CN103751773B - 稳定表达猪瘟病毒e0-e1-e2蛋白的重组bhk细胞系及其在制备猪瘟疫苗与诊断试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组细胞系及其在制备猪瘟疫苗与诊断试剂中的应用。其中，所述表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组细胞系为BCSFV-E012，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC？No.7720。此外，本发明还公开了稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白细胞系的建立方法以及使用所述细胞系制备预防猪瘟的疫苗组合物的方法，进一步的，本发明还公开了所述重组细胞系表达的E0-E1-E2蛋白在制备预防猪瘟的疫苗及诊断试剂中的应用。采用本发明所述的重组细胞系制备得到的猪瘟疫苗安全性高，免疫效果好，容易大规模生产，不易受外源病毒污染或抗体影响，而且不产生猪瘟病毒非结构蛋白抗体，因此可以对疫苗免疫与病毒感染动物进行鉴别。

Description

稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组BHK细胞系及其在制备猪瘟疫苗与诊断试剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组BHK细胞系及其在制备猪瘟疫苗与诊断试剂中的应用。更具体地，本发明涉及一种表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白重组BHK细胞系是BCSFV-E012。本发明还公开了制备所述重组BHK细胞系的方法和该重组细胞系在制备预防猪瘟疫苗以及猪瘟诊断试剂中的应用。属于生物医药基因工程与免疫学领域。

背景技术

猪瘟（Classicalswinefever,CSF）又称猪霍乱（Hogcholera,HC）是由猪瘟病毒（HogCholeravirus,HCV或Classicalswinefevervirus,CSFV）引起的一种急性热性致死性疾病，猪瘟具有高度接触传染性，流行广泛，发病与死亡率高，危害极大。国际兽疫局(OIE)以前将其定为A类传染病，现将期列为通报疫病，我国将其列为一类动物疫病。

在中国全国范围内都有猪瘟发病流行，对养猪业危害极大。目前对该病的有效防措施为疫苗免疫预防。其中由中国科学家研究成功的猪瘟弱毒疫苗（C株）对世界范围内猪瘟防控发挥了卓著贡献。该疫苗目前仍被我国等多个国家使用。而且由此弱毒株的基础上开发出了乳兔苗，免脾淋苗，原代细胞苗及传代细胞苗等多种形式的弱毒疫苗。但组织苗的生产需要大量健康动物，生产过程中人工劳动强度大，成本高，有接种副反应等等这些不利因素影响了此类疫苗的实际应用。而以培养细胞繁殖弱毒生产疫苗同样也受到诸多因素困扰，如细胞培养用血清中BVDV及抗体会干扰病毒生长，病毒抗原滴度难以提高，弱毒疫苗需要全程冷链保藏等等均导致弱毒疫苗的最终使用效果受到影响。而且所有弱毒疫苗在实际合用过程中均易受母源抗体影响，这也是导致免疫失败的因素之一。

那么随着现代基因工程技术与细胞生物工程技术的发展，许多科研人员试图以现代分子生物学手段研制出可以克服现有疫苗缺陷的新型猪瘟疫苗。这些新型的猪瘟疫苗有病毒活载体疫苗，合成肽疫苗，DNA疫苗，昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单疫苗，大肠杆菌表达蛋白的亚单位疫苗等等。其中至目前得到应用的有欧洲科研人员研制的以昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗，该疫苗免疫不受母源抗体影响，而且可以与病毒感染进行抗体检测鉴别诊断。

CSFV为有囊膜病毒，病毒粒子大小约为40-60nm。病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3kb，含一个大的开放性阅读框(ORF)，编码一个含3898个氨基酸残基的多聚蛋白，分子量约为438kDa。多聚蛋白在翻译的同时和翻译后经病毒和宿主细胞的蛋白酶加工成12种成熟的病毒蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白，其多聚蛋白上从N疫到C端的顺序依次为：Npro、C、E0(Erns)、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80)，除C、E0、E1和E2为结构蛋白外．其余均为非结构蛋白。结构蛋白的加工是由宿主细胞的信号肽酶介导进行的，蛋白酶首先在核衣壳蛋白C和E012前体之间剪切多聚蛋白，随后在E2的C端剪切开，最后E012被迅速剪切成E01和E2。在E2从E012前体释放以后，E01被加工成E0和E1，最后这3种囊膜糖蛋白通过分子内或分子间二硫键形成复合物，组装成病毒粒子结构。

