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的LC-MS图谱；
图13是1,3-二甲基-8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的1H NMR图谱；
图14是1,3-二甲基-8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的LC-MS图谱；
图15是1,3-二甲基-8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的1H NMR图谱；
图16是1,3-二甲基-8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的LC-MS图谱；
图17是1,3-二甲基-8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的1H NMR图谱；
图18是1,3-二甲基-8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的LC-MS图谱；
图19是正常组支气管及肺泡结构图；
图20是模型组支气管及肺泡结构图；
图21是阳性对照组支气管及肺泡结构图；
图22是药物治疗组1支气管及肺泡结构图；
图23是药物治疗组2支气管及肺泡结构图；
图24是药物治疗组3支气管及肺泡结构图；
图24是药物治疗组4支气管及肺泡结构图；
图26是药物治疗组5支气管及肺泡结构图；
图27是药物治疗组6支气管及肺泡结构图；
图28是药物治疗组7支气管及肺泡结构图；
图29是药物治疗组8支气管及肺泡结构图；
图30是药物治疗组9支气管及肺泡结构图；
图31是血清中的IL-8的水平的柱形图。
具体实施方式
实施例1
R1,R2为氢，R3为邻硝基苄基吡唑—合成8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤
（1）合成原料邻硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸
①合成吡唑-4-甲酸乙酯
在装有搅拌器、温度计、滴液漏斗及分馏柱的250mL反应瓶中，加入原甲酸三乙酯0.12mol、氰乙酯乙酯0.10mol、乙酸酐0.4g及氯化锌催化剂0.1g,搅拌，110℃回流1h，继续加热升温至132℃，并从分馏柱上口蒸出反应时生成的低沸点物；反应液经冷却析出结晶，过滤并用乙醇洗涤，得淡黄色结晶乙氧基亚甲基氰乙酸乙酯，Mp:50～51℃；0.1mol乙氧基亚甲基氰乙酸乙酯和0.10mol水合肼在400mL乙醇中搅拌12h，减压旋蒸除去乙醇，得淡黄色固体3-氨基吡唑-4-甲酸乙酯，Mp:102℃；将3-氨基吡唑-4-甲酸乙酯溶解在100mL冰乙酸中，搅拌下逐次加入0.15mol的稀HCl溶液和0.2mol亚硝酸钠溶液，反应混合物在0℃搅拌15min，加入200mL乙醇，回流1h，减压旋蒸除去乙醇，残渣用水洗，过滤，用二氯甲烷提取水溶液,用硫酸镁干燥有机相，过滤，减压浓缩得到米色固体吡唑-4-甲酸乙酯，收率：99.5%，Mp:69℃；
②合成邻硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸
将吡唑-4-甲酸乙酯溶解在丙酮溶液中，加入0.05mol碳酸钾和0.12mol邻硝基苄基溴，50℃加热16h，过滤除去碳酸钾，加入固体氢氧化钾0.02mol，加热回流18h，甲醇减压蒸馏过滤，残渣溶解于水并且用乙酸乙酯洗涤，水层用盐酸酸化，析出浅黄色固体邻硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸，质量：20.8g，收率：85%，Mp：175～177℃；
（2）合成8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤
1.0mmol邻硝基苄基-4-吡唑甲酸和1.0mmol碳二亚胺盐酸盐溶解在22mL甲醇中，搅拌下分5次加入1.0mmol的5,6-二氨基脲嘧啶,搅拌8小时，过滤，除去溶剂，水洗，将其溶解在15mL甲醇和15mL的氢氧化钠溶液中，在300 W微波中反应50 min，冷却至室温，以6mol/L的盐酸在冰浴中酸化到pH=5,析出黄色固体8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤，质量：30.1g，收率：83.1%，Mp：189～192℃，纯度：＞95%。1H NMR (DMSO-d6): 1H NMR (DMSO-d6): 13.35 (s,1H), 10.09(s,1H), 8.07 (m,1H), 7.84 (s,1H),7.68 (s,1H)7.28-7.43 (m,3H), 6.12 (s,1H), 5.09 (s,2H)（如图1）; LC-MS(m/z):354 [M+]（如图2）。
