CN102449162A

CN102449162A - 对生物功能组合物灭菌的要素和方法

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Publication number: CN102449162A
Application number: CN2010800233497A
Authority: CN
Inventors: 延斯·阿尔特里克特; A·布鲁尔; N·舒亚特; J·科特哈默
Original assignee: Leukocare AG
Current assignee: Leukocare AG
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2030-03-31
Also published as: CN102449162B; JP2012521776A; JP6412477B2; US20140134214A1; US20120093803A1; EP2414538B1; JP2016028593A; EP3128014B1; US20230225939A1; JP6250281B2; US8685459B2; WO2010112576A1; ES2770086T3; EP2236617A1; US11564865B2; EP2414538A1; EP3128014A1; DK3128014T3

Abstract

本发明中涉及但不限于一种封闭的经灭菌的容器，所述容器包含作为稳定剂的至少一种载体；和可逆地附着于该载体的至少一种生物分子，其中所述载体部分地或完全地包被所附着的生物分子，并且其中所述至少一种载体选自由如二肽或三肽等(多)肽、氨基酸、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷及其混合物组成的组。本发明还涉及本发明的经灭菌的容器的生产方法及其应用。

Description

对生物功能组合物灭菌的要素和方法

技术领域

本发明涉及但不限于一种封闭的经灭菌的容器，所述容器包含至少一种作为稳定剂的载体；和至少一种可逆地附着于该载体的生物分子，其中所述载体部分或完全包被所附着的生物分子，并且其中所述至少一种载体选自由如二肽或三肽等(多)肽、氨基酸、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷及其混合物组成的组。本发明还涉及本发明的经灭菌的容器的生产方法及其应用。

在本说明书中，引用了包含专利申请和制造商手册在内的许多文件。这些文件的公开内容应被认为与本发明的专利性无关，通过引用将其整体并入本说明书中。更具体而言，对所有参考文件通过引用并入的程度等同于具体且单独地指明各份单独文件通过引用并入。

背景技术

在治疗和预防疾病的产品的制造中，一个主要关注的问题是确保不会将微生物污染物传播至所述产品的接受者或用户。然而，这些药物产品通常源于含有如病毒等病原体的生物材料，或者其制造过程利用有被病原体污染嫌疑的试剂或培养基。

因此，国际指南(International guidelines)推荐，在药物制造过程中引入专门步骤以除去那些潜在的细菌或病毒污染物或使其失活。1996年2月14日颁布的“欧洲指导原则CPMP/BWB/268/95(European Note for Guidance CPMP/BWB/268/95)”将使病毒失活或将其除去的明显有效的方法定义为能使传染性降低约4 Log(＝4 log 10)以上的方法。

存在许多除去病毒和其他污染物或使其失活的方法，例如，环氧乙烷处理、溶剂-清洁剂(SD)处理、热或酸pH处理、色谱、纳米过滤、巴氏杀菌或辐射。

但是，所有这些方法都存在严重缺陷：

环氧乙烷处理的缺点是其经常与蛋白反应。另外，由于乙烯副产物已知的组织毒性和潜在的致癌性，只允许向生物药物添加非常少量的环氧乙烷。

WO 97/42980描述了一种利用热灭活的生物活性化合物的灭菌方法。该方法包括：获得含有足以赋予热稳定性的量的海藻糖的干燥样品，和将该干燥样品暴露于一定温度的加热条件下一定时间，令其足以使病毒基本失活。然而，所应用的时间和温度不符合灭菌的定义。灭菌被定义为除去或破坏所有形式的微生命(细菌、病毒、真菌、孢子)的经过验证的方法(WHO Aids Series No.2，第二版。“Guidelines on sterilizationand disinfection methods′effective against human immunodeficiency virus(HIV)”Geneva：World Health Organization，1989)。由于统计原因，在验证过程中完全除去不能得到证明。因此，术语“无菌保证值”(sterility assurance level，SAL)被用作无菌度的尺度。根据ISO 11139：2006(1)，无菌保证值(SAL)是灭菌后物品上存在一个活力微生物的概率。术语SAL具有通常为10^-6或10^-3的量值。当为确保无菌而应用该量值时，SAL为10^-6是较低的值，但提供了比SAL为10^-3时更高的无菌保证。SAL为10^-6意味着特定物品被污染的几率低于百万分之一(10^-6)。SAL＝10^-6是关键物品的可接受标准。为确保通过干热灭菌实现SAL＝10^-6，时间和温度都很重要。为确保SAL＝10^-6，通常可接受的是必须超过以下时间和温度组合：

-在170℃(340℉)保持60分钟

-在160℃(320℉)保持120分钟

-在150℃(300℉)保持150分钟

-在121℃(250℉)保持12小时

WO 97/42980中描述的方法不足以确保SAL＝10^-6。因此，术语“灭菌”被误用，并且该方法是“病毒减少方法”，而非灭菌方法。

US 5,730,933描述了一种利用辐射灭菌使生物功能化合物失活的方法。辐射灭菌具有高穿透能力、较低化学反应性和即时效果的优点，且无需控制温度、压力、真空度或湿度。此外，辐射灭菌广泛用于许多产品行业，其剂量水平及其生物效果是公知的。通常，＞25kGy的辐射剂量已经证明可在灭菌程序的验证过程中确保SAL＝10^-6。

US 5,730,933中公开的辐射灭菌法涉及在含有蛋白(明胶、牛血清白蛋白)和自由基清除剂的保护液中温育生物化合物，和冷冻该生物化合物。虽然冷冻生物活性化合物是US 5,730,933中所公开的方法的必要部分，但是其具有生物功能化合物的活性显著降低的缺点，在US 5,730.933中所引用的实例中，所述活性被显著降低至低于灭菌和冷冻前活性的百分之十。此外，如US 5,730.933中所使用的含有蛋白的溶液具有下述缺点：在这些溶液中温育的生物功能化合物具有被微生物污染的高风险。

产生不被污染的药物的另一种方案是药物的无菌生产。然而，该方法的主要缺点在于，整个生产过程必须在净化室中的无菌条件下进行。这很耗时并且是成本密集的。另外，通过无菌生产只能达到低安全水平。通常，无菌生产仅能确保SAL＝10^-3，意味着该工艺经过验证可确保在无菌条件下生产的特定物品受到微生物污染的可能低于千分之一。这比常规灭菌低1000倍。

因此，需要提供与制造生物药物相容的灭菌方法。

对生物功能化合物灭菌时的主要挑战在于避免灭菌过程中对活性化合物造成的不可逆变化。治疗蛋白通常具有复杂结构并且非常容易被破坏，即，对于降解(其一级结构的改变)和/或变性(其二级、三级和四级结构的改变)敏感，这使其难以经受强烈的病毒灭活或灭菌方法。

灭菌后的这些分子改变会导致这些化合物生物活性或抗原性质损失、其药物形式在存储时稳定性降低和行程新免疫原性，所述新免疫原性在反复施用或应用时会给所述产品的接受者带来过敏反应的风险。

发明内容

本发明涉及一种无菌容器，所述无菌容器包含载体、可逆地附着于所述载体的至少一种生物分子、部分或完全包被所附着的生物分子的至少一种稳定剂；和可选的盖子，其中所述至少一种稳定剂选自由(多)肽、氨基酸、糖类、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷及其混合物组成的组；还涉及如权利要求中描述了特性的其他实施方式。

另外，本发明涉及一种封闭的经灭菌的容器，所述容器包含作为稳定剂的至少一种载体；和可逆地附着于该载体的至少一种生物分子，其中所述载体部分或完全包被所附着的生物分子，并且其中所述至少一种载体选自由如二肽或三肽等(多)肽、氨基酸、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷及其混合物组成的组。

令人惊讶的是，发现通过提供在本发明容器中的生物分子，或者通过提供根据本发明的方法可生产或生产的容器中的生物分子，可实现相对于现有技术的以下优点：

即使在已知产生10^-6的SAL的标准灭菌方法之后，本发明的容器中所包含的生物分子仍将其活性保持在非常高的程度。因此，可以在灭菌之前填充和封闭包含生物分子的容器，并可以进行灭菌，优选最终或批量灭菌。(最终或批量)灭菌使得可在非无菌或半无菌条件下生产包含生物分子的容器。由于该特征，与必须在无菌条件下生产的生物分子用常规容器的生产成本相比，可以大大降低生产成本。

以此方式获得的已经灭菌(最终或批量)的经灭菌的容器含有稳定的生物功能产品，所述产品不含能够被测量到的病原体，即，不含或基本不含可存活的病原体、灭活的病原体或者保持较大其活性百分比的未被检测到的量的病原体。

本发明还涉及经灭菌的容器的生产方法。

该方法包括获得在容器中的样品，所述容器含有足以赋予生物功能产品稳定性的量的稳定剂，和将该样品暴露于灭菌条件，保持足以基本对病原体、特别是细菌和病毒灭活的时间。灭菌条件包括环氧乙烷处理、热灭活、高压灭菌、等离子灭菌和优选的如β或γ辐射等辐射。

在灭菌程序中不必添加清除剂。

由于引入了稳定剂，因此大部分生物分子甚至可以在室温存储很长时间。

因为在容器中生物分子可逆附着在载体上，所以在添加适当溶剂后可实现生物分子的迅速释放。这使含有生物分子的溶液可以直接用于注射到患者体内。

具体实施方式

在第一实施方式中，本发明提供一种无菌容器，所述无菌容器包含载体、可逆地附着于所述载体的至少一种生物分子、部分或完全包被所述生物分子的至少一种稳定剂，和可选的盖子，其中所述至少一种稳定剂选自由(多)肽、氨基酸、糖类、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷及其混合物组成的组，其中优选的是稳定剂自身为载体。

本发明提供一种封闭的经灭菌的容器，所述容器包含为稳定剂的至少一种作载体；和可逆地附着于该载体的至少一种生物分子，其中所述载体部分或完全包被所附着的生物分子，并且其中所述至少一种载体选自由如二肽或三肽等(多)肽、氨基酸、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷及其混合物组成的组。

本发明上下文中的术语“容器”指所有适合生物分子用的容受器。这些容受器可以被选择为但不限于小瓶(vial)、安瓿(ampulla)、低温储器(cryocontainer)、试管(tube)、药瓶(phial)、烧瓶(flask)、瓶(bottle)和袋(bag)。