猪瘟病毒的基因组结构与其它黄病毒如乙型脑炎病毒等黄病毒有着某些相似的特点。基因组都是编码一个大的多聚蛋白前体后经剪切加工形成结构蛋白与非结构蛋白。已知如JEV等黄病毒的结构蛋白基因在哺乳动物细胞内表达能组装形成病毒样颗粒（viruslikeparticle,VLP）结构。VLP抗原具有接近于病毒粒子的天然结构构象，能诱导机体产生体液免疫与细胞免疫。且不含病毒核酸，不能复制，无致病性，安全性高，所有这些优点使得表达VLP抗原是制备新型病毒病疫苗的首选。那么猪瘟病毒的结构蛋白在哺乳动物细胞内表达后能不能形成VLP结构目前还没有报道。本研究室近年来开展了以哺乳动物细胞系表达不同黄病毒细胞蛋白基因。本研究组在本发明中探索了不同表达细胞系并最终找到合适表达细胞系，克服了表达黄病毒膜蛋白对细胞的毒性作用，并建立了大规模筛选等技术，结果成功制备了表达猪瘟病毒结构蛋白细胞系，而且表达蛋白能组装成病毒样颗粒结构。该细胞系表达VLP抗原能对免疫猪诱导产生良好的免疫反应。同时该抗原表达量高，易于纯化，可以用作CSFV抗体检测的抗原。该细胞系表达抗原所制备的疫苗可望为猪瘟的预防提供新型、高效的预防制剂。对我国及至世界范围内猪瘟的预防控制可以发挥重要作用。

发明内容

本发明的目的之一是提供稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组BHK细胞系。

本发明的目的之二是提供一种构建上述稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组BHK细胞系的方法。

本发明的目的之三是将所述的表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组BHK细胞系及所表达的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白应用于制备猪瘟疫苗，或者将其用于制备成诊断或检测猪瘟病毒感染的试剂。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一种用于预防猪瘟的疫苗组合物，其特征在于所述的疫苗组合物中含有经稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系表达的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白及佐剂，其中所述的E0-E1-E2蛋白为病毒样颗粒抗原。

在本发明中，优选的，所述的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo．1所示。

在本发明中，优选的，所述的稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系是通过以下方法构建得到的：

(1)构建真核表达质粒，该真核表达质粒包括其中***的编码猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的cDNA序列；

(2)将所述真核表达质粒转染BHK-21细胞；

(3)经质粒转染的细胞以添加了G418的培养液选择培养；

(4)将经选择培养的细胞进行稀释克隆，收获克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较猪瘟病毒E2蛋白的表达量，获得稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组BHK细胞系。

其中，优选的，所述的编码猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的cDNA序列如SEQIDNo．2所示。

按照上述方法，本发明得到了一株能够稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组BHK细胞系，命名为BCSFV-E012，分类命名为幼仓鼠肾细胞(Babyhamsterkidneycell)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.7720，保藏时间为2013年6月18日。

本发明还提出了所述的BHK细胞系所表达的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白，其特征在于所述的E0-E1-E2蛋白为病毒样颗粒蛋白。

本发明制备的表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组细胞系，容易培养，增殖快速，可无限扩大，性质稳定，蛋白表达量高，表达蛋白经细胞自身加工修饰后能形成病毒样颗粒，表达蛋白免疫猪后能诱导动物机体产生病毒中和抗体，可抵抗病毒感染。细胞培养液中的表达蛋白经纯化后可以用检测猪瘟病毒抗体。

因此，进一步的，本发明还提出了所述的稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系或其培养物在制备预防猪瘟病毒病疫苗药物中的应用，其中所述的培养物为由表达的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白自组装形成的病毒样颗粒蛋白。及

