CN102329749B

CN102329749B - 一株经航天育种技术选育的枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN102329749B
Application number: CN2011102780644A
Authority: CN
Inventors: 单宝龙; 谷巍; 徐海燕; 翟延庆
Original assignee: SHANDONG BAOLAI-LEELAI BIO-ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: SHANDONG BAOLAI-LEELAI BIO-ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2011-09-19
Filing date: 2011-09-19
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2031-09-19
Also published as: CN102329749A

Abstract

本发明公开了一株经航天育种技术选育的枯草芽孢杆菌，该菌株命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N9-1-35，已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2011301。本发明的枯草芽孢杆菌经试验测试表明，是非常优秀的益生素菌种。进入动物肠道后，除了发挥其益生素的功能外，在其生长繁殖过程中还能够产生多种消化酶，从而提高动物对饲料的消化吸收，提高饲料转化率，降低饲料成本，可以用于产酶益生素的生产，是一株极具研究开发价值的菌株。本发明还公开了一种产酶益生素，其是由枯草芽孢杆菌菌粉、乳酸链球菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉及玉米淀粉组成的。

Description

一株经航天育种技术选育的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株经航天育种技术选育的枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

二十一世纪，人们对食品安全和生态环境要求越来越高，处于养殖业前沿的饲料行业普遍引起人们的关注。全国饲料工业办公室颁布的《1996-2020年中国饲料工业发展战略研究》中已明确提出“用绿色环保产品替代饲用抗生素等化学合成物质滥用非常迫切”，替代这些污染物质最优方法就是利用生物技术。微生态制剂是生物技术化的现代高技术产品，是将益生菌、酶制剂、低聚糖、生物肽有机结合的功能性生物饲料添加剂。这几个领域是当前安全饲料添加剂的研究热点，可以实现由单一产品目前尚无法完全替代饲用抗生素的使用效果。另外，微生态制剂具有安全、高效的特点，在畜禽饲料中使用，不仅解决了动物性食品的抗生素残留、滥用状况带来的安全问题，而且大大降低了养殖业传染性疾病以及对环境造成的污染(养殖污染目前已经成为我国第一大污染源)。

微生态制剂具有安全、无污染、无残留、预防疾病等特点，能够显著提高饲料转化率和动物的生产性能，是替代饲用抗生素等化学合成物质首选的绿色饲料添加剂。微生态制剂不仅是一个产品，更是一项综合技术，是在畜牧业领域实现可持续发展、节约型畜牧业、解决三农问题的关键。微生态制剂的大量使用可使中国畜牧饲料业由传统的粗放型向现代意义上的“质量、效益、生态和可持续发展”型转变，将大大提高我国动物性产品的世界市场竞争力。

饲用酶制剂的研究与开发已受到饲料业及养殖业的高度重视，目前已研制出的酶制剂有纤维素酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、植酸梅、木聚糖酶、葡聚糖酶等多种，但由于此类酶制剂的耐高温性、耐酸性等耐受性较差、贮存时间较短等缺点，影响了产品的酶活，从而影响了该类产品的饲喂效果，大大限制了饲用酶制剂的推广应用，急需开发一种新型的动物微生态制剂。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一株经航天育种技术选育的枯草芽孢杆菌，本发明的菌株是从动物肠道内容物、畜禽粪便、土壤等材料中，通过诱变、转基因等技术，筛选出的高酶活特性的益生素菌株，对菌株进行安全试验、发酵条件的研究，并进行复方配伍，经动物试验验证等，本发明研制出了一种新的微生态制剂-产酶益生素。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株经航天育种技术选育的枯草芽孢杆菌，该菌株命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N9-1-35，已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M2011301。

所述枯草芽孢杆菌N9-1-35的特性如下：菌落呈圆形或不规则性，边缘不整齐，表面有皱褶、粗糙，污白色或微带黄色，有***；该菌种细胞大小为0.3μm～0.5μm×1.4μm～3.0μm，呈杆状，革兰氏阳性；芽孢椭圆形，大小为0.6μm～0.9μm×1.0μm～1.5μm，孢囊不膨大，有运动性；能利用葡萄糖、木糖及***糖等，能水解淀粉，还原硝酸盐；在含7％氯化钠的培养基上能够生长，在50℃下培养能够生长，V-P反应呈阳性，在厌氧条件下不生长。

