CN101948850A - 登革病毒病毒样颗粒的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及登革病毒病毒样颗粒的制备方法及应用，其是通过融合PCR技术分别对四个型别的登革病毒(DENV)prM-E基因元件进行改造，然后将四个型别的登革病毒prM-E基因改造元件分别克隆入真核***表达载体中，再将该重组表达载体分别转染哺乳动物细胞，并使其分泌表达登革病毒病毒样颗粒(VLPs)。另外，本发明对DENV-1 VLPs和DENV-2 VLPs的免疫效果进行初步研究，为登革病毒VLPs多价疫苗的研制奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及登革病毒病毒样颗粒的制备方法及应用。
背景技术
登革病毒(DENV)感染是当今人类中流行最广的虫媒病毒病。登革病毒通过伊蚊传播，如今几乎在所有的热带、亚热带地区都有分布。据WHO估计，全球有25～30亿人口面临感染登革病毒的危险，每年大约有5千万到1亿登革热(Dengue fever DF)病例发生，患者表现出高热、头痛、肌痛、关节痛及皮疹等症状；这其中有50万例发展成更为严重的登革出血热(Dengue hemorrhagic fever DHF)和登革休克综合征(Dengue shock syndrome DSS)，每年因登革病毒感染死亡的人数是2.5万。近年来随着全球气候变暖及旅游事业的发展，其传播媒介伊蚊的地理分布范围不断扩大，登革病毒感染在全世界范围内广泛播散，已成为世界上分布最广、发病人数最多、危害最大的重要虫媒病毒病之一。
但是，关于登革病毒及其感染还有许多迄今未了解和解决的问题，以至登革病毒感染的防治缺乏非常有效的措施，特别是登革病毒疫苗研究没有取得重大进展。登革病毒有4个血清型，4种血清型病毒都可以导致发病。目前的研究表明，针对登革病毒某一血清型的抗体对其他血清型无长期保护作用，当再次感染异型病毒时，会由于抗体依赖增强作用(antibody-dependent enhancement，ADE)而使患者产生更为严重的登革出血热和登革休克综合征。所以一种成功的登革疫苗必须对4型登革病毒都能够产生保护性免疫，能够预防登革病毒感染所引起的疾病。WHO已将登革病毒疫苗确立为优先发展的疫苗之一。而登革病毒疫苗也一直是各国学者关注的焦点，将近60年来，研制登革疫苗的努力从未停止，但目前仍没有登革疫苗用于临床。
伴随着分子生物学的飞速发展，产生了一些研究登革疫苗的新思路，病毒样颗粒疫苗就是其中的一种。病毒样颗粒(VLPs)是一种不含病毒核酸的假病毒颗粒，完全没有感染性成分，只是具有灭活病毒或减毒活疫苗病毒颗粒衣壳的真实构象，它以一个更接近真实构象的形式呈递病毒抗原，更容易被机体免疫***识别，并且没有病毒毒力回复或病毒基因重组或重配的可能。正由于它具有很强的免疫原性及很好的安全性，因而被认为是一个非常好的疫苗候选物。
登革病毒为黄病毒科黄病毒属的成员，为单股正链RNA病毒，基因组长约11kb，含有一条单一的开放读码框。基因排列顺序为5′-NCR-C-PrM/M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-NCR-3′，共编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其中E基因编码的E蛋白为病毒表面包膜糖蛋白，具有与细胞表面受体结合，介导膜融合，诱导产生中和抗体等重要生物学功能，是病毒最重要的抗原成份。PrM基因编码的PrM/M蛋白也被认为是诱导产生中和抗体的抗原成分。非结构基因及非编码区主要与病毒复制及蛋白翻译有关。有报道称，对于黄病毒属成员，共同表达prM蛋白及E蛋白可形成病毒样颗粒。
由于prM蛋白及E蛋白均为糖蛋白，而E.coli表达***本身具有局限性，即缺少蛋白质后修饰功能，使得表达产物不能糖基化。因此，在真核表达***中表达prM蛋白及E蛋白有利于蛋白功能的实现。目前，国内研究中尚未发现有在真核***中分泌表达四型登革病毒病毒样颗粒研究的报道。
发明内容
本发明的目的是提供登革病毒病毒样颗粒的制备方法。
本发明的另一目的是提供可分泌表达DENV1-4病毒样颗粒的真核***重组载体。
本发明的进一步目的是提供登革病毒病毒样颗粒在预防登革病毒所引起的疾病中的应用。
为了实现本发明目的，本发明的编码登革病毒病毒样颗粒的基因，其具有Seq ID No.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3、Seq ID No.4或SeqID No.5所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有编码同等功能蛋白质的核苷酸序列。例如在SeqIDNo.1-5中编码JESS信号肽序列的区段，将编码第20-24位氨基酸序列的GCTTGTGCAGGAGCC替换为CCACAGGCACAGGCC。