容器和盖子(当容器包含盖子时)可以由分开的元件形成(例如，带有橡胶塞子的玻璃小瓶)，也可以作为一件制成(例如，塑料安瓿)。

与术语“生物分子”、“载体”和“稳定剂”关联的术语“至少一种”涉及存在至少一种分子，如至少一种生物分子和/或至少一种稳定剂。该术语不涉及分子的数量。

在本发明的上下文中，术语“生物分子”描述的是基本是生物来源并且具有与药物、诊断和科学应用相关的特征的任何材料。生物分子是有机分子，优选通过活生物体产生的有机分子，包括优选生物可降解的聚合分子，如(多)肽或肽、糖类、脂质和脂肪酸和核酸，以及小分子，如初级代谢物、次级代谢物，和天然产物。其他优选生物分子是上述分子的组合，例如糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂、核酸-蛋白复合物。术语“生物分子”不仅包含可从天然来源中分离的固有分子，还包含天然生物分子或其生物活性片段(的衍生物)，以及人造、重组或(半)合成分子，即，天然分子或合成、半合成或重组产生的人造分子。人造分子例如为引入了变化的衍生自天然分子的那些分子。除属于上述种类的那些分子之外的生物可降解性聚合分子有木质素和多羟基脂肪酸酯(天然聚合物)和聚亚环烷基酯、聚乳酸及其共聚物、聚酰胺酯、聚乙烯酯、聚乙烯醇和聚酐(人造聚合物)。所有上述分子或分子种类都在术语“生物分子”范围内。

对于本领域技术人员而言可以理解的是，本发明中所使用的术语“生物分子”也包括包含在如真核或原核细胞、组织、病毒及其片段(例如细胞器、膜或衣壳)等结构之中或之上的如上所述的生物分子。本发明的术语“生物分子”也包括包含在干细胞或肿瘤细胞之中或之上的生物分子及其片段。在本发明的该实施方式中，生物分子可以以分离的形式或者以包含在所述真核或原核细胞、组织、病毒或其片段之中或之上的形式附着于固体载体。作为另外一种选择，包含生物分子(优选在其表面上包含生物分子)的结构可以充当本发明的载体。

优选的生物分子发挥与药物、诊断或科学应用有关的性质。换言之，适用于本发明的生物分子优选发挥的生物活性使它们可用作和适合用作药物活性剂、诊断试剂和/或研究工具。

此处所使用的术语“(多)肽”描述的是一组分子，其包含一组肽，以及一组多肽，后一个术语可与术语“蛋白”互换使用。所述一组肽由至多30个氨基酸的分子构成，所述一组多肽由超过30个氨基酸的分子构成。根据本发明，术语“肽”也描述了长度为30个氨基酸以下的蛋白的片段。多肽或肽还可以形成二聚体、三聚体和更高级的低聚物，即由超过一个多肽或肽分子构成。形成这种二聚体、三聚体等的多肽或肽分子可以是相同的，也可以是不同的。相应的更高级结构因此而称作同质或异质二聚体、同质或异质三聚体等。术语“多肽”、“蛋白”和“肽”也指天然修饰的多肽/蛋白和肽，其中所述修饰例如通过糖基化、乙酰化和磷酸化等进行。所述修饰在本领域中是公知的。特别优选的(多)肽是抗体或其保留其结合特异性的片段、酶、受体、膜蛋白、转运蛋白、凝血因子、激素、细胞因子或其功能片段。

优选的落在术语“肽”范围内的稳定剂为二肽和三肽。因此，可以是载体的至少一种稳定剂优选为至少一种二肽和/或三肽。更优选的是，稳定剂包含至少两种(对应于至少两种稳定剂，或者在稳定剂为载体的情况下对应于至少两种载体；可以根据以下数字转变)、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种不同二肽和/或三肽。示例性二肽为甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln，与单独的谷氨酰胺相比显示了增强的稳定性)、甘氨酰酪氨酸(Gly-Tyr)、丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln，后二者与单独的酪氨酸相比显示了增强的水溶性)和双甘氨肽。其他天然二肽为肌肽((β-丙氨酰-L-组氨酸)、鹅肌肽(β-丙氨酰-N-甲基组氨酸)、高鹅肌肽(N-(4-氨基丁酰)-L-组氨酸)、京都酚(L-酪氨酰-L-精氨酸)、鲸肌肽(Balenine)(或蛇肉肽)(β-丙氨酰-N τ-甲基组氨酸)、格里肽(Glorin)(N-丙酰-γ-L-谷酰基-L-鸟氨酸-δ-lac乙酯)和巴蒂肽(Barettin)(环-[(6-溴-8-en-色氨酸)-精氨酸])。其他人造二肽为阿斯巴甜(N-L-a-天冬氨酰-L-苯丙氨酸1-甲酯)和伪脯氨酸。示例性三肽为谷胱甘肽(γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸)及其类似物眼晶体酸(L-γ-谷氨酰-L-α-氨基丁酰-甘氨酸)和正眼酸(y-谷氨酰-丙氨酰-甘氨酸)。其他三肽为异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(IPP)、甘脯谷肽(Glypromate)(甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸)、促甲状腺素释放激素(TRH、促甲状腺素释放素或普罗瑞林)(L-焦谷氨酰-L-组氨酸基-L-脯氨酰胺)、促黑激素抑制素(脯氨酰-亮氨酰-甘氨酰胺)、亮抑蛋白酶肽(N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰胺)和爱森肽(pGlu-Gln-Ala-OH)。优选的是，用作稳定剂的至少一种三肽、更优选的是所有三肽在联系本发明的医疗应用(参见下文)而使用时不发挥任何药理性质。本发明的该优选实施方式的组合物优选不含有蛋白或非氨基酸、二肽或三肽的蛋白的片段。因此，在本发明的该优选实施方式中，组合物不含有蛋白或其由超过三种氨基酸构成的片段。相反，该实施方式的组合物优选还包含至少一种氨基酸、优选至少两种、更优选至少三种、进而更优选至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种以上不同氨基酸，如至少十一种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种或至少20种不同氨基酸。

根据本发明，术语“核酸”或“核酸分子”包括如cDNA或基因组DNA等DNA，和如反义RNA或siRNA等RNA。还包含的是本领域已知的核酸模拟分子，如DNA或RNA的合成或半合成衍生物和混合的聚合物。所述核酸模拟分子或核酸衍生物包含硫代膦酸酯核酸(phosphorothioate nucleic acid)、氨基磷酸酯核酸(phosphoramidatenucleic acid)、2’-O-甲氧基乙基核糖核酸、吗啉代核酸、己糖醇核酸(HNA)、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)(参见Braasch和Corey，Chem Biol 2001，8：1)。LNA是其中核糖环受到2’-氧和4’-碳之间的亚甲基键的约束的RNA衍生物。如本领域技术人员很容易理解的那样，核酸分子可以含有另外的非天然或衍生的核苷酸碱基。核酸分子还包括核酶、适体、质粒和染色体。本发明的核酸分子可以以分离的形式或者以与其他生物分子(如蛋白等，例如组蛋白或核糖体的蛋白)复合的形式使用。

术语“糖类”是指作为具有多羟基的醛或酮的有机化合物，通常在每个不作为醛或酮官能团的一部分的碳原子上附加有一个羟基。根据分子的长度，糖类被称为单糖、寡糖或多糖。糖类一旦与非糖类分子结合，所获得的分子即被称作糖苷。经修饰的糖类具有例如N-乙酰酯、羧基或硫酸酯测量，并可含有葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖胺、葡萄糖胺。

示例性糖类为支链淀粉、糖原、淀粉、α-和β-葡聚糖、右旋糖苷和糖胺聚糖，如透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素及其衍生物如糖苷。

特别优选的蛋白是抗体或其保留有结合特异性的片段。适用于本发明的抗体可以是例如多克隆抗体或单克隆抗体。术语“抗体”也包含依然保留有其结合特异性的抗体的衍生物。抗体的片段包含但不限于Fab片段、F(ab′)₂或Fv片段。生产抗体及其片段的技术在本领域中是公知的，并描述于例如Harlow和Lane的“Antibodies，ALaboratory Manual”(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)和Harlow和Lane的“Using Antibodies：A Laboratory Manual”(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1998)中。这些抗体例如可以用于所关注的分子的免疫沉淀反应或者用于从患者体液中除去不想要的分子。

术语“抗体”也包括如合成的、嵌合的、单链的(例如scFV)和人源化的抗体或其仍保留有其结合特异性的衍生物或片段等实施方式。可以使用本领域中已知的各种程序来生产所述抗体和/或片段。此外，为生产单链抗体而描述的技术适于生产特异性地结合于所关注的分子或其片段的单链抗体。此外，可使用转基因动物表达人源化抗体。最优选的是，抗体是单克隆抗体。对于单克隆抗体的制备，可以使用任何提供通过连续细胞系温育产生的抗体的方法。这种技术的实例包括杂交瘤技术(和MilsteinNature 256(1975)，495-497)、三源杂交瘤技术、人类B-细胞杂交瘤技术(Kozbor，Immunology Today 4(1983)，72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)，77-96)来产生人类单克隆抗体。可以使用如BIAcore***中所采用的表面等离子体共振来提高与所关注的生物分子的表位结合的噬菌体抗体的功效(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。根据本发明的上下文，术语“抗体”还包含可以在细胞中表达的抗体构建体，例如可通过例如病毒或质粒载体转染和/或转导的抗体构建体。一旦获得抗体或其片段，抗体自身或为其编码的DNA可以进行测序以提供用于小或大规模地重组产生抗体或其片段的信息。生产重组抗体的方法是本领域技术人员所知道的。

如本领域中所公知的，抗体或其衍生物或片段还可以化学修饰。

抗体可以是任何种类的抗体。最优选的是，抗体是单克隆抗体，并属于IgG、IgM或IgY类。IgY抗体表示IgG抗体在鸡中的类似物。

稳定剂选自由如二肽或三肽等(多)肽、氨基酸、糖类、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷或其混合物组成的组。对于作为载体的稳定剂而言情况亦如此，以下所列实例也适用于作为载体的稳定剂。