本发明的枯草芽孢杆菌N9-1-35最适的培养基为：0.5％葡萄糖，1.0％蛋白胨、0.5％牛肉膏、0.5％氯化钠，调pH至7.2，115℃条件下灭菌20min(所述百分数为质量百分数)。

本发明的枯草芽孢杆菌N9-1-35是从常规枯草芽孢杆菌中通过航天育种技术筛选出来的，经试验测试表明，其是非常优秀的益生素菌种。进入动物肠道后，除了发挥其益生素的功能外，在其生长繁殖过程中还能够产生淀粉酶、中性蛋白酶、纤维素酶等多种消化酶，从而提高动物对饲料的消化吸收，提高饲料转化率，降低饲料成本，可以用于产酶益生素的生产，是一株极具研究开发价值的菌株。

所述生产制备酶益生素的方法为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N9-1-35经发酵处理，得到发酵液，然后加入玉米淀粉通过喷雾干燥制成枯草芽孢杆菌菌粉，再复配乳酸链球菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉及玉米淀粉，即得产酶益生素。

所述制备枯草芽孢杆菌菌粉的具体步骤如下：

(i)菌种：选用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N9-1-35；

(ii)斜面培养：将菌种一环接种于固体斜面培养基上，在37℃下培养18～24h；

(iii)一级种子培养：取上述培养好的斜面，在无菌条件下用接种环取一环接种于50mL～100mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养12～16h，制得一级种子液；

(iv)扩大培养：以2％(v/v)的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养8～14h，制得二级种子液；

(v)发酵罐培养：以2％(v/v)的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，通气培养22～28h；

(vi)收集发酵产物：待步骤(v)芽孢率达到90％以上时，收集发酵液；

(vii)向发酵液中加入4～8％(质量百分数)玉米淀粉，立即喷雾干燥，制得菌粉。

所述步骤(iii)、(iv)中的种子液体培养基配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，使用时，调节pH至7.0～7.5，115℃条件下灭菌20min；所述步骤(ii)中的固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0％的琼脂粉；所述步骤(v)中的液体发酵培养基配方为：玉米粉60g/L，豆粕30g/L，磷酸氢二钠6g/L，硫酸铵3g/L，氯化钙2g/L，pH7.0～7.5。

通过上述方法制备得到的产酶益生素，是由枯草芽孢杆菌菌粉、乳酸链球菌(Streptococcuslactis)菌粉、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)菌粉及玉米淀粉组成，优选的配方为：枯草芽孢杆菌菌粉、乳酸链球菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉及玉米淀粉的质量比为6∶2∶1∶21，枯草芽孢杆菌、乳酸链球菌和嗜酸乳杆菌的活菌数分别大于或者等于3×10⁸cfu/g、1×10⁸cfu/g和5×10⁷cfu/g。

附图说明

本发明提供的菌株命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N9-1-35，已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2011301，保藏地址为：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。

图1为枯草芽孢杆菌N9-1-35与枯草芽孢杆菌N酶活比较示意图。

图2-1为枯草芽孢杆菌N9-1-35斜面10代与1代酶活比较示意图，其中A为中性蛋白酶，B为淀粉酶，C为纤维素酶，单位U/mL。

图2-2为枯草芽孢杆菌N9-1-35斜面10代与1代活菌数比较示意图，1gX为活菌数的对数值。

图3为枯草芽孢杆菌N9-1-35的产酶曲线。

图4为实施例4中的生产工艺流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例一、菌种的筛选

1、材料与方法

1.1样品：土壤、枯草、动物肠道内容物、牛、羊、鹅等动物的粪便、牛瘤胃内容物。

1.2筛选培养基：

产淀粉酶菌株的筛选培养基：玉米淀粉1.0％、牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、琼脂粉2.0％，pH7.2～7.4，121℃，灭菌30min。