本发明还提供含有编码登革病毒病毒样颗粒的基因的载体。优选地，所述载体为真核***表达载体。更优选地，所述载体为pcDNA5/FRT。
本发明还提供含有上述重组载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。更优选地，所述宿主细胞为293T细胞。
本发明还提供上述基因编码的登革病毒病毒样颗粒的制备方法，其包括步骤：
1)采用RT-PCR技术从DENV-1 GZ01/95株、DENV-2 ZS01/01株、DENV-3 H87株以及DENV-4 H241株中分别获得四个型别的登革病毒prM-E基因元件；2)通过融合PCR技术分别对四个型别的登革病毒prM-E基因元件进行改造，即在各型别prM-E基因前增加一段来自日本脑炎病毒SA14-14-2株的信号肽序列和/或将各型别prM-E基因C末端的20％基因序列替换为日本脑炎病毒SA14-14-2株E基因的相应序列；3)将四个型别的登革病毒prM-E基因改造元件分别克隆入真核***表达载体中；4)用3)中得到的重组表达载体分别转染哺乳动物细胞，并使其分泌表达登革病毒病毒样颗粒；5)ELISA检测登革病毒病毒样颗粒的免疫原性。
本发明进一步提供上述基因编码的登革病毒病毒样颗粒在预防登革病毒所引起的疾病中的应用。
具体地，本发明一方面提供了经基因特性分析和分泌表达设计而改造的四个型别登革病毒的prM-E基因元件。其是采用RT-PCR技术获得了DENV-1 GZ01/95株、DENV-2 ZS01/01株、DENV-3 H87株以及DENV-4H241株的prM-E蛋白编码基因序列。为了实现登革病毒VLPs的分泌表达，本发明对四个型别登革病毒的prM-E基因元件进行分泌表达设计并通过融合PCR技术对prM-E基因进行改造。考虑到在哺乳动物细胞表达体系中形成登革病毒VLPs的关键是prM-E蛋白在表达细胞中的正确合成、转运、切割、包装及构象形成，prM基因N端的信号肽序列对其有直接影响，而E基因C末端的20％区域为跨膜区及螺旋区，对于登革病毒VLPs的形成起到了至关重要的作用。因此上述表达元件的改造包括在DENV1-4 prM-E基因前增加一段来自日本脑炎病毒(JEV)SA14-14-2株的信号肽序列，以及将DENV1-4E基因C末端的20％基因序列缺失或替换为JEV SA14-14-2株E基因的相应序列。
改造后的四型登革病毒prM-E基因元件分别命名为：
JD1prME、JD1prMEΔ20％、JD1prMEΔ20％JEV；
JD2prME、JD2prMEΔ20％、JD2prMEΔ20％JEV；
JD3prME、JD3prMEΔ20％、JD3prMEΔ20％JEV；
JD4prME、JD4prMEΔ20％、JD4prMEΔ20％JEV。
本发明的另一方面，提供了能够分泌表达四个型别登革病毒病毒样颗粒的重组载体。其是通过特异的限制性酶切位点NheI及NotI，分别将上述的四个型别登革病毒prM-E基因改造元件克隆入真核***表达载体pcDNA5/FRT中。分别命名为：
pJD1prME、pJD1prMEΔ20％、pJD1prMEΔ20％JEV；
pJD2prME、pJD2prMEΔ20％、pJD2prMEΔ20％JEV；
pJD3prME、pJD3prMEΔ20％、pJD3prMEΔ20％JEV；
pJD4prME、pJD4prMEΔ20％、pJD4prMEΔ20％JEV。
进一步地，本发明将上述重组表达载体转染293T细胞，48小时后收获转染细胞及表达上清。经IFA检测，DENV1-4 prM-E基因在细胞内均获得高效表达。通过Western blot检测表达上清，其中，pJD2-4prME未检测到明显目的条带，pJD1-4prMEΔ20％检测到蛋白分泌，但为不完整的prM-E蛋白分泌，而对于pJD1prME及pJD1-4prMEΔ20％JEV，在约60KD处观察到目的条带，证实DENV1-4VLPs全部有效分泌到上清中。
根据上述结果，本发明将pJD1prME及pJD1-4prMEΔ20％JEV列为能够分泌表达登革病毒病毒样颗粒的重组载体。
本发明的再一方面，提供了一种登革病毒病毒样颗粒的制备方法。其是将上述的五个重组表达载体大量转染哺乳动物细胞，表达上清经高倍浓缩后，采用15-60％蔗糖密度梯度离心法对DENV1-4VLPs进行纯化，并利用SDS-PAGE及Western blot对纯化的VLPs进行鉴定。