实施例2
R1,R2为氢，R3为间硝基苄基吡唑—合成8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤
1.0mmol间硝基苄基-4-吡唑甲酸和1.0mmol碳二亚胺盐酸盐溶解在22mL甲醇中，搅拌下分5次加入1.0mmol的 5,6-二氨基脲嘧啶,搅拌12小时，过滤，除去溶剂，水洗，将其溶解在15mL甲醇和15mL的氢氧化钠溶液中，微波（360 W）中反应30 min，冷却至室温，以6mol/L的盐酸在冰浴中酸化到pH=4，析出黄色固体8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤，质量：31.5g，收率89.3%.，Mp：196～198℃，纯度：＞95%。1H NMR (DMSO-d6): 13.39 (s,1H), 10.01(s,1H), 7.99-8.03 (m,2H), 7.81 (s,1H),7.62 (s,1H) 7.45-7.40 (m,2H), 6.08 (s,1H), 5.01 (s, 2H)（如图3）；LC-MS(m/z):354 [M+]（如图4）。
实施例3
R1,R2为氢，R3为对硝基苄基吡唑—合成8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤
1.0mmol对硝基苄基-4-吡唑甲酸和1.0mmol碳二亚胺盐酸盐溶解在22mL甲醇中，搅拌下分5次加入1.0mmol的 5,6-二氨基脲嘧啶,搅拌10小时，过滤，除去溶剂，水洗，将其溶解在15mL甲醇和15mL的氢氧化钠溶液中，微波（350 W）中反应20 min，冷却至室温，以6mol/L的盐酸在冰浴中酸化到pH=2, 析出淡黄色固体8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤，质量：28.4g，收率82.8%，Mp：208～210℃，纯度：97.4%。1H NMR (DMSO-d6): 13.39 (s,1H), 10.02(s,1H), 8.07(m,2H) ,7.61 (s, 1H),7.32 (m,2H), 7.43 (s,1H), 6.08 (s,1H), 5.01 (s,2H)（如图5）; LC-MS(m/z):354 [M+]（如图6）。
实施例4
R1为氢，R2为甲基，R3为邻硝基苄基吡唑—合成1-甲基-8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤
（1）合成原料邻硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸
①合成吡唑-4-甲酸乙酯
在装有搅拌器、温度计、滴液漏斗及分馏柱的250mL反应瓶中，加入原甲酸三乙酯0.10mol、氰乙酯乙酯0.10mol、乙酸酐1g及氯化锌催化剂0.15g，搅拌，120℃回流1.5h，继续加热升温至130℃，并从分馏柱上口蒸出反应时生成的低沸点物；反应液经冷却析出结晶，过滤并用乙醇洗涤, 得淡黄色结晶乙氧基亚甲基氰乙酸乙酯，Mp:50～51℃；0.1mol乙氧基亚甲基氰乙酸乙酯和0.10mol水合肼在400mL乙醇中搅拌10h，减压旋蒸除去乙醇，得淡黄色固体3-氨基吡唑-4-甲酸乙酯，Mp:102℃；将3-氨基吡唑-4-甲酸乙酯溶解在100mL冰乙酸中，搅拌下逐次加入0.2mol的稀HCl溶液和0.15mol亚硝酸钠溶液，反应混合物在-2℃搅拌30min，加入200mL乙醇，回流0.5h，减压旋蒸除去乙醇，残渣用水洗，过滤，用二氯甲烷提取水溶液,用硫酸镁干燥有机相，过滤，减压浓缩得到米色固体吡唑-4-甲酸乙酯，收率：89.1%，Mp:69℃；
②合成邻硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸
将吡唑-4-甲酸乙酯溶解在丙酮溶液中，加入0.05mol碳酸钾和0.10mol邻硝基苄基溴，40℃加热20h，过滤除去碳酸钾，加入固体氢氧化钾0.02mol，加热回流12h，甲醇减压蒸馏过滤，残渣溶解于水并且用乙酸乙酯洗涤，水层用盐酸酸化，析出浅黄色固体邻硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸，质量：19.1g，收率：78%，Mp：175～177℃；
