CN102363751A

CN102363751A - 登革病毒样颗粒及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102363751A
Application number: CN2011100750413A
Authority: CN
Inventors: 江丽芳; 黎孟枫; 刘岩; 周俊梅
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2011-03-24
Filing date: 2011-03-24
Publication date: 2012-02-29

Abstract

本发明公开了登革病毒样颗粒及其制备方法与应用。登革病毒1-4病毒样颗粒重组载体转化的P.pastoris酵母菌株，其分别为pGAPZ-α-PrME-D1-X33、pGAPZ-sPrME472-D2-X33、pGAPZ-sPrME-D3-X33和pGAPZ-sPrME-D4-X33，分别于2011年3月14日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，编号分别为CCTCCM2011063、CCTCCM2011064、CCTCCM2011065和CCTCCM2011066。登革病毒1-4病毒样颗粒，由权利要求1所述重组载体转染P.pastoris酵母X33细胞并分泌所得。本发明采用非甲醇依赖的P.pastoris酵母***制备登革病毒样颗粒，国内外尚未见报道，具有创新性。该***制备的登革病毒样颗粒能用于制备疫苗，既克服了目前减毒活疫苗、亚单位疫苗和载体疫苗等登革疫苗研究中的诸多缺点，具有安全高效、适于规模化生产的优势。

Description

登革病毒样颗粒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体内容为应用毕赤酵母制备登革病毒样颗粒的方法及应用。

背景技术

登革病毒（dengue virus, DENV）以伊蚊为传播媒介，感染人可引起登革热（dengue fever, DF）、登革出血热（dengue hemorrhagic fever, DHF）和登革休克症（dengue shock syndrome, DSS）。DHF/DSS 病情严重，病死率高，其发病机制至今尚未阐明。由于缺乏有效的登革病毒疫苗，加上控制蚊媒的实际困难，使登革病毒感染流行的地域和流行强度在不断地扩大。目前登革热在全球许多地方卷土重来，已成为世界上分布最广、发病最多、危害较大的一种虫媒病毒性疾病。因此，加强DENV 致病机制、疫苗的研究及快速诊断试剂盒的研制已经成为十分迫切的问题。

登革疫苗的研究已经有近百年的历史，但目前还尚无成功的疫苗问世。制约登革疫苗研究的因素主要有以下几个方面：(1) 缺乏合适的、能模拟人体感染DENV临床症状的动物模型；(2) 对DENV感染导致DHF和DSS的具体机制尚不清楚；(3) DENV不同型之间存在抗体依赖的感染增强作用（antibody-dependent enhancement, ADE）。因此研制DENV疫苗需要对4个型都有均衡的保护作用，因此增加了研制的难度。

病毒样颗粒（Virus-like particles, VLPs) 疫苗的出现为研发新型安全高效的疫苗提供了一个新的契机。VLPs是指由病毒的一个或多个结构蛋白组装成的，不含病毒核酸，不能进行自主复制的空心颗粒。由于VLPs不包含病毒DNA或RNA，因此不存在毒力的回复和同源重组的隐患。同时，VLPs保留了与天然病毒粒子相同或类似的空间构型和诱导中和抗体的抗原表位，具有很强的免疫原性。不但能诱导产生体液免疫，而且可以激发CD4⁺T细胞的增殖和CTL反应（cytotoxic T lymphocyte）。目前多数病毒的VLPs是通过体外表达***来实现有效的自我组装，其中包括HIV, Influenza A virus, Hantaan virus, Rotavirus, Papillomavirus 等病毒。

