ES2502666B1 - Procedimiento de estabilización de biomoléculas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para la estabilización de biomoléculas caracterizado porque dicha estabilización se consigue manteniendo la viscosidad del medio en el cual se encuentran dichas biomoléculas. Es de aplicación a un amplio número de biomoléculas tales como ATP o NADH y permite la utilización de las mismas en procedimientos analíticos, clínicos o médicos que se vayan a llevar a cabo en condiciones no adecuadas para el mantenimiento de su estabilidad.

Description

SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCiÓN La presente invención se encuadra en el ámbito del sector farmacéutico y de la biotecnología. El procedimiento de estabilización de biomoléculas objeto de la presente invención pretende dar solución al problema técnico que representa el hecho de que ciertas moléculas orgánicas necesarias para que la maquinaria celular pueda seguir funcionando (como ATP, NADH, ARN, Y muchas proteínas y enzimas) son muy inestables, sobre todo cuando las condiciones a que se ven expuestas son extremas, por ejemplo pero no exclusivamente, por aumentos de temperatura.

Para la utilización de estas moléculas en ensayos o reacciones y para su empleo clínico, esas biomoléculas han de mantenerse en condiciones estables hasta su utilización. Además, su almacenamiento o transporte no siempre es posible hacerlo en frío y en muchas ocasiones algunos reactivos que contienen algunas de estas biomoléculas han de ser transportados o mantenidos en condiciones inadecuadas para el mantenimiento de su estabilidad. La tecnología propuesta presenta la posibilidad de aumentar significativamente la estabilidad de biomoléculas lo que tiene aplicaciones prácticas para su utilización en reacciones o ensayos enzimáticos o analíticos, en procedimientos clínicos o médicos, o cualquier otra utilización.

ESTADO DE LA TÉCNICA Las células vivas se componen de un amplio número de moléculas orgánicas. La gran mayoría de elias son propias de esas células por lo que se suelen denominar biomoléculas. Aunque las células parecen perfectamente estables, se sabe que un gran número de biomoléculas son relativamente inestables en solución dependiendo de las condiciones en las que se mantengan (Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL. 2002. Bioquímica. Ed. Reverté, Barcelona). Por ejemplo, la gran mayoría de biomoléculas no resisten exposición a temperaturas relativamente elevadas. Como ejemplos típicos de biomoléculas inestables podemos citar, entre otras, el ATP (adenosin trifosfato), NAD (nicotinamida adenina dinucleótido) y NADP (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato), ARN (ácido ribonucleico) y un largo número de proteínas (Stryer et al. 2002).

A pesar de la inestabilidad de muchas moléculas biológicas, hoy en día sabemos que existen microorganismos que necesitan temperaturas elevadas, incluso alrededor de los 100°C, para crecer y desarrollarse (Grogan, DW. 1998. Hyperthermophiles and the problem 01 DNA instability. Mol Microbiol. 28: 1043-1049; Vieille C, Zeikus GJ. 2001 . Hyperthermophilic enzymes: Sources, uses, and molecular mechanisms of thermostability. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 1-43). Estos microorganismos termófilos, sin embargo, utilizan las mismas biomoléculas que cualquier otro ser vivo (Stetter, KO. 1999. Extremophiles and their adaptation to hot environments. FEBS Lett 452: 22-25; Daniel, RM, DA Cowan. 2000. Biomolecular stability and life at high temperatures. Cell Mol Lite Sci. 57: 250-264). Un problema fundamental es como moléculas tan lábiles como el ATP, que es la molécula energética por excelencia en las células, pueden permitir que continúe la vida de esas células a temperaturas elevadas. El ATP, por ejemplo, se descompone un 60% al exponerse 1 h a 95°C y el NAD más del 95% en dichas condiciones (Daniel and Cowan , 2000) en solución a pH 7.

Existen un sinfín de casos en los que distintas biomoléculas de uso comercial se exponen a elevadas temperaturas u otras condiciones adversas para su estabilidad. En la actualidad, prácticamente todas las biomoléculas inestables se transportan y almacenan bajo refrigeración. Sin embargo, existen muchas ocasiones que no es posible mantenerlas refrigeradas o un sistema de refrigeración adecuado no está disponible. El caso más típico sería el envío de biomoléculas para análisis o procedimientos médicos o clínicos a países del tercer mundo, o el mantenimiento de reactivos para análisis en condiciones de calor intenso como pueden ser ambulancias o coches de policía en épocas veraniegas en España. El problema es conseguir mantener biomoléculas estables en cualquier condición ambiental sin necesidad de sistemas caros de congelación .