（2）合成1-甲基-8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤
在250mL反应瓶中将0.1mol邻硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸，0.1mol 碳二亚胺盐酸盐溶解在150mL甲醇中，分5次加入0.1mol 1-甲基-5,6二氨基脲嘧啶，搅拌9小时，减压除去溶剂，水洗；置250mL反应瓶中，加入75mL甲醇和75mL的氢氧化钠溶液，搅拌溶解后置微波（300 W）中反应10 min，冷却，以6mol/L的盐酸在冰浴中酸化到pH=2，析出淡黄色固体1-甲基-8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤，质量：30.4g，收率81.9%，Mp：219～221℃，纯度：97.5%。1H NMR (DMSO-d6): 13.37 (s,1H), 8.09(m,H) ,7.81 (s,1H),7.64(s,1H)7.52-7.33(m, 3H), 6.08 (s,1H), 5.01 (s,2H),3.18(s,3H)（如图7）; LC-MS(m/z):368 [M+]（如图8）。
实施例5
R1为氢，R2为甲基，R3为间硝基苄基吡唑—合成1-甲基-8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤
在250mL反应瓶中将0.1mol间硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸，0.1mol 碳二亚胺盐酸盐解在150mL甲醇中，分5次加入0.1mol 1-甲基-5,6二氨基脲嘧啶，搅拌13小时，减压除去溶剂，水洗；置250mL反应瓶中，加入75mL甲醇和75mL的氢氧化钠溶液，搅拌溶解后置微波（400 W）中反应50 min，冷却，以6mol/L的盐酸在冰浴中酸化到pH=3，析出淡黄色固体1-甲基-8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤，质量：32.4g收率87.9%，Mp：235～237℃，纯度：98.6%。1H NMR (DMSO-d6):13.32(s,1H),8.03-7.99(m,2H),7.81(s,1H),7.64(s,1H)7.50-7.43(m,2H),6.02(s,1H),5.03(s,2H),3.14(s,3H)（如图9）； LC-MS(m/z):368 [M+]（如图10）。
实施例6
R1为氢，R2为甲基，R3为对硝基苄基吡唑—合成1-甲基-8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤
在250mL反应瓶中将0.1mol对硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸，0.1mol 碳二亚胺盐酸盐溶解在150mL甲醇中，分5次加入0.1mol 1-甲基-5,6二氨基脲嘧啶，搅拌8小时，减压除去溶剂，水洗；置250mL反应瓶中，加入75mL甲醇和75mL2mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌溶解后置微波（300 W）中反应40 min，冷却，以6mol/L的盐酸在冰浴中酸化到pH=2，析出淡黄色固体1-甲基-8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤，质量：30. 5g，收率82.9%，Mp：214～216℃，纯度：98.3%。1H NMR (DMSO-d6): 13.31 (s,1H), 8.07(m,2H) ,7.75 (s, 1H), 7.48(s,1H)7.32(m,2H), 6.02(s,1H)，5.00(s,2H),3.17(s,3H)(如图11);LC-MS：(m/z): 368 [M+](如图12)。
实施例7
R1,R2为甲基，R3为邻硝基苄基吡唑—合成1,3-二甲基-8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤
（1）合成原料邻硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸
①合成吡唑-4-甲酸乙酯