优选的是，稳定剂选自白蛋白(例如，人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、乳白蛋白)、Hsp100/Clp家族、Hsp90家族、Hsp70家族、Hsp60/GroEL家族的热休克蛋白，和小热休克蛋白(sHsps)，一般分子伴侣：BiP、GRP94、GRP170，凝集素分子伴侣：钙连蛋白(calnexin)和钙网蛋白(calreticulin)，非经典分子伴侣如HSP47和ERp29，折叠分子伴侣如蛋白二硫化物异构酶(PDI)、肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶(PPI)或ERp57。

稳定剂也可以是或者含有单糖、寡糖和多糖、优选羟乙基淀粉(HES)、糖原、淀粉酶、葡聚糖、糊精或安茴酰牛扁碱(inuline)、木糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、岩藻糖、甘油醛、二羟基丙酮、乳糖、乳果糖、海藻糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇、肌醇，上述稳定剂可带或可不带氨基、N-乙酰、羟基乙基、硫酸酯修饰。稳定剂也可以包含分子伴侣或酪蛋白。分子伴侣是辅助非共价折叠/解折叠和其他大分子结构组装/解体的蛋白，但是当后者在进行其正常生物功能时不出现在这些结构中。

此外，稳定剂也可以是或者含有离子液体或相容性溶质。离子液体是其中离子配位很差导致这些溶剂是液体的盐。离子液体建议适于保护由其涂布的物质，使其免受潜在有害的材料的影响或辐射。在本发明的上下文中，离子液体被认为可保护生物分子，使其在灭菌时免于分解。相容性溶质为两性、结合水的有机分子，其特征在于具有被蛋白表面排斥的性质。

稳定剂可以是或含有皂苷。皂苷是一类形成次级代谢物的化合物，其见于天然来源、衍生自天然来源或可化学合成。皂苷在各种植物物种中特别丰富。皂苷是两性苷，其可根据在水性溶液中震荡时产生的皂类泡沫按现象分类，也可以根据其与亲脂性三萜烯衍生物结合的一个以上亲水苷部分的组成按结构分类。皂苷的实例为甘草酸、甘草次酸、葡萄糖醛酸、七叶树皂角素、常春藤苷和毛地黄皂苷。优选的是，用作稳定剂的皂苷在联系本发明的医疗应用(参见下文)而使用时不发挥任何药理性质。

优选的是，皂苷为甘草酸(glycyrrhicic acid)(亦作：glycyrrhizic acid)或其衍生物，并且相容性溶质为依克多因(ectoin，(S)-2-甲基-1，4，5，6-四氢甲基嘧啶-4-羧酸)或羟基依克多因。

甘草酸的衍生物是本领域公知的，包括通过甘草酸在羧基和羟基上的转化、通过将氨基酸残基缀合至糖类部分中或者将2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺引入甘草酸的苷链中而产生的那些衍生物。其他衍生物为甘草酸的酰胺、甘草酸与两个氨基酸残基以及一个游离的30-COOH官能团的缀合物和至少一个氨基酸烷基酯在甘草酸分子的糖类部分中的缀合物。具体衍生物的实例可见于例如Kondratenko等的文献(RussianJournal of Bioorganic Chemistry，Vol 30(2)，(2004)，pp.148-153)。

在优选实施方式中，缓冲液中包含所述至少一种稳定剂和/或至少一种生物分子。除其他因素之外，所使用的缓冲剂取决于拟包被/包埋的生物分子。通常适于与生物分子接触的缓冲剂例如为磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、乳酸盐、铵、甘氨酸、巴比妥酸盐、HEPES、MOPS、MES、TRIS。适于抗体的示例性缓冲剂将在下文中进一步描述。

在另一优选实施方式中，所述至少一种稳定剂或稳定组合物包含至少两种不同氨基酸的氨基酸混合物。在本发明的更优选实施方式中，至少一种稳定剂或稳定组合物包含2～18种不同氨基酸、更优选2～10种、进而更优选2～8种并且最优选2～5种或5～8种不同氨基酸。作为另外一种选择，至少一种稳定剂或稳定组合物包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种以上不同氨基酸，如至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种或至少20种不同氨基酸。包含在至少一种稳定剂或稳定组合物中的不同种氨基酸的数量优选不超过18。

形成稳定剂或包含在稳定组合物中的氨基酸可以选自天然氨基酸和人工氨基酸或其衍生物。天然氨基酸是例如20种成蛋白氨基酸甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸(根据本发明，所述术语也包括“天冬氨酸”和“谷氨酸”的盐)、谷氨酰胺、半胱氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苏氨酸和色氨酸。其他天然氨基酸是例如肉碱、鸟氨酸、羟脯氨酸、高半胱氨酸、瓜氨酸、羟赖氨酸或β-丙氨酸。

氨基酸衍生物为例如n-乙酰基-色氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基苏氨酸、膦酰基酪氨酸、麦拉宁(melanin)、精氨琥珀酸及其盐或DOPA。人工氨基酸是具有不同侧链长度和/或侧链结构和/或在不同于α-C原子的位置具有氨基的氨基酸。

如果至少一种稳定剂或稳定组合物包含半胱氨酸，则优选的是，在至少两种氨基酸的混合物中含有低于1干重％、优选低于0.5干重％的半胱氨酸。这也适用于包含至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种至少9种或至少10种以上氨基酸，如至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种或至少20种氨基酸的组合物。

由于半胱氨酸中包含SH基团，因此包含半胱氨酸的组合物可以在例如SH基团处发生氧化，引起令人不愉快的气味和/或可能使组合物颜色改变为棕色暗影。为最小化这些不合需要的效果，特别是在将组合物结合医疗器材使用时，应该使组合物中包含的半胱氨酸的量如上所述地降低。然而，即使这些效果不合需要，它们也不会影响包含较高百分比半胱氨酸(相反其导致棕色或发出令人不愉快的气味)的本发明的组合物的适合性。

在更优选实施方式中，至少一种稳定剂或稳定组合物包含如上所述的至少两种不同氨基酸的氨基酸混合物和优选为甘草酸的皂苷。在该实施方式中，稳定剂或稳定组合物优选不包含蛋白或非氨基酸、二肽和/或三肽的蛋白的片段。因此，在本发明的该优选实施方式中，组合物不含有蛋白或由超过三种氨基酸构成的蛋白片段，也不含有人或动物源的水解蛋白。所述组合物具有下述优点，即，不存在污染包埋于其中的生物分子的风险。其还是已知稳定组合物的具有成本效益的替代品。

在另一个更优选的实施方式中，皂苷包含在至少一种稳定剂或包含任意数量不同氨基酸的稳定组合物中(所述氨基酸包含在上述最低数量的氨基酸名单中)，例如所述组合物中包含至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种以上不同氨基酸，例如至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种或至少20种不同氨基酸。

特别优选的是包含以下各组中的至少一种氨基酸的组合物：(a)具有非极性脂肪族R基团的氨基酸；和(b)具有极性不带电荷的R基团的氨基酸；和(c)具有带正电荷的R基团的氨基酸；和(d)具有带负电荷的R基团的氨基酸；和(e)具有芳香性R基团的氨基酸。

天然氨基酸可以归类于上述特征组中(Nelson D.L.& Cox M.M.，′LehningerBiochemie′(2005)，pp.122-127)，其中从每组中选择至少一种氨基酸用于本发明的组合物。天然氨基酸以外的其他氨基酸，如人造氨基酸等，也可以进行相应分类。尽管本发明的组合物中可以包含上述每组中的超过一种氨基酸，如至少两种或至少三种氨基酸，但是目前优选的是从每组中只选择一种氨基酸。本领域技术人员还会理解，根据本发明使用的组合物中存在的每组的氨基酸数量不必相同。相反，可以选择氨基酸的任何组合，只要每组中的至少一种氨基酸存在即可。

特别优选的是下述稳定组合物，其中包含在组合物中的氨基酸为丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸和色氨酸。另一种特别优选的稳定组合物包含天冬氨酸盐、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸。

也特别优选的是下述至少一种稳定剂或稳定组合物，其中包含在组合物中的氨基酸是或者选自精氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和色氨酸。该组合物对于其灭菌后、特别是辐射后的性质已经显示了特别的优点。所述氨基酸组合显示了未发出任何令人不愉快的气味或在辐射后变色。然而，即使这些效果并非所需要的，它们也不会影响包含较高百分比半胱氨酸(相反其导致棕色或发出令人不愉快的气味)的本发明的组合物的适合性。

生物分子可逆地附着于载体。可与术语“固定化”或“固定”互换使用的术语“附着”涉及生物分子在载体上的固着。

术语“可逆地附着”限定了当生物分子附着于载体时可以通过适当要素从所述载体上释放下来。根据附着的种类(例如附着是否为共价或非共价)，可以采用不同的释放生物分子的要素。实例是通过蛋白酶切割、pH变化或温度变化。生物分子附着于载体，直至到了需要的时候并且只有在那时才从载体上释放下来。

上述技术只是将生物分子可逆地附着在固体载体上的实例。但是，应当强调的是，本发明并不限于这些实例。相反，可以采用适于将生物分子可逆地附着在载体上的现有技术中已知的任何常用方法。

选择生物分子的可逆附着，从而使生物分子能够从载体上迅速释放下来。关于这一点，术语“迅速”是指超过50％、如60％、70％或80％的所述生物分子可以在2小时以内、如在1小时、30分钟或20分钟释放，其可以为任意组合，如60％在30分钟或20分钟释放、70％在30分钟或20分钟释放或者80％在30分钟或20分钟释放、优选超过85％在10分钟以内释放、最优选超过98％在1分钟内释放。这可以通过例如应用下述方法之一来实现。所述迅速释放使得本发明的容器适于医疗或临床应用(见下文)。此外，选择生物分子的可逆附着，优选使在临床应用之前立时释放生物分子。

可逆附着可以是共价的或非共价的。

优选的是，非共价键是具有高亲合力和特异性的非共价键。所述非共价键的实例是链亲和素-生物素或抗生物素蛋白-生物素***形成的那些非共价键。在此实例中，链亲和素/抗生物素蛋白共价偶联于适当的载体。然后生物素化的生物分子非共价但具有高亲合力地结合于链亲和素/抗生物素蛋白。通过添加过量的生物素，结合得到竞争性的抑制，并且生物素化的生物分子得到释放。

