CN105349562B - 表达猪细小病毒vp2蛋白的重组载体、重组菌及其应用 - Google Patents

表达猪细小病毒vp2蛋白的重组载体、重组菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105349562B
CN105349562B CN201510949952.2A CN201510949952A CN105349562B CN 105349562 B CN105349562 B CN 105349562B CN 201510949952 A CN201510949952 A CN 201510949952A CN 105349562 B CN105349562 B CN 105349562B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ppv
protein
recombinant
bacterium
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510949952.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105349562A (zh
Inventor
华涛
张道华
唐波
张雪花
唐应华
常晨
刘国洋
陆吉虎
吴培培
于漾
侯继波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Academy of Agricultural Sciences filed Critical Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201510949952.2A priority Critical patent/CN105349562B/zh
Publication of CN105349562A publication Critical patent/CN105349562A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105349562B publication Critical patent/CN105349562B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体、重组菌及其应用，属于生物技术领域。表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，是将猪细小病毒VP2蛋白编码基因***原核表达载体pEASY‑blunt E1后得到。本发明还提供表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，是将所述重组载体导入大肠杆菌后获得。本发明表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，导入大肠杆菌后，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白具有血凝性和优异的抗原性，有望应用于制备猪细小病毒疫苗。采用本发明重组菌能够高效制备猪细小病毒VP2蛋白，生产成本低、操作简单、不操作猪细小病毒具有更好的生物安全性。

Description

表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体、重组菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体、重组菌及其应用。
背景技术
猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，尤其是初产母猪在没有免疫的条件下发病更为严重，以死胎、木乃伊胎、死产、母猪流产、延期发情和产弱仔为主要特征。1967 年Cartwright首次分离出PPV后, 该病毒在世界范围内广泛传播和流行。上世纪80年代我国改革开放以后，随着规模化猪场逐渐增多，PPV在我国的感染越发严重, 阳性检出率达90%以上，给我国的养猪产业带来了巨大的经济损失。PPV属于细小病毒科，细小病毒属，PPV基因组编码有3种结构蛋：VP1 、VP2 和VP3 ，3种非结构蛋白：NS1 、NS2 和NS3。其中VP2蛋白是构成PPV病毒衣壳的主要结构蛋白, 且是最重要的免疫保护性抗原。
许多研究和临床实践表明疫苗免疫是控制PPV流行的一个很有效的方法。猪体免疫后，主要通过产生体液免疫应答来获得抵抗PPV感染的保护力。我国用于预防 PPV 的疫苗主要为灭活疫苗，即将PPV在ST细胞等猪源传代细细胞系上进行培养，分离去除细胞杂质获得具有感染性病毒，之后用化学试剂灭活、佐剂混合制成疫苗。PPV灭活疫苗具有安全性好、不需要低温保存等优点。但灭活疫苗也存在着生产成本昂贵、生产耗时长、需要大量劳动力、且免疫效果不稳定的缺点；另外，灭活的化学试剂和残留病毒DNA可能对免疫猪体存在危险性。新型PPV亚单位疫苗获得了广泛的研究，VP2在体外表达后不仅具有良好的免疫原性, 而且可以诱导产生强烈免疫保护性。目前用于研究猪细小病毒亚单位疫苗抗原的表达***主要是杆状病毒感染的昆虫细胞表达***，其表达蛋白具有高可溶性和血凝性，能产生病毒样颗粒，免疫保护效果较好，但其生产成本比PPV灭活疫苗高出数倍，在生产操作方面更为复杂，对人员素质要求更高。通常情况下，原核表达***相比较于真核***，蛋白表达量高、生产成本低，生产操作更为简单，对人员素质要求也更低，但是现有技术中，采用原核表达***制备的VP2蛋白为不具有可溶性和血凝性的包涵体，免疫原性较差，免疫后免疫指标不好用通用HI试验进行评定。