所述的稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系或其培养物在制备诊断或检测猪瘟病毒感染试剂中的应用，其中所述的培养物为由表达的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白自组装形成的病毒样颗粒蛋白。

更进一步的，本发明提出了一种制备所述的预防猪瘟的疫苗组合物的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将上述所述的BHK细胞系BCSFV-E012正常传代后长至90%满时，换血清含量为1～2%（v/v）的低血清培养基继续培养4-6d，收获细胞培养上清液存于4℃；

（2）细胞上清液经截留分子量为100kD超滤浓缩后调整至E2抗原ELISA效价为1：32至1：64后，加入终浓度为0.02%（w/w）硫柳汞后为疫苗抗原液；

（3）疫苗抗原液与油佐剂按体积比为1：1.5进行混合并充分乳化，即得。

本发明的有益效果如下：

1．将本发明的表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组细胞的培养物制备成疫苗，可以诱导动物机体产生针对CSFV的中和抗体，并能够在体内或体外中和CSFV，阻止病毒感染动物机体。

2.本发明所选用的表达***为BHK-21细胞，所获得的重组细胞系抗原表达量高，可以悬浮培养或高密度发酵培养，易于大量生产。

3.本发明的重组表达细胞系可以利用无血清培养基或低血清培养基进行培养表达，可以降低抗原或疫苗生产成本。

4.本发明对抗原蛋白基因进行了基因密码子优化，有利于提高抗原表达量。

5.利用本发明的重组表达细胞系的细胞培养物制备的油佐剂疫苗和水相佐剂疫苗均能诱导动物机体产生较高效价的病毒中和抗体。

6.利用本发明重组细胞系表达的抗原制备的疫苗免疫动物不产生猪瘟病毒非结构蛋白抗体，因此，可以通过检测猪瘟病毒非结构蛋白抗体来对疫苗免疫与病毒感染动物进行鉴别。

7.本发明所制备的猪瘟疫苗不含病毒核酸，不能复制，无致病性，具有极高的生物安全性，疫苗免疫不受母源抗体或已经存在抗体干扰。

附图说明

图1为重组真核细胞表达质粒构建示意图；

图2为转染后不同克隆细胞表达E2蛋白ELISA检测；

图3为筛选克隆细胞系不同代次细胞表达E2蛋白ELISA检测；

图4为重组细胞系表达CSFVE2蛋白IFA检测；

A，克隆细胞第5代；B，克隆细胞第25代；C，正常BHK-21细胞对照；

图5为重组细胞系表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白形成病毒样颗粒电镜观察；

箭头所示为细胞表达E0-E1-E2蛋白在细胞内所形成的CSFV病毒样颗粒；

图6为免疫猪血清猪瘟病毒ELISA抗体检测；

图7为重组细胞系表达蛋白检测猪瘟血清抗体结果。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围之内。

实施例1稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组细胞系的构建及检测

1材料与方法

1.1质粒，菌株与细胞

真核表达载体质粒pCAG-neo、DH5α感受态细胞和BHK-21细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室保存，质粒中提试剂盒和RNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品，胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司，G418购自Gibco公司，胰酶购自Hyclone公司，ReverseTranscriptaseM-MLV﹑PrimeSTAR^TMHSDNAPolymerase﹑SalI﹑XhoI﹑BamHI﹑T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，抗CSFVE2蛋白与抗CSFVE0蛋白的单克隆抗体由本研究组制备，猪瘟病毒抗原ELISA检测试剂盒为MedianDiagnostics公司产品，猪瘟病毒E2蛋白抗体ELISA检测试剂盒为IDEXX公司产品，FITC标记山羊抗小鼠IgG购自中杉金桥生物公司，HDTransfectionReagent转染试剂盒购于Roche公司。