生物分子可以通过连接体、优选可切割的连接体而连接。适当的连接体可以选自但不限于

a)具有二硫桥的连接体如SDAD(NHS-SS-双吖丙啶)、SulfoSAND、DSP，其可以通过添加具有-SH基团的试剂如硫醇(thiols，mercaptanes)、半胱氨酸、巯基乙醇或二硫苏糖醇而被轻易切割，

b)具有肽键的连接体，其可使用特定蛋白酶、优选人的酶切割，

c)可以通过超声切割的连接体，

d)具有酯键的连接体，如EGS，可由例如羟胺切割，

e)具有砜的连接体，如BSOCOES，可在ph较高(例如pH 11.6)时被切割，

f)具有顺式二醇的连接体，如DST，可由偏高碘酸钠切割。

作为另外一种选择，生物分子可以通过干燥而可逆地附着，在下文中将结合本发明的方法对其进行详细描述。在该实施方式中，可逆附着以下述方式实现：生物分子和用作稳定剂的分子和固体载体在干燥后粘附在一起。当载体为稳定剂时，生物分子和用作稳定剂的分子粘附在一起。生物分子的释放于对上述化合物添加液体时发生，由此将生物分子和稳定分子溶解/溶液化下来。

载体可以是二维或三维的。载体可以是平面、球状、珠状的，可以是筛网、网或纤维网。

在一个优选实施方式中，载体包含在容器中或形成容器的一部分。用于该实施方式的可用的容器是玻璃或塑料小瓶。容器表面可以表现出用于该目的的特定结构，以增大表面，例如针状微结构。

在另一个优选实施方式中，当载体不是稳定剂时，载体是固体、优选是多孔的(例如，泡沫或海绵)容器。适当的载体材料选自由玻璃、医用级不锈钢、金属合金(例如铬钴钼、氮氧化钛)、羟基磷灰石、聚硅氧烷、聚苯乙烯、聚-L-乳酸；聚氨酯、聚酯、聚砜、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸(polyacryl)、聚丙烯腈、聚酰胺、PMMA、毛织填塞物(fleece wadding)、开孔泡沫塑料或玻璃和网状塑料或玻璃和衍生自于海绵(海绵动物)的结构或(烧结的)陶瓷组成的组。

其他优选固体载体是筛网、纤维网或烧结材料。

在另一个优选实施方式中，载体是珠。珠可以通过过滤而与生物分子分离，或者，如果使用的是如Dynabeads

或MACS

-beads等磁性珠，可以通过磁铁而将其与生物分子分离。另外，可以使用能够作为生物分子-珠复合物注入患者体内的纳米珠。

在另一个优选实施方式中，载体是半固体。半固体载体的材料可以例如选自能够膨胀的凝胶，如水凝胶(例如PolyHema)或凝胶状蛋白混合物(例如Matrigel)。在一个不同的优选实施方式中，载体是可增溶的。可增溶的载体可以选自可溶聚合物，例如多糖、多肽或聚乙二醇。其他可增溶的载体包括晶体或离子液体。通常，本发明的作为稳定剂的载体是可增溶的。

在更优选的实施方式中，可增溶的载体包含优选的是在水性、可选缓冲的溶液中溶解的蛋白结构和/或糖类结构。

在优选的实施方式中，容器内部基本不含大气氧气。在该实施方式中，术语“基本不含”指与空气中的大气氧气相比，本发明的容器中的大气氧气的含量非常低。因此，“基本不含大气氧气”表示容器内的大气氧气的含量低于10％，优选低于5％，更优选低于2％，进而更优选低于1％，最优选为0％～1％。

在另一个优选的实施方式中，容器内部基本不含液体，优选基本不含水。在该实施方式中，术语“基本不含”指与容器的生物分子和稳定剂的总量或者无水内容物相比，本发明的容器中液体、优选水的含量非常低。因此，“基本不含液体”表示容器内的液体的含量低于10％，优选低于5％，更优选低于2％，如低于1％、0.5％或0.2％。

以上两个实施方式通过优化容器内的环境条件使附着于稳定剂/载体并且进行灭菌的生物分子的稳定性得到进一步提高。例如，通过从容器中除去液体，灭菌较不易于破坏附着于容器内的载体/稳定剂的生物分子，这是因为在对如水等液体施加辐射时会释放较少的反应性氧物种。

在替代性优选实施方式中，容器可通过或通过下述本发明的方法生产。

在另一个实施方式中，本发明涉及生物分子用容器的生产方法，所述方法包括：(a)将载体***容器中；(b)将至少一种生物分子可逆地附着于所述载体；(c)在含有至少一种稳定剂的溶液中温育可逆地附着有生物分子的载体使得所述至少一种生物分子部分或完全由所述至少一种稳定剂包被，所述至少一种稳定剂选自如二肽或三肽等(多)肽、氨基酸、糖类、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷或其混合物；(d)密封容器；和(e)对容器灭菌。

对于载体为稳定剂的情况，本发明涉及生物分子用经灭菌的容器的生产方法，所述方法包括：(a)将至少一种载体***容器中，所述至少一种载体是选自如二肽或三肽等(多)肽、氨基酸、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷或其混合物的稳定剂；(b)将至少一种生物分子可逆地附着于所述载体，使得所述至少一种生物分子部分或完全由所述至少一种载体包被；(c)密封容器；和(d)对容器灭菌。

本发明还涉及生物分子用容器的生产方法，所述方法包括：(a)将至少一种生物分子可逆地附着于载体，(b)将附着有至少一种生物分子的该载体***容器中，(c)在含有至少一种稳定剂的溶液中温育可逆地附着有至少一种生物分子的所述载体，以使该至少一种生物分子部分或完全由所述至少一种稳定剂包被，所述至少一种稳定剂选自如二肽或三肽等(多)肽、氨基酸、糖类、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷或其混合物，(d)密封该容器；和(e)对该容器灭菌。

在又一个实施方式中，本发明涉及生物分子用容器的生产方法，所述方法包括：(a)将至少一种生物分子可逆地附着于载体，(b)在含有至少一种稳定剂的溶液中温育可逆地附着有至少一种生物分子的载体，以使该至少一种生物分子部分或完全由所述至少一种稳定剂包被，所述至少一种稳定剂选自如二肽或三肽等(多)肽、氨基酸、糖类、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷或其混合物，(c)将可逆地附着有至少一种生物分子的该载体***容器中，(d)密封该容器；和(e)对该容器灭菌。

对于载体为稳定剂的情况，本发明涉及生物分子用经灭菌的容器的生产方法，所述方法包括：(a)将至少一种生物分子可逆地附着于选自如二肽或三肽等(多)肽、氨基酸、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷或其混合物的作为稳定剂的载体，以使至少一种生物分子部分或完全由所述至少一种稳定剂包被，(b)将附着有至少一种生物分子的该载体***容器中，(c)密封该容器；和(d)对该容器灭菌。

在另一个实施方式中，本发明提供生物分子用最终无菌容器的生产方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将生物分子可逆地附着于载体，

(b)将附着有生物分子的载体***容器中，

(c)在包含一种或多种稳定剂的组合物中温育载体，以使生物分子部分或完全由所述一种或多种稳定剂包被，所述稳定剂选自

(多)肽、氨基酸、淀粉、糖、磷酸酯(盐)、多元醇、聚乙二醇或其混合物，

(d)封闭容器，

(e)对容器最终灭菌。

步骤(a)、(b)和(c)可以以不同顺序进行：(a)、(b)和(c)可以依次进行。作为另外一种选择，步骤(b)可以在步骤(a)之前进行，然后再进行步骤(c)。在第三种替代性方式中，顺序为首先是(b)，然后(c)，再然后是(a)。

如果适用，对于本发明的容器和关于所述容器的上述优选实施方式所给出的定义经必要变更可适用于本发明的上述方法，特别是关于下述方面适用：载体和/或稳定剂或稳定剂组合物的性质和/或组成、生物分子和关于稳定剂和/或载体和/或生物分子的附着或释放的方法。这特别包括涉及作为氨基酸混合物的稳定剂的优选实施方式和如皂苷等优选附加成分及其特别优选的实施方式。

在适用于本发明的方法的另一种替代性方式中，生物分子对载体的可逆附着和/或在包含至少一种稳定剂的溶液中的温育以批量生产的方式完成，所述批量生产在将经涂布的载体***容器之前包括切割步骤。批量生产的方法对于本领域技术人员是公知的。

附着有生物分子的载体的***可以手动或自动进行。

容器的密封可以例如通过应用盖子(例如，橡皮塞)来进行，或者在采用仅由一块材料形成的玻璃或塑料容器时通过将开口熔融来进行。

本发明的该方法及由其生产的载体的主要优点在于，可以对包含生物分子的容器进行(最终或批量)灭菌。本发明上下文中的术语“最终灭菌”是指灭菌在生产过程的最后进行，即在生物分子和稳定剂已经附着于载体并且已将所述载体***容器中之后进行。适当的灭菌方法包括但不限于环氧乙烷(EO)处理、(干)热或酸pH处理、溶剂-清洁剂(SD)处理、X射线、高压或等离子体灭菌。特别优选的是辐射，最优选的是β或γ辐射。

因此，(最终或批量)灭菌使得可在非无菌或半无菌条件下生产包含生物分子的容器。由于该特征，与必须在完全无菌条件(即，无菌条件)下生产的生物分子用常规容器的生产成本相比，可以大大降低生产成本。

然而，灭菌不必一定在最后进行，而是可以在添加至少一种稳定剂之后的另一时间来完成。本发明的灭菌方法的另一优点在于，生物材料的灭菌不需要冷冻。这是非常有利的，因为与例如US 5,730,933等现有技术的已知方法相比，所要灭菌的生物材料的生物功能会因此有很大增强。

在更优选的实施方式中，至少一种稳定剂包含皂苷或者是皂苷，优选甘草酸或其衍生物。适当的衍生物已在上文进行了定义。

在另一个优选实施方式中，本发明的方法还包括干燥生物分子的步骤。该步骤优选在温育可逆地附着有至少一种生物分子的载体之后进行，或者在载体为稳定剂的情况下于在包含如上所述的至少一种稳定剂的溶液中将至少一种生物分子可逆地附着于所述载体之后进行。当生物分子与用作稳定剂的分子(即，氨基酸，其可选地与皂苷联合和/或可选地与至少一个如所描述的二和/或三肽联合)干燥后粘附在一起从而实现可逆附着时，可逆附着的步骤包括将载体与生物分子一起干燥。对应于可逆性附着的生物分子的释放在对粘附在一起的以上化合物添加液体时发生，由此将生物分子和稳定分子从载体上溶解/溶液化下来。优选的是，干燥生物分子，直至残留液体含量低于最初应用的组合物的10％、优选低于5％、更优选低于2％，如低于1％、0.5％或0.2％。优选的干燥方法包括但不限于用于除去稳定组合物的方法，如空气干燥、喷雾干燥、冷冻干燥和沉淀。其他适合的技术包括晶化和微晶化。