进一步地，本发明分别用DENV-1 VLPs和DENV-2 VLPs免疫Balb/c小鼠，能产生抗DENV rEIII蛋白的特异IgG抗体，且抗体具有一定的中和活性，为登革病毒疫苗研制奠定了基础。
本发明首次在真核表达***中分泌表达四型登革病毒病毒样颗粒，并对DENV-1 VLPs和DENV-2 VLPs的免疫效果进行初步研究，为登革病毒VLPs多价疫苗的研制奠定了基础。
附图说明
图1a是本发明带有日本脑炎信号肽及prM-E基因全长的pJD1-4prME重组载体结构示意图。
图1b是本发明带有日本脑炎信号肽及缺失E基因C末端20％基因的pJD1-4prMEΔ20％重组载体结构示意图。
图1c是本发明带有日本脑炎信号肽及将E基因C末端20％基因替换为日本脑炎相应区域的pJD1-4prMEΔ20％JEV重组载体结构示意图。
图2a是本发明含有pJD1-4prME细胞的免疫荧光鉴定图，其中A、B、C、D分别代表pJD1prME、pJD2prME、pJD3prME、pJD4prME瞬时转染293T细胞后，与登革E蛋白特异性抗体DE1的反应结果。
图2b是本发明含有pJD1-4prMEΔ20％的细胞的免疫荧光鉴定图，其中A、B、C、D分别代表pJD1prMEΔ20％、pJD2prMEΔ20％、pJD3prMEΔ20％、pJD4prMEΔ20％瞬时转染293T细胞后，与登革E蛋白特异性抗体DE1的反应结果。
图2c是本发明含有pJD1-4prMEΔ20％JEV细胞的免疫荧光鉴定图，其中A、B、C、D分别代表pJD1prMEΔ20％JEV、pJD2prMEΔ20％JEV、pJD3prMEΔ20％JEV、pJD4prMEΔ20％JEV瞬时转染293T细胞后，与登革E蛋白特异性抗体DE1的反应结果。
图3a是本发明pJD1prME、pJD1prMEΔ20％、pJD1prMEΔ20％JEV转染293T细胞后的表达上清经浓缩后与重组DV1 EⅢ蛋白兔免疫血清反应结果的western blot鉴定图，其中1、2、3、4分别代表pJD1prME、pJD1prMEΔ20％、pJD1prMEΔ20％JEV以及pcDNA5/FRT瞬时转染293T细胞48小时后，收获表达上清，浓缩约20倍后与重组DV1 EⅢ蛋白兔免疫血清的反应结果。
图3b是本发明pJD2prME、pJD2prMEΔ20％、pJD2prMEΔ20％JEV转染293T细胞后的表达上清经浓缩后与重组DV2 EⅢ蛋白兔免疫血清反应结果的western blot鉴定图，其中1、2、3、4分别代表pJD2prME、pJD2prMEΔ20％、pJD2prMEΔ20％JEV以及pcDNA5/FRT瞬时转染293T细胞48小时后，收获表达上清，浓缩约20倍后与重组DV2 EⅢ蛋白兔免疫血清的反应结果。
图3c是本发明pJD3prME、pJD3prMEΔ20％、pJD3prMEΔ20％JEV转染293T细胞后的表达上清经浓缩后与重组DV3 EⅢ蛋白兔免疫血清反应结果的western blot鉴定图，其中1、2、3、4分别代表pJD3prME、pJD3prMEΔ20％、pJD3prMEΔ20％JEV以及pcDNA5/FRT瞬时转染293T细胞48小时后，收获表达上清，浓缩约20倍后与重组DV3 EⅢ蛋白兔免疫血清的反应结果。
图3d是本发明pJD4prME、pJD4prMEΔ20％、pJD4prMEΔ20％JEV转染293T细胞后的表达上清经浓缩后与重组DV4 EⅢ蛋白兔免疫血清反应结果的western blot鉴定图，其中1、2、3、4分别代表pJD4prME、pJD4prMEΔ20％、pJD4prMEΔ20％JEV以及pcDNA5/FRT瞬时转染293T细胞48小时后，收获表达上清，浓缩约20倍后与重组DV4 EⅢ蛋白兔免疫血清的反应结果。
图4是本发明超速离心纯化后DENV-1及DENV-2 VLPs的SDS-PAGE鉴定图，其中M为蛋白marker，1为超离后的上清层，2为20％蔗糖层，3为pJD1prME超离亮带层，4为pJD2prMEΔ20％JEV超离亮带层，5为60％蔗糖层，6为pcDNA5/FRT超离后的上清层，7为pcDNA5/FRT的20％蔗糖层，8为pcDNA5/FRT的亮带层，9为pcDNA5/FRT的60％蔗糖层。
图5是本发明超速离心纯化后DENV-1及DENV-2 VLPs的Western blot鉴定图，其中1为超离后的上清层，2为20％蔗糖层，3为pJD1prME超离亮带层，4为pJD2prMEΔ20％JEV超离亮带层，5为60％蔗糖层，6为pcDNA5/FRT超离后的上清层，7为pcDNA5/FRT的20％蔗糖层，8为pcDNA5/FRT的亮带层，9为pcDNA5/FRT的60％蔗糖层；反应抗体为重组DV EⅢ蛋白兔免疫血清。