1.2重组表达质粒的构建

opti-CSFV-E012基因为经真核细胞偏嗜性密码子优化的编码CSFVE0-E1-E2蛋白的基因。CSFVE0-E1-E2蛋白的氨基酸序列参考CSFVShimen株的蛋白序列(GenBank:AAC68902.2)，将该蛋白序列中E2蛋白第258位氨基酸V修改为氨基酸I，在E0蛋白的N端加入一个氨基酸M和22氨基酸残基序列作为信号肽，E0-E1-E2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在设计该基因时，在起始密码子前加有Kozak序列与SacI酶切位点与保护性碱基；在的E蛋白基因编码末端加有终止子与XhoI酶切位点与保护性碱基。opti-CSFV-E012基因以及该基因特异性扩增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的基因opti-CSFV-E012大小为2.475bp，两端含有SacI﹑XhoI酶切位点，序列如SEQIDNO.2所示，合成基因克隆在pUC57质粒中。真核表达载体pCAG-neo用SacI﹑XhoI双酶切处理，然后与经SacI与XhoI双切回收的opti-CSFV-E012基因在T4DNA连接酶作用下连接，转化DH5α感受态细胞后涂布含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，用SacI﹑XhoI双酶切对其进行鉴定；酶切鉴定阳性质粒命名为pCAGneo-opti-CSFV-E012，同时送生物公司进行测序验证。质粒构建示意图见图1。

1.3细胞转染与筛选

选生长状态良好的BHK-21细胞消化传代至24孔板中，待BHK-21细胞长至90%满时，按照HDTransfectionReagent转染试剂盒操作说明用重组质粒pCAGneo-opti-CSFV-E012转染细胞。转染48h后加入含G418(1000μg/mL)选择性培养基进行加压培养，4d后将细胞用胰酶消化，以有限稀释法传代于96孔板中继续培养，7d后在倒置显微镜下观察每孔细胞的克隆数目。挑选含有1个细胞集落(即1个细胞团块)的孔相继在24孔板、6孔板、细胞培养瓶中扩大培养，同时对各细胞进行IFA鉴定以及对表达蛋白进行ELISA检测。筛选IFA信号较强及表达抗原量高的细胞克隆。

1.4克隆细胞表达E2蛋白的ELISA检测

克隆细胞在24孔板中培养2d后，收集上清液，以未转染BHK-21细胞的培养上清液为对照，用CSFV抗原检测试剂盒检测克隆细胞上清培养液中E2蛋白，ELISA检测按试剂盒说明进行，测定OD450值，对各细胞克隆表达抗原进行相对定量比较筛选。

1.5间接免疫荧光试验检测目的蛋白在转染细胞中的表达

将克隆细胞接种至24孔或12孔板中，24h后去除培养液，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，用含0.1%TritonX100的PBS作用细胞10min，PBS洗3次，用含4%BSA的PBS封闭2h，PBS洗1次，加入1:500稀释的抗E2蛋白单克隆抗体或1：200稀释的E0蛋白单克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS洗3次，加入按1:200稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG，室温孵育2h，PBS洗3次，在荧光显微镜下观察结果。

1.6克隆细胞的RT-PCR鉴定

用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，取10μL进行反转录,加入OligodT1μL，RNase抑制剂1μL，M-MLV5×Buffer5μL，M-MLV转录酶1μL，dNTP（10mM）2.5μL，补加双蒸水至25μL，混合，42℃加热60min，95℃5min终止反应。然后利用opti-CSFV-E012基因特异性引物，PCR扩增目的基因。

1.7重组细胞系表达蛋白形成病毒样颗粒的电镜观察

将经IFA与ELISA检测能稳定表达目的蛋白的细胞传代培养，换细胞维持液后再培养4天后，将培养细胞送电镜室进行固定，超薄细胞切片，透射电镜观察细胞内猪瘟病毒样颗粒。对筛选出高表达量细胞克隆进行大量培养，收获上清液后经超滤浓缩后再经蔗糖密度梯度离心纯化表达抗原，将纯化抗原进行负染电镜观察

CSFV-VLP。

2结果

2.1重组表达质粒的构建

构建的重组表达质粒pCAGneo-opti-CSFV-E012的结构图见图1。提取的重组质粒经XhoΙ﹑SacΙ双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，发现有两条带，酶切产物电泳带型与预期结果一致，同时测序结果表明重组质粒中SacΙ﹑XhoΙ酶切位点间的序列和设计的编码E0-E1-E2蛋白的基因完全一致。