本发明的方法可以还包括步骤(f)，即，从载体上洗脱生物分子。所应用的洗脱方法取决于所使用的载体，并可以包括但不限于具有高盐浓度的溶液、含生物素溶液或者含有蛋白酶或含SH物质的溶液。

在另一个实施方式中，本发明包括容器，其中应用了使生物分子优选以所附着的生物分子的50％以上、如以60％、70％或80％在2小时以下、如1小时、30分钟或20分钟的比率从载体上脱附的溶液，脱附可以采用任意组合，如60％在30分钟或20分钟内、70％在30分钟或20分钟内或者80％在30分钟或20分钟内、更优选的是超过85％在10分钟内、最优选的是超过98％在1分钟内脱附。生物分子从载体上的脱附可以例如通过切割非共价键和/或共价键而实现，所述切割由所述溶液的高或低离子强度、pH改变和/或所述溶液中存在含巯基物质、羟胺、高碘酸盐(酯)、蛋白酶引起。

在另一个实施方式中，生物分子通过超声或辐射、优选通过红外、可见或紫外光的帮助从载体上脱附。

本发明的方法的另一个优点在于，通过所述方法生产的包含生物分子的容器适于长期存储。向医疗市场引入新型或修改的产品需要确保它们可以存储更长时间(一至五年)而不会在使用产品时有性能的任何显著降低，从而影响安全性和有效性。由于这种产品通常不存在整周期环境老化样品，因此通常需要进行“加速老化”试验，以在可获得整周期样品之前提供支持这些产品所要求保护的性能和储藏寿命的实验数据。

一种加速老化的简化方法是基于下述测试，先在单增加温度下测试，然后应用下述规则，所述规则表述温度每增加10℃，化学反应的速率将提高Q₁₀倍。为常用医疗聚合物选择的典型的关系是Q₁₀＝2；即，在使用或存储温度之上温度每升高10℃反应速率增加一倍。

为获得用于诊断或治疗的生物分子的足够的储藏寿命，需要将这些生物分子冷冻以防止其变性(Cleland等，(2001)，Journal of Pharmaceutical Sciences第90卷，第310-321页)。此外，所关注的生物分子必须在含有如糖(例如蔗糖、海藻糖、甘露醇)或盐等所谓冻干保护剂的稳定溶液中温育。然而，由于存在生物分子受冷冻而变性的风险，需要在4℃或室温的存储方法，对于不稳定的生物分子如IgM抗体尤其如此。

令人惊讶的是，发现通过提供由本发明的至少一种稳定剂包被(即，完全或部分地(即，优选至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、进而更优选至少80％、至少90％、至少95％，如至少98％或99％等)可逆地附着在载体之上或之中)的在本发明容器中的生物分子，所述生物分子可以在45℃存储多达7天而不显著丧失其生物活性。根据之前所述的规则，该“加速老化”相当于在5℃存储16周。

优选的存储温度为-273℃～-15℃，特别优选的是2℃～8℃和2℃～30℃的温度。

在本发明的容器或方法的优选实施方式中，至少一种稳定剂和/或至少一种生物分子包含在缓冲的优选水性的溶液中。除其他因素之外，所使用的缓冲剂取决于拟包被/包埋的生物分子。通常适于与生物分子接触的缓冲剂例如为磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、乳酸盐、铵、甘氨酸、巴比妥酸盐、HEPES、MOPS、MES、TRIS。

在本发明的容器或方法的另一优选实施方式中，所述稳定剂包含低于1％、更优选低于0.3％的吐温(tween)、优选吐温80。

吐温是用于聚山梨醇酯的通称，其为在某些药物和食品制剂中所使用的一类乳化剂和表面活性剂。它们通常用于使油性成分溶于水基产品中。聚山梨醇酯是源于被脂肪酸酯化的PEG化山梨聚糖(山梨糖醇的一种衍生物)的油性液体。聚山梨醇酯的实例为聚山梨醇酯20((吐温20或聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)、聚山梨醇酯40(吐温40或聚氧乙烯(20)山梨聚糖单棕榈酸酯)、聚山梨醇酯60(吐温60或聚氧乙烯(20)山梨聚糖单硬脂酸酯)和聚山梨醇酯80(吐温80或聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯)。吐温80在本发明所使用的组合物中是最优选的。

在本发明过程中，已经发现，添加低于1％(优选相对于生物分子和氨基酸的干重低于1％)的吐温可避免在处理本发明的液体组合物的过程中发泡。

在本发明的方法的优选实施方式中，在密封容器之前和在可逆地附着至少一种生物分子或将附着有至少一种生物分子的载体***容器之后，从容器中除去大气氧气和/或从容器中除去液体、优选水。

如以上关于本发明的容器所进行的描述，上述实施方式的特征通过优化容器内的环境条件进一步增强了附着于稳定剂/载体并进行灭菌的生物分子的稳定性。例如，通过从容器中除去液体，灭菌更不易于破坏容器内附着于载体/稳定剂的生物分子。

在一个不同的实施方式中，本发明涉包含至少一种生物分子的无菌液的生产方法，所述方法包括：(a)执行本发明的生物分子用容器的生产方法；和(b)从载体上洗脱所述至少一种生物分子；和可选的(c)在步骤(b)的同时、之前或之后应用能使结构变性的生物分子复性的复性液。作为另外一种选择，该实施方式的步骤(b)和(c)可以形成更前面所述的本发明的经灭菌的容器的生产方法的一部分。

术语“洗脱”涉及至少一种可逆附着的生物分子从载体上的释放。洗脱可以使用优选缓冲的水溶液、如缓冲或未缓冲的盐溶液等或者水在适当条件下进行，所述条件取决于附着的种类，即，是否为如上所述的共价附着或非共价附着。

洗脱速率在上文中已经进行了描述。如上所述的适当的洗脱速率使本发明的容器适于医疗应用，其中装置需要在几分钟内为准备用于医疗应用。在该实施方式中，洗脱可以通过下述方式进行：将适当的、优选水溶液注射至容器中，并将其对患者施用，以使洗脱的生物分子可以离开容器并在患者体内分散。

优选的是，复性液包含分子伴侣(例如，Hsp100/Clp家族、Hsp90家族、Hsp70家族、Hsp60/GroEL家族的热休克蛋白和小热休克蛋白(sHsps))。一般分子伴侣为例如BiP、GRP94、GRP170，凝集素分子伴侣为例如钙连蛋白和钙网蛋白，非经典分子伴侣为例如HSP47和ERp29、折叠分子伴侣为例如蛋白二硫化物异构酶(PDI)、肽酰-脯氨酰-顺-反式异构酶(PPI)、ERp57、离子液体和/或精氨酸。

在优选实施方式中，在步骤(b)和可选的(c)后，无菌溶液的生产方法还包括将所洗脱的至少一种生物分子应用于柱或过滤器。适当的柱或过滤器为例如离子交换柱，如偶联于如琼脂糖或苯乙烯等适当基体的DEAE、消胆胺、聚乙烯亚胺等，或者如Sepharose G25等尺寸排阻柱，或者填充有木炭的柱。

所述应用对应于在紧随生物分子从其载体上释放之后和/或在注入患者过程中的含有生物分子的溶液的纯化。该步骤能够除去会对所附着的生物分子造成破坏的物质，和除去可能已在灭菌工艺过程中形成的变性的生物分子。

本发明的容器可用于诊断、预防和治疗应用。因此，本发明的载体可以形成医疗或诊断装置的一部分。所述装置是包含根据本发明稳定的生物分子的生物组分和非生物部分的组合，并且也被称作生物装置组合产品。

治疗装置包括医疗植入物、导管、支架、输液管，其可单独使用或与体外循环中所使用的其他组件或医疗装置组合使用。

治疗方法在使用医疗装置情况下可以包括本发明的容器的体内和离体应用。因此，包含本发明的容器的装置可以被植入患者以进行体内应用，从而在将(体)液应用于容器中时逐渐释放生物分子。对于离体应用，包含本发明的容器的装置可以与要处理的体液的循环相连。来自患者动脉或静脉的血可以例如引导通过所述装置，并随后泵回患者体内(与血流相连)。作为另外一种选择，可以将体液的样品与载体在体外温育。在后一种处理的后续步骤中，体液可以被再次引入患者体内。所有这些应用必须将液体应用至容器中以溶解包含于其中的之后可充当例如药物的生物分子。

在整个本发明中所使用的术语“患者”包含患病对象和健康对象。本发明的患者是接受医疗关注、护理或治疗的任何人。该人经常但不始终患病或受伤，如果患病或受伤，则需要医师或其他医疗专业人员的治疗。在另一些情况中，术语“患者”可与“对象”互换使用，“对象”可以患病或不患病。对象可以是动物，优选哺乳动物，最优选人。根据上述内容，患者也可以是例如紧急或例行地诊断疾病或健康状况的健康人。

附图显示：

图1

显示的是包含可逆地附着有生物分子的载体和保护性涂层的小瓶。生物分子(例如细胞因子)被稳定剂溶液包埋，由此受保护而免受如存储过程中的脱水或灭菌过程中的辐射等逆境影响。

图2

显示的是不同的载体：

a)载体是不可溶性凝胶或可溶性凝胶

b)载体是非织造纤维网

c)载体是筛网或织网

d)保护性涂层自身是载体并包被生物分子或者小瓶自身是载体

e)载体具有开孔(像海绵)或烧结结构

f)载体包含纳米颗粒、微颗粒或大颗粒

g)小瓶自身是载体并具有增加表面的微观或宏观结构(例如针状结构)。

图3

显示的是其中小瓶自身是载体的实例。首先，通过干燥使生物分子附着于载体。然后，添加稳定剂溶液并再干燥。若不添加稳定剂，则在后续的灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为白介素8＝IL8)将失去其大部分生物功能。相反，稳定剂溶液A(白蛋白和甘露醇)和B(具有不同氨基酸的溶液)保护了生物分子。显示的是IL8对于人嗜中性粒细胞的趋化活性。