产中性蛋白酶菌株的筛选培养基：大豆蛋白粉1.0％、牛肉膏0.5％、磷酸氢二钾0.05％、硫酸镁0.05％、氯化钙0.05％、吐温-800.1％、琼脂粉2.0％，pH7.2～7.4，121℃，灭菌30min。

产纤维素酶菌株的筛选培养基：羧甲基纤维素1％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.05％、硫酸镁0.02％、氯化钙0.01％、氯化铁0.02％、琼脂粉2.0％，pH7.2～7.4，121℃，灭菌30min。

产植酸酶菌株的筛选培养基：植酸钙2.0％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％、氯化钙0.002％、硫酸亚铁0.001％、硫酸锰0.001％、琼脂粉2.0％，pH7.2～7.4，121℃，灭菌30min。

1.3样品初筛：样品放入烧杯中，加入10倍量的灭菌生理盐水，90℃处理10min，然后做10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释，每个稀释度涂步平板3个，37℃培养24～72h，进行各种产酶菌株的筛选。观察透明圈的大小，计算透明圈与菌落直径比，挑取透明圈与菌落直径比较大的菌落，做纯培养，保存于冰箱中备用。

1.4菌种复筛：250mL三角瓶装液量50mL，转速180rpm，温度34℃，培养24h，测酶活。摇瓶复筛培养基：牛胨培养基。

淀粉酶的测定按照《食品酶学原理与分析方法》中细菌α-淀粉酶活力的测定，中性蛋白酶的测定采用福林-酚法，纤维素酶的测定采用羧甲基纤维素钠(CMC)糖化力法，植酸酶的测定采用钒钼磷法。

1.5仪器：UV-2000紫外分光光度计；恒温水浴锅；培养箱；光学显微镜；秒表。

2、结果

2.1初筛结果：见表1，从30个样品中，共分离了123个菌株，通过透明圈与直径比的筛选，共筛选了8株较理想的菌株。

表1初筛结果

注：1、-：表示测不到；2、BL₀：为从土壤中筛选的蜡样芽孢杆菌；3、BL₁：为从土壤中筛选的地衣芽孢杆菌；4、Z₆：为从枯草中筛选出的枯草芽孢杆菌；5、Z₈：为从枯草中筛选出的短小芽孢杆菌；6、Y：为从羊粪中筛选出的枯草芽孢杆菌；7、N：为从牛粪中筛选出的枯草芽孢杆菌；8、M：为从秸秆中筛选出的枯草芽孢杆菌；9、E：为从鹅粪中筛选出的枯草芽孢杆菌。

2.2复筛结果：见表2，N菌株产4种酶的能力最好，E菌株次之，二者均比枯草标准株、DM423、8501的产酶能力要高许多。

表2复筛结果

注：1、-：表示测不到；2、BL₀：为从土壤中筛选的蜡样芽孢杆菌；3、BL₁：为从土壤中筛选的地衣芽孢杆菌；4、Z₆：为从枯草中筛选出的枯草芽孢杆菌；5、Z₈：为从枯草中筛选出的短小芽孢杆菌；6、Y：为从羊粪中筛选出的枯草芽孢杆菌；7、N：为从牛粪中筛选出的枯草芽孢杆菌；8、M：为从秸秆中筛选出的枯草芽孢杆菌；9、E：为从鹅粪中筛选出的枯草芽孢杆菌。10、KB：为枯草标准株，购自中国科学院微生物所菌种保藏中心；11、DM423：为大连医学院康白教授选育的蜡样芽孢杆菌；4、8501：为四川农业大学何明清教授选育的蜡样芽孢杆菌。

实施例二、菌种的鉴定及安全试验

1、材料与方法

11菌种：从牛粪及鹅粪等样品中分离得到的微生物经初筛、复筛后，共筛选出2株产中性蛋白酶等酶活性能较高的菌株，编号分别是N和E。

1.2细菌的常规生化鉴定：除特别说明外，一般形态、生理生化性状试验均参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)和《微生物学实验手册》进行。