2.2E0-E1-E2基因稳定表达细胞系的建立

2.2.1转染细胞株的筛选

细胞转染48h后，加入G418选择培养基，以有限稀释法传代于96孔板中继续培养，7d后在倒置显微镜下挑选出含单个细胞集落的克隆并经IFA鉴定，筛选出5个阳性细胞克隆。

2.2.2克隆细胞的RT-PCR鉴定

利用RT-PCR对IFA鉴定阳性细胞克隆进行目的基因的扩增后，结果表明，对所筛选出的细胞克隆的不同代次的细胞均能扩增出与理论大小一致的目的条带。表明目的基因已稳定融合于细胞基因组中，且遗传稳定。

2.3.3表达细胞系的ELISA检测筛选

对5个克隆细胞培养上清液进行CSFVE2蛋白抗原ELISA检测，结果表明经IFA筛选出的5个克隆中5号克隆蛋白表达量最高(图2)，选取5号细胞克隆进行传代培养与进一步特性分析。5号克隆细胞经过不同代次传代后对培养上清液进行CSFVE2蛋白ELISA检测，结果表明筛选出的克隆细胞系在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平(图3)。结果表明构建的重组细胞系能稳定表达目的基因。

将得到的能够稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的5号克隆，命名为BCSFV-E012，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.7720，保藏时间为2012年6月18日。

2.3.4间接免疫荧光试验检测E2蛋白在转染细胞中的表达

间接免疫荧光试验显示，细胞克隆在克隆后第一代即能呈现较强的黄绿色荧光信号，而对照细胞不呈现荧光信号。且该细胞克隆经传代至第20代时，仍能稳定表达目的蛋白(图4)。

2.3.5间接免疫荧光试验检测E0蛋白在转染细胞中的表达

间接免疫荧光试验显示，经E2表达量ELISA检测筛选出的细胞系细胞经E0单克隆抗体检测后能呈现绿色荧光信号。表明E0蛋白在细胞内得到表达。

2.3.6重组细胞系表达蛋白形成病毒样颗粒的电镜观察

重组细胞系经细胞切片电镜观察表明，在细胞的内膜***内质网中可以观察到CSFV病毒样粒子，直径约为40nm。细胞培养上清液中纯化的抗原经电镜也观察到CSFV病毒样颗粒结构（图5）。表明所构建细胞系表达的蛋白能组装成CSFV-VLP。

实施例2细胞系表达重组蛋白对猪的免疫保护试验

疫苗制备：将实施例1所构建筛选的重组细胞系BCSFV-E012（CGMCCNo.7720）细胞正常传代后长至90%满时，换低血清培养基（血清含量为1～2%）继续培养4-6d，收获细胞培养上清液存于4℃，细胞上清液经截留分子量为100kD超滤浓缩后调整至E2抗原ELISA效价为1：32至1：64后加入终浓度为0.02%硫柳汞后为疫苗抗原液。疫苗抗原液与油佐剂按体积比为1：1.5进行混合并充分乳化。对照组弱毒疫苗为市场销售的猪瘟细胞苗（牛睾丸原代细胞源）产品。

动物分组与免疫：实验用猪在免疫前均进行采血分离血清进行CSFV抗体检测为阴性。选取日龄相近断奶长白仔猪15头，随机分为3组：第一组猪5只为弱毒疫苗免疫对照组，免疫CSFV弱毒苗5头份/猪，只免疫一次（弱毒疫苗组）；第二组猪5只为重组细胞系表达E0-E1-E2抗原制备的油苗组，免疫疫苗2ml，第一次免疫四周后进行加强免疫一次（重组抗原疫苗组）；第三组猪5只为空白对照组，进行PBS注射对照（PBS对照组）。