发明内容
本发明目的是提供表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，将该重组载体导入大肠杆菌后，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白具有血凝性和优异的抗原性。
本发明的另一目的是提供制备猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白具有血凝性和优异的抗原性，可以用于制备猪细小病毒疫苗。
本发明的再一目的是提供制备猪细小病毒VP2蛋白的方法，该方法能够高效制备VP2蛋白、生产成本低、操作简单，不操作猪细小病毒具有更好的生物安全性。从实际操作性考虑，有望代替灭活疫苗制苗用抗原。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，是将猪细小病毒VP2蛋白编码基因***原核表达载体pEASY-blunt E1后得到。
在本发明中，所述猪细小病毒VP2蛋白编码基因来源于猪细小病毒PPV-JS 株。
本发明还提供表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，是将所述重组载体导入大肠杆菌后获得。
所述大肠杆菌为BL-21。
本发明还提供所述重组菌在制备猪细小病毒VP2蛋白方面的应用。
在本发明中，所述应用包括诱导所述重组菌表达猪细小病毒VP2蛋白的步骤。
优选的技术方案在，在重组菌培养物OD600达到0.4-0.6时，采用IPTG诱导表达猪细小病毒VP2蛋白。
优选的技术方案中，IPTG添加至重组菌培养物中的终浓度为0.05-0.2mM。
本发明表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，导入大肠杆菌后，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白具有血凝性和优异的抗原性，有望应用于制备猪细小病毒疫苗。采用本发明重组菌能够高效制备猪细小病毒VP2蛋白，生产成本低、操作简单、不操作猪细小病毒具有更好的生物安全性。
附图说明
图1显示了VP2蛋白编码基因的扩增结果，其中泳道M为DL 2 000 Marker，其余泳道为PCR扩增产物。
图2显示了重组质粒p-PPV-VP2的双酶切鉴定结果，其中泳道M为DL 2 000Marker，泳道1为阳性重组质粒p-PPV-VP2。
图3显示了VP2蛋白在BL-21-VP2和对照菌BL-21-p中的表达情况。Marker：ThermoScientific PageRuler 预染Ladder；1：对照菌BL-21-p裂解液上清；2：BL-21-VP2裂解液上清；3：对照菌BL-21-p裂解液沉淀；4：BL-21-VP2裂解液沉淀。
图4是各样品血凝性检测结果，每行左边显示了孔的编号，每行样品从左往右浓度依次降低。
图5显示了OD600为0.4、0.5和0.6时诱导后，菌体裂解液上清的血凝性检测结果，其中最左边的标记表明每行样品诱导前的OD600值，右边给出每行样品的血凝效价。
图6. 采用PPV-JS或BL-21-VP2的4单位抗原检测待检血清的HI抗体效价结果，其中左边的文字指出每行检测的血清，右边的文字指出孔的编号。
具体实施方式
实施例1 构建表达VP2蛋白的重组菌
一 构建重组表达载体
1.引物设计
参照 PPV- NADL2株基因序列（KF049424.1），应用 Primer premier 5.0 软件设计引物PPV-VP2-kpn i和PPV-VP2-bamh i，用于扩增猪细小病毒PPV-JS株（缩写为PPV-JS株，公开于CN102965345A，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCCNO.6605）VP2 蛋白编码基因全部序列。
PPV-VP2-kpn i的核苷酸序列（SEQ ID NO：2）如下：ggtaccATGAGTGAAAATGTGGAACAAG，PPV-VP2-bamh i的核苷酸序列（SEQ ID NO：3）如下：ggatccCTAGTATAATTTTCTTGGTAT，由上海英骏生物有限公司合成。其中PPV-VP2-kpn i携带KpnⅠ酶切位点，PPV-VP2-bamh i携带BamhⅠ酶切位点。
2.PPV-JS株基因组 DNA 的提取
（1）取PPV-JS株病毒样品450μl加入50μl、浓度为10%的SDS溶液，加入3μl蛋白酶K；
（2）在56℃水浴中震荡条件下孵育30min；
（3）加入500μl的TRIS-酚，混匀，5分钟后，在4℃、10000-12000r/min条件下离心10分钟；
