CN101899466A - 登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒颗粒疫苗及其制备方法。所述的嵌合假病毒颗粒是将克隆了登革病毒和日本脑炎病毒结构基因的重组表达质粒转染到靶细胞中表达而得到的。所述的嵌合假病毒制备方法包括1)含有登革病毒和日本脑炎病毒结构蛋白编码序列的重组表达质粒的构建；2)将重组质粒导入靶细胞并进行稳定转染细胞克隆的筛选；3)培养稳定转染的细胞，从而产生登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒颗粒；4)从细胞培养上清中提取并纯化嵌合假病毒颗粒。该疫苗嵌合了登革病毒和日本脑炎病毒的抗原组分，可以刺激机体产生免疫应答，进而预防登革病毒和/或日本脑炎病毒感染性疾病，具有免疫效果好、安全、适于产业化生产的优点。
Description
技术领域
本发明涉及登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒及其制备方法，本发明还涉及登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒在作为疫苗研究方面的用途。
背景技术
登革病毒(Dengue virus，DV)和流行性乙型脑炎病毒(国际上称为日本脑炎病毒，Japanese encephalitis virus，JEV)均为黄病毒科的单股正链RNA病毒，以蚊虫为媒介进行传播。DV所致的登革热(Dengue fever，DF)、登革出血热和登革休克综合症(Denguehemorrhagic fever/Dengue shock syndrome，DHF/DSS)广泛流行于热带和亚热带地区，全球有25～30亿人生活在流行区内，每年有1亿以上的人遭受感染，其中约100万人发展成严重的DHF/DSS，死亡率5～20％(Chaturvedi UC.J Biosci.2008；33(4)：429-441)。我国海南、广东、广西、福建、浙江和台湾等地区都是登革热的重点流行区域，多次发生DF、DHF/DSS的爆发流行，给流行区人们的健康带来严重影响。JEV所致的日本脑炎，也称流行性乙型脑炎(简称乙脑)主要流行于亚洲，威胁着约30亿人的健康，每年约5万人感染，死亡率29％，得过乙脑的幸存者多有神经和精神后遗症，我国是乙脑流行的重点区域(Wang H，et al.Jpn J Infect Dis.2009；62(3)：331-336)。
目前，对DV感染性疾病仍无特异的治疗手段，也无安全有效的疫苗问世。对乙脑的预防虽有灭活疫苗和减毒活疫苗，但接种后易发生播散性脑脊髓膜炎(Acute Disseminated EncephaloMyelitis，ADEM)和过敏反应，减毒活疫苗接种更是存在病毒活力增强致病风险。
现有技术中的疫苗包括以下几种：
灭活疫苗：如第一个乙脑灭活疫苗BIKEN/JE
是由1935年首次分离自日本的Nakayama流行毒株经鼠脑培养、***灭活后制成的，使用半个多世纪后，保护力日趋低下，且ADEM等毒副作用日益明显。
减毒活疫苗：我国1988年自行研制的SA14-14-2减毒株在乙脑的预防上发挥了极大作用，人群保护率60-96％，据2005年WHO统计，该减毒疫苗的使用超过全球乙脑疫苗市场份额的50％，但目前国际上对其安全性仍存在争议，尚未被美国和欧洲等接受。
美国00807995公开了一种减毒登革病毒的疫苗组合物。该减毒病毒通过在P D K细胞中连续传代得到。施用减毒的登革-1、登革-2、登革-3和登革-4病毒可刺激个体的免疫***以诱导抵御所有四种登革病毒血清型的保护作用。由于减毒病毒存在独立增强制备的风险，因而限制其应用。
日本99801764提供了一种比常规疫苗高约2-10倍效价的新的灭活病毒颗粒以及增强免疫原，及其制备方法。但仅用作由日本脑炎病毒群引起的感染性疾病的诊断试剂。
Beasley等(PLoS Pathog.2010；6(2)：e1000790)公开了一种以黄热病病毒YFV-17D为载体的乙脑重组疫苗，但是由于携带了重组的病毒特异性基因，在体内存在活力增强的风险，因此限制了该疫苗的适用范围。
基因工程亚单位疫苗：目前虽还没有登革热疫苗上市，但印度(Etemad B，et al.2008)和我国学者(Chen S，et al.2007)将4种血清型登革病毒E蛋白的特定区域融合在一起，构建成4价重组蛋白疫苗，在动物水平有一定保护作用，中和滴度为1∶47-1∶588，对各型DV的保护力差异较大，相比较而言，亚单位疫苗的保护效果不如颗粒性疫苗。