血清中和抗体检测：实验猪在免疫前采血一次，经ELISA检测所有猪血清为CSFV抗体阴性。在一免后四周油苗免疫组进行加强免疫一次。在第一次免疫后2周和4周分别采血分离血清。在二次免疫后第2、4、8、12、16、20、24、28周采血分离血清。实验动物猪血清均进行CSFV病毒中和抗体检测，检测中和抗体方法为OIE手册推荐的NPLA法。具体方法为：各组猪血清56℃灭活30min后，在96孔细胞板中开始用DMEM进行10倍稀释，以后再依次进行2倍稀释。将稀释好的血清50μL与等体积CSFV病毒(Shimen株，200TCID₅₀/0.1ml)混合。37℃孵育1h，然后加100μLPK-15细胞，37℃培养3d后将细胞用20%丙酮PBS固定。以抗CSFVE2蛋白单克隆抗体为一抗，HRP标记羊抗鼠酶标记抗体为二抗，用ACE进行显色。每个血清样品进行3次重复。同时设立空白对照。细胞板经显色后于光镜下观察判定结果。以减少50%以上感染的最大血清稀释倍数为血清的中和效价。

血清ELISA抗体检测：免疫前后所采集猪血清以IDEXX猪瘟抗体检测试剂盒进行检测，检测方法按试剂盒说明进行。分别按说明书方法计算抗体阻断率。将血清进行倍比稀释后检测血清抗体效价（抗体阻断率大于40%的血清最高稀释倍数）。

结果：血清中和抗体检测结果表明，本发明所构建制备的表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白重组BHK细胞系所表达的抗原制备的疫苗免疫猪后能诱导猪产生CSFV病毒中和抗体。二免后二周(初免后6周)中和抗体最高能达5120，达到中和抗体高峰，其值明显高于弱毒疫苗免疫组中和抗体水平。二免后四周(初免后8周)重组亚单位疫苗能诱导中和抗体效价为2560。以后中和抗体呈缓慢下降趋势，但依然保持高水平中和抗体。至免疫后7个月（28周），本发明制备的疫苗免疫组病毒中和抗体水平仍达320，远远高于能对猪提供免疫保护所需的病毒中和抗体水平（40～50）。而实验中未免疫对照猪在整个实验期间其病毒中和抗体水平都为小于10。具体实验数据如表1所示。

阻断ELISA检测抗体结果显示，重组亚单位疫苗免疫猪后2周可诱导产生猪瘟特异性抗体（抗体阻断率大于40%），随后抗体水平逐渐升高，在免疫后第6-8周达峰值。在抗体持续期间，重组亚单位疫苗免疫组抗体水平均高于弱毒疫苗组抗体水平。这种高水平抗体在免疫后观察32周期始终存在（图6）。

表1重组亚单位疫苗免疫猪血清病毒中和抗体检测结果

^a重组抗原疫苗组于初次免疫后4周进行加强免疫一次。

实施例3用重组细胞系表达抗原间接ELISA法检测猪瘟病毒抗体

将BCSFV-E012细胞扩大培养，收获细胞培养上清液。细胞上清液经低速离心去除细胞碎片等杂质后再经0.45μm滤膜过滤澄清。澄清的上清液再经截留分子量为100kD的滤膜超滤浓缩。经约40倍体积浓缩后，再经12000rpm离心，去除不溶杂质。上清液经浓度为10%至50%的连续蔗糖密度梯度离心。收集20%－30%浓度蔗糖层液，再经超滤脱糖与浓缩后测定蛋白含量，纯化抗原于-70℃保存备用。用纯化CSFV-E012蛋白为包被抗原，包被96孔聚苯乙烯酶标板。用pH9.6，0.1M碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度为3μg/ml，按100μl/孔加入酶标板中，4℃包被过夜。然后用PBST（PBS＋0.05%Tween）洗涤酶标板3次；含1%BSA的PBST封闭酶标板，37℃封闭2h，封闭后用洗液PBST洗板3次，立即用于检测或－20℃存放备用。