图4

显示的是其中小瓶自身是载体的实例。首先，通过干燥使生物分子附着于载体。然后，添加稳定剂溶液并再干燥。若不添加稳定剂，则在加速存储(45℃)过程中生物分子(此处为白介素8＝IL8)将失去其大部分生物功能。相反，稳定剂溶液A(白蛋白和甘露醇)和B(具有不同氨基酸的溶液)保护了生物分子。显示的是IL8对于人嗜中性粒细胞的趋化活性。

图5

显示的是其中小瓶自身是载体的实例。首先，通过干燥使生物分子附着于载体。然后，添加稳定剂溶液并再干燥。若不添加稳定剂，则在后续的灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为ds-DNA)将失去其大部分生物功能。相反，稳定剂溶液A(白蛋白和甘露醇)和B(具有不同氨基酸的溶液)保护了生物分子。显示的是以初始值的百分比表示的可检测的DNA量。

图6

显示了其中稳定剂自身是载体的实例。添加生物分子和稳定剂溶液并一起干燥。若不添加稳定剂，则在后续的灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为白介素8＝IL8)将失去其大部分生物功能。相反，稳定剂溶液A(白蛋白和甘露醇)和B(具有不同氨基酸的溶液)保护了生物分子。显示的是IL8对于人嗜中性粒细胞的趋化活性。

图7

显示了其中稳定剂自身是载体的实例。添加生物分子和稳定剂溶液并一起干燥。若不添加稳定剂，则在后续的存储和/或灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)将失去其大部分生物功能。相反，稳定剂溶液A(白蛋白和甘露醇)和B(具有不同氨基酸的溶液)保护了生物分子。显示的是与抗原的特异性结合。

图8

不同解吸液对于生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)的生物活性的影响。除0.5MH₂SO₄外，本实验中测试的其他解吸液对于生物分子的生物活性没有显著影响。显示的是与抗原的特异性结合。

图9

在将生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)附着于开孔聚氨酯泡沫(supplier A，大孔)后测试生物分子的解吸。虽然pH 4.75的柠檬酸盐缓冲剂和1M NaCl仅解吸少量生物分子，但1MNaCl+0.02M咪唑和磷酸盐缓冲盐水分别可以解吸明显更多的生物分子。显示的是与抗原的特异性结合。

图10

在将生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)附着于开孔聚氨酯泡沫(supplier B，较小孔)后测试生物分子的解吸。pH 4.75的柠檬酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲盐水解吸得比含有或不含有0.02M咪唑的1M NaCl强少许。显示的是与抗原的特异性结合。

图11

在将生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)附着于开孔聚氨酯泡沫(supplierSmith&Nephews，小孔)后测试生物分子的解吸。若不添加稳定剂，则在后续的存储和/或灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)将失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的稳定剂溶液保护了生物分子。抗体的回收几乎为100％(5μg/ml)。显示的是与抗原的特异性结合。

图12

在使生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)附着于PVA-水凝胶之后测试生物分子的解吸。若不添加稳定剂，则在后续的存储和/或灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子将失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的稳定剂溶液保护了生物分子。洗脱的抗体的回收率非常高。显示的是与抗原的特异性结合。

图13

可切割的连接体的实例的化学结构。

图14

用于保护冻干和灭菌后抗肝炎抗体的氨基酸组合物的抗甲型肝炎测试(功能ELISA)。

图15

皂苷的结构类型具有增强氨基酸组合的保护性效果的潜能。优选的是使用皂苷甘草酸。

图16

在采用50kGy β辐射时，至少3种氨基酸的组合和2种氨基酸与附加的甘草酸的组合提供了对固定化抗体的最大保护。

图17

氨基酸组合物在不同逆境条件下提供保护。对于不同剂量的β-辐射和升温下的人工老化提供了最佳保护。对于γ-辐射或环氧乙烷灭菌的保护较小，但具相关性。

图18和图19

含有至少5种氨基酸的氨基酸后涂层在长期存储过程中提供保护。对于非灭菌样品而言，在45℃持续62天后约80％抗原结合能力得到保留。灭菌样品(β，25kGy)在45℃持续62天后保留其抗原结合能力的约70％。不考虑灭菌，在存储过程中，含有仅2种氨基酸的氨基酸后涂层仅保留有约40％的抗原结合能力。无后涂层的则仅保留了20％～30％的活性。

图20和图21

向后涂布溶液添加1mM甘草酸可增强保护效果。含有至少5种氨基酸和甘草酸的氨基酸后涂层在长期存储过程中提供保护。对于非灭菌样品而言，在45℃持续62天后约90％抗原结合能力得到保留。灭菌样品(β，25kGy)在45℃持续62天后保留其抗原结合能力的约80％。不考虑灭菌，在存储过程中，含有2种氨基酸和甘草酸的氨基酸后涂层保留有约70％的抗原结合能力。无后涂层的则仅保留了20％～30％的活性。

图22

利用γ-辐射灭菌的样品在使用含有18种氨基酸的氨基酸后涂层保护时保留约85％活性；该效果不会因使用甘草酸而进一步增强；使用5种氨基酸时保留活性为75％；使用2种氨基酸时仅保留40％。通过添加甘草酸改善使用2种氨基酸的保护，此处其保留的活性为65％。当使用含有18种氨基酸的氨基酸后涂层保护时，使用ETO灭菌的样品保留约85％的活性；使用甘草酸不会进一步增强此效果。含有5或2种氨基酸的后涂层仅具有很小的保护效果；添加甘草酸可以边际性地增强保护。

图23

氨基酸、二肽或其混合物的氨基酸后涂层，可选地带有甘草酸。

以下面的实施例来说明本发明。

实施例1：对玻璃瓶中的白介素-8灭菌，瓶自身是载体。

实验：

将白介素-8(IL-8，R&D，208-IL)在PBS(不具有Ca^2+/Mg²⁺，PAA，H15-002)中稀释至10μg/ml。向玻璃瓶中添加5μl该溶液(50ng IL-8)并旋转4小时，直至干燥。添加25μl稳定溶液(A＝20g/l白蛋白(Biotest Pharma)和10g/l甘露醇(Serag Wiesner，219675)，B＝20g/l氨基酸混合物和1mM甘草酸(铵盐，Fluka，50531))并旋转/干燥过夜。

利用≥25kGy(β-辐射)对瓶灭菌。在冷藏条件下存储未灭菌的对照组。

测定：

从10％ACDA全血中分离嗜中性粒细胞。利用2ml HES(Grifols 662650)沉降20ml ACDA血(10％)。将上清液移入至7ml Percoll(L6143)中并以2000x g离心分离20分钟。将分离的粒细胞再悬浮于1％自体血清中，并将细胞计数设定为0.5x 10⁶个/ml。

将阳性对照组5μl IL-8-溶液(50ng)溶解在25μl稳定溶液(A和B)中。向各无菌瓶中添加1ml PBS(具有Ca^2+/Mg²⁺，Hyclone，SH3026401)(含有1％自体血清)以溶解干燥的膜。

为检测样品的趋化活性，将无菌和非无菌瓶中的全部IL-8溶液和对照组移入至12孔板中。***迁移过滤器(3μm，Corning，3462)，并将500μl粒细胞悬浮液移入至过滤器中。将该板在37℃温育30分钟。通过FACS和计数珠(Invitrogen，C36950)对各孔中的细胞计数，从而检测迁移的细胞数。

结果：

参见图3

若不添加稳定剂，则在后续的灭菌(≥25kGy辐射)过程中生物分子(此处为白介素8＝IL8)将失去其大部分生物功能。相反，稳定剂溶液A(白蛋白和甘露醇)和B(含有不同氨基酸的溶液)保护了生物分子。显示的是IL8对于人嗜中性粒细胞的趋化活性。

实施例2：对玻璃瓶中的白介素-8灭菌，稳定剂自身是载体。

实验：

将白介素-8(IL-8)在PBS(不具有Ca^2+/Mg²⁺，PAA，H15-002)中稀释至10μg/ml。将5μl该溶液(50ng IL-8)和25μl稳定溶液(A＝20g/l白蛋白(Biotest Pharma)和10g/l甘露醇(Serag Wiesner，219675)，B＝20g/l氨基酸混合物和1mM甘草酸(铵盐，Fluka，50531))混合并移入至玻璃瓶中。旋转/干燥该瓶过夜。

利用≥25kGy的辐射对瓶灭菌。在冷藏条件下存储未灭菌的对照组。

测定：

从10％ACDA全血中分离嗜中性粒细胞。利用2ml HES(Grifols 662650)沉降20ml ACDA血(10％)。将上清液移入至7ml Percoll(L6143)中并以2000x g离心20分钟。将分离的粒细胞再悬浮于1％自体血清中，并将细胞计数设定为0.5x 10⁶个/ml。

将阳性对照组5μl IL-8-溶液(50ng)溶解在25μl稳定溶液(A或B)中。向各无菌瓶中添加1ml PBS(具有Ca^2+/Mg²⁺，Hyclone，SH3026401)(含有1％自体血清)以溶解干燥的膜。

为检测样品的趋化活性，将无菌和非无菌瓶中的全部IL-8溶液和对照组移入至12孔板中。***迁移过滤器(3μm)，并将500μl粒细胞悬浮液移入至过滤器中。将该板在37℃温育30分钟。对各孔中的细胞计数(通过FACS和计数珠)，从而检测迁移的细胞数。

结果：

参见图6

若不添加稳定剂，则在后续的灭菌(≥25kGy辐射)过程中生物分子(此处为白介素8＝IL8)将失去其大部分生物功能。相反，稳定剂溶液A(白蛋白和甘露醇)和B(具有不同氨基酸的溶液)保护了生物分子。显示的是IL8对于人嗜中性粒细胞的趋化活性。

实施例3：对玻璃瓶中的抗小鼠IgG灭菌，稳定剂自身是载体。

实验：

将抗小鼠IgG(生物素化的，Jackson ImmunoResearch，115-065-003)在PBS(不具有Ca^2+/Mg²⁺，PAA，H15-002)中稀释至4μg/ml。将25μl(100ng)该抗体溶液和25μl2倍浓缩的稳定溶液(A＝20g/l白蛋白(BiotestPharma)和10g/l甘露醇(Serag Wiesner，219675)，B＝20g/l氨基酸混合物和1mM甘草酸(铵盐，Fluka，50531))混合并移入至玻璃瓶中。旋转/干燥该瓶过夜。