古巴200680051377公开了利用E蛋白的表面保守区域开发广谱抗病毒分子(一种嵌合蛋白质)以用于预防和/或治疗由登革病毒1-4和其他黄病毒引起的感染。但该嵌合蛋白缺乏病毒样的颗粒结构，效果不如完整病毒颗粒。
假病毒疫苗：假病毒(pseudovirus)为不含核酸的病毒空壳结构，但保留了天然病毒颗粒的空间构象，不仅可用于模拟天然病毒对宿主的感染，探索病毒侵入敏感细胞的机制，同时VLPs由病毒主要结构蛋白组成，含病毒特异的抗原表位，能够刺激机体免疫***产生很强的免疫应答，是很有发展前景的、安全的候选疫苗。Merck公司研制的HPV6、11、16、18四价VLP Gardasil疫苗(预防***)已于2006年6月获得美国FDA许可，成为第一个投放市场应用的VLPs疫苗，也标示着未来疫苗的发展方向。
综上所述，本领域急切需求安全性好，免疫效价高的优质疫苗。
发明内容
本发明的目的就是提供一种免疫效果好、安全、适于产业化生产的登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗及其制备方法。该疫苗嵌合了登革病毒和日本脑炎病毒的抗原组分，可以刺激机体产生免疫应答，进而预防登革病毒和/或日本脑炎病毒感染性疾病。
在本发明的第一方面，提供了一种登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的重组表达质粒，所述的表达质粒中***了下列元件：
a)黄病毒属信号肽编码序列；
b)全部登革病毒的preM/M编码区；
c)登革病毒E蛋白前35个氨基酸的编码区；
d)日本脑炎病毒E蛋白后120个氨基酸的编码。
在另一个优选方案中，所述的表达质粒包括pcDNA3.1、pcDNA6.0、pCIneo(+)、pReceiver等。
在另一个优选方案中，所述的表达质粒中***元件按a-b-c-d的顺序串联而成。
在另一个优选方案中，所述的黄病毒属信号肽编码序列选自：SEQ ID NO：1所示的编码日本脑炎病毒preM/M信号肽的核苷酸序列，SEQ ID NO：3所示的编码II型登革病毒preM/M信号肽的核苷酸序列、及SEQ ID NO：4所示的编码西尼罗河病毒preM/M信号肽的核苷酸序列。
在另一个优选方案中，所述的登革病毒为登革病毒血清型I、II、III或IV型。
在本发明的第二方面，提供了一种嵌合假病毒颗粒，它由权利要求1所述的重组表达质粒转染靶细胞后表达形成，不含任何核苷酸。所述的靶细胞包括：BHK21、293、239T、Cos、Hela等来源于真核生物的传代细胞系。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合，它含有上述重组表达质粒表达的假病毒颗粒和药学上可接受的佐剂或载体。
在本发明的第四方面，提供了本发明的重组假病毒颗粒的用途，用于制备预防登革热和/或日本脑炎的药物。
在本发明的第五方面，提供了一种制备嵌合假病毒颗粒的方法，包括以下步骤：
1)将权利要求1所述的含有登革病毒和日本脑炎病毒结构蛋白编码序列的重组表达质粒导入靶细胞；
2)当所述的靶细胞表达登革病毒和日本脑炎病毒结构蛋白时，用质粒携带的抗性基因对应的抗生素对转染细胞进行筛选，获得稳定转染的细胞克隆；
3)培养稳定转染的细胞，从而产生登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒颗粒；
4)回收嵌合假病毒颗粒。
本发明提供了包含本发明所述的重组嵌合假病毒颗粒的各种组合物，包括药用组合物，尤其是疫苗组合物。
药物组合
本发明所述的药用组合物可以包含实际使用时所选用的药学上可以接受的缓冲剂，也包含用于预定用途的其它物质。本领域已有多种缓冲剂适用于预定用途，本领域的技术人员都善于选择的缓冲剂。在一些实例中，该药用组合可以含有药学上可接受的保湿剂，药学上可接受的各种保湿剂在多种公开出版物都有叙述，包括如中华人民共和国药典(2005版)。
所述的药用组合物可制备出各种剂型，如注射剂、片剂、丸剂、胶囊、喷雾剂等。适用于局部使用和口服的药用级别的有机或无机载体或稀释剂。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油脂。还可用稳定剂、乳化剂、维持pH的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅助材料。