Se discuten a continuación documentos encontrados que reflejan cual es el estado de la técnica:

CA2568714A1 : A biomolecule-containing formulation of increase stability Esta patente se centra en administrar biomoléculas, glicoproteínas (interferon) en este caso, en una solución relativamente compleja que le confiere mayor estabilidad dentro de un fluido no acuoso. Los interferones son especialmente inestables y han de estabilizarse durante su administración. La solución que proponen incluye la desecación de la biomolécula (por ejemplo, por liofilización) y suspensión de la partícula desecada resultante en un fluido no acuoso hidrofóbico. La partícula desecada incluye la biomolécula (interferon) un tampón, un surfactante, y uno o más estabilizadores que pueden ser un carbohidrato, un antioxidante y un aminoacido. La temperatura para las que se propone es de 37°C o ligeramente superior. El procedimiento objeto de la presente invención es mucho más sencillo, es aplicable a cualquier biomolécula (no sólo glicoproteínas) y puede emplearse para el mantenimiento a largo plazo de biomoléculas a elevadas temperaturas (muy superiores a 37°C), no únicamente durante su administración. No se requiere la inclusión de la biomolécula como una suspensión de partículas secas.

EP1449523A1 : Composition and method tor stable injectable liquids Esta patente se basa en la estabilización de vacunas para su transporte sin refrigeración . La vacuna o material bioactivo se estabiliza inmovilizándolo en una substancia cristalina (glassy; por ejemplo, cristales de azúcares), de la cual las pequeñas partículas siempre se suspenden en uno o más fluorocarbonos líquidos en los que las partículas son insolubles. A efectos de lo buscado en este documento, lo que se utiliza es la elevada densidad de los fluorocarbonos para separarlos en distintas fases de substancias tampón que disolverían las partículas cuando necesiten ser utilizadas. Un inconveniente de este procedimiento es que los fluorocarbonos están muy regulados por su riesgo ambiental.

Frente a lo divulgado en este documento, el procedimiento de la invención no contempla necesariamente el empleo de f1uorocarbonos sino que se basa en aumentar la viscosidad como un método sencillo para estabilizar biomoléculas sometidas a situaciones inadecuadas para su almacenamiento, transporte o manipulación.

EP2489736A1 : Verfahren zur Stabilisierung einer biologischen Probe Se basa en el empleo de amidas para la estabilización de biomoléculas (sondas biológicas). Está dirigida al mantenimiento de diversos tipos de biomoléculas, entre ellas ácidos nucleicos y proteínas que pueden estar refrigeradas o no. Opcionalmente se emplean, además de las amidas, diversos compuestos como alcoholes, disolventes, tampones, sustancias osmóticamente activas, quelatantes u otras, consiguiéndose estabilizar las biomoléculas en un rango de temperaturas comprendido entre -80 y 80°C. El procedimiento de invención propuesto en el presente caso no utiliza amidas y propone un método sencillo de estabilizar biomoléculas aumentando la viscosidad de la solución que contiene dichas biomoléculas.

US2012308987A1 ; Matrices and media lor storage and stabilization 01 biomolecules Esta invención se basa en el empleo de compuestos, principalmente inorgánicos y solubles en agua, que funcionan como antioxidantes y permiten la estabilización y almacenaje de biomoléculas en estado seco (dry-state). En ciertas composiciones emplean lo que denominan plastificador que es un compuesto que facilita el almacenamiento de la matriz en estado seco. Estos plastificadores mejoran las propiedades de la matriz (por ejemplo, su flexibilidad) y entre muchos de los posibles plastificadores que mencionan se encuentra el etilen glicol. Se menciona que el plastificador no interfiere con la estabilid ad química o física de las biomoléculas almacenadas.

La principal diferencia con respecto al procedimiento objeto de la presente invención es que en esta patente se requiere que se seque la biomolécula, su uso en seco. Además la formulación es más compleja y se basa en el empleo de compuestos inorgánicos solubles en agua, antioxidantes y una larga lista de otros posibles compuestos (plastificadores) para mejorar el funcionamiento de la formula. La formula puede incluir inhibidores de ARNasas, ADN, ARN, aminoácidos, entre otros. La formulación es altamente compleja.