登革病毒为黄病毒科黄病毒属的成员，为单股正链RNA病毒，基因组长约11kb，含有一条单一的开放读码框。基因排列顺序为5'-NCR-C- PrM/M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-NCR-3'，共编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其中E基因编码的E蛋白为病毒表面包膜糖蛋白，具有与细胞表面受体结合，介导膜融合，诱导产生中和抗体等多种生物学功能，是病毒最重要的抗原成份。PrM基因编码的PrM/M蛋白也被认为是诱导产生中和抗体的抗原成分。非结构基因及非编码区主要与病毒复制及蛋白翻译有关。有报道称，黄病毒的包膜E蛋白与prM蛋白在体外表达***中共表达时，可折叠为类似天然病毒粒子空间结构的多聚体颗粒即病毒样颗粒，也称作亚病毒颗粒（subviral particles，SVPs）。在登革病毒方面，有研究者应用酵母***、CHO-K1细胞等进行了VLPs表达的尝试，但DENV VLPs在哺乳动物细胞中的低水平表达以及蛋白功能的维护一直是阻碍登革VLPs疫苗发展的瓶颈。因此，选择合适的DENV VLPs表达***，并采取合理的策略提高VLPs表达产量和分泌水平成为了发展DENV VLPs疫苗急需解决的问题。目前，相关研究中尚未发现有在毕赤酵母真核***中分泌表达四个型登革病毒病毒样颗粒研究的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供登革病毒1-4病毒样颗粒。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先构建用于不同重组表达子所采用的引物序列，分别可扩增登革病毒SprME基因，其长度为1983 bp，编码prM信号肽，prM蛋白和全长的E蛋白。又可扩增到的是SprME472基因，其长度为1914 bp，编码prM信号肽，prM蛋白和TM2端截断的E蛋白。

本发明还提供用于表达DENV1～4病毒样颗粒的基因元件。其是采用RT-PCR技术获得了DENV-1 GZ01/95株、DENV-2 ZS01/01株、DENV-3 H87株以及DENV-4 H241株的prM-E蛋白编码基因序列。为了使登革病毒VLPs能获得高效表达，我们对1～4 型登革病毒CprM-E或prME基因的表达元件进行了改造，包括在prM基因N端设计理想的信号肽序列，替换四型登革病毒E基因锚定区的部分基因等，本发明构建并表达了截去E蛋白TM2（E蛋白472aa-496aa）端的prME472和含全长E蛋白的prME，最终确定了表达VLPs的最佳构建策略。四型登革病毒prM-E基因元件分别命名为：DENV1-PrME，DENV2-sPrME472，DENV3-sPrME, DENV4-sPrME。

本发明还提供能够分泌表达四个型登革病毒样颗粒的P.pastoris酵母菌株。其是通过特异的限制性酶切位点Bsp119I和Xba I，分别将上述的四个型别登革病毒prM-E基因元件克隆入真核***表达载体pGAPZ αA中。分别命名为：I型登革病毒样颗粒毕赤酵母表达工程菌pGAPZ-α-PrMED1-X33、II型登革病毒样颗粒毕赤酵母表达工程菌pGAPZ-sPrME472-D2-X33、III型登革病毒样颗粒毕赤酵母表达工程菌pGAPZ-sPrME-D3-X33和Ⅳ型登革病毒样颗粒毕赤酵母表达工程菌pGAPZ-sPrME-D4-X33，再将重组载体转化到P.pastoris酵母菌X33内，获得稳定表达登革病毒病毒样颗粒的工程菌，分别于2011年3月14日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，编号分别为CCTCC M 2011063、CCTCC M 2011064、CCTCC M 2011065和CCTCC M 2011066。

本发明还提供上述基因编码的登革病毒样颗粒的制备方法，其步骤包括：

1) 采用RT-PCR技术从DENV-1 GZ01/95株、DENV-2 ZS01/01株、DENV-3 H87株以及DENV-4 H241株中分别获得四个型登革病毒的prM-E基因元件；

2）对1～4 型登革病毒CprM-E或prME基因的表达元件进行了改造，包括在prM基因N端设计理想的信号肽序列，替换四型登革病毒E基因锚定区的部分基因；

3）将四个型登革病毒的prM-E基因改造元件分别克隆入真核***表达载体中；

4）用3）中得到的重组表达载体分别转染P.pastoris酵母X33细胞，并使其分泌表达登革病毒病毒样颗粒；

5）用SDS-PAGE、Western blot技术，检测目的基因表达。

6）用15-60%蔗糖密度梯度离心和电镜技术，检测病毒样颗粒的形态特征。

本发明进一步提供上述基因编码的登革病毒样颗粒在预防登革类疾病中的应用。本发明分别用DENV1～4-VLPs单价、双价及四价配伍免疫Balb/c小鼠，能诱发中和抗体、细胞免疫及免疫记忆反应，为登革病毒疫苗研制奠定了基础。

与现有技术相比，本发明采用如下技术方案：

本发明采用非甲醇依赖的P .pastoris酵母***制备登革病毒样颗粒，国内外尚未见报道，具有创新性。该***制备的登革病毒样颗粒能用于制备疫苗，既克服了目前减毒活疫苗、亚单位疫苗和载体疫苗等登革疫苗研究中的诸多缺点，具有安全高效、适于规模化生产的优势。

附图说明

图1是本发明所使用的pGAPZα A表达载体结构示意图，该载体包含组成型的GAP启动子，编码酿酒酵母α信号肽基因序列和编码抗Zeocin抗生素的基因。

图2是本发明重组载体构建示意图，A：登革病毒包膜蛋白prM和E。H1 (400-413 aa)和H2 (430-449 aa)代表预测的E蛋白C末端茎干部位的α-螺旋区域。CS (413-430 aa)代表间隔H1和H2螺旋的区域。TM1 (449-472 aa)和TM2 (473-495 aa)代表预测的E蛋白跨膜区域。箭头代表信号肽酶的切割位点。B：不同重组表达载体的构建。P_GAP代表pGAPZ α A中的GAP启动子。S代表prM的信号肽序列，α代表pGAPZ α A中的α信号肽序列。

图3是本发明构建的重组载体酵母转化子用GAP通用引物PCR鉴定结果，其中泳道1是空载体转化子对照，2～4是pGAPZ-sPrME472转化子，5是酵母X33对照，6～9是pGAPZ-sPrME转化子，10、11是pGAPaZ-sPrME转化子。

图4是本发明构建的重组载体酵母转化子用目的基因特异引物PCR鉴定结果，其中泳道2～4是pGAPZ-sPrME转化子。

图5亦是本发明构建的重组载体酵母转化子用目的基因特异引物PCR鉴定结果，其中泳道2～4是pGAPZ-sPrME472转化子。

图6是本发明VLPs在酵母细胞中表达的Western blot鉴定图，其中1、2分别是pGAPaZ-PrME转化子表达细胞裂解液和表达上清与登革病毒特异性单抗反应的Western blot鉴定结果，3、4分别是pGAPZ-sPrME472转化子表达细胞裂解液和表达上清与登革病毒特异性单抗反应的Western blot鉴定结果，5、6分别是pGAPZ-sPrME转化子表达细胞裂解液和表达上清与登革病毒特异性单抗反应的Western blot鉴定结果，可见在各重组子的细胞裂解液和发酵上清均可检测到约50 kDa的E蛋白和20 kDa prM蛋白。

图7是本发明用蔗糖密度梯度离心法纯化表达的VLPs的Western blot鉴定图，其中A1～3是pGAPaZ-PrME转化子表达VLPs在30％、35％、40％蔗糖层收集，B1～3是pGAPZ-sPrME转化子表达VLPs在30％、35％、40％蔗糖层收集，可见本发明表达的登革病毒VLPs含有E、PrM和M蛋白。

图8是本发明得到的VLPs的负染电镜照片，直径为30 nm和 55 nm直径的VLPs均被检测到，且具有与天然登革病毒颗粒相似的形态。

图9是本发明得到的VLPs的免疫电镜照片，其中A、B是细胞裂解液中的VLPs，C、D是表达上清浓缩液中的VLPs，所用抗体为登革病毒多抗血清，亦观察到直径为30 nm和 55 nm直径的VLPs。

图10是本发明得到的VLPs的透射电镜照片，其中A是酵母X33对照，B是本发明构建的转化子，在酵母细胞的胞浆中形成了许多双层膜囊泡结构，每个囊泡中都充满了直径约为30-55 nm 左右呈结晶状排列的VLPs。

图11是本发明VLPs免疫小鼠的血清效价随时间变化的水平测定，其中PBS为PBS免疫Balb/C小鼠阴性对照，PrME代表pGAPZ-sPrME VLPs免疫Balb/C小鼠，CPrME代表pGAPZ-sCPrME VLPs免疫Balb/C小鼠。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 DENV1～4VLPs基因表达元件最佳构建策略的确定

一、DENV1～4病毒培养及病毒RNA的抽提

将DENV-1 GZ01/95株、DENV-2 ZS01/01株、DENV-3 H87株以及DENV-4 H241株分别接种C6/36细胞单层上，加入含2%灭活小牛血清的MEM培养液，于37℃ 培养至出现细胞病变达“+++～++++”，收集上清进行RNA的制备。采用Trizol试剂法提取培养上清总RNA。Trizol^? LS试剂为美国Invitrogen公司产品。

二、DENV1～4 prME基因元件的制备

采用ThermoScript^TM RT-PCR System（美国Invitrogen）将DENV1-4的RNA反转录合成cDNA第一链。

反应体系：模板RNA（5-10 μg）8 μl，引物R 2 μl，dNTPs（100mM）2 μl，DEPC水3 μl。总体积15 μl，将上述成分混匀并在65℃水浴5 min，迅速在冰上预冷2 min以上。加入下列成分：5× PrimeScript buffer 4 μl，RNase Inhibitor（40 U/μl）1 μl，Reverse Transcriptase (200 U/μl) 0.5 μl。

反应条件：42℃保温30 min，70℃ 15 min。

得到的cDNA用于PCR扩增，PCR反应体系：10× LA Buffer（Mg²⁺free）5 μl，MgCl₂ 5 μl，dNTPs 8 μl，cDNA 5 μl，引物F、R各2 μl，LA Taq 酶1 μl，ddH₂O 22 μl。

。

实施例2 能分泌表达DENV1～4VLPs的重组载体的构建及鉴定

一、重组载体的构建

将实施例1中制备的prME基因经Bsp119 I和Xba I双酶切后回收目的片段，与经同样双酶切的pGAPZαA载体(Invitrogen公司产品)定向连接，连接产物转化E.coli DH5α（美国Stratagene公司产品）感受态细胞，挑取单克隆接种含有抗生素的LB培养基进行37℃振荡培养过夜，质粒经小量制备后酶切及测序鉴定。选取鉴定正确的质粒分别命名为：pGAPZ-α-PrMED1、pGAPZ-sPrME472-D2、pGAPZ-sPrME-D3和pGAPZ-sPrME-D4，将鉴定正确的重组载体转化到P.pastoris酵母细胞中，获得稳定表达的工程菌，分别于2011年3月14日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，编号分别为CCTCC M 2011063、CCTCC M 2011064、CCTCC M 2011065和CCTCC M 2011066。

上述重组载体的构建示意图如图1所示。

二、重组载体转化毕赤酵母

将重组载体【pGAPZ-α-PrMED1，pGAPZ-sPrME472-D2，pGAPZ-sPrME-D3，pGAPZ-sPrME-D4，】以及空载体pGAPαA的DH5α培养菌液离心后收集菌体，提取质粒。用Bgl II酶分别将上述重组质粒线性化。反应体系：10×buffer L 100 μl，重组质粒200 μl，Bgl II 50 μl，ddH₂O 50 μl。离心混匀后，分装成20 μl/管，37℃酶切过夜。取100 μl制备好的毕赤酵母X33感受态细胞，与10 μg线性化的质粒DNA混合，转移到预冷的0.2 cm的电转化杯中，冰浴5 min，在Bio-Rad电转化仪中进行电击转化，电脉冲参数为电压1500 V，5 ms。电击后立即加入1 ml预冷的1 mol/L山梨醇，将混合液转移到1.5 ml离心管，30 ℃温育1 h。取200 μl铺在含有100～500 μg /ml Zeocin的YPD平板上，30 ℃恒温培养培养2～3天至平板长出乳白色酵母转化菌落。

三、酵母转化子的PCR鉴定

挑取上述酵母转化菌落，用酵母表达载体的上下游通用引物5’pGAPForward/3’AOX I，α-factor/3’AOX I, Y1/3’AOX I分别进行PCR检测，PCR反应体系：10×Taq 缓冲液5μl，dNTPs（2.5mM）5 μl，酵母转化子0.5 μl，上下游引物各2.5 μl，rTaq 酶（5U/ul）1 μl，ddH₂O 33.5 μl。

结果如图2所示。

四、DENV1～4VLPs的Western blot鉴定

挑取经PCR鉴定为阳性的含有重组载体【pGAPZ-α-PrMED1，pGAPZ-sPrME472-D2，pGAPZ-sPrME-D3，pGAPZ-sPrME-D4，】的酵母转化子分别接种于3 ml YPD液体培养基（100μg/ml Zeocin）中，30 ℃，250 rpm有氧振荡培养12 h。接着按1:100比例将菌液转至100 ml新鲜YPD发酵培养液中，30 ℃振荡培养120 h，4 ℃ 10,000 rpm离心，分别收集上清和菌体，保存于－70 ℃备用。用裂解缓冲液（50 mM NaH₂PO₄,1 mM PMSF,1 mM EDTA，5% glycerol，pH 7.4）裂解细胞。以空载体pGAPα A的X33转化子作对照。

取80 μl上清与20 μl 5×上样缓冲液混合，20 μl细胞裂解液与等量的2×上样缓冲液混合，煮沸10 min。样品冷却后，进行SDS-PAGE。每个点样孔加30 μl样品。电泳结束后，将一块胶进行考马斯亮蓝染色，相同点样顺序的另一块胶进行Western blotting检测。经半干电转法，将蛋白转移到PDVF膜上，以DENV1～4的抗E单抗（商品化试剂）或以抗DENV1～4免疫的多抗血清为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG为二抗（1：2000美国 Sigma），DAB显色，结果如图6所示。在各重组子的细胞裂解液和发酵上清均可检测到约50 kDa的E蛋白和20 kDa prM蛋白。

实施例3 DENV1～4VLPs的制备和鉴定

一、蔗糖密度梯度离心分离病毒样颗粒

收获培养的酵母细胞，将细胞裂解液上清用10～50％蔗糖密度梯度超速离心法对DENV1-4 VLPs进行纯化，吸取30～40%含絮状的病毒样颗粒层进行SDS-PΑGE和Western blotting检测。图7为纯化VLPs的Western blot鉴定图。

二、电镜技术检测病毒样颗粒

将上述纯化法得到的含病毒样颗粒的溶液层进行负染电镜观察, 如图8所示，直径为30 nm和 55 nm直径的VLPs均被检测到。用一定稀释浓度的抗DENV-2血清进行免疫电镜观察，如图9，亦观察到直径为30 nm和 55 nm直径的VLPs。收集培养72h的重组酵母细胞进行透射电镜观察表达VLPs的重组酵母细胞超微结构，如图10所示，在酵母细胞的胞浆中形成了许多双层膜囊泡结构，每个囊泡中都充满了直径约为30-55 nm 左右呈结晶状排列的DENV-2 VLPs，本发明的VLPs无论是在形态结构，蛋白和膜组份，甚至在颗粒的组装上都与感染细胞释放的DENV病毒粒子具有类似的特征。

实施例4 DENV1～4VLPs的初步免疫学研究

一、免疫方案

4-6周龄Balb/c 小鼠，在0、7、28天注射DENV-1 VLPs或DENV-2 VLPs，灭活病毒免疫组和PBS免疫组作为对照。

二、ELISA检测血清抗体

1. 标准抗原的滴定：包被纯化的VLPs，进行倍比稀释。一抗为1:100稀释的抗VLPs血清。测定OD_450nm的吸收值，以阳性OD/阴性OD大于2.1为抗原最高稀释度。

2. 抗原包被：将纯化的VLPs抗原，按100 μl/孔加入96孔板中，37℃，1h，然后置于4℃过夜。PBST洗板3次；

3. 封闭：加入4％BSA的PBST，200 μl/孔，37℃封闭1h；

4. 加入从1：20开始进行倍比稀释的各免疫组的血清，100 μl /孔，37℃温育1h，PBST洗板3次；

5. 加入HRP标记的山羊抗小鼠 IgG(1:3000)，100 μl/孔，37℃温育1h，PBST洗板3次；

6. 加入TMB底物100 μl/孔，37℃温育40 min。加入终止液50 μl/孔，测定波长为450 nm 的OD值,以阳性血清OD/阴性血清OD大于2.1的血清稀释度为最高的抗体稀释倍数。结果如图11所示。

三、中和试验检测血清抗体的中和活性

1. 将DENV-2 NGC株病毒作10倍系列稀释（用MEM维持液），接种细胞板，每稀释度接种4孔，37℃培养逐日观察病变情况，并记录。最后根据能使50%细胞产生病变计算TCID₅₀。

2. 将各免疫组血清用0.22 μm的滤膜过滤，然后在56℃水浴，灭活30 min。

3. 用无血清的MEM将血清进行倍比稀释1：8~1：256。

4. 用MEM维持液将DENV-2稀释成100 TCID₅₀。

5. 将等量的100 TCID₅₀ DENV-2稀释液与不同稀释度的血清进行混合，然后在37℃水浴，中和1h。每稀释度种4孔细胞，在37℃ CO₂温箱培养7天后观察细胞病变并记录。设灭活DENV-2免疫血清加病毒对照，PBS血清加病毒对照，PBS血清加MEM对照。

6. 根据细胞病变计算50%血清中和终点，即能保护50%细胞不产生病变的血清稀释度。即为其中和效价。所测中和效价为1：16～1：45。

进一步地，本发明还对DENV-3 VLPs和DENV-4 VLPs的免疫原性进行了初步检测，结果表明二者均能产生具有一定中和活性的抗体。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.登革病毒1-4病毒样颗粒重组载体转化的P .pastoris酵母菌株，其分别为pGAPZ-α-PrMED1-X33、pGAPZ-sPrME472-D2-X33、pGAPZ-sPrME-D3-X33和pGAPZ-sPrME-D4-X33，分别于2011年3月14日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，编号分别为CCTCC M 2011063、CCTCC M 2011064、CCTCC M 2011065和CCTCC M 2011066。

2.登革病毒1-4病毒样颗粒，其特征在于由权利要求1所述重组载体转染P.pastoris酵母X33细胞并分泌所得。

3.登革病毒1-4病毒样颗粒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

2）对1～4 型登革病毒CprM-E或prME基因的表达元件进行改造，在prM基因N端设计理想的信号肽序列，替换四型登革病毒E基因锚定区的部分基因；

5）用SDS-PAGE和Western blot检测目的基因表达；

6）用15-60质量%蔗糖密度梯度离心和电镜技术，检测病毒样颗粒的形态特征。

4.登革病毒1-4病毒样颗粒在制备预防登革类疾病的疫苗中的应用。