当本发明用作疫苗时，重组的嵌合假病毒可采用多种方法进行配制。通常情况下，按本领域熟知的各种方法，用药学上可以接受的载体或运载体配制本发明的疫苗。合适的药用载体包括无菌生理盐水，也可用其它无菌的水性和非水性的等渗注射液，是本领域技术人员熟知的药学上可接受的载体。配制本发明的疫苗组合物时还可含有其它成分，如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分都是疫苗领域的技术人员所熟知的。佐剂包括(但不限于)铝盐佐剂、皂苷佐剂、Cerbu佐剂(Cerbu Biotechnik Gmbh，Gaiberg，Germany)等。稳定剂包括(但不限于)精氨酸、乙基纤维素、多元醇、氨基酸、无机盐、PEG等。
给药途径与剂量：
当用作疫苗时，可用本领域技术人员熟知的方法将本发明的重组登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒颗粒施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径或模拟病毒感染的途径施用这些疫苗。采用疫苗组合物的形式时，除含有重组的嵌合病毒外，还可包括药学上可以接受的载体、佐剂、稳定剂、pH调节剂等。
给药常规与途径包括：肌肉注射、皮下注射、滴鼻、静脉注射、经口服等，如果需要也可采用组合给药途径。疫苗组合物的给用剂量可以单剂量，也可多剂量，且可给予加强剂量以维持被施用个体的免疫力。
在所选用的给药途径中，应以“有效剂量”给予登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒颗粒的量，足以引发被施用个体的免疫应答，能有效保护被施用个体，抵抗登革病毒和/或日本脑炎病毒的感染。
所述的有效剂量，是指在疫苗组合物中所选用的登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒颗粒的量是按可引发个体免疫保护性应答而无明显的副作用的量确定。以疫苗组分中嵌合假病毒颗粒蛋白质为基础计算有效剂量，通常包括给予约1-500μg蛋白质，较佳地为1-200μg，更加地10-100μg。可用包括观察对象中的抗体滴度和其它反应来确定具体疫苗的最佳用量，通过检测疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量，施用佐剂或免疫刺激剂可提高本发明假病毒颗粒的免疫应答，这些都是本领域的技术人员所熟知的。
本发明人经过深入的研究，建立了登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗制备技术，并成功构建了安全性好、免疫效价高的抗登革热病毒和/或日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗，在此基础上完成了本发明。和现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.提高了免疫的有效性：
1)嵌合假病毒表面既拥有登革病毒E蛋白的中和表位，又含有日本脑炎病毒E蛋白的保护性抗原区，免疫宿主个体后可以产生对登革病毒和日本脑炎病毒的免疫活性，免疫效能上优于单一组分疫苗。
2)由于假病毒的组织亲嗜性和感染过程与真病毒相同，因此可以模拟天然病毒的早期感染过程，有效刺激机体的免疫应答。
2.提高了疫苗的安全性。
本发明的嵌合假病毒没有病毒特异的核酸，因而不具有复制能力，也不会引起登革病毒和日本脑炎病毒导致的特异性细胞病变，可以最大程度地降低疫苗使用的风险。
3.生产成本低。
在构建了重组表达质粒后，转化靶细胞并筛选稳定的细胞克隆。在生产时，只需要培养稳定转染的细胞克隆即可产生大量的假病毒颗粒，从而缩短了疫苗生产流程，提高了疫苗的生产效率，产品生产成本降低。
下面结合具体实施实例，进一步阐明本发明。应当指出的是，这些实例仅用于进一步阐明本发明，而不用于限制本发明的适用范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版，科学出版社，2002)中所述的条件，或按试剂制造产家所建议的条件进行。
附图说明
图1为嵌合假病毒重组表达质粒制备的过程示意图。
图2为稳定转染克隆的筛选过程示意图。
图3为抗G418克隆的Western blot鉴定结果，图中可见11个克隆中有4个克隆能表达特异性抗原，它们分别是B8，B11，C4和C7克隆。
具体实施方式
申请人通过大量实验，发现本发明登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的构建必须满足下列条件：