测定：

使用抗原(小鼠IgG，Innovativ Research，Ir-Ms-Gf)包覆ELISA板(Greiner Bio-one，655061)：将抗原稀释至1μg/ml，取100μl移入至各孔中并在4℃温育过夜。使用洗涤缓冲液(25x浓缩，Invitrogen，WB02)洗涤该板2次。使用白蛋白(5％)封闭该板并再洗涤3次。

向所有样品瓶中添加200μl PBS以溶解干燥的膜(理论上为5μg/ml)。使用PBS将样品稀释至10ng/ml。为计算抗体浓度，制备新鲜抗体的系列稀释液。

将样品和标准品移入至ELISA板(各自为2x 200μl)中，并在环境温度温育1小时。洗涤该板3次。向各孔中添加200μl链亲和素溶液(辣根过氧化物酶(HRP)标记，Pierce，21126，在PBS中稀释至0.1μg/ml)，并在环境温度温育1小时。洗涤该板3次。将HRP发色底物TMB(TMB＝四甲基联苯胺，Invitrogen，00-2023)在H₂O中以1∶2稀释，并向各孔中添加200μl。在环境温度避光温育该板15分钟。为停止显色反应，添加50μl稀H₂SO₄(使用蒸馏水以1∶5稀释，Merck，1007311000)。在450nm处检测板的吸收(Fusion Photometer A153601，PerkinElmer)。

结果：

参见图7

若不添加稳定剂，则在后续的存储和/或灭菌(≥25kGy辐射)过程中生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)将失去其大部分生物功能。相反，稳定剂溶液A(白蛋白和甘露醇)和B(具有不同氨基酸的溶液)保护了生物分子。显示的是与抗原的特异性结合。

实施例4：对抗小鼠IgG灭菌，载体是聚氨酯泡沫。

实验：

从微孔聚氨酯(PU)泡沫(Smith&Nephew，66012608)冲压具有规定直径(1cm)的样品。将抗小鼠IgG(生物素化的，Jackson ImmunoResearch，115-065-003)附着于样品：将抗体在PBS(不具有Ca^2+/Mg²⁺，PAA，H15-002)中或在稳定溶液(20g/l白蛋白(BiotestPharma)和10g/l甘露醇(Serag Wiesner，219675)在PBS中的溶液)中稀释至5μg/ml，并使用抗体溶液包被PU样品。将该样品在37℃温育1小时。

除去抗体溶液，并空气干燥PU样品2小时。通过β-辐射(25kGy)对样品灭菌，并在冷藏条件下存储未灭菌的对照组。

测定：

使用抗原(小鼠IgG，Innovativ Research，Ir-Ms-Gf)涂布ELISA板(Greiner Bio-one，655061)：将抗原稀释至1μg/ml，取100μl移入至各孔中并在4℃温育过夜。使用洗涤缓冲剂(25x浓缩，Invitrogen，WB02)洗涤该板2次。使用白蛋白(5％)封闭该板并再洗涤3次。

使用PBS包被PU样品并在环境温度温育1小时。收集样品溶液，并使用PBS以1∶20稀释，进而以1∶4连续稀释。为计算样品的抗体浓度，制备新鲜抗体的连续稀释液。

将样品和标准品移入至ELISA板(各自为2x 200μl)中，并在环境温度温育1小时。洗涤该板3次。向各孔中添加200μl链亲和素液(以辣根过氧化物酶(HRP)标记，Pierce，21126，在PBS中稀释至0.1μg/ml)，并在环境温度温育1小时。洗涤该板3次。将HRP发色底物TMB(TMB＝四甲基联苯胺，Invitrogen，00-2023)在H₂O中以1∶2稀释，并向各孔中添加200μl。在环境温度避光温育该板15分钟。为停止显色反应，添加50μl稀H₂SO₄(使用蒸馏水以1∶5稀释，Merck，1007311000)。在450nm处检测板的吸收(Fusion Photometer A153601，PerkinElmer)。

结果：

若不添加稳定剂，则在后续的存储和/或灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)将失去其大部分生物功能。相反，稳定剂溶液(白蛋白和甘露醇)保护生物分子。抗体的回收几乎为100％(5μg/ml)。显示的是与抗原的特异性结合。

实施例5：对抗小鼠IgG灭菌，载体是PVA水凝胶。

实验：

制备7％(m/v)的聚乙烯醇(PVA，Sigma，341584-25G)水溶液(加热至85℃)。将该溶液冷却至环境温度。将抗小鼠IgG (生物素化的，Jackson ImmunoResearch，115-065-003)在PBS中稀释至200μg/ml。

水凝胶混合物由以下物质组成：

-6.75ml PVA溶液(7％)

-4.5μl抗小鼠IgG(200μg/ml)

-2.25PBS或稳定溶液(20g/l白蛋白(Biotest Pharma)和10g/l甘露醇(SeragWiesner，219675)的PBS溶液)

将PVA水凝胶注入小型陪替氏皿(直径35mm，2ml溶液)中。将水凝胶膜空气干燥48小时。通过β-辐射(25kGy)对样品灭菌，并在冷藏条件下存储未灭菌的对照组。

测定：

使用抗原(小鼠IgG，Innovativ Research，Ir-Ms-Gf)涂布ELISA板(Greiner Bio-one，655061)：抗原被稀释至1μg/ml，将100μl移入至各孔中并在4℃温育过夜。使用洗涤缓冲剂(25x浓缩，Invitrogen，WB02)洗涤该板2次。使用白蛋白(5％)封闭该板并再洗涤3次。

将PVA水凝胶置入6孔板中并使用2ml PBS(不具有Ca^2+/Mg²⁺，PAA，H15-002)包被。30分钟、1小时和2小时后收集PBS并使用新鲜PBS置换。

将样品的系列稀释液和标准品移入至ELISA板(各自为2x 200μl)中，并在环境温度温育1小时。洗涤该板3次。向各孔中添加200μl链亲和素液(辣根过氧化物酶(HRP)标记，Pierce，21126，在PBS中稀释至0.1μg/ml)，并在环境温度温育1小时。洗涤该板3次。将HRP发色底物TMB(TMB＝四甲基联苯胺，Invitrogen，00-2023)在H₂O中以1∶2稀释，并向各孔中添加200μl。在环境温度避光温育该板15分钟。为停止显色反应，添加50μl稀H₂SO₄(使用蒸馏水以1∶5稀释，Merck，1007311000)。在450nm处检测板的吸收(Fusion Photometer A153601，PerkinElmer)。

结果：

若不添加稳定剂，则在后续的存储和/或灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)将失去其大部分生物功能。相反，稳定剂溶液(白蛋白和甘露醇)保护生物分子。洗脱的抗体的回收率非常高。显示的是与抗原的特异性结合。

实施例6：特定氨基酸组合物的保护效果。

将20mg人抗甲型肝炎抗体(Beriglobin(人IgG，AK)，CSL Behring)和40mg保护组合物溶在水中，使每个样品的总体积为525μl并将其冻干。然后，将样品溶解在1ml水中，并使用HAV(甲型肝炎病毒)IgGELISA测试功能。

组成：

20g精氨酸

20g组氨酸

20g赖氨酸

3g谷氨酸

2g色氨酸

20g甘氨酸

15g丙氨酸

0.2g吐温80

1g甘草酸铵盐

使用NaOH和/或NaCl将pH调节至约7.2。然后，将该溶液进行无菌过滤。

将400μl溶液(对应于40mg固体化合物)与125μl Beriglobin(对应于20mg抗体)混合。

冻干：

冻干如下进行：

初始冷冻温度为-40℃；

冷冻3小时后初始真空度为0.1mBar；

以约1.5℃/小时的速度升温23小时；

在6℃和0.004mBar下过夜干燥6小时。

灭菌：

利用25kGy对冻干样品辐射，一份样品用50kGy β-辐射。

结果：

HAV-ELISA的结果如图14所示。

干燥并灭菌后，获得白色、无味、固有稳定性的饼状物。向每种样品中添加1ml水并监视溶解行为。溶解在少于30秒内发生，并且不存在聚集物。甚至24小时后，也未检测到肉眼可见的或用显微镜可见的聚集物。

结论：

与未经辐射的对照组相比，该组合物的应用使得Beriglobin的甲型肝炎抗体部分仅有很小的损失。

实施例7：作为稳定化合物的不同皂苷的试验。皂苷的结构类型对于抗体具有稳定作用。

材料和方法

所有实验都基于相同基本ELISA测定设计。(参见上文)

LO-MM-3对ELISA板的吸附和后涂层的应用

经涂布的表面的逆境暴露

LO-MM-3功能的ELISA检测

实验：

如“材料和方法”部分所述进行LO-MM-3对于板的吸附和后涂层的应用以及灭菌；和一般性ELISA程序。辐射剂量(电子束)为50kGy。

结果：

实验结果如图15所示。皂苷的结构类型具有增强氨基酸组合的保护性效果的潜能。优选的是使用皂苷甘草酸。

实施例8：包含至少3种不同氨基酸或至少两种不同氨基酸和如甘草酸等皂苷的稳定组合物提供非常好的保护。

材料和方法

所有实验都基于相同基本ELISA测定设计。(参见上文)

LO-MM-3对ELISA板的吸附和后涂层的应用

经涂布的表面的逆境暴露

LO-MM-3功能的ELISA检测

实验：

将氨基酸溶解在0.5M NaOH(Merck，106482)或0.5M HCl(Merck，100319)中以获得具有最高浓度的储液。将氨基酸储液以不同组合混合在一起，使在后涂布液中总氨基酸浓度为20g/l。

将氨基酸混合物的pH定为约7.0。

如“材料和方法”部分所述进行LO-MM-3对板的吸附和后涂层的应用以及灭菌；和一般性ELISA程序。辐射剂量(电子束)为50kGy。

结果：

实验结果如图16所示。在采用50kGy β辐射时，至少3种氨基酸的组合和2种氨基酸与附加的甘草酸的组合提供了对固定化抗体的最大保护(超过75％)。

实施例9：优选的氨基酸组合物在不同逆境条件下提供保护。

材料和方法

所有实验都基于相同基本ELISA测定设计。(参见上文)