在装有搅拌器、温度计、滴液漏斗及分馏柱的250mL反应瓶中，加入原甲酸三乙酯0.15mol、氰乙酯乙酯0.10mol、乙酸酐0.1g及氯化锌催化剂0.2g,搅拌，100℃回流2h，继续加热升温至140℃，并从分馏柱上口蒸出反应时生成的低沸点物；反应液经冷却析出结晶，过滤并用乙醇洗涤, 得淡黄色结晶乙氧基亚甲基氰乙酸乙酯，Mp:50～51℃；0.1mol乙氧基亚甲基氰乙酸乙酯和0.10mol水合肼在400mL乙醇中搅拌14h，减压旋蒸除去乙醇，得淡黄色固体3-氨基吡唑-4-甲酸乙酯，Mp:102℃；将3-氨基吡唑-4-甲酸乙酯溶解在120mL冰乙酸中，搅拌下逐次加入0.1mol的稀HCl溶液和0.1mol亚硝酸钠溶液，反应混合物在-5℃搅拌10min，加入200mL乙醇，回流1.5h，减压旋蒸除去乙醇，残渣用水洗，过滤，用二氯甲烷提取水溶液，用硫酸镁干燥有机相，过滤，减压浓缩得到米色固体吡唑-4-甲酸乙酯，收率：88.6%，Mp:69℃；
②合成邻硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸
将吡唑-4-甲酸乙酯溶解在丙酮溶液中，加入0.05mol碳酸钾和0.15mol邻硝基苄基溴，70℃加热12h，过滤除去碳酸钾，加入固体氢氧化钾0.02mol，加热回流20h，甲醇减压蒸馏过滤，残渣溶解于水并且用乙酸乙酯洗涤，水层用盐酸酸化，析出浅黄色固体邻硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸，质量：19.4g，收率：80%，Mp：175～177℃；
（2）合成1,3-二甲基-5,6-二氨基脲嘧啶
将二甲基脲0.18 mol、氰乙酸0.16mol，在 95℃下于25ml乙酸酐中搅拌2h，减压蒸除乙酸、乙酸酐， 剩余物加水，加活性炭脱色，过滤，冷却，以NaOH调pH=10，抽滤，得浅黄色固体1,3–二甲基-6-氨基-脲嘧啶；将1,3–二甲基-6-氨基-脲嘧啶溶解在水中搅拌均匀，平均分5次亚硝酸钠0.16mol，加完后冷却至室温，继续搅拌1h，过滤，收集沉淀，水洗，晒干，得紫色固体1,3-二甲基-5-亚硝基-6-氨基脲嘧啶；将1,3-二甲基-5-亚硝基-6-氨基脲嘧啶溶解在氨水中，平均分5次加入0.18mol连二亚硫酸钠，溶液先变红色接着变成绿色最后变为浅黄色，降至室温继续搅拌10分钟，反应混合物体积量减少一半，在冰浴中冷却，过滤收集沉淀，水洗得淡黄色固体1,3-二甲基-5,6-二氨基脲嘧啶，质量：25.9g，收率：95%，Mp：210～213°C；
（3）合成1,3-二甲基-8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤
在250mL反应瓶中将0.1mol邻硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸，0.1mol 碳二亚胺盐酸盐溶解在150mL甲醇中，分5次加入0.1mol 1,3-二甲基-5,6二氨基脲嘧啶，搅拌10小时，减压除去溶剂，水洗；置250mL反应瓶中，加入75mL甲醇和75mL的氢氧化钠溶液，搅拌溶解后置微波（350 W）中反应30 min，冷却，以6mol/L的盐酸在冰浴中酸化到pH=5，析出淡黄色固体1,3-二甲基-8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤，质量：31.6g，收率83.1%。Mp：264～266℃，纯度：98.5%。1H NMR (DMSO-d6): 13.37 (s,1H), 8.07(m,H) ,7.73 (s,1H), 7.41(s,1H) 7.45-7.32 (m,3H), 5.04 (s,2H), 3.11(s,3H), 3.07(s,3H)（如图13）;LC-MS(m/z):382 [M+]（如图14）。
实施例8
R1，R2为甲基，R3为间硝基苄基吡唑—合成1,3-二甲基-8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤
（1）合成1,3-二甲基-5,6-二氨基脲嘧啶
将二甲基脲0.18 mol、氰乙酸0.15mol，在 90℃下于25ml乙酸酐中搅拌1h，减压蒸除乙酸、乙酸酐，剩余物加水，加活性炭脱色，过滤，冷却，以NaOH调pH=9，抽滤，得浅黄色固体1,3–二甲基-6-氨基-脲嘧啶；将1,3–二甲基-6-氨基-脲嘧啶溶解在水中搅拌均匀，平均分5次亚硝酸钠0.15mol，加完后冷却至室温，继续搅拌2h，过滤，收集沉淀，水洗，晒干，得紫色固体1,3-二甲基-5-亚硝基-6-氨基脲嘧啶；将1,3-二甲基-5-亚硝基-6-氨基脲嘧啶溶解在氨水中，平均分5次加入0.18mol连二亚硫酸钠，溶液先变红色接着变成绿色最后变为浅黄色，降至室温继续搅拌20分钟，反应混合物体积量减少一半，在冰浴中冷却，过滤收集沉淀，水洗得淡黄色固体1,3-二甲基-5,6-二氨基脲嘧啶，质量：24.6g，收率：88%，Mp：210～213°C；