1)必须有完整的preM/M结构蛋白。黄病毒属病毒的preM/M结构蛋白为一种基质蛋白，在病毒颗粒的形成中有重要作用，任何对preM/M结构蛋白的缺失或移码突变，形成假病毒的效率会显著下降。
2)删除登革病毒E蛋白的后99个氨基酸，相应的编码序列是登革病毒E蛋白的后297个核苷酸，因为这段序列中含有一个包膜锚定区(氨基酸452-491)和一个茎环区(氨基酸395-450)，能使表达的E蛋白滞留于内质网上，降低了分泌。虽然删除小于99个氨基酸(如79，59，39，19个)仍可形成假病毒颗粒，但假病毒颗粒的形成效率逐渐下降，因此优选的范围是删除E蛋白的后79-99个氨基酸，更佳地删除99个。
3)必须保留日本脑炎病毒E蛋白的后198个氨基酸，相应的编码序列是日本脑炎病毒E蛋白的后594个核苷酸，因为该区域内含有E蛋白结合靶细胞的区域，能刺激机体产生有效的免疫应答。
可用于本发明的登革病毒没有特别限制，可以是4种血清亚型中的任何一种，4种亚型的基因组序列登录号如下：
I型：U88536
II型：U87411
III型：AY099336
IV型：AF326825
可用于本发明的日本脑炎病毒基因组序列登录号为：NC_001437.1
在制备本发明的嵌合假病毒颗粒时，通常按以下步骤进行：
1.构建重组表达质粒
这可通过常规PCR扩增、连接、转化技术实现(见实施例1)。
2.筛选稳定转染的细胞克隆(见实施例2)
在获得重组表达质粒后，一种常规的方法是将其引入靶细胞，培养转染细胞，一段时间(如48小时)后，收集培养上清，超速离心得到嵌合假病毒。另一种优选的方法是采用质粒携带的抗性基因所对应的抗生素(如G418)筛选质粒转染后的细胞，获得有稳定抗性的细胞克隆，再培养该克隆一段时间(如48小时)后，收集培养上清，离心得到嵌合假病毒颗粒。
实施例1 构建嵌合假病毒重组表达质粒
1.黄病毒信号肽编码序列(S片段)的制备
(1)根据SEQ NO 所示的日本脑炎病毒信号肽序列(Davis BS etal，J Virol 2001，75(9)：4040-4047)设计一对寡核苷酸片段：S1：ATAGGCTAGCGCCATGGGCAAGAGATCGGCGGGCTCAATCATGTGGCTCGCAAGCTTGG(SEQID No ： 5 ) ， S2：GCGTGTGGTTAAATGGAATGCTCCTGCGTAAGCTATGACAACTGCCAAGCTT GCGAGC(SEQ ID No：6)，由大连TakaRa公司DNA合成部合成；
(2)引物延伸法合成S片段(S1链的5′端有EheI酶切位点)：因S1，S2寡核苷酸片段的3′端设计了14bp的互补序列，即可采用引物延伸法生成S片段，该片段编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。具体操作为：将合成的寡核苷酸片段用无菌蒸馏水配制成100μM浓度，各取2μl置于一0.25mlEp管中，补加PrimerStar DNA聚合酶(TakaRa)1μl，dNTPs(TakaRa，2.5mM/each)1.5μl，5×buffer 5μl，补充ddH2O至25μl。PCR扩增仪(BioRad)上按94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒扩增2个循环，1.2％的琼脂糖(上海生工)凝胶电泳，按TakaRa胶回收试剂盒说明书回收目的片段，得到黄病毒信号肽编码序列(S片段)
2.登革病毒II型preM/M蛋白编码序列的PCR扩增
(1)所述的登革病毒II型是GenBank登录号为U87411的病毒株，用SV Total RNA Isolation试剂盒(Promega)，按试剂盒说明书提取登革病毒RNA，用RT-PCR方法(参见萨姆布鲁克等著，黄培堂等译《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)(扩增preM/M蛋白(SEQ ID No：9)编码序列(M片段)，所用DNA引物如下：M1，TTCCATTTAACCACACGCAACGGAGAA(SEQ ID No：7)和M2，TGTCATTGAAGGAGCGACAGCT GTCAGTA(SEQ ID No：8)，引物由大连TakaRa合成；
(2)逆转录逆转录(RT)试剂盒为Promega产品，以病毒RNA为模板，以下游M2为引物进行RT得到cDNA第一链，RT反应如下：
10×RT buffer 4μl
MgCl2(25mM) 2μl
dNTP(25mM/each) 1μl
引物M2(10μM) 1μl
RNasin(40μg/ml) 1μl
逆转录酶(AMV，10U/μl) 1μl