图6是本发明DENV-1 VLPs、DENV-2 VLPs及PBS免疫Balb/C小鼠后，小鼠血清抗rEIII蛋白IgG检测结果比较，PBS为PBS免疫Balb/C小鼠阴性对照，D1 VLPs代表DENV-1 VLPs免疫Balb/C小鼠，D2 VLPs代表DENV-2 VLPs免疫Balb/C小鼠。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 DENV1-4prME基因元件的改造
一、DENV1-4、JEV的培养及细胞总RNA提取
将DENV-1 GZ01/95株、DENV-2 ZS01/01株、DENV-3 H87株及DENV-4 H241株、JEV SA14-14-2株(成都生物制品研究所)毒种液分别接种于贴壁长满的C6/36细胞，待细胞病变达+++～++++时，采用Trizol试剂法提取细胞总RNA。TrizolLS试剂为美国Invitrogen公司产品。
二、DENV1-4 prME基因元件的改造
采用ThermoScriptTM RT-PCR System(美国Invitrogen)将DENV 1-4以及JEV的RNA反转录合成cDNA第一链。通过融合PCR的方法对DENV1-4的prM-E基因进行改造：(1)第一轮PCR分别扩增来自日本脑炎病毒SA14-14-2株的信号肽序列JESS、DENV1-4 prME、DENV1-4prMEΔ20％以及JEV E基因C末端的20％基因；(2)融合PCR以第一轮PCR产物为模板，分别扩增：
JD1prME、JD1prMEΔ20％、JD1prMEΔ20％JEV；
JD2prME、JD2prMEΔ20％、JD2prMEΔ20％JEV；
JD3prME、JD3prMEΔ20％、JD3prMEΔ20％JEV；
JD4prME、JD4prMEΔ20％、JD4prMEΔ20％JEV。
酶切位点均为NheI(GCTAGC)及NotI(GCGGCCGC)。
第一轮PCR所用引物如下：
JESS-F：5′-gggcGCTAGCCGCCGCCGCCATGGGAAAACGGTCAGCGGGCTCAATCATGTGGC-3′
JESS-R：5′-GGCTCCTGCACAAGCTATG-3′
DENV-1 prME-F(DENV-1 prMEΔ20％-F)：5′-CATAGCTTGTGCAGGAGCCTTCCATCTGACCACCCGAGG-3′
DENV-1 prME-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaCGCCTGGACCATGACTCCTAGG-3′
DENV-1 prMEΔ20％-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaACTGCTTCCCTTCTTGAACC-3′
r DENV-1 prMEΔ20％-R：5′-GTTGAAAAGGCCTTGCCCAGACTGCTTCCCTTCTTGAACC-3′
DENV-2prM E-F(DENV-2 prMEΔ20％-F)：5′-CATAGCTTGTGCAGGAGCCTTCCATTTAACCACACGCAACG-3′
DENV-2 prME-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaGGCCTGCACCATGACTCCC-3′
DENV-2 prMEΔ20％-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaAGAGCTTCCTTTCTTAAACC-3′
r DENV-2 prMEΔ20％-R：5′-GTTGAAAAGGCCTTGCCCAGAGAGCTTCCTTTCTTAAACC-3′
DENV-3prM E-F(DENV-3 prMEΔ20％-F)：5′-CATAGCTTGTGCAGGAGCCTTCCACTTAACTTCACGAGATGG-3′
DENV-3 prME-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaAGCTTGCACCACGACCCCCAG-3′
DENV-3 prMEΔ20％-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaCGAGCTTCCCTTCCTGTACC-3′
r DENV-3 prMEΔ20％-R：5′-GTTGAAAAGGCCTTGCCCAGCGAGCTTCCCTTCCTGTACC-3′