（2）合成1,3-二甲基-8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤
在250mL反应瓶中将0.1mol间硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸，0.1mol 碳二亚胺盐酸盐溶解在150mL甲醇中，分5次加入0.1mol 1,3-二甲基-5,6二氨基脲嘧啶，搅拌16小时，减压除去溶剂，水洗；置250mL反应瓶中，加入75mL甲醇和75mL的氢氧化钠溶液，搅拌溶解后置微波（360 W）中反应50 min，冷却，以6mol/L的盐酸在冰浴中酸化到pH=3.6，析出黄色固体1,3-二甲基-8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤，质量：33. 6g，收率：89.3%。Mp：284～287℃，纯度：99.1%。1HNMR(DMSO-d6):13.33(s,1H),8.01-7.98(m, 2H) ,7.69 (s,1H), 7.57(s,1H)7.45-7.39 (m,2H), 5.05 (s,2H), 3.02(s,3H), 3.03(s,3H)（如图15）; LC-MS(m/z):382 [M+]（如图16）。
实施例9
R1，R2为甲基，R3为对硝基苄基吡唑—1,3-二甲基-8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的合成
（1）合成1,3-二甲基-5,6-二氨基脲嘧啶
将二甲基脲0.18 mol、氰乙酸0.20mol，在 110℃下于25ml乙酸酐中搅拌1.5h，减压蒸除乙酸、乙酸酐, 剩余物加水，加活性炭脱色，过滤，冷却，以NaOH调pH=8，抽滤，得浅黄色固体1,3–二甲基-6-氨基-脲嘧啶；将1,3–二甲基-6-氨基-脲嘧啶溶解在水中搅拌均匀，平均分5次亚硝酸钠0.18mol，加完后冷却至室温，继续搅拌3h，过滤，收集沉淀，水洗，晒干，得紫色固体1,3-二甲基-5-亚硝基-6-氨基脲嘧啶；将1,3-二甲基-5-亚硝基-6-氨基脲嘧啶溶解在氨水中，平均分5次加入0.3mol连二亚硫酸钠，溶液先变红色接着变成绿色最后变为浅黄色，降至室温继续搅拌30分钟，反应混合物体积量减少一半，在冰浴中冷却，过滤收集沉淀，水洗得淡黄色固体1,3-二甲基-5,6-二氨基脲嘧啶，质量：26.2g，收率：92%，Mp：210～213°C；
（2）合成1,3-二甲基-8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤
在250mL反应瓶中将0.1mol对硝基苄基-1H-吡唑-4-甲酸，0.1mol 碳二亚胺盐酸盐溶解在150mL甲醇中，分5次加入0.1mol 1,3-二甲基-5,6二氨基脲嘧啶，搅拌15小时，减压除去溶剂，水洗；置250mL反应瓶中，加入75mL甲醇和75mL的氢氧化钠溶液，搅拌溶解后置微波（400 W）中反应20 min，冷却，以6mol/L的盐酸在冰浴中酸化到pH=2，析出黄色固体1，3-二甲基-8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤，质量31.6g，收率82.8%。Mp：254～256℃，纯度：99.0%。1HNMR(DMSO-d6):13.33(s,1H),8.07(m,2H),7.65(s,1H), 7.54(s,1H)7.32(m,2H),5.03(s,2H),3.08(s,3H), 3.06(s,3H)（如图17）; LC-MS(m/z):382 [M+]（如图18）。
临床实验报告－抗哮喘活性实验