Total RNA(0.6μg/μl) 10μl
RNase free H2O 20μl
混匀后42℃水浴1小时，然后75℃10分钟，以灭活逆转录酶。
(3)PCR扩增以(2)中RT得到的cDNA第一链为模板，用M1-M2引物进行PCR扩增，反应如下：
RT反应混合物(cDNA) 1μl
5×PCR buffer(TaKaRa) 10μl
MgCl2(25mM)(TaKaRa) 5μl
dNTP(25mM/each)(TaKaRa) 1μl
引物M1(10μM) 1μl
引物M2(10μM) 1μl
PrimerStar(10U/μl) 1μl
dH2O 30μl
total 50μl
混匀后，置PCR扩增仪(BioRad)上按94℃30秒，52℃30秒，72℃60秒扩增25个循环，1.2％的琼脂糖(上海生工)凝胶电泳，按TakaRa胶回收试剂盒说明书回收目的片段；
3.登革病毒II型E蛋白编码序列的PCR扩增
用总RNA提取试剂盒提取登革病毒基因组RNA，用RT-PCR方法扩增E蛋白(SEQ ID No：12)的编码序列(E片段)，所用DNA引物如下为E1：AGC TGTCGCTCCTTCAATGACA(SEQ ID No：10)和E2：GCGGGAATTCAC TTCCTTTCTTGAACCAGTTAAG(SEQ IDNo：11)，E2的5‘端有EcoRI酶切位点。逆转录和PCR扩增按本实施例2的步骤2进行，不同在于对引物进行了更换。
4.SME片段的PCR扩增与克隆
(1)扩增 利用S、M、E片段间的互补序列，在一0.25ml的PCR反应管中各加入S、M、E片段1nM，以S1/E2为引物进行PCR扩增，扩增条件如下：
5×PCR buffer(TaKaRa) 10μl
MgCl2(25mM)(TaKaRa) 5μl
S片段(1mM) 1μl
M片段(1mM) 1μl
E片段(1mM) 1μl
dNTP(25mM/each)(TaKaRa) 2μl
引物S1(10μM) 1μl
引物E2(10μM) 1μl
PrimerStar(10U/μl) 1μl
dH2O 27μl
total 50μl
混匀后，置PCR扩增仪(BioRad)上按94℃30秒，50℃30秒，72℃3分钟扩增25个循环，1.2％的琼脂糖(上海生工)凝胶电泳，按TakaRa胶回收试剂盒说明书回收SME片段；
(2)酶切与连接 回收的SME片段经EheI(TaKaRa)/EcoRI(TaKaRa)双酶切，***真核表达质粒pCIneo(+)(Promega)的EheI/EcoRI位点；
酶切反应：SME片段(45ng/μl) 10μl
10×buffer B(TakaRa) 5μl
EheI(5U/μl) 2μl
EcoRI(5U/μl) 2μl
dH2O 31μl
total 50μl
混匀后置37℃水浴反应4小时，1.2％的琼脂糖(上海生工)凝胶电泳，按TakaRa胶回收试剂盒说明书回收双酶切后的SME片段；
pCI-neo(Promega)质粒的双酶切反应体系同上，回收质粒；
连接反应：10×ligation buffer(Promega) 1.5μl
pCI-neo(EheI/EcoRI酶切，25ng/μl) 1μl
SME片段(EheI/EcoRI酶切，68ng/μl) 5μl
T4 ligase(Promega，10U/μl) 1μl
dH2O 6.5μl
total 15μl
混匀后置16℃水浴反应16小时，75℃5min灭活连接酶；
(3)转化
大肠埃希菌DH5α感受态的制备参见分子克隆实验指南(第三版，科学出版社，2002)，取4μl连接产物于100μl DH5α感受态细胞中，混匀，冰浴中30min，42℃休克90秒，置冰浴中2min，将混合物加入900μl LB培养基(TakaRa)中，37℃振荡培养1小时，涂布AMP(100μg/ml，西南制约)轻质平板，37℃培养18小时，挑选AMP抗性菌落进行质粒提取与鉴定，序列正确者命名为pCI-SME。
5.日本脑炎病毒E蛋白III区编码序列的PCR扩增
所述的日本脑炎病毒为Beijing-1株(GenBank登录号为NC_001437.1)，用总RNA提取试剂盒提取日本脑炎病毒Beijing-1株RNA，用RT-PCR方法(参见萨姆布鲁克等著，黄培堂等译《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)扩增E蛋白III区(SEQID No：15)的编码序列(J片段)，所用DNA引物如下为J1：GGGCGAATTCATGTGTACAGAAAAATTCTCGTTC(SEQ ID No：13)和J2：GACCTCTAGATCAAGCATGCACATTGGTCGCTAA(SEQID No：14)，J1引物含EcoRI位点，J2引物含有XhoI位点。逆转录和PCR扩增参见本实施例2的方案进行。