DENV-4 prM E-F(DENV-4 prMEΔ20％-F)：5′-CATAGCTTGTGCAGGAGCCTTTCACTTGTCAACAAGAGATGG-3′
DENV-4 prME-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaTGCGTGAACTGTGAAACCCAG-3′
DENV-4 prMEΔ20％-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaGGAACTCCCTTTCCTGAACCAATGG-3′
r DENV-4 prMEΔ20％-R：5′-GTTGAAAAGGCCTTGCCCAGGGAACTCCCTTTCCTGAACC-3′
JEV E20％-F：5′-CTGGGCAAGGCCTTTTCAAC-3′
JEV E20％-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaAGCATGCACATTGGTCGCTAAG-3′
第一轮PCR体系及条件(采用罗氏试剂盒：PCR Grade Nucleotide Mix)
1.分别扩增JESS及JEV E基因C末端的20％基因PCR体系：ddH2O 36μl；10×缓冲液5μl；DMSO 2.5μl；dNTP1μl；引物F、R各2μl；模板1μl；酶0.5μl。条件：95℃ 2min
72℃ 7min
2.分别扩增DENV1-4 prME及DENV1-4 prMEΔ20％基因PCR体系同上。
条件：95℃ 2min
72℃ 7min
融合PCR所用引物如下：
DENV-1 prME-F(DENV-1 prMEΔ20％-F)：5′-CATAGCTTGTGCAGGAGCCTTCCATCTGACCACCCGAGG-3′
DENV-2prM E-F(DENV-2 prMEΔ20％-F)：5′-CATAGCTTGTGCAGGAGCCTTCCATTTAACCACACGCAACG-3′
DENV-3prM E-F(DENV-3 prMEΔ20％-F)：5′-CATAGCTTGTGCAGGAGCCTTCCACTTAACTTCACGAGATGG-3′
DENV-4 prM E-F(DENV-4 prMEΔ20％-F)：5′-CATAGCTTGTGCAGGAGCCTTTCACTTGTCAACAAGAGATGG-3′
JEV E20％-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaAGCATGCACATTGGTCGCTAAG-3′
JESS-F：5′-gggcGCTAGCCGCCGCCGCCATGGGAAAACGGTCAGCGGGCTCAATCATGTGGC-3′
DENV-1 prME-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaCGCCTGGACCATGACTCCTAGG-3′
DENV-1 prMEΔ20％-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaACTGCTTCCCTTCTTGAACC-3′
DENV-2 prME-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaGGCCTGCACCATGACTCCC-3′
DENV-2 prMEΔ20％-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaAGAGCTTCCTTTCTTAAACC-3′
DENV-3 prME-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaAGCTTGCACCACGACCCCCAG-3′
DENV-3 prMEΔ20％-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaCGAGCTTCCCTTCCTGTACC-3′
DENV-4 prME-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaTGCGTGAACTGTGAAACCCAG-3′
DENV-4 prMEΔ20％-R：5′-tgtgGCGGCCGCttaGGAACTCCCTTTCCTGAACCAATGG-3′
融合PCR体系及条件(采用罗氏试剂盒：PCR Grade Nucleotide Mix)
1.首先分别将DENV1-4 prMEΔ20％与JEV E基因C末端的20％基因进行融合，融合后的片段命名为DENV1-4 prMEΔ20％JEV。