1.3安全试验：将不同浓度(1×10⁸cfu/mL、1×10⁹cfu/mL、1×10¹⁰cfu/mL、1×10¹¹cfu/mL)的N菌株和E菌株的发酵液对小白鼠进行腹腔注射，每组10只，连续观察1周看小白鼠的死亡情况和临床症状。

2、结果

2.1菌种的鉴定：经细菌的生化反应，N菌株和E菌株完全符合枯草芽孢杆菌的特性，初步判定为枯草芽孢杆菌，结果见表3。

表3生化反应结果

注：+：阳性-：阴性d：可变

2.2安全试验：通过小白鼠的安全试验可知，空白组及四个浓度组N和E菌株小白鼠均未出现死亡情况，并且除了1×10¹¹cfu/mL组有极个别的在前2天精神不振外，其余皆表现良好。说明筛选的N菌株和E菌株的安全性良好，适合于做后续试验的备选菌种。

实施例三、N菌株诱变菌种的选育

1、材料和方法

11菌种：枯草芽孢杆菌N菌株

1.2培养基

1.2.1液体种子培养基

蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，水1000mL，pH7.2。121℃，灭菌30min。

1.2.2液体发酵培养基

葡萄糖5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，水1000mL，pH7.2。

装量：500mL三角瓶装100mL，121℃灭菌30min。

1.3酶活测定方法及仪器同实施例一。

1.4诱变方法：

搭载在中国酒泉卫星发射的第18颗返回式科学与技术卫星，经过18天的轨道运行，在太空微重力、强辐射、高能粒子、交变磁场等特殊环境下，使菌株发生基因突变，最后对返回的菌株分离筛选。

2试验内容与结果

2.1航天育种

始发株为山东宝来利来生物研究院选育的枯草芽孢杆菌N菌株。该菌株搭载第18颗返回式科学与技术试验卫星，于2003年11月3日15时20分在中国酒泉卫星发射中心由长征2号运载火箭发射升空，经过18天的轨道运行，返回舱于2003年11月21日10时零4分在四川中部地区回收着陆，返回舱于2003年11月23日凌晨运至北京空间技术研制试验中心。于12月6号取回公司生物研究院。枯草芽孢杆菌N菌株在太空经微重力、强辐射、高能粒子、交变磁场等的作用下发生变异。接着，发明人就开始了航天育种技术菌种筛选工作。

2.1.1诱变菌株的初筛

按常规初筛程序进行，结果见表4(透明圈与菌落直径之比)。

表4初筛结果

由试验结果可知，经过航天育种，筛选出的N菌株的变异株产酶性能绝大多数下降，只有极少数升高，得到了两株透明圈与菌落直径之比高于出发菌株的诱变株N1-1-4和N9-1-35。

2.1.2诱变菌株的复筛

采用液体三角瓶经37℃培养24h，测定中性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，对枯草芽孢杆菌初筛菌种进行三次试验(取均值)，最后，选出酶活最好的菌株，结果见表5。

表5复筛结果

由试验结果可知，诱变株N9-1-35的中性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶皆远远高于出发株N，是出发株N的3.7倍、2倍、7倍多，所以选定N9-1-35作为后续试验的备选菌种。

2.2芽孢杆菌N9-1-35的鉴定

方法见实施例二1.2的细菌常规生化鉴定。

经过鉴定N9-1-35属于：细菌界(Bacteria)，厚壁菌门(Firmicutes)，芽孢杆菌纲(Bacilli)，芽孢杆菌目(Bacillales)，芽孢杆菌科(Bacillaceae)，芽孢杆菌属(Bacillus)，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N9-1-35，已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2011301。

2.3枯草芽孢杆菌N9-1-35的培养特性

无荚膜，周鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6μm-0.9μm×1.0μm-1.5μm，椭圆到柱状，位菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。