6.嵌合基因的构建与克隆
将本实施例5中所获的J片段经EcoRI/XhoI酶切，***4(3)中制备的真核表达质粒pCI-SME中，转化大肠埃希菌DH5α感受态，挑选AMP抗性菌落进行质粒提取与鉴定，序列正确的嵌合基因如SEQ ID No：17所示，该质粒能表达嵌合假病毒蛋白(SEQ ID No：16)。参见图1，图1为嵌合假病毒重组表达质粒的构建过程，含正确嵌合基因的重组子命名为pCI-SMEJ。
实施例2 嵌合假病毒重组表达质粒转染靶细胞及稳定转染克隆的筛选
1.将实施例1所述的重组表达质粒pCI-SMEJ按脂质体试剂说明书(LipofectamineTM 2000，Invitrogen)转染BHK21细胞(Baby hamsterkidney)(ATCC#：CCL-10)，用含10％小牛血清(Hyclone)的DMEM培养基(GIBCO)培养20小时。
2.用0.25％的胰酶(GIBCO)消化转染细胞，参照萨姆布鲁克等著，黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版，2002年，科学出版社)的克隆有限稀释法用含0.6mg/ml G418(Sigma)和10％小牛血清的DMEM培养基进行培养，10天后，培养板中出现克隆生长，挑取克隆进行扩大培养。
3.收集单克隆培养上清，取100μl冷冻干燥浓缩，参照《分子克隆实验指南》的SDS-PAGE方法进行电泳，电转移到硝酸纤维素膜上，用小鼠抗登革病毒II型的抗血清作一抗，辣根过氧化物酶(HR)标记的兔抗小鼠(中山公司)作二抗进行免疫印迹(Western blot)鉴定，有特异性抗原表达者为稳定转染细胞克隆。附图2显示了稳定转染克隆的筛选过程；附图3显示了对11个稳定转染克隆的Western blot鉴定结果，可见11个克隆中有4个克隆能表达特异性抗原，分别是B8，B11，C4和C7克隆，其中B8，B11，C4，C7为细胞克隆的全称。
实施例3 嵌合假病毒颗粒疫苗的制备过程
1.复苏实施例2中获得的稳定转染克隆，用含10％小牛血清的DMEM培养基扩大培养，达到所需的细胞量后，改用2％小牛血清的DMEM培养基培养，每48小时收集上清一次，6000g离心30分钟(Sigma 3T3离心机)，留存上清。
2.嵌合假病毒颗粒的离心纯化：在培养上清中加入PEG8000(上海生工，终浓度为7.1％)和NaCl(上海生工，终浓度为2.7％)，4℃振摇过夜(16-20小时)，4℃ 50000g离心1小时，沉淀用1/100体积的TNE buffer(10mM Tris，1mM EDTA，100mM NaCl，pH 8.0)重悬，制成浓缩病毒液。
TNE buffer的配制如下：称取1.21g Tris(上海生工)，0.37g EDTA(上海生工)和5.84gNaCl(上海生工)于一大烧杯中，加入500ml蒸馏水溶解，用1M的NaoH(上海生工)调节pH值到8.0，补加蒸馏水至1000ml，分装，15磅高压15分钟。
3.嵌合假病毒颗粒的密度梯度离心纯化：根据假病毒颗粒与残留细胞碎片密度不同这一事实，采用密度梯度离心法分离，即使细胞碎片与病毒克隆的大小相同，在密度梯度中也能将其分开。
(1)以0.1M PBS为稀释液配制不同浓度的蔗糖(上海生工)溶液：60％、57％、55％、53％、50％、40％、30％(W/V)等梯度溶液；即分别称取60、57、55、53、50、40、30g蔗糖于100ml盐水瓶中，加1M PBS溶液(配制方法参见分子克隆实验指南)10ml，补加蒸馏水至100ml，10磅高压15分钟，4℃冰箱保存。
(2)Beckman离心机水平转头专用15ml离心管6支，分别由高到低装填60％、57％、55％、53％、50％、40％、30％(W/V)等蔗糖溶液，总体积共14ml。并且最底层承载液(60％蔗糖溶液)不少于4ml，以防止病毒颗粒被离心到管底。加每层液体时，沿管壁慢加，各层之间有明显区分带为佳。
(3)在最表层缓慢加入浓缩病毒液，约1ml，与30％蔗糖溶液有明显区分带。
(4)将离心管装入套筒中，盖紧螺盖，悬挂于水平转头，置入离心机，4℃，110000g离心6h。
(5)取出离心管，先肉眼观察各梯度蔗糖的区分带中有无蛋白质沉淀或明显蛋白带出现，再以1ml注射器将区分带中的沉淀物轻轻吸出作为样本。