LO-MM-3对ELISA板的吸附和后涂层的应用

经涂布的表面的逆境暴露

LO-MM-3功能的ELISA检测

实验：

所使用的组合物：

保护组合物A(化合物/升)

20g精氨酸

20g组氨酸

20g赖氨酸

3g谷氨酰胺

2g色氨酸

20g甘氨酸

15g丙氨酸

0.2g吐温80

1g甘草酸铵盐

使用NaOH和/或HCl将pH调节至约7.2。然后，将该溶液进行除菌过滤。

如“材料和方法”部分所述进行LO-MM-3对于板的吸附和后涂层的应用以及灭菌；和一般性ELISA程序。

结果：实验结果如图17所示。氨基酸组合物在不同逆境条件下提供保护。对于不同剂量的β-辐射和升温下的人工老化提供了最佳保护。对于γ-辐射或环氧乙烷灭菌的保护较小，但具相关性。

实施例10：氨基酸后涂层在长期存储过程中提供保护。

实验：

将氨基酸溶解在0.5M NaOH(Merck，106482)或0.5M HCl(Merck，100319)中以获得具有最高浓度的储液。将氨基酸储液混合在一起以使后涂布液中总氨基酸浓度达到200mM。这些氨基酸以等摩尔比例使用。

18种氨基酸：Ala，Arg，Asp，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val

5种氨基酸(1)：Asp，Arg，Phe，Ser，Val

5种氨基酸(2)：Ala，Glu，Lys，Thr，Trp

2种氨基酸(1)：Asp，Val

2种氨基酸(2)：Ala，Glu

将氨基酸混合物的pH设为约7.0；并将混合物进一步在PBS中稀释，以使最终浓度为200mM。

如“材料和方法”部分所述进行LO-MM-3对板的吸附和后涂层的应用以及灭菌；和一般性ELISA程序。通过加速老化程序模拟长期存储。将板在45℃存储，并在存储0、10、25、41和62天后确定抗体活性。这相当于在5℃实际时间为0、6、12、24和36个月的老化。

结果：

含有至少5种氨基酸的氨基酸后涂层在长期存储过程中提供保护。对于非灭菌样品而言，在45℃持续62天后约80％抗原结合能力得到保留。灭菌样品(β，25kGy)在45℃持续62天后保留其抗原结合能力的约70％。不考虑灭菌，在存储过程中，含有仅2种氨基酸的氨基酸后涂层仅保留有约40％的抗原结合能力。向后涂布溶液添加1mM甘草酸可增强保护效果：对于含有至少5种氨基酸和甘草酸的非灭菌样品而言，在45℃持续62天后约90％的抗原结合能力得到保留。灭菌样品(β，25kGy)在45℃持续62天后保留其抗原结合能力的约80％。在存储过程中，含有2种氨基酸和甘草酸的氨基酸后涂层保留有约70％的抗原结合能力。

实施例11：氨基酸后涂层在不同灭菌过程中提供保护。

实验：

5种氨基酸：Asp，Arg，Phe，Ser，Val

2种氨基酸：Asp，Val

如“材料和方法”部分所述进行LO-MM-3对板的吸附和后涂层的应用以及灭菌；和一般性ELISA程序。对一块板进行辐射(γ，25kGy)。辐射在Beta-Gamma-Service(德国Bruchsal)进行。另一块板通过EO(ETO BO1 cycle)灭菌；灭菌在Rose GmbH(德国Trier)进行。

结果：

利用γ-辐射灭菌的样品在使用含有18种氨基酸的氨基酸后涂层保护时保留约85％活性；该效果不会因使用甘草酸而进一步增强；使用5种氨基酸时保留活性为75％；使用2种氨基酸时仅保留40％。添加甘草酸改善了使用2种氨基酸的保护；此处其保留的活性为65％。当使用含有18种氨基酸的氨基酸后涂层保护时，经ETO灭菌的样品保留约85％的活性；使用甘草酸不会进一步增强此效果。含有5或2种氨基酸的后涂层仅具有很小的保护效果；添加甘草酸可以增强边际保护。

实施例12：由氨基酸和二肽组成的后涂层提供抵抗高辐射剂量的保护。

材料和方法

-所有实验都基于相同基本ELISA测定设计。(参见上文)

-LO-MM-3对ELISA板的吸附和后涂层的应用

-经涂布的表面的逆境暴露

-LO-MM-3功能的ELISA检测

实验：

将氨基酸溶解在0.5M NaOH(Merck，106482)或0.5M HCl(Merck，100319)中以获得具有最高浓度的储液。将氨基酸储液混合在一起以使后涂布液中总氨基酸浓度达到20g/l。二肽以10g/l的浓度单独使用，和以2g/l的浓度与氨基酸组合使用。

7种氨基酸：Arg，His，Lys，Glu，Trp，Gly，Ala

2种二肽：甘氨酰酪氨酸(Gly-Tyr)，甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln)

将氨基酸混合物的pH设定为约7.0。

结果：

当使用含有仅7种氨基酸的氨基酸后涂层保护时，经50kGy β-辐射灭菌的样品保留约60％的活性；该效果在添加如Gly-Tyr等二肽或二肽组合时得到进一步增强。甘草酸不进一步增强氨基酸二肽组合的保护效果。

Claims

1.一种封闭的经灭菌的容器，所述容器包含

-作为稳定剂的至少一种载体；和

-可逆地附着于所述载体的至少一种生物分子，

其中所述载体部分地或完全地包被所附着的生物分子，并且其中所述至少一种载体选自由(多)肽、氨基酸、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷及其混合物组成的组。

2.如权利要求1或2所述的容器，其中将所述至少一种生物分子附着于所述载体，从而使超过50％的所述生物分子能够在2小时以内从所述载体上释放，优选超过85％的所述生物分子能够在10分钟以内从所述载体上释放。

3.如权利要求1或2所述的容器，其中所述至少一种生物分子选自由(多)肽、核酸、糖类、脂质及其组合组成的组。

4.如权利要求3所述的容器，其中所述(多)肽是抗体、酶、受体、膜蛋白、转运蛋白、凝血因子、激素、细胞因子、生长因子或其功能片段。

5.如权利要求1～4中任一项所述的容器，其中所述载体为固体、半固体或是可增溶的。

6.如权利要求5所述的容器，其中所述半固体载体包括水凝胶或凝胶状蛋白混合物。

7.如权利要求5所述的容器，其中所述可增溶的载体包含可溶于水性溶液中的结构，所述溶液可选地是缓冲溶液。

8.一种生物分子用经灭菌的容器的生产方法，所述方法包括：

(a)将选自(多)肽、氨基酸、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷或其混合物的作为稳定剂的至少一种载体***容器中；

(b)将至少一种生物分子可逆地附着于所述载体，从而使得所述至少一种生物分子部分地或完全地被所述至少一种载体包被；

(c)密封所述容器；和

(d)对所述容器灭菌。

9.一种生物分子用经灭菌的容器的生产方法，所述方法包括：

(a)将至少一种生物分子可逆地附着于选自(多)肽、氨基酸、多元醇、聚乙二醇、离子液体、相容性溶质、皂苷或其混合物的作为稳定剂的载体，从而使得所述至少一种生物分子部分地或完全地被所述至少一种稳定剂包被，

(b)将附着有所述至少一种生物分子的所述载体***容器中，

(c)密封所述容器；和

(d)对所述容器灭菌。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述生物分子与所述载体的所述可逆地附着以批量生产进行，所述批量生产在所述将经涂布的载体***所述容器中之前包括切割步骤。

11.如权利要求8～10中任一项所述的方法，其中所述可逆地附着包括将所述载体与所述生物分子一起干燥。

12.如权利要求1～7中任一项所述的容器或如权利要求8～11中任一项所述的方法，

其中所述灭菌通过环氧乙烷(EO)、β辐射、γ辐射、X射线、热灭活、高压或等离子灭菌进行。

13.如权利要求1～7中任一项所述的容器或如权利要求8～12中任一项所述的方法，

其中所述(多)肽为白蛋白、分子伴侣或酪蛋白，

其中所述皂苷为甘草酸；

其中所述相容性溶质为依克多因或羟基依克多因；和/或

其中所述氨基酸为至少两种不同氨基酸的混合物，并且优选为至少三种不同氨基酸的混合物。

14.如权利要求1～7或13中任一项所述的容器或者如权利要求8～13中任一项所述的方法，其中所述至少一种稳定剂包含在缓冲液中。

15.如权利要求13或14所述的容器或方法，其中所述氨基酸的混合物包含以下每组中的至少一种氨基酸

(a)具有非极性脂肪族R基团的氨基酸；

(b)具有极性不带电荷的R基团的氨基酸；

(c)具有带正电荷的R基团的氨基酸；

(d)具有带负电荷的R基团的氨基酸；和

(e)具有芳香性R基团的氨基酸。

16.如权利要求13～15中任一项所述的容器或方法，其中包含在所述混合物中的所述氨基酸选自脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸，其中半胱氨酸的含量低于固体干氨基酸混合物的1％。

17.如权利要求13～16中任一项所述的容器或方法，其中包含在所述混合物中的所述氨基酸是或者选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸、谷氨酸、色氨酸、甘氨酸和丙氨酸。

18.如权利要求13～17中任一项所述的容器或方法，其中所述皂苷为甘草酸或其衍生物，并且其中所述氨基酸为至少两种氨基酸的混合物。

19.如权利要求1～7或13～18中任一项所述的容器或者如权利要求8～18中任一项所述的方法，其中所述稳定剂包含低于1％、更优选低于0.3％的吐温、优选吐温80。

20.如前述权利要求中任一项所述的容器，所述容器内部基本不含大气氧气。

21.如前述权利要求中任一项所述的容器，所述容器内部基本不含液体、优选不含水。

22.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法在步骤(b)之后且在步骤(c)之前还包括

-从所述容器中除去大气氧气，和/或

-从所述容器中除去液体、优选除去水。

23.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括：

(e)将所述至少一种生物分子从所述载体上洗脱；和可选的

(f)在步骤(b)的同时、之前或之后应用能使结构变性的生物分子复性的复性液。

24.前述权利要求中任一项所述的容器在诊断或治疗中的应用。