2.4枯草芽孢杆菌N9-1-35的酶系和活菌数分析

500mL三角瓶装液体发酵培养基100mL，灭菌、冷却、接种，37℃恒温培养24h，测中性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和活菌数。同时，用始发株枯草芽孢杆菌N作为对照试验。结果见表6及图1。

表6三角瓶液体发酵液的酶活和活菌数(三次试验平均值)

经航天育种获得的变异株N9-1-35与原始菌株N相比，三角瓶液体小试中性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和活菌数均有明显地提高。

从以上试验结果看，枯草芽孢杆菌N9-1-35与始发株N相比，中性蛋白酶活性提高了23.7％，纤维素酶活性提高了47.2％，淀粉酶酶活提高了82.5％，活菌数提高了65.2％。

2.5枯草芽孢杆菌N9-1-35的遗传稳定性

250mL三角瓶装液体发酵培养基50mL，灭菌、冷却，将经过斜面传代10次的枯草芽孢杆菌N9-1-35接种1环于液体三角瓶中，37℃恒温培养24h，测中性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和活菌数。同时，用1代的枯草芽孢杆菌N9-1-35作为对照试验。结果见表7及图2-1、2-2。

表7枯草芽孢杆菌N9-1-3510代和1代酶活和活菌数

综合以上试验结果可以看出：枯草芽孢杆菌N9-1-35经过斜面传代10次，其产酶性能、活菌数均保持在较高水平，该菌株是一株非常理想的产酶益生素生产用菌株。

2.6N9-1-35菌不同培养阶段的酶活测定

250mL三角瓶装液量50mL，转速为200rpm，温度37℃，分别于4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、24h取样测定发酵液的淀粉酶和中性蛋白酶酶活。结果见表8及图3。

表8不同发酵时间的酶活

由试验结果可知，N9-1-35在发酵18h左右中性蛋白酶及淀粉酶达到最大值。

2.7饲喂试验

2.7.1N9-1-35菌株的最佳饲喂浓度的确定：

2.7.1.1材料

试验菌株：经过诱变得到的枯草芽孢杆菌N9-1-35；

试验动物：1日龄的海兰褐蛋雏公鸡，由泰安市东岳种禽公司购得。基础日粮见表9。

表9基础日粮配方

2.7.1.2方法

将N9-1-35菌株发酵、离心、干燥制成菌粉。在饲料中添加不同浓度的菌粉进行饲喂试验，添加预混料中枯草芽孢杆菌N9-1-35菌粉终浓度分别为5×10⁴cfu/g、1×10⁵cfu/g、2×10⁵cfu/g、5×10⁵cfu/g、1×10⁶cfu/g、2×10⁶cfu/g七个组。日常管理正常进行。

预饲3天，称重后将350只雏公鸡随机分成七个组，每组50只。试验期3周，试验结束后称鸡重、耗料量，计算料肉比。

2.7.1.3生长性能指标结果：见表10

表10菌株N9-1-35的最佳饲喂浓度

从表10可看出，第2、3、4、5、6组的料肉比分别比第1组(对照组)降低了4.26％、9.69％、8.14％、11.6％，其中以添加了N9-1-35菌粉5×10⁵cfu/g饲料为最好，浓度过高饲喂效果反而下降。

2.7.2产酶益生素对生长猪肠道酶活性的影响

2.7.2.1材料与方法

(1)产酶益生素

由N9-1-35菌粉、乳酸链球菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉及玉米淀粉组成，由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院研制生产，参见实施例四。

(2)试验动物的选择、分组及饲养管理

20头体重约为20Kg左右的长白杂交猪，随机分成两组，每组10头，一组为试验组，另一组为对照组。基础日粮相同，(见表11)，试验组饲料中添加0.1％的产酶益生素，预饲期一周，试验期三周。猪只自由采食、饮水，按猪场正常程序进行免疫。试验结束时从每组中随机取3头猪屠宰，立即从空肠中无菌采取适量肠内容物进行淀粉酶和中性蛋白酶活性检测。分别采用α-淀粉酶测定方法和福林-酚试剂法来测定。