（4）取上清，加入1:1（V/V）混合的TRIS-酚和氯仿混合物500μl，作用5分钟后10000-12000r/min离心10分钟；
（6）取上清，加入500μl的氯仿，作用5分钟，10000-12000r/min离心10分钟；
（7）取上清，加上清体积2倍的无水乙醇和10%（体积百分浓度）的醋酸钠水溶液；
（8）将步骤（7）所得混合物置于-20℃下30分钟以上；
（9）取-20℃下放置的样品在4℃、10000r/min离心10分钟；
（10）弃上清，在沉淀中加入75%（体积百分浓度）的乙醇水溶液，在4℃、6500r/min离心5分钟，弃去上清；重复2遍；
（11）吸干或者晾干乙醇；
（12）加入30μl的ddH2O溶解，得到PPV-JS株基因组 DNA，置于-20℃下保存。
3.VP2蛋白编码基因的扩增和纯化回收
（1）将反应体系设定为50 μL体系：0.5 μL PrimerSTAR 高保真酶，10 μL 5×PSBuffer，4 μL dNTPs，引物PPV-VP2-kpn i和PPV-VP2-bamh i各1 μL（20 μmol/L），2μL PPV-JS株基因组DNA，28.5μL ddH2O。
（2）反应条件：98℃ 2min；98℃ 15s，60℃ 30 s，72 ℃ 2min，30个循环；72℃5min。产物在4℃保存。
（3）采用1%琼脂糖凝胶电泳回收扩增的基因片段，以DL 2 000 Marker作为对照。结果如图1所示，在大约1.7kb处出现特异性的VP2蛋白编码基因条带。采用OMEGA DNA 凝胶回收试剂盒回收VP2蛋白编码基因。具体操作见说明书。
猪细小病毒PPV-JS株VP2蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
PCR过程中用到的试剂购自TAKARA 。
4. 表达质粒的构建
（1）将VP2蛋白编码基因***pEASY-blunt E1原核表达载体（购自北京全式金生物技术有限公司），构建重组质粒p-PPV-VP2。连接体系为 5μL体系：2μL VP2蛋白编码基因胶回收产物，1 μL pEASY-blunt E1载体，2μL ddH2O。24℃连接20min。
（2）将连接产物加入到100μL的DH5α感受态细胞中，冰浴30 min，之后42℃热休克90 s，冰浴5 min。加入1mL LB 培养基，37℃摇床上180 rpm培养 1 h，取出后10000g离心1min，弃800μL上清，留200 μL上清重悬菌体，全部涂布具有氨苄（Amp）抗性的LB 平板上，37℃培养过夜。
（3）随机挑取上述LB平板上的单菌落，接种于具有氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃过夜培养。
5. 质粒的提取
采用鼎国质粒小量提取试剂盒提取本实施例步骤4中挑选到的重组菌内的质粒，具体操作步骤见试剂盒说明书。
6. 重组质粒的鉴定
10μL双酶切鉴定体系：0.5μL BamHⅠ，0.5μL KpnⅠ，1μL 10×K Buffer，4 μL质粒，4μL ddH2O，37℃酶切1 h。酶切产物的电泳图如图2所示，质粒经BamHⅠ和KpnⅠ酶切鉴定正确，为阳性重组质粒，命名为p-PPV-VP2。将重组质粒p-PPV-VP2送英骏公司测序，测序正确。
二 构建重组菌
1. 重组质粒p-PPV-VP2转化表达菌
（1）按照常规方法，将p-PPV-VP2重组质粒转化大肠杆菌BL-21的感受态细胞，然后涂布于含50 μg/mL Amp（氨苄青霉素）抗性的LB平板上，37℃培养过夜。
（2）挑取上述Amp抗性LB平板上的单菌落，命名为重组菌BL-21-VP2，接种于含50 μg/mL Amp抗性的 LB 液体培养基中，在37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。
按照上述相同方法，将质粒pEASY-blunt E1转化BL-21的感受态细胞，得到对照菌BL-21-p。
2. 重组菌诱导表达和SDS-PAGE鉴定
（1）将BL-21-VP2和对照菌BL-21-p培养液分别按1:100（体积比） 接种含50 μg/mlAmp的LB液体培养基。
（2）在37℃、200rpm条件下培养下2h，此时OD600大约为0.4。
（3）加入终浓度为0.1 mM的IPTG，在37℃、200rpm条件下振荡培养4小时。
（4）培养结束后，分别取5ml BL-21-VP2和对照菌BL-21-p菌液，超声破碎处理后，离心分离菌体裂解液上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳。结果如图3所示，BL-21-VP2裂解液上清中存在目的条带，且上清具有较高血凝活性，HA效价达到29，重组菌BL-21-VP2裂解液沉淀中存在目的蛋白的包涵体，血凝活性很低，HA效价仅为25，说明VP2蛋白在BL-21-VP2中实现了可溶性表达，且表达的VP2蛋白血凝效价较高。HA效价的检测方法见实施例2。
实施例2 VP2蛋白血凝性鉴定和血凝价（HA）测定
1. 1% 豚鼠红细胞液的制备
（1）用注射器吸取抗凝剂（4%柠檬酸钠溶液）1mL；取至少1只SPF豚鼠，采血约4mL，与1mL抗凝剂混合，然后缓慢加入10mL离心管中混匀。