PCR体系：ddH2O 35μl；10×缓冲液5μl；DMSO 2.5μl；dNTP1μl；引物F、R各2μl；两个片段的模板各1μl；酶0.5μl。
条件：95℃ 2min
72℃ 7min
2.最后将JESS分别与DENV1-4 prME、DENV1-4 prMEΔ20％及DENV1-4 prMEΔ20％JEV基因进行融合。
PCR体系：ddH2O 35μl；10×缓冲液5μl；DMSO 2.5μl；dNTP1μl；引物F、R各2μl；两个片段的模板各1μl；酶0.5μl。
条件：95℃ 2min
72℃ 7min
实施例2 能够分泌表达DENV1-4VLPs的重组载体的构建及鉴定
将实施例1中经过融合PCR改造的prME基因经NheI和NotI双酶切后回收目的片段，与经同样双酶切的pcDNA5/FRT载体(Invitrogen公司产品)定向连接，连接产物转化E.coli DH5α(美国Stratagene公司产品)感受态细胞，挑取单克隆接种含有抗生素的LB培养基进行37℃振荡培养12小时，质粒经小量制备后酶切及测序鉴定。选取鉴定正确的质粒分别命名为：
pJD1prME、pJD1prMEΔ20％、pJD1prMEΔ20％JEV；
pJD2prME、pJD2prMEΔ20％、pJD2prMEΔ20％JEV；
pJD3prME、pJD3prMEΔ20％、pJD3prMEΔ20％JEV；
pJD4prME、pJD4prMEΔ20％、pJD4prMEΔ20％JEV；
上述重组表达载体的结构示意图如图1a～图1c所示。
二、重组载体瞬时转染293T细胞
转染前一天用不含抗性的培养基将293T细胞(ATCC)传至6孔板中，待细胞长至90％单层满时进行转染。转染前用不含FBS及双抗的培养基将细胞轻轻洗两次，加入2ml上述培养基。制备转染混合物：首先在EP管中加入50μl OPTI(不含血清)，接着加入2μg待转染的质粒，轻轻混匀，再加入5μl转染试剂(FuGENEHD Transfection Reagent)，轻轻混匀，室温静置20min，将转染试剂轻轻滴入细胞培养基中，轻轻转动细胞培养板，将液体混匀。37℃CO2培养箱培养48h后进行检测，转染同时设置阴性对照，为pcDNA5/FRT空载体转染细胞。
三、DENV1-4 VLPs的间接免疫荧光鉴定
将上清轻轻吸出暂时保存于4℃。将细胞吹下后用PBS洗2遍。细胞重悬于PBS中，制备抗原片，冷丙酮固定15min。以登革病毒E蛋白特异性抗体DE1(abcam)为一抗(1∶100)，FITC标记的羊抗鼠血清为二抗(1∶100；美国Sigma)，荧光显微镜下观察抗原片。结果在荧光显微镜下能观察到特异荧光，pcDNA5/FRT转染的293T细胞不与DE1抗体反应。结果如图2所示。
四、DENV1-4 VLPs的western-blot鉴定
将上清浓缩20倍后取40μl加10μl 5×蛋白上样缓冲液，煮沸3min，进行SDS-PAGE电泳，经半干电转法，将蛋白转移到PDVF膜上，以DENV1-4重组EⅢ蛋白免疫的兔血清为一抗(1∶200)，HRP标记的羊抗兔血清为二抗(1∶2000美国Sigma)，DAB显色，结果如图3所示。pJD1prME与pJD1prMEΔ20％JEV在60KD处均可见目的条带，而pJD1prMEΔ20％条带大小明显小于前两者。pJD2-4prME表达上清均未见明显目的条带，pJD2-4prMEΔ20％JEV表达上清在60KD处均可见条带，与预期一致，而pJD2-4prMEΔ20％表达上清虽能检测到目的条带，但大小明显小于60KD。
实施例3 DENV1-4VLPs的制备、鉴定及免疫原性实验
一、DENV1-4VLPs的制备及鉴定
收获pJD1prME、pJD1-4prMEΔ20％JEV转染上清各2L，高倍浓缩至3ml后采用15-60％蔗糖密度梯度离心法对DENV1-4 VLPs进行纯化，抽取各层条带进行SDS-PAGE和Western blot检测。图4为DENV-1及DENV-2VLPs的SDS-PAGE鉴定图，图5为DENV-1及DENV-2VLPs的Western blot鉴定图。
二、DENV-1及DENV-2 VLPs初步免疫原性实验
1、免疫方案：4-6周龄Balb/c小鼠，在0、7、28天注射DENV-1 VLPs或DENV-2 VLPs，1×PBS作为阴性对照。
2、ELISA检测血清抗rEIII蛋白抗体(rEIII蛋白为在原核表达***中串联表达四个型别登革病毒的EIII蛋白，其制备过程如下：首先，PCR扩增1-4型DENV的EIII基因片段，并通过融合PCR的方法将1-4型DENV的EIII基因片段连接后获得融合基因rEIII，将rEIII融合基因克隆至原核表达载体pET30a中，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE可溶性分析结果显示表达形式为包涵体。包涵体复性采用稀释复性的方法，复性后蛋白依次经金属螯合层析柱和弱阴离子交换柱进行纯化，即得)。
a.抗原包被：以原核表达纯化的rEⅢ蛋白为抗原，按200ng/孔加入96孔板中，4℃过夜，PBST洗板3次；
b.每孔加入300μl无菌PBS配制的5％脱脂奶，37℃封闭2h，PBST洗板3次；
c.将收集的小鼠血清用5％的脱脂奶进行稀释，从1∶50开始，作2倍系列稀释，按100μl/孔加入96孔板中，37℃孵育1h，PBST洗板6次；
d.加入二抗：HRP标记的羊抗鼠IgG用5％脱脂奶按1∶1000稀释，100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗板6次；
e.显色：加底物A液、B液(购自万泰生物药业)每孔50μl，避光放置10min。2N H2SO4 50μl终止反应。
f.酶标仪检测A450，结果如图6所示。图6为DENV-1 VLPs、DENV-2VLPs及PBS免疫Balb/C小鼠后，鼠血清抗rEIII蛋白IgG检测结果比较，其中PBS为PBS免疫Balb/C小鼠阴性对照，D1VLPs代表DENV-1 VLPs免疫Balb/C小鼠，D2 VLPs代表DENV-2 VLPs免疫Balb/C小鼠。
3、中和试验检测血清的中和活性
a.将BHK-21细胞传代至96孔板，待细胞长至单层；
b.将收集的小鼠免疫血清于56℃灭活30min，过0.45μm滤膜；
c.将灭活血清用Eagle’s维持液(含1％FBS，1％P.S，1％G，2％Na+)从1∶5开始，依次作2倍的倍比稀释，与100TCID50的DENV-1或DENV-2按1∶1混合，37℃温育1h；
d.吸出96孔板中的培养液，用维持液洗1次；
e.按200μl/孔加入中和血清，每个稀释度作4个复孔；
f.37℃，5％CO2条件培养，逐日观察病变，共观察7天；
g.以四个复孔均不出现可观察到的细胞病变的血清稀释度作为抗体中和效价，结果如表1所示。
表1DENV-1及DENV-2 VLPs小鼠免疫血清中和抗体效价检测结果
进一步地，本发明还对DENV-3 VLPs和DENV-4 VLPs的免疫原性进行了初步检测，结果表明二者均能产生具有一定中和活性的抗体。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.编码登革病毒病毒样颗粒的基因，其特征在于，其具有Seq IDNo.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3、Seq ID No.4或Seq ID No.5所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有编码同等功能蛋白质的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述基因的载体。
3.含有权利要求2所述载体的宿主细胞。
4.如权利要求3所述的宿主细胞，其为哺乳动物宿主细胞。
5.权利要求1所述基因编码的登革病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括步骤：
1)采用RT-PCR技术从DENV-1 GZ01/95株、DENV-2 ZS01/01株、DENV-3 H87株以及DENV-4 H241株中分别获得四个型别的登革病毒prM-E基因元件；
2)通过融合PCR技术分别对四个型别的登革病毒prM-E基因元件进行改造，即在各型别prM-E基因前增加一段来自日本脑炎病毒SA14-14-2株的信号肽序列和/或将各型别prM-E基因C末端的20％基因序列替换为日本脑炎病毒SA14-14-2株E基因的相应序列；
3)将四个型别的登革病毒prM-E基因改造元件分别克隆入真核***表达载体中；
4)用3)中得到的重组表达载体分别转染哺乳动物细胞，并使其分泌表达登革病毒病毒样颗粒；
5)ELISA检测登革病毒病毒样颗粒的免疫原性。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述真核***表达载体为pcDNA5/FRT。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为293T细胞。
8.权利要求1所述基因编码的登革病毒病毒样颗粒在制备预防登革病毒所引起的疾病的药物中的应用。
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