对实施例1～实施例9合成的化合物8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤（化合物1），8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤（化合物2），8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤（化合物3），1-甲基-8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤（化合物4），1-甲基-8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤（化合物5），1-甲基-8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤（化合物6），1,3-二甲基-8-(邻硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤（化合物7），1,3-二甲基-8-(间硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤（化合物8），1,3-二甲基-8-(对硝基苄基-1H-吡唑)-黄嘌呤的合成（化合物9）分组进行药理实验，并通过对哮喘大鼠的支气管壁和气道平滑肌厚度，以及血清中的IL-8的水平进行分析，旨在观察A2BAR拮抗剂8-(硝基苄基-1H-吡唑)黄嘌呤对卵白蛋白（Ovalbumin）激发的大鼠哮喘模型的干预作用，探讨8-(硝基苄基-1H-吡唑) -黄嘌呤的药理作用，为临床应用A2BAR拮抗剂8-(硝基苄基-1H-吡唑) -黄嘌呤治疗哮喘提供依据。
具体实验步骤如下：
1、建造实验模型
随机挑选年龄性别相同，体重150～200g的大鼠120只。随机分为12组:正常对照组(10只)、模型组(10只)、阳性（8-(间三氟甲基苄基-1H-吡唑)-1,3-二甲基黄嘌呤）对照组(10只)、药物治疗组（药物治疗组1～药物治疗组9每组10只，共90只），正常组不作任何处理。模型组：参照文献【1、Kips JC, Brussekke GJ, Joos GF, et al.Interleukin-12 inhibits antigen-induced airway hyperresponsiveness in mice Am J Respir Crit Care Med,1996,153(2):535-539；2、刘玉慧，张少丹，程艳蕊等，腺苷受体与支气管哮喘治疗研究新进展，国际呼吸杂志，2006,2(1):64-65；3、谢炎燊，佟万成，雾化吸入雷公藤内酯醇对豚鼠哮喘气道反应性的治疗作用，国际医药卫生导报,2008,14(17):20-22.】略做改动，以卵蛋白混悬液（0.1mg/ml）lml腹腔内注射致敏。15天后以10%卵蛋白雾化吸入诱喘，让动物自行吸入，诱发气道痉挛，出现呼吸频率加深、加快及点头运动、呼吸困难、咳嗽、跌倒直至哮喘发作，1日1次，持续7天。药物治疗组：按与模型组相同的方法处理动物。15天后在10%卵蛋白诱发前30分钟，分别以合成化合物1～化合物9取1ml混悬液(8ug/ml) 腹腔内注射，1日1次，持续7天。阳性对照组：按与模型组相同的方法处理动物。15天后在10%卵蛋白诱发前30分钟以8-(间三氟甲基苄基-1H-吡唑)-1,3-二甲基黄嘌呤1ml混悬液(8ug/ml) 腹腔内注射，1日1次，持续7天。
2、测量指标
（1）光镜标本的制备
① 取材与固定 固定大鼠，暴露胸部，取出四组大鼠完整的双侧肺叶及主支气管，用10%***液固定；
②脱水包埋及切片 标本投入0.01mol·L-1PBS磷酸盐缓冲液（PH=7.4）内浸泡12小时，中间换液两次；之后投入70%酒精，80%酒精，90%酒精，100%酒精Ⅰ，100%酒精Ⅱ，梯度酒精脱水；二甲苯透明；常规石蜡包埋；用石蜡切片机进行连续石蜡切片，厚5微米；
③HE染色步骤 切片常规脱蜡至二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，100%酒精Ⅰ，100%酒精Ⅱ，各10分钟，95%酒精，90%酒精，80%酒精，70%酒精各10分钟，蒸馏水冲洗；苏木素染色1分钟，自来水冲洗；1%盐酸酸化，自来水冲洗；伊红染色2分钟；常规梯度酒精脱水70%酒精，80%酒精，90%酒精，95%酒精，各2分钟，100%酒精Ⅰ，100%酒精Ⅱ，各10分钟；二甲苯透明；中性树胶封片；
④观察 肺组织经HE染色后，将切片放在连接计算机的显微镜下（放大400倍），找到完整的肺内支气管横断面，测定肺内支气管壁厚度及气道平滑肌厚度。
（2）IL-8的测定
每组各取2只于最后一次雾化后24h摘除右眼球取血3mL，以4000转/分离心，5分钟，留取上清液，保存在-20℃的冰箱中待测。取各组小鼠血上清液100μl和标准品100μl；从已平衡至室温的密封袋中取出板条；除空白孔外，分别将样品和标准品（100μl/孔），加入相应孔中；37℃孵箱孵育90分钟；洗板4次；除空白孔外，加入生物素化抗体（100μl/孔），用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60分钟；洗板4次；除空白孔外，加入酶结合物（10μl/孔），封住板孔；37℃孵箱孵育30分钟；洗板4次；加入显色剂100μl/孔，37℃，避光显色15分钟；加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值。