（2）洗涤豚鼠红细胞：将步骤（1）中10mL离心管中的血液混合物在1500 rpm条件下离心10min，弃上清，取沉淀物，加入5ml PBS缓冲液（pH 7.2,是含有下述成分的水溶液：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L， 下同），轻轻混合，再经1500 rpm离心10min，吸管移去上清和沉淀红细胞上层的白细胞薄膜。洗涤过程重复2次后，加入5mL PBS缓冲液（pH 7.2）轻轻混合红细胞，4℃保存备用，5天内使用。
（3）20%豚鼠红细胞液： 取步骤（2）处理后得到的红细胞，在锥形刻度离心管中1500rpm离心10分钟，弃去清，观察离心管中红细胞体积，加入4倍体积的PBS缓冲液（pH7.2），混合均匀，得到20%豚鼠红细胞液。
(4) 10%豚鼠红细胞液： 取步骤（2）处理后得到的红细胞，在锥形刻度离心管中1500rpm离心10分钟，弃去清，观察离心管中红细胞体积，加入9倍体积的PBS缓冲液（pH7.2），混合均匀，得到10%豚鼠红细胞液。
(5)1%豚鼠红细胞液：取10%豚鼠红细胞液1 mL，加入9mL PBS缓冲液（pH 7.2），混合均匀，得到1%豚鼠红细胞液。
2. VP2蛋白血凝性鉴定和血凝（HA）效价测定
取实施例1标题二中步骤2制备的BL-21-VP2裂解液上清液和沉淀，来验证本发明方法制备的VP2蛋白的血凝性。将BL-21-VP2裂解液沉淀采用上清等体积的PBS缓冲液（pH7.2）重悬，得到VP2蛋白包涵体重悬液。
96孔V型血凝反应板每行孔检测不同的样品，分别编号为PBS空白对照、PPV阳性对照、对照菌BL-21-p阴性对照、样品孔1（VP2蛋白包涵体重悬液）和样品孔2（BL-21-VP2裂解液上清液）。每孔中先加入25μL的PBS缓冲液（pH7.2），然后在每排孔的第一个孔中加入样品，样品孔1中加入25μL VP2蛋白包涵体重悬液，样品孔2中加入25μL BL-21-VP2裂解液上清液，PBS空白对照中加入25μL PBS缓冲液（pH7.2），PPV阳性对照中加入25μL血凝价为29的PPV-JS株病毒抗原液（采用ST细胞扩增PPV-JS株病毒抗原获得），对照菌BL-21-p阴性对照中加入25μL对照菌BL-21-p全菌诱导前超声裂解液。对各样品分别进行2倍倍比稀释，然后在每孔中加入25μL的PBS缓冲液（pH7.2），最后在每孔中加入1%豚鼠红细胞液25μL，在37℃作用2h后，观察结果。
结果如图4，BL-21-VP2表达的可溶性VP2蛋白具有血凝性，血凝效价高达29，与PPV-JS株病毒抗原液的血凝价相似；VP2蛋白包涵体的血凝效价（HA）较低，仅仅只有25。
实施例3 VP2蛋白制备方法条件优化
1. 重组菌BL-21-VP2诱导前的最适菌浓度优化
（1）将BL-21-VP2菌液按体积比为 1:100 接种至含有50 μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中。
（2）在37℃、200rpm条件下培养2~3h，选择OD600(菌体细胞密度)为0.4、0.5和0.6时的菌液，分别加入终浓度为0.1 mM的IPTG，然后在37℃、200rpm条件下振荡培养4小时，进行诱导表达。
（3）培养结束后，取5ml菌液超声，12000rpm离心，取裂解液上清，按照实施例2中方法检测血凝效价，以判断可溶性VP2蛋白的表达量。
结果如图5所示，OD600为0.4、0.5和0.6时诱导后，菌体裂解液上清的血凝效价分别达到29、210和211。 即在菌体浓度OD600=0.6时进行诱导，VP2蛋白原核表达的血凝效价最高，达到211。
实施例4 VP2蛋白制作4单位抗原应用于血凝抑制试验（HI）
1. 原核表达的VP2蛋白制作4单位抗原
取血凝效价是 29的PPV-JS株病毒液（采用ST细胞扩增获得）采用PBS缓冲液（pH7.2）稀释成4 倍抗原，即将PPV-JS株病毒液进行2倍倍比稀释，直至稀释液的血凝效价为22，得到PPV-JS的4单位抗原。将实施例3中血凝效价为29的BL-21-VP2裂解液上清进行2倍倍比稀释，取血凝效价为22的稀释液作为BL-21-VP2的4单位抗原。
2. 猪PPV阴性血清、阳性血清处理
取200μL猪PPV阴性血清和PPV疫苗免疫过后的阳性血清分别进行如下处理：将血清在56℃水浴锅中灭活处理30min，加入400μL、25%（质量百分浓度）白陶土悬液，混匀后室温放置30 min，4000rpm离心10min，取上清液，加入200μL、20%豚鼠红细胞液，振荡混匀后在37℃作用1 h；4000rpm离心10min，吸取上清，作为 1：4 稀释的血清样品。
3. 血凝抑制试验
分别采用BL-21-VP2、PPV-JS的4单位抗原来检测处理后的猪PPV阳性血清的HI抗体效价,以考察BL-21-VP2表达的VP2蛋白的抗原性。同时设对照菌BL-21-p阴性对照（对照菌BL-21-p全菌诱导前超声裂解液）。