W00243750A2: Method for stabilizing biomolecules in liquid formulations. Esta tecnología se centra en el empleo de solventes líquidos para la estabilización de biomoléculas (proteinas con actividad biológica fundamentalmente en el tracto respiratorio) para su empleo en su administración como aerosoles incluyendo sistemas electrostáticos y electrohidrodinámicos. La formula se compone de un liquido portador (agua y un líquido orgánico), la proteína con efecto biológico, un estabilizador (un derivado de un carbohidrato con una cadena carbonada suspendido o disuelto en el líquido portador) y, opcionalmente, un excipiente farmaceutico. Entre los compuestos orgánicos que componen los líquidos portadores o solvente mencionan polietilenglicol entre otros (entre los ejemplos citados proponen la mezcla etanol/polietilen glicol 80%/20%). Lo más característico de esta tecnología es el empleo del agente estabilizador que se compone de un derivado de un carbohidrato con una cadena de entre 8-12 carbonos. La presencia del polietilen glicol como solvente no implica una mayor estabilidad de la proteína ensayada, dicha estabilidad viene dada por el derivado del carbohidrato, según los resultados presentados.

Esta invención se refiere a proteínas y su administración como aerosoles. La estabilidad que proporciona esta formulación parece venir dada (según sus resultados) por el agente estabilizador que es el derivado de un azúcar con una cadena de 8-12 carbonos.

A la vista de los documentos del estado de la técnica discutidos en los párrafos anteriores, sería interesante disponer de una tecnología que permita rebajar los costes requeridos para poder transportar y mantener biomoléculas y que sea capaz de mantenerlas estables por más tiempo en condiciones de preservación inadecuadas. Su utilización debería extenderse a cualquier aplicación que emplee biomoléculas relativamente inestables para su utilización en condiciones adversas de laboratorio o industria, de utilización en análisis de campo o en lugares inhóspitos o con reducida infraestructura y condiciones lejanas a las ideales para su preservación.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN Constituye el objeto de la presente invención un procedimiento para la estabilización de biomoléculas caracterizado porque dicha estabilización se consigue manteniendo la viscosidad del medio en el cual se encuentran dichas biomoléculas.

En una realización preferente del objeto de la presente invención, el medio en el cual se encuentran las biomolécuas es acuoso y el mantenimiento de la viscosidad se lleva a cabo añadiendo modificadores de la viscosidad seleccionados entre etilenglicol, ectoína, polisacáridos tales como almidón o ficolI, azúcares tales como sacarosa, maltosa o trehalosa, proteínas tales como gelatina, albúmina, caseína o enzimas tales como lisozima. Esta relación de modificadores de la viscosidad se aporta con carácter indicativo, no limitativo.

Más específicamente, se emplea etilenglicol a una concentración comprendida entre 20% y el 70% dependiendo del grado de estabilidad que se desee alcanzar.

Las biomoléculas a estabilizar se seleccionan entre, ARN, ATP, NAD, NADH, NADP, otros factores enzimáticos, enzimas y proteínas. La referida relación de biomoléculas se aporta con carácter indicativo, no limitativo.

En una realización particular de la presente invención, la biomolécula estabilizada es adenosín trifosfato (ATP), empleándose para ello una solución acuosa de etilenglicol, concretamente una disolución al 50% en tampón fosfato al a, 1 M Y pH = 7,3. En esas condiciones, la molécula de ATP es mucho más estable en dicho medio en un intervalo de temperaturas comprendido entre 25 y 90°C.

En otra realización particular de la presente invención, la biomolécula estabilizada es NADH (nicotinamida adenín nucleólido), empleándose para ello una solución acuosa de etillénglicol, específicamente una disolución al 50% en tampón fosfato al 0,1 M Y pH = 7,3.

En otra realización de la invención, el medio utilizado para la estabilización del NADH es una solución acuosa de ectoína, específicamente una disolución a una concentración de 0,45 g/mI.

En ambos casos se consigue incrementar considerablemente el tiempo en el que la molécula de NADH permanece estable en solu ción .