抗体检测操作程序：加入待检测猪血清（定性检测血清100倍稀释，抗体效价检测血清进行倍比稀释，同时设立阳性血清对照与阴性血清对照以及不加血清的空白对照），37℃孵育1h，PBST洗液洗涤3次，每次3分钟；加入辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG（Goat-anti-pigIgG-HRP），37℃孵育1h，PBST洗液洗涤4次，每次3分钟；加入HRP显色底物（TMB显色剂），室温孵育5-15分钟观察显色反应；充分显色后，加入2M硫酸终止显色反应；用酶标仪测量450nm波长的吸光值；判定结果。

判定结果时：空白对照及阴性血清孔吸光值小于或等于0.3，阳性血清对照孔吸光值大于0.4时结果有效；计算P/N值＝(检测孔OD值－空白对照孔OD值)/(阴性血清OD值－空白对照孔OD值)，P/N值等于或大于2时为阳性；以反应阳性血清的最大稀释倍数为该样品血清的抗体效价。

选取已知的猪瘟病毒抗体阳性猪血清以及阴性猪血清各20份，分别以纯化CSFV-E012蛋白为包被抗原进行间接ELISA检测，以检测抗原的检测效果。检测结果如图7所示，所有阳性血清OD450值均大于0.5，所有阴性血清OD450值均小于0.3。表明本抗原具有很好的特异性与敏感性。

Claims (8)

1.一种用于预防猪瘟的疫苗组合物，其特征在于所述的疫苗组合物中含有经稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系表达的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白及佐剂，其中所述的E0-E1-E2蛋白为病毒样颗粒抗原，所述的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；

所述的预防猪瘟的疫苗组合物是通过以下步骤制备得到的：

(1)将BHK细胞系BCSFV-E012正常传代后长至90％满时，换血清体积百分比含量为1～2％的低血清培养基继续培养4-6d，收获细胞培养上清液存于4℃；

(2)细胞上清液经截留分子量为100kD超滤浓缩后调整至E2抗原ELISA效价为1：32至1：64后，按照质量百分比计，加入终浓度为0.02％硫柳汞后为疫苗抗原液；

(3)疫苗抗原液与油佐剂按体积比为1：1.5进行混合并充分乳化，即得；

其中，所述的BHK细胞系BCSFV-E012，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.7720。

2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于所述的稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系是通过以下方法构建得到的：

(1)构建真核表达质粒，该真核表达质粒包括其中***的编码猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的cDNA序列；

(2)将所述真核表达质粒转染BHK-21细胞；

(3)经质粒转染的细胞以添加了G418的培养液选择培养；

(4)将经选择培养的细胞进行稀释克隆，收获克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较猪瘟病毒E2蛋白的表达量，获得稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的重组BHK细胞系。

3.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于所述的编码猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的cDNA序列如SEQIDNo.2所示。

4.稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系，命名为BCSFV-E012，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.7720，所述的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

5.由权利要求4所述的BHK细胞系所表达的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白，其特征在于所述的E0-E1-E2蛋白在细胞内表达能自组装成为病毒样颗粒蛋白，所述的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

6.权利要求4所述的稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系或其培养物在制备预防猪瘟病毒病疫苗药物中的应用，其中所述的培养物为由表达的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白自组装形成的病毒样颗粒蛋白，所述的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

7.权利要求4所述的稳定表达猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的BHK细胞系或其培养物在制备诊断或检测猪瘟病毒感染试剂中的应用，其中所述的培养物为由表达的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白自组装形成的病毒样颗粒蛋白，所述的猪瘟病毒E0-E1-E2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

8.一种制备权利要求1-3任一项所述的预防猪瘟的疫苗组合物的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将权利要求4所述的BHK细胞系BCSFV-E012正常传代后长至90％满时，换血清体积百分比含量为1～2％的低血清培养基继续培养4-6d，收获细胞培养上清液存于4℃；

(2)细胞上清液经截留分子量为100kD超滤浓缩后调整至E2抗原ELISA效价为1：32至1：64后，按照质量百分比计，加入终浓度为0.02％硫柳汞后为疫苗抗原液；

(3)疫苗抗原液与油佐剂按体积比为1：1.5进行混合并充分乳化，即得。