在标准96孔v型血凝反应板各孔中都加入25μL的PBS缓冲液（pH7.2），每行孔检测不同的样品，分别编号为BL-21-VP2抗原孔、PPV-JS抗原孔和对照菌BL-21-p阴性对照。每行中第1孔中加入25μL处理后的待检血清，混匀，取出25μL加至第 2 孔，依此类推对处理后的待检血清进行2倍倍比稀释，直到第12孔，弃25μL。BL-21-VP2抗原孔中，每孔加入BL-21-VP2的4单位抗原25μL；PPV-JS抗原孔中，每孔加入PPV-JS的4单位抗原25μL；对照菌BL-21-p阴性对照中，每孔加入对照菌BL-21-p全菌诱导前超声裂解液。37℃作用 1 h，每孔加入1%豚鼠红细胞液25μL，振荡混匀，置37℃作用2 h，观察结果。
结果如图6，可见以PPV-JS或BL-21-VP2的4单位抗原检测到的待检血清的HI抗体效价大小相同，均为27，显示本发明制备的VP2蛋白与PPV-JS株病毒具有相同抗原性，抗原表位与原病毒相似，这是现有技术中原核表达的VP2蛋白所不具备特性，因此本发明制备的VP2蛋白具有应用于疫苗的前景。上述结果说明，本发明制备的VP2蛋白不仅与PPV-JS株病毒具有相同的凝集豚鼠红细胞血凝性，且均能与血清中PPV特异性抗体发生反应，抑制红细胞凝集。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体、重组菌及其应用
<130> 20151218
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1740
<212> DNA
<213> 猪细小病毒PPV-JS株
<400> 1
atgagtgaaa atgtggaaca acacaaccct attaatgcag gcactgaatt gtctgcaaca 60
ggaaatgaat ctgggggtgg gggcggcggt ggcgggggta ggggtgctgg gggggttggt 120
gtgtctacag gtactttcaa taatcaaaca gagtttcaat acttggggga gggcttggtt 180
agaatcactg cacacgcatc aagactcata catctaaata tgccagaaca cgaaacatac 240
aaaagaatac atgtactaaa ttcagaatca ggggtggcgg gacaaatggt acaagacgat 300
gcacacacac aaatggtaac accttggtca ctaatagatg ctaacgcatg gggagtgtgg 360
ttcaatccag cggactggca gttaatatcc aacaacatga cagaaataaa ctgggttagt 420
tttgaacaag aaatattcta tgtagtactt aaaacaatta cagaatcagc aacctcacca 480
ccaaccaaac tatataataa tgatcgaact gcaagcttaa tggtcgcact agacaccaat 540
aacacacttc catacacacc agcagcacct agaagtgaaa cacttggttt ttatccatgg 600
ttacctacaa aaccaactca atacagatat tacctatcat gcatcagaaa cctaaatcca 660
ccaacataca ctggacaatc acaacaaata acagactcaa tacaaacagg actacacagt 720
gacattatgt tctacacaat agaaaatgca gtaccaattc atcttctaag aacaggagat 780
gaattctcca caggaatata tcactttgac acaaaaccac taaaactaac tcactcatgg 840
caaacaaata gatctctagg actgcctcca aaactactaa ctgaacctac cacagaagga 900
gaccaatacc caggaacact accagcagct aacacaagaa aaggttatca ccaaacaact 960
aataatagct acacagaagc aacagcaatt aggccagctc aggtaggata taatacacca 1020
tacatgaatt ttgaatactc caatggtgga ccatttctaa ctcctatagt accaacagca 1080
gacacacaat ataatgatga tgaaccaaat ggtgctataa gatttacaat gggttaccaa 1140
catggacaat taaccacatc ttcacaagag ctaggaagat acacattcaa tccacaaagt 1200
aaatgtggaa gagctccaaa tcaacaattt aaccaacagg caccactaaa cctagaaaat 1260
acaaataatg gaacacgttt accttcagat ccaataggag ggaaatctaa catgcatttc 1320
atgaatacac tcaatacata tggaccatta acagcactaa acaatactgc acctgtattt 1380