3、药理实验结果
（1）显微镜下观察到的正常组，模型组，阳性对照组以及药物治疗组支气管及肺泡全图（图19～图30）及用倒置相差显微镜及照相***测得的肺内支气管厚度和气道平滑肌厚度如表1：
表1
| 分组 | 肺内支气管壁厚度（μm） | 气道平滑肌厚度（μm） |
| 正常组 | 38.71±18.02☆☆◇◇ | 13.70±6.67☆☆◇◇ |
| 模型组 | 93.52±22.99△△◇◇ | 19.18±4.34△△◇◇ |
| 阳性对照组 | 68.78±18.68△☆ | 16.45±2.98△☆ |
| 化合物1治疗组 | 81.04±15.68△☆ | 18.91±2.12△☆ |
| 化合物2治疗组 | 68.03±16.01△☆ | 16.91±3.32△☆ |
| 化合物3治疗组 | 80.05±19.76△☆ | 17.45±2.34△☆ |
| 化合物4治疗组 | 45.89±12.16△☆ | 14.89±3.61△☆ |
| 化合物5治疗组 | 42.67±11.89☆ | 14.32±4.07☆ |
| 化合物6治疗组 | 47.62±12.87△☆ | 14.67±4.54△☆ |
| 化合物7治疗组 | 51.16±13.30△☆ | 15.22±2.57△☆ |
| 化合物8治疗组 | 48.16±14.15△☆ | 14.53±2.85△☆ |
| 化合物9治疗组 | 53.88±12.39△☆ | 14.58±3.18△☆ |
注：1、与正常组比较：△ P <0.05，△△ P <0.01
2、与模型组比较：☆ P <0.05，☆☆ P <0.01
3、与阳性对照组比较：◇ P <0.05，◇◇ P <0.01
应用SPSS13.0软件进行数据处理，数值变量结果
±s表示，两组间比较采用随机分组t检验方法，多组间比较采用方差分析，以P<0.01或P <0.05为判定标准。实验表明，哮喘大鼠较正常大鼠肺内支气管壁厚度及气道平滑肌厚度明显增加，与正常组比较有显著差异（P<0.01）。化合物1治疗组～化合物9治疗组，其气管壁厚度及平滑肌厚度明显减少，与模型组有显著性（P<0.05）。
（2）血清中的IL-8的水平如表2：
表2
| 分组 | 血清IL-8水平（ng/L） |
| 正常组 | 8.23±0.72☆☆◇◇ |
| 模型组 | 50.32±0.83△△◇◇ |
| 阳性对照组 | 17.65±0.55△☆☆ |
| 化合物1治疗组 | 14.34±0.68△☆☆ |
| 化合物2治疗组 | 12.45±0.83△☆☆ |
| 化合物3治疗组 | 14.12±0.58△☆☆ |
| 化合物4治疗组 | 14.12±0.70△☆☆ |
| 化合物5治疗组 | 10.03±0.81☆☆ |
| 化合物6治疗组 | 14.28±0.57△☆☆ |
| 化合物7治疗组 | 17.31±0.71△☆ |
| 化合物8治疗组 | 18.82±0.39△☆ |
| 化合物9治疗组 | 19.98±0.64△☆ |
注：1、与正常组比较：△ P <0.05，△△ P <0.01
2、与模型组比较：☆ P <0.05，☆☆ P <0.01
3、与阳性对照组比较：◇ P <0.05，◇◇ P <0.01
应用SPSS13.0软件进行数据处理，数值变量结果±s表示，两组间比较采用随机分组t检验方法，多组间比较采用方差分析，以P<0.01或P<0.05为判定标准。实验表明，哮喘大鼠较正常大鼠血清IL-8水平明显增加，经统计学分析与正常组有显著差异（P<0.01）。化合物1治疗组～化合物9治疗组，其血清IL-8水平明显减少，与模型组有显著性（P<0.05）。
通过大鼠药理实验，合成化合物的抗哮喘活性已得到验证，但从图31中可以看出化合物的结构不同，其抗哮喘的程度也不相同。主要取决于合成化合物的电荷分布和亲脂性，1-甲基取代后化合物的亲脂性增强，而1,3-二甲基取代虽然亲脂性更强，但电荷分布与1-甲基取代不同，实验证明1-甲基取代间位硝基取代化合物的抗哮喘活性最强。
Claims (10)
1.一种8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂，其特征是，结构式如下：
其中R1,R2分别为氢、烷基、取代的烷基、烯烃中的一种或二种；R3为硝基苄基吡唑取代基。