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A: Resultados del experimento para determinar la estabilidad del ATP a distinta viscosidad en presencia y ausencia de etilenglicol a 25°C y ao°c. Figura 1 B: Detalle de los resultados de la figura 1 A a BOoC. Figura 2: Resultados del experimento realizado para determinar el aumento de la estabilidad del NADH en presencia y ausencia de etilenglicol. Figura 3: Resultados de la variación de la tasa de degradación de NADH frente a la viscosidad en presencia de etilen glicol Figura 4: Resultados del experimento realizado para determinar el aumento de la estabilidad del NADH en presencia y ausencia de ectoína.

DESCRIPCiÓN DETALLADA Y MODO DE REALIZACiÓN DE LA INVENCiÓN La presente tecnología que se propone sería válida para la generalidad de biomoléculas y específicamente adecuado para pequeñas biomoléculas como ATP, NAO, NADH Y NADP, muy comunes en reacciones enzimáticas o ensayos enzimáticos utilizados en analítica.

En un intento de disminuir la interacción entre las moléculas en suspensión, se propone el empleo de soluciones con viscosidad elevada con objeto de reducir la fricción entre biomoléculas y facilitar asi su mantenimiento o estabilidad. Al aumentar la temperatura, la viscosidad de los liquidos acuosos disminuye drásticamente lo que resulta en una mayor inestabilidad de las moléculas por su constante vibración. Por tanto, sería necesaria la utilización de substancias que aumenten la viscosidad de las soluciones donde se encuentran las biomoléculas para poder aumentar su estabilidad. Por ejemplo, el agua a

20°C posee una viscosidad de aproximadamente 1.0 mPa.s mientras que a 90°C su viscosidad se reduce a 0.3 mPa.s, unas 3.2 veces inferior.

Una disminución de la viscosidad da lugar a una mayor inestabilidad de las moléculas y por tanto aumenta la degradación y desnaturalización de las biomoléculas o moléculas orgánicas clave para el mantenimiento de la vida de las células. El procedimiento objeto de la presente invención propone que aumentando la viscosidad se puede conseguir una estabi lización de las biomoléculas bajo condiciones extremas (por ejemplo, de temperatura) de modo que se obtengan tiempos de vida equiparables o superiores a los que presentan esas biomoléculas en condiciones idóneas de mantenimiento o funcionamiento.

Para ello se propone el empleo de moléculas que proporcionen un aumento de viscosidad incluso a temperaturas elevadas. Un ejemplo sencillo es el etilenglicol, otros ejemplos pueden ser gelatinas o almidón, como proteínas o polisacáridos, respectivamente, entre otras muchas moléculas. Concentraciones elevadas de moléculas orgánicas también suelen resultar en aumentos de viscosidad en la solución. Ejemplos, pueden ser aminoácidos o azúcares, entre otros.

Ejemplo 1: Para aumentar la viscosidad de las soluciones con biomoléculas y como modelo para comprobar la tecnología se empleó etilenglicol. El etilenglicol al 50% en agua y a 80°C presenta una viscosidad equivalente a la viscosidad del agua a 25°C (o temperatura ambiente). La biomolécula inestable utilizada como modelo en este estudio fue el ATP (adenosin trifosfato o trifosfato de adenosina) que es la mólecula energética por excelencia en todas las células vivas. La presencia de etilenglicol al 50% en agua no presentaba ningún efecto en la estabilidad del ATP ni en la reacción de la luciferasa (Enliten, kit comercial para la cuantificación de ATP, Promega). Se comparó la degradación del ATP a 25°C y 80°C en solución acuosa (tampón fosfato 0.1 M Y pH 7.3) con y sin etilenglicol de forma que se pudo ver como se degrada el ATP a lo largo del tiempo de incubación a esas temperaturas. A 80°C, en presencia de etilenglicol la viscosidad era aproximadamente 1 mPa.s (equivalente a la viscosidad del agua a 25°C) mientras que en solución acuosa sin la adición de etilenglicol la viscosidad era de aproximadamente 0.3 mPa.s. (Nota: mPa.s = miliPascales segundo; unidades recomendadas de viscosidad).

Los resultados a 25°C demostraban que la presencia de etilenglicol no afectaba la estabilidad del ATP (Figura 1 A). De los resultados a 80°C se observa una mayor estabilidad del ATP en la solución más viscosa (con etilenglicol) (Figura 1 B) la cual permitió la detección de niveles elevados de ATP durante toda la duración del experimento mientras que a la viscosidad baja el ATP dejaba de ser detectable a las 7 horas (Figura 1 B). En la Figura 1 B se presenta un detalle de los resultados a BOoe .