粗酶液的制备：将肠内容物加适量相应的缓冲溶液浸泡20min左右，然后在(0～4℃)离心，5000rpm，5min，上清液即为粗酶液。

表11基础日粮配方

2.7.2.2试验结果与分析：见表12。

表12产酶益生素对生长猪肠道酶活性的影响

由表12可见：试验组的中性蛋白酶比对照组提高了149.4％，淀粉酶提高了98.1％。说明产酶益生素在猪肠道中，除了发挥益生素的功能外，还能够产生各种消化酶，促进营养物质的消化吸收，提高饲料转化率，具有显著的经济效益。

2.7.3产酶益生素节省饲料试验：

2.7.3.1材料与方法

(1)产酶益生素

(2)试验动物的选择、分组及饲养管理

将360只1日龄的海兰褐蛋雏公鸡，随机分成6个组，即1个对照组和5个试验组，每组设2个重复，每个重复30只鸡。基础日粮同2.7.1.1。试验设计见表13。按照常规对鸡舍进行消毒及鸡只的免疫，采用笼养方式，自由采食、饮水。试验期28天。试验结束时称重、计算耗料量、鸡增重及料肉比。

表13试验设计

2.7.3.2试验结果与分析：见表14。

表14产酶益生素的饲喂试验

表14的结果表明：用4.8％的石粉替代部分5％预混料，然后再添加0.1％和0.2％的产酶益生素(二组、四组)，对鸡的饲喂效果要好于对照组(一组)。用9.2％的麦饭石粉替代部分5％预混料，然后再添加0.1％和0.2％的产酶益生素(三组、五组)，对鸡的饲喂效果与对照组(一组)无明显差异。不用石粉替代5％预混料组，料肉比是最低的，比对照组降低了10.7％。说明产酶益生素进入肠道后能够促进营养物质的消化吸收，明显提高饲料的转化率，降低饲料成本，具有显著的经济效益。

3、结论

从以上试验结果可看出菌株N9-1-35是非常优秀的益生素菌种，进入肠道后能够产生各种消化酶，促进营养物质的消化吸收，明显提高饲料的转化率，降低饲料成本。

实施例四制备产酶益生素

方法为：枯草芽孢杆菌N9-1-35经发酵处理，得到发酵液，然后加入6％(重量百分数)玉米淀粉(商品名称：玉米淀粉；商品号：6920420601219；生产厂家：山东金城股份有限公司)通过喷雾干燥制成枯草芽孢杆菌菌粉；再复配上乳酸链球菌(Streptococcus lactis)菌粉(商品名称：乳酸链球菌菌粉；商品号：2006061303；生产厂家：山东宝来利来生物工程股份有限公司)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)菌粉(商品名称：嗜酸乳杆菌菌粉；商品号：2009061402；生产公司：山东宝来利来生物工程股份有限公司)和玉米淀粉(商品名称：玉米淀粉；商品号：6920420601219；生产厂家：山东金城股份有限公司)即为产酶益生素，其中，枯草芽孢杆菌菌粉、乳酸链球菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉及玉米淀粉(此处玉米淀粉是指复配时加入的玉米淀粉，并不包括菌粉中含有的玉米淀粉)质量比为6∶2∶1∶21，枯草芽孢杆菌、乳酸链球菌和嗜酸乳杆菌的活菌数分别为3×10⁸cfu/g、1×10⁸cfu/g和5×10⁷cfu/g。在500g产酶益生素中，需要枯草芽孢杆菌菌粉100g、乳酸链球菌菌粉33.33g、嗜酸乳杆菌菌粉16.67g及玉米淀粉350g，复配方式为常规搅拌混合复配。

所述制备枯草芽孢杆菌菌粉的具体步骤如下(生产发酵流程图如图4所示)：

(i)菌种：选用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N9-1-35；

(ii)斜面培养：将菌种一环接种于固体斜面培养基上，在37℃下培养20h；

(iii)一级种子培养：取上述培养好的斜面，在无菌条件下用接种环取一环接种于50mL～100mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养14h，制得一级种子液；