(6)通过Western blot检测各区带的假病毒颗粒纯度和量，确定假病毒主要的沉降区带后，大量制备纯化假病毒颗粒，-80℃储存备用。
实施例4 嵌合假病毒疫苗的动物实验
为证实嵌合假病毒的免疫疗效，我们检测了嵌合假病毒疫苗对BalB/c小鼠抵抗日本脑炎病毒致死性攻击的保护作用。
致死性攻击病毒量的确定：为测试日本脑炎病毒对BalB/c小鼠致死性攻击所需的病毒量，首先将经病毒噬斑测定(Schaechter’sMechanisms of Microbial Disease，4th edition，2007，Engleberg，DiRita& Dermody.)的日本脑炎病毒Beijing-1株用PBS稀释成1×103～1×107pfu/ml(plaque forming unit，pfu)，注射到4周龄的BalB/c小鼠颅内，每组10只，20μl/只，阴性对照用PBS。结果，注射3天后1×105～1×107pfu/ml注射组小鼠全部死亡；1×103pfu/ml注射组有90％存活；1×104pfu/ml注射组有20％存活，最终确定1×105pfu/ml为最适致死剂量。
嵌合假病毒颗粒疫苗治疗方案：实验分为4组，每组10只4周龄BalB/c小鼠。
| 第一天皮下注射 | 注射后14天(皮下) | 注射后28天(颅内) | 注射后35天 | |
| 正常对照 | PBS 500μl | PBS 500μl | PBS 20μl | 日本脑炎病毒抗体检测 |
| 病毒对照组 | PBS 500μl | PBS 500μl | 105pfu日本脑炎病毒 | |
| 疫苗免疫组 | 105pfu嵌合假病毒颗粒 | 105pfu嵌合假病毒颗粒 | 105pfu日本脑炎病毒 | |
| 疫苗对照组 | 105pfu嵌合假病毒颗粒 | 105pfu嵌合假病毒颗粒 | PBS 20μl | 日本脑炎病毒抗体检测 |
在疫苗对照组和免疫组里的每只小鼠经皮下注射105pfu嵌合假病毒颗粒，在注射后14天，再次注射105pfu嵌合假病毒颗粒作为追加免疫，正常对照组和病毒对照组则注射PBS缓冲液。在注射后28天，病毒对照组和疫苗治疗组的小鼠每只颅内注射105pfu的日本脑炎病毒进行攻击，正常对照组和疫苗对照组则注射PBS。
1.嵌合假病毒免疫疗效的观察
(1)当小鼠注射假病毒颗粒后，每天观察生长情况，进食、活动等状态，记录死亡时间。
(2)在第二次皮下注射假病毒21天，用酶联免疫吸附试验(ELISA)法(参见分子克隆实验指南)检测小鼠血清中抗体滴度。
2.实验结果
(1)假病毒颗粒疫苗对小鼠的保护情况
我们观察到，病毒对照组在进行105pfu日本脑炎病毒颅内攻击后3天内，小鼠无一存活，死亡率为100％；疫苗免疫组小鼠在受同样剂量的日被脑炎病毒攻击后，除1只于攻击后4天死亡外，其余全部存活，保护率90％。
(2)嵌合假病毒疫苗对小鼠免疫应答的影响
经ELISA检测小鼠血清中抗日本脑炎病毒的抗体效价，结果疫苗对照组的抗体效价较正常对照组升高16倍。
| 血清抗体效价(ELISA) | |
| 正常对照组 | 1∶800 |
| 疫苗对照组 | 1∶12800 |
实施例5 构建不同型的II型登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗
在本实例中，按照实施例1-3所述的方法构建了下列II型登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗，其不同点在于II登革病毒E蛋白的长度不同，产生假病毒颗粒的效率如下：
| 保留E蛋白基因的长度 | 保留E蛋白的氨基酸长度 | 缺失E蛋白C-端氨基酸的长度 | 能否产生假病毒颗粒 | 假病毒产生效率 |
| 1428 | 476 | 19 | 否 | 0 |
| 1368 | 456 | 39 | 否 | 0 |
| 1308 | 436 | 59 | 能 | 4.2×103pfu/ml |
| 1248 | 416 | 79 | 能 | 9.4×105pfu/ml |
| 1188 | 396 | 99 | 能 | 1.5×106pfu/ml |
实施例6 构建I型登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗
在本实施例中，按实施例1构建了I型登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒重组表达质粒，不同点在于仅用I型登革病毒的preM/M基因和E蛋白基因(缺失C-端99个氨基酸的编码序列)代替II型登革病毒，然后采用实施例2和3的方法制备假病毒颗粒，再按实施例4中疫苗免疫组相同的方案给药，进行动物实验。