ccaaatggtc aaatatggga taaagaactt gatacagatc taaaacctag actacatgtt 1440
acagctccat ttgtttgtaa aaacaatcca ccaggacaac tatttgtaaa aatagcacca 1500
aacctaacag atgatttcaa tgctgactct cctcaacaac ctagaataat aacttattca 1560
aacttttggt ggaaaggaac actaacattc acagcaaaaa tgagatccag taatatgtgg 1620
aaccctatta gacaacacac aacaacagca gaaaacattg gtaaatatat tcctacaaat 1680
attggtggca tgaaaatgtt tccagaatat tcacaactta taccaagaaa attatactag 1740
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物PPV-VP2-kpn i
<400> 2
ggtaccatga gtgaaaatgt ggaacaag 28
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PPV-VP2-bamh i
<400> 3
ggatccctag tataattttc ttggtat 27

Claims (7)

1.表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，其特征在于将猪细小病毒VP2蛋白编码基因***原核表达载体pEASY-blunt E1后得到，所述猪细小病毒VP2蛋白编码基因来源于猪细小病毒PPV-JS 株。
2.表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，是将权利要求1所述重组载体导入大肠杆菌后获得的。
3.根据权利要求2所述表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，其特征在于所述大肠杆菌为BL-21。
4.权利要求3所述重组菌在制备猪细小病毒VP2蛋白方面的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于包括诱导所述重组菌表达猪细小病毒VP2蛋白的步骤。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于在重组菌培养物OD600达到0.4-0.6时，采用IPTG诱导表达猪细小病毒VP2蛋白。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于IPTG添加至重组菌培养物中的终浓度为0.05-0.2mM。
CN201510949952.2A 2015-12-18 2015-12-18 表达猪细小病毒vp2蛋白的重组载体、重组菌及其应用 Active CN105349562B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510949952.2A CN105349562B (zh) 2015-12-18 2015-12-18 表达猪细小病毒vp2蛋白的重组载体、重组菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510949952.2A CN105349562B (zh) 2015-12-18 2015-12-18 表达猪细小病毒vp2蛋白的重组载体、重组菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105349562A CN105349562A (zh) 2016-02-24
CN105349562B true CN105349562B (zh) 2019-08-09

Family

ID=55325624

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510949952.2A Active CN105349562B (zh) 2015-12-18 2015-12-18 表达猪细小病毒vp2蛋白的重组载体、重组菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105349562B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105820216A (zh) * 2016-05-28 2016-08-03 青岛易邦生物工程有限公司 一种猪细小病毒vp2蛋白
CN105879024B (zh) * 2016-05-28 2020-11-27 青岛易邦生物工程有限公司 一种猪细小病毒亚单位疫苗
CN106148358A (zh) * 2016-07-15 2016-11-23 河南省农业科学院 一种利用大肠杆菌表达***制备猪细小病毒病毒样颗粒亚单位疫苗的方法及应用