(iv)扩大培养：以2％(v/v)的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养12h，制得二级种子液；

(v)发酵罐培养：以2％(v/v)的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，通气培养24h；

(vii)向发酵液中加入6％玉米淀粉，立即喷雾干燥，制得菌粉。

所述步骤(iii)、(iv)中的种子液体培养基配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，使用时，调节pH至7.2，115℃条件下灭菌20min；所述步骤(ii)中的固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5％的琼脂粉；所述步骤(v)中的液体发酵培养基配方为：玉米粉60g/L，豆粕30g/L，磷酸氢二钠6g/L，硫酸铵3g/L，氯化钙2g/L，pH7.2。

Claims

1.一株经航天育种技术选育的枯草芽孢杆菌在生产制备产酶益生素中的应用，其特征在于：该菌株命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）N9-1-35，已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2011301；

制备产酶益生素的方法为：枯草芽孢杆菌N9-1-35经发酵处理，得到发酵液，然后加入玉米淀粉通过喷雾干燥制成枯草芽孢杆菌菌粉，再复配乳酸链球菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉及玉米淀粉，即得产酶益生素；

所述枯草芽孢杆菌菌粉是由以下步骤获得的：

（ⅰ）菌种：选用枯草芽孢杆菌N9-1-35；

（ⅱ）斜面培养：将菌种一环接种于固体斜面培养基上，在37℃下培养18～24h；

（ⅲ）一级种子培养：取上述培养好的斜面，在无菌条件下用接种环取一环接种于50mL～100mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养12～16h，制得一级种子液；

（ⅳ）扩大培养：以2%的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养8～14h，制得二级种子液；

（ⅴ）发酵罐培养：以2%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，通气培养22~28h；

（ⅵ）收集发酵产物：待步骤（ⅴ）芽孢率达到90%以上时，收集发酵液；

（ⅶ）向发酵液中加入4～8%玉米淀粉，立即喷雾干燥，制得菌粉；

所述步骤（ⅲ）、（ⅳ）中的种子液体培养基配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，使用时，调节pH至7.0～7.5，115℃条件下灭菌20min；所述步骤（ⅱ）中的固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0%的琼脂粉；所述步骤（ⅴ）中的液体发酵培养基配方为：玉米粉60g/L，豆粕30g/L，磷酸氢二钠6g/L，硫酸铵3g/L，氯化钙2g/L，pH 7.0～7.5。

2.一种产酶益生素，其特征在于：由枯草芽孢杆菌菌粉、乳酸链球菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉及玉米淀粉组成，所述枯草芽孢杆菌菌粉、乳酸链球菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉及玉米淀粉的质量比为6∶2∶1∶21，枯草芽孢杆菌、乳酸链球菌和嗜酸乳杆菌的活菌数分别大于或者等于3×10⁸cfu/g、1×10⁸cfu/g和5×10⁷cfu/g；

所述枯草芽孢杆菌菌粉是由以下步骤获得的：

（ⅰ）菌种：选用权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌N9-1-35；

（ⅱ）斜面培养：将菌种一环接种于固体斜面培养基上，在37℃下培养20h；

（ⅲ）一级种子培养：取上述培养好的斜面，在无菌条件下用接种环取一环接种于50mL～100mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养14h，制得一级种子液；

（ⅳ）扩大培养：以2%的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养12h，制得二级种子液；

（ⅴ）发酵罐培养：以2%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，通气培养24h；

（ⅶ）向发酵液中加入6%玉米淀粉，立即喷雾干燥，制得菌粉；

所述步骤（ⅲ）、（ⅳ）中的种子液体培养基配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，使用时，调节pH至7.2，115℃条件下灭菌20min；所述步骤（ⅱ）中的固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5%的琼脂粉；所述步骤（ⅴ）中的液体发酵培养基配方为：玉米粉60g/L，豆粕30g/L，磷酸氢二钠6g/L，硫酸铵3g/L，氯化钙2g/L，pH 7.2。