Ejemplo 2: De forma similar se han hecho experimentos para determinar si un aumento de la viscosidad aumenta la estabilidad del NADH (nicotina mida adenín dinucleotido). Se realizaron dos experimentos, uno en presencia y ausencia de etilenglicol y otro en presencia y ausencia de ectoina. Etilenglicol y ectoina son dos compuestos que se utilizan para elevar la viscosidad de la solución. El etilenglicol se utilizó al 50% en agua como en el caso descrito anteriormente. La ectoina se empleó a una concentración de 0.45 g/mi que daba lugar a un aumento de la viscosidad con respecto al agua (1.6 mPa.s a 80°C; 7.7 mPa.s a 20°C) similar al descrito para el caso del etilenglicol. Los experimentos se realizaron con una concentración final de NADH de 1 mM. Los resultados obtenidos se muestran en las figuras 2 y 3 (para el NADH con etilenglicol) y 4 (para el NADH con ectoina). En ambos casos (figuras 2 y 4) se observó que al aumentar la temperatura, las soluciones con mayor viscosidad conferían una mayor estabilidad a las biomoléculas (NADH en este ejemplo).

En la figura 3 se representa la velocidad de degradación frente a la viscosidad. Corresponde a NADH en etilenglicol y las distintas viscosidades se han conseguido aumentando la concentración de etilenglicol desde 10 hasta 60%.

Es decir, en presencia de etilenglicol o ectoina se obtenía una mayor viscosidad y a temperaturas elevadas se observó mayor estabilidad o persistencia del compuesto lábil ensayado (NADH en estos ejemplos) que en soluciones con viscosidad más baja (en ausencia de esos compuestos).

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Procedimiento para la estabilización de biomoléculas caracterizado porque dicha estabilización se consigue manteniendo la viscosidad del medio en el cual se encuentran dichas biomoléculas.

2. 2.

   Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio en el cual se encuentran las biomolécuas es acuoso.

3. 3.

   Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el mantenimiento de la viscosidad del medio acuoso en el cual se encuentran las biomoléculas se lleva a cabo añadiendo modificadores de la viscosidad seleccionados entre, etilenglicol, ectoína, almidón, ficoll, sacarosa, maltosa, trehalosa, gelatina, albúmina, caseina o lisozima.

4. 4.

   Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 3, caracterizado porque el modificador de la viscosidad es etilenglicol.

5. 5.

   Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 4, caracterizado porque el etilenglicol se añade al medio acuoso a una concentración comprendida entre el 20% yel 70%, preferentemente al 50%.

6. 6.

   Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las biomoléculas a estabilizar se seleccionan entre, ARN, ATP, NAO, NAOH, NAOP, otros factores enzimáticos y enzimas.

7. 7.

   Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 6, caracterizado porque la biomolécula estabilizada es adenosintrifosfato (ATP).

8. 8.

   Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 7, caracterizado porque el medio utilizado para la estabilización del ATP es una solución acuosa de etilenglicol.

9. 9.

   Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 8, caracterizado porque la solución acuosa de etilenglicol es una disolución al 50% en tampón fosfato al 0.1 M Y pH = 7.3.

10. 10.

    Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicaciones 8 y 9, caracterizado porque la molécula de ATP se estabiliza en dicho medio en un intervalo de temperaturas comprendido entre 25 y 90°C.

11. 11 . Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 6, caracterizado porque la biomolécula estabilizada es nicotinamida adenín dinucleotido (NADH ).

12. 12.

    Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 11, caracterizado porque el medio utilizado para la estabilización del NADH es una solución acuosa de etillénglicol.

13. 13.

    Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 12, caracterizado porque la solución acuosa de etilenglicol es una disolución al 50% en tampón fosfato al 0.1 M Y pH = 7.3.

14. 14.

    Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 11, caracterizado porque el medio utilizado para la estabilización del NADH es una solución acuosa de ectoína

15. 15.

    Procedimiento para la estabilización de biomoléculas según la reivindicación 14, caracterizado porque la solución acuosa de ectoína es una disolución a una concentración de 0,45 g/mI.