2.根据权利要求1所述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂，其特征是，R1,R2为氢、甲基，且R1,R2相同或不同。
3.根据权利要求2所述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂，其特征是，R1,R2为相同的取代基。
4.一种8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂的合成方法，其特征是，反应式为：
将等摩尔量的硝基苄基吡唑-4-甲酸和碳二亚胺盐酸盐溶解在甲醇中，分5次加入与硝基苄基吡唑-4-甲酸等摩尔量的式2，搅拌8～16h,过滤，除去溶剂，水洗，将其溶解在甲醇和氢氧化钠溶液中，使混合溶液PH=8～12，搅拌溶解后置300～400W微波中反应10～50min，冷却至室温，以盐酸在冰浴中酸化到pH=2～5，析出8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂。
5.根据权利要求4所述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂的合成方法，其特征是，以盐酸在冰浴中酸化后的pH=3～4。
6.根据权利要求4所述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂的合成方法，其特征是，式2中R1、R2为甲基，反应式为：
将二甲基脲0.18mol、氰乙酸0.15～0.2mol，在90～110℃下于乙酸酐中搅拌1～2h,减压蒸除乙酸、乙酸酐, 剩余物加水,加活性炭脱色,过滤,冷却,以NaOH调pH=8～10, 抽滤, 得1,3-二甲基-6-氨基脲嘧啶；1,3-二甲基-6-氨基脲嘧啶溶解于醋酸溶液中，平均分5次加入与 1,3-二甲基-6-氨基脲嘧啶等摩尔量的亚硝酸钠，加完后冷却至室温，搅拌1～3h，过滤 ，得1,3-二甲基-5-亚硝基-6-氨基脲嘧啶；将1,3-二甲基-5-亚硝基-6-氨基脲嘧啶溶解在氨水中，平均分5次加入连二亚硫酸钠0.1～0.3 mol，降至室温继续搅拌10～30min，在冰浴中冷却，过滤收集沉淀，水洗得1,3-二甲基-5,6-二氨基脲嘧啶；Mp：210～214℃。
7.根据权利要求6所述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂的合成方法，其特征是，1,3-二甲基-6-氨基脲嘧啶溶解时的温度为50～75℃，然后降温至50℃。
8.根据权利要求6所述的-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂的合成方法，其特征是，减压蒸除乙酸、乙酸酐后剩余物加水时加水量为20～100mL。
9.根据权利要求4 所述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂的合成方法，其特征是，制备硝基苄基吡唑-4-甲酸的反应式为：
加入0.1mol氰乙酸乙酯、0.1～0.15mol原甲酸三乙酯、乙酸酐0.1～1g及氯化锌催化剂0.1～0.2g,搅拌，100～120℃回流1～2h，通过Claisen酯缩合，继续加热升温至130～140℃使之反应完全，并从分馏柱上口蒸出反应时生成的低沸点物；反应液经冷却析出结晶,过滤并用乙醇洗涤, 得乙氧基亚甲基氰乙酸乙酯，Mp:50～51℃；0.1mol乙氧基亚甲基氰乙酸乙酯和0.1mol水合肼在溶解在乙醇中搅拌10～14h，减压旋蒸除去乙醇，得3-氨基吡唑-4-甲酸乙酯，Mp:102℃；将3-氨基吡唑-4-甲酸乙酯溶解在冰乙酸中，搅拌下加入0.1～0.2mol的稀HCl溶液和0.1～0.3mol亚硝酸钠溶液，反应混合物在-5～0℃搅拌10～30min，加入乙醇，回流0.5～1.5h，减压旋蒸除去乙醇，残渣用水洗，过滤，用二氯甲烷提取水溶液, 用硫酸镁干燥有机相，过滤，减压浓缩得到吡唑-4-甲酸乙酯，Mp:69℃；将吡唑-4-甲酸乙酯溶解在丙酮溶液中，加入碳酸钾和0.1～0.15mol硝基苄基溴，在40～70℃，反应12～20h，过滤除去碳酸钾，加入固体氢氧化钾0.02mol，回流反应12～20h，甲醇减压蒸馏过滤，残渣溶解于水并且用乙酸乙酯洗涤，水层用盐酸酸化至析出硝基苄基吡唑-4-甲酸。
10.如权利要求1所述的8-吡唑取代黄嘌呤类A2B腺苷受体拮抗剂在治疗哮喘病的药物中应用。
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