结果，在2次假病毒颗粒免疫后14天用105pfu的日本脑炎病毒进行攻击，保护率为80％。
实施例7 构建III型登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗
在本实施例中，先按本发明实施例1构建了III型登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒重组表达质粒，其不同点在于仅用III型登革病毒的preM/M基因和E蛋白基因(缺失C-端99个氨基酸的编码序列)代替II型登革病毒，然后采用实施例2和3的方法制备假病毒颗粒，再按实施例4中疫苗免疫组相同的方案给药，进行动物实验。
结果，在2次假病毒颗粒免疫后14天用105pfu的日本脑炎病毒进行攻击，保护率为75％。
实施例8 构建IV型登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗
在本实施例中，按照实施例1所述的方法构建了IV型登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒重组表达质粒，不同点在于仅用IV型登革病毒的preM/M基因和E蛋白基因(缺失C-端99个氨基酸的编码序列)代替II型登革病毒，然后按实施例2和3的方法制备假病毒颗粒，再采用实施例4中疫苗免疫组相同的方案给药，进行动物实验。
结果，在2次假病毒颗粒免疫后14天用105pfu的日本脑炎病毒进行攻击，保护率为84％。
Claims (10)
1.一种登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的重组表达质粒，其特征在于：所述的表达质粒中含有一由下列元件组成的嵌合编码基因：
a)黄病毒属信号肽编码序列；
b)登革病毒的preM/M编码区；
c)登革病毒E蛋白前396个氨基酸的编码区；
d)日本脑炎病毒E蛋白后120个氨基酸的编码区。
2.根据权利要求1所述的登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的重组表达质粒，其特征在于：所述表达质粒是pcDNA3.1或pcDNA6.0或pCIneo(+)或pReceiver。
3.根据权利要求1所述的登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的重组表达质粒，其特征在于：所述嵌合编码编码基因由***元件按a-b-c-d的顺序串联。
4.根据权利要求1所述的登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的重组表达质粒，其特征在于：所述嵌合编码基因的黄病毒属信号肽编码序列选自：SEQ ID NO：1所示的编码日本脑炎病毒preM/M信号肽的核苷酸序列，SEQ ID NO：3所示的编码II型登革病毒preM/M信号肽的核苷酸序列，SEQ ID NO：4所示的编码西尼罗河病毒preM/M信号肽的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的重组表达质粒，其特征在于：所述的登革病毒为登革病毒血清型I或II或III或IV型。
6.一种嵌合假病毒颗粒，其特征在于：由权利要求1所述的重组表达质粒转染靶细胞后表达的嵌合蛋白自组装形成，不含任何核苷酸。
7.根据权利要求6所述的嵌合假病毒颗粒，其特征在于：所述的靶细胞包括来源于真核生物的传代细胞系的BHK21或293或293T或Cos或Hela。
8.一种登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗，其特征在于：它含有权利要求6所述的嵌合假病毒颗粒和药学上可接受的佐剂或载体。
9.嵌合假病毒颗粒在制备用于预防登革热和/或日本脑炎药物中的用途。
10.一种嵌合假病毒颗粒的制备方法，其特征在于有以下步骤：
1)将权利要求1所述的含有登革病毒和日本脑炎病毒结构蛋白编码序列的重组表达质粒导入靶细胞；
2)当所述的转染靶细胞表达登革病毒和日本脑炎病毒结构蛋白时，用质粒携带的抗性基因对应的抗生素对转染细胞进行筛选，获得稳定转染的细胞克隆；
3)培养稳定转染的细胞，产生登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒颗粒；
4)回收嵌合假病毒颗粒。
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