CN107400676A (zh) * 2017-07-17 2017-11-28 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 表达pedv的m+n双基因的原核融合表达载体及应用
CN110845580A (zh) * 2019-11-05 2020-02-28 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
in silico prediction and in vitro identification of bluetongue virus 4 VP5 protein B-cell epitopes;L.Sun et al.;《appl microbiol biotechnol》;20131212;3033-3047 *
两株猪细小病毒的分子特征及其重要蛋白的原核表达;戚亭;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20081015;摘要，第32页第3.1.6.2节,第38页第3.2.4节 *
我国2株野生动物源细小病毒VP2和NS1基因序列及所编码蛋白的分析;梁萌等;《中国兽医学报》;20130331;第33卷(第3期);345-350 *
猪细小病毒LXB-PPV-20-06株VP2蛋白原核表达载体的构建与表达;戚亭等;《中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会论文集》;20080901;摘要 *
猪细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性;吕建强等;《微生物学报》;20021231;第42卷(第6期);675-679 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105349562A (zh) 2016-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105349562B (zh) 表达猪细小病毒vp2蛋白的重组载体、重组菌及其应用
CN106479986B (zh) 一种o型***病毒样颗粒及其制备方法和用途
CN103539842B (zh) 草鱼呼肠孤病毒ⅱ型s10基因编码的重组蛋白、由其制备的多克隆抗体及应用
CN107432930B (zh) 一种i群4型禽腺病毒dna疫苗及其制备方法和应用
CN113293148B (zh) 一种h基因替换的嵌合麻疹减毒株的构建
CN115998856A (zh) 一种新冠流感免疫原性组合物及其制备方法和应用
CN107227311A (zh) 重组猪细小病毒样粒子及其制备方法和应用
US11607448B2 (en) Whole avian-origin reverse genetic system and its use in producing H7N9 subtype avian influenza vaccine
CN101418314A (zh) 山羊痘疫苗株表达载体
CN107298700B (zh) 人工改造的PCV2 Rep蛋白、重组PCV2病毒及其应用
CN102416174A (zh) 猪o型***重组噬菌体疫苗及其构建方法
CN108315306A (zh) 一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法
CN102337248B (zh) 表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组BHK细胞系及其应用
CN106929487A (zh) 一种***病毒嵌合病毒样颗粒及其制备方法
CN104292338A (zh) 含sars病毒n抗原的重组蛋白及展示n蛋白的杆状病毒
CN106399267A (zh) 表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHOH及构建方法
CN110846326A (zh) 一种貉细小病毒vp2基因、表达载体、重组菌、制备vp2蛋白的方法和组装方法
CN108179155A (zh) 一种PCV2 Cap标记蛋白的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建方法
CN105132437B (zh) 表达鼠伤寒沙门菌OmpL蛋白的重组猪痘病毒载体疫苗
CN103614329A (zh) 一种j亚群禽白血病dna疫苗的构建及应用
CN102363751A (zh) 登革病毒样颗粒及其制备方法与应用
CN102643335A (zh) 重组轮状病毒vp6载体蛋白及其制备
CN101422606A (zh) 抗家畜亚洲ⅰ型***病毒基因工程多肽疫苗及其制备方法
CN106497951B (zh) 一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株、构建方法及其应用
CN106110319B (zh) 猪瘟病毒e2基因重组杆状病毒灭活疫苗制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant