CN106190933B - 广谱抗致病菌的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种广谱抗致病菌的枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明公开的一株枯草芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC 11164。具有广谱抑制致病菌（主要为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌）的能力，并具有很强的产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力，该菌在饲料和微生态试剂方面具有很好的应用前景。

Description

广谱抗致病菌的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种广谱抗致病菌的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
近年来，随着世界上许多国家限制或禁止在饲料中使用抗生素。寻找新的抗生素替代品成为畜牧业的一个紧迫的任务。人们开始纷纷寻求其它的替代品和替代技术，以保证畜牧业生产的效率与效益不受影响。发酵饲料和微生态制剂技术是新近成长起来的具有许多优点的新型生产技术，饲料经益生菌发酵和添加微生态制剂后含有更多的活性益生菌菌体、各种酶、各级代谢产物、多种维生素、蛋白质分解产物、活性小肽、氨基酸、抑菌物质、免疫增强因子、促生长因子等，起到促进生长、维持动物肠道的菌群平衡作用；由于不添加抗生素等药物，不会造成抗生素药物残留，添加益生菌微生态制剂和发酵饲料是一种生态健康型饲料生产技术。
枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病。开发新型枯草芽孢杆菌菌种，有利于我国畜牧业健康发展，保证人民食品安全。
发明内容
本发明的目的在于提供一种广谱抗致病菌的枯草芽孢杆菌及其应用，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JLTH-146筛选自健康仔猪的新鲜粪样，具有广谱抑制致病菌的能力，并具有很强的产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力，可作为发酵饲料发酵剂和微生态制剂应用于畜禽养殖，以弥补现有技术的不足。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
广谱抗致病菌的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌在2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 11164。
所述的枯草芽孢杆菌在饲料方面中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌应用于发酵饲料发酵剂领域。
所述的枯草芽孢杆菌在微生态试剂方面中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌在微生态试剂方面中的应用，所述微生态试剂的制备是：
（1）、种子液制备：挑一环新鲜的枯草芽孢杆菌JLTH-146菌泥，接种于100mLLB培养基中，500mL三角瓶装液200mL，恒温37℃、200rpm培养12-16h即成种子液；
（2）、工作发酵液培养：将上述种子液以8-12%接种量接种至灭菌液体LB培养基中，恒温37℃、200r/min培养16-24h，平板计数在108~1010CFU/mL时停止发酵培养；
（3）、菌粉制备：将工作发酵液离心，10000rpm、8min，收集菌体，加入糊精搅拌混匀，经过真空冷冻干燥成粉，制成含活菌量为100-1000亿/g的枯草芽孢杆菌微生态制剂。
所述的枯草芽孢杆菌在微生态试剂方面中的应用，所述微生物试剂为枯草芽孢杆菌JLTH-146的菌粉，按质量百分比为0.1%~1.0%的比例添加至畜禽饲料中。
本发明的有益效果在于：本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JLTH-146通过16S rDNA序列比对分析，与GenBank登录号NR 102783.1的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis strain 168菌株的16S rDNA序列的同源性最高，相似性为99％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定枯草芽孢杆菌JLTH-146属于芽孢杆菌属(Bacillus)，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
本发明枯草芽孢杆菌JLTH-146具有广谱抗菌作用，对多种致病菌（主要为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌）具有较好的抑制作用。
本发明的枯草芽孢杆菌JLTH-146应用于发酵饲料发酵剂领域。所述发酵饲料发酵剂为枯草芽孢杆菌JLTH-146液态发酵液，按待发酵饲料质量百分比1%-5%添加到发酵物料中。
本发明的另一个方面提供一种包含上述枯草芽孢杆菌JLTH-146的微生态制剂。所述的微生态制剂为枯草芽孢杆菌JLTH-146的菌粉，按质量百分比为0.1%-1.0%的比例添加至畜禽饲料中。
本发明的枯草芽孢杆菌JLTH-146具有广谱抑制致病菌能力和很高的产酶能力，可作为饲料发酵剂和微生态试剂应用于畜禽饲料中，能有效提高养殖动物的生产性能，应用前景广阔。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明的枯草芽孢杆菌JLTH-146基因序列；
图2为本发明的枯草芽孢杆菌JLTH-146***发育树。
具体实施方式
下面结合附图进一步说明本发明的详细内容及其具体实施方式。
参见图1及图2所示，本发明的广谱抗致病菌的枯草芽孢杆菌所述枯草芽孢杆菌在2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC11164。
所述的枯草芽孢杆菌在饲料方面中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌应用于发酵饲料发酵剂领域。
所述的枯草芽孢杆菌在微生态试剂方面中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌在微生态试剂方面中的应用，所述微生态试剂的制备是：
（1）、种子液制备：挑一环新鲜的枯草芽孢杆菌JLTH-146菌泥，接种于100mLLB培养基中，500mL三角瓶装液200mL，恒温37℃、200rpm培养12-16h即成种子液；
（2）、工作发酵液培养：将上述种子液以8-12%接种量接种至灭菌液体LB培养基中，恒温37℃、200r/min培养16-24h，平板计数在108~1010CFU/mL时停止发酵培养；
（3）、菌粉制备：将工作发酵液离心，10000rpm、8min，收集菌体，加入糊精搅拌混匀，经过真空冷冻干燥成粉，制成含活菌量为100-1000亿/g的枯草芽孢杆菌微生态制剂。
所述的枯草芽孢杆菌在微生态试剂方面中的应用，所述微生物试剂为枯草芽孢杆菌JLTH-146的菌粉，按质量百分比为0.1%~1.0%的比例添加至畜禽饲料中。
实施例：
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
LB培养基：蛋白胨10g、酵母粉3g、氯化钠5g、葡萄糖3g，水1000mL。pH6.2-7.0。营养琼脂平板：蛋白胨 10g、牛肉膏3g、氯化钠 5g、琼脂 15g、蒸馏水 1000mL。pH至7.2～7.4。
血平板培养基：蛋白胨 10g、牛肉膏3g、脱纤维羊血50mL、氯化钠 5g、琼脂 15g、蒸馏水 1000mL。pH至7.2～7.4。
实施例1
枯草芽孢杆菌分离筛选及鉴定：
1、菌株初筛
采集吉林省各地健康仔猪新鲜粪样20份，分别称取5g样品，加入45mL无菌生理盐水，制备成样品悬液，经80℃水浴处理后，涂布于LB营养平板上，恒温37℃培养48小时，获得168株芽孢杆菌。
2、抑制致病菌芽孢杆菌初步筛选
将分离得到的菌株，恒温37℃培养16-48小时后，8000r/min离心10min，取上清液，将滤纸片直径0.8cm浸泡于分离得到的上清液中15min，取大肠杆菌（Escherichiacoli）CMCC44825为指示菌50μL，均匀涂布于营养琼脂平板上，静置20min，放上准备好的滤纸片，恒温37℃培养16小时，观察抑菌情况。用游标卡尺测抑菌圈的直径，以抑菌圈的直径表示抑菌活性。大肠杆菌购于广东微生物种质资源库。
经过抑菌实验，筛选得到1株对大肠杆菌抑制性最高的菌株，对该菌株进一步鉴定分析。
3、芽孢杆菌分类学鉴定
(一)按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌***鉴定手册”(东秀珠，蔡妙英等编著，北京：科学出版社，2001.2)中描述菌种分类鉴定的方法，对菌株JLTH-146进行形态特征、培养特性和生理生化特性鉴定，具体结果如下：
菌体的形态和生理生化特性：
芽孢菌在LB平板上生长时菌落较大，呈白色微黄，圆形，中央凸起，半透明，长时间培养易在表面形成褶皱，革兰阳性，菌体为短杆状( 0.5～0.6)μ m×( 1.3～1.6)μ m，芽孢呈椭圆形中生。
生理生化特征：结果如表1所示。
表1 枯草芽孢杆菌JLTH-146生理生化试验
检测项目 结果
革兰氏染色 ＋
对氧需求 ＋
酪蛋白水解 ＋
淀粉水解 ＋
明胶液化 ＋
硝酸盐还原 ＋
柠檬酸盐试验 ＋
过氧化氢酶试验 ＋
石蕊牛奶还原 ＋
V—P测定 ＋
尿素利用 －
产吲哚试验 －
葡萄糖 ＋
果糖 ＋
乳糖 ＋
木糖 ＋
甘露糖 ＋
9%NaCl ＋
备注：-表示阴性反应；+表示阳性反应。
(二)16S rDNA试验
提取JLTH-146的总DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1.5kb的扩增产物，将扩增产物回收，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序公司进行测序。测得的序列如图1所示。
将测序结果与Gen-Bank序列同源性比较，然后用软件MEGA5.0构建***发育树(如图2所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，菌株JLTH-146与Bacillussubtilis strain 168(GenBank登录号NR 102783.1)同源性为99％，并处于***发育树同一分支。
基于菌体形态特征、生长条件、生理生化、16S rDNA鉴定结果特征，将菌株JLTH-146鉴定为Bacillus subtilis。建议的分类命名为枯草芽孢杆菌；该菌株已于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC 9501，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.11164。
实施例2：枯草芽孢杆菌JLTH-146抑制致病菌实验
1、抑制致病菌能力检测：
将分离得到的菌株，恒温37℃培养16-48小时后，8000r/min离心10min，取上清液，将滤纸片直径0.8cm浸泡于分离得到的上清液中15min，取大肠杆菌（Escherichiacoli）CMCC44825、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）CMCC26071、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）CMCC50、志贺氏菌（Shigellaflexneri）CMCC51061为指示菌各取50μL，均匀涂布于营养琼脂平板上。甲型溶血性链球菌（α-hemolytic streptococcus）CMCCB32213、乙型溶血性链球菌（β-hemolytic streptococcus）CMCCB32210为指示菌各取50μL，均匀涂布于血平板培养基上。静置20min，放上准备好的滤纸片，恒温37℃培养16小时，观察抑菌情况。用游标卡尺测抑菌圈的直径，以抑菌圈的直径表示抑菌活性。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌购于广东微生物种质资源库。甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌购于中国医学细菌保藏管理中心。
枯草芽孢杆菌JLTH-146抑制致病菌能力如表2所示：
表2枯草芽孢管菌JLTH-146抑制致病菌能力试验
实施例3：枯草芽孢杆菌JLTH-146产酶实验
1、α-淀粉酶检测：
淀粉培养基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g、蒸馏水1000ml、琼脂粉20g。
将分离得到的菌株点种到培养基上，37℃培养16-48小时后，在菌株生长良好的培养基表面滴加一定量碘液，使其均匀布满整个培养基平板，如果生长出的菌落周边出现无色透明圈，说明淀粉已被水解。测量透明圈直径与菌落直径的比值。
2、蛋白酶检测：
牛奶培养基：脱脂牛奶50ml、蒸馏水50ml、琼脂粉1.5g。
将分离的到的菌株点种到牛奶培养基，37℃培养16-48小时，如果生长出的菌落周边有透明圈产生，说明培养基中酪蛋白已经被水解。测量透明圈直径与菌落直径的比值。
3、纤维素酶检测：
纤维素培养基：营养琼脂+0.5%CMC：
将分离得到的菌株点种到纤维素培养基，37℃培养16-48小时，用0.1%刚果红溶液使其均匀布满整个培养基平板，染色30分钟，再滴加一定量1moL/L氯化钠，布满培养基平板表面，脱色20分钟左右，如果生长出的菌落周边出现透明水解圈，说明培养基中CMC已经被水解。
测量透明圈直径与菌落直径的比值。
枯草芽孢杆菌JLTH-146的产酶情况如表3所示：
表3枯草芽孢杆菌JLTH-146的产酶试验
由表中可以看出，枯草芽孢杆菌JLTH-146具有很强的产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶能力，三种酶的透明圈直径与菌落直径比均在5.0左右，因此本发明筛选的枯草芽孢杆菌JLTH-146在发酵饲料及其动物微生态制剂的应用上有很大的潜力。
实施例4：枯草芽孢杆菌JLTH-146发酵饲料的制备
1、种子液制备：挑一环新鲜的枯草芽孢杆菌JLTH-146菌泥，接种于100mLLB培养基中（250mL三角瓶装液100mL），恒温37℃、200r/min培养16-24h即成种子液；
2、工作发酵液培养：将上述种子液以8-12%接种量接种至灭菌LB液体培养基中，恒温37℃、200r/min培养16-24h，平板计数在108~1010CFU/mL时停止发酵培养；
3、发酵饲料制备：将制备好的工作发酵液按发酵物料质量5%~12%接入，恒温37℃培养35-48小时，发酵完毕后尽快包装，要求物料压实，密闭。
常规发酵物料配方：玉米粉62%、豆粕22%、麦麸12%、预混料4%，营养含量和发酵后营养含量见表4：
表4常规猪饲料发酵前后的营养成分变化表
常规营养成分 发酵前 发酵后 变化率%
粗蛋白% 18.2% 19.3% +6.04%
粗纤维% 5.7% 4.1% －28.07%
赖氨酸 0.82% 0.89% +8.53%
由上表可知，发酵后常规饲料的营养价值发生显著的变化。饲料中粗纤维下降了28.07%，粗蛋白在原来基础上提高了6.04%、赖氨酸在原来基础上提高了8.53%。提高了饲料营养价值，利于动物对饲料的消化吸收。
实施例5：枯草芽孢杆菌JLTH-146微生态制剂的制备
1、种子液制备：挑一环新鲜的枯草芽孢杆菌JLTH-146菌泥，接种于100mLLB培养基中（500mL三角瓶装液200mL），恒温37℃、200rpm培养12-16h即成种子液；
2、工作发酵液培养：将上述种子液以8-12%接种量接种至灭菌液体LB培养基中，恒温37℃、200r/min培养16-24h，平板计数在108~1010CFU/mL时停止发酵培养；
3、菌粉制备：将工作发酵液离心（10000rpm，8min）收集菌体，加入适量的糊精搅拌混匀，经过真空冷冻干燥成粉，制成含活菌量为100-1000亿/g的枯草芽孢杆菌微生态制剂。
实施例6：枯草芽孢杆菌JLTH-146微生态制剂对仔猪生产性能的影响
将60只生长良好、体重相近的仔猪随机分为2组，每组3个重复，每个重复10只，Ⅰ组为对照组，饲喂普通商品日粮，Ⅱ组为实验组，在普通商品日粮基础上添加质量百分比为0.2%的枯草芽孢杆菌JLTH-146微生态制剂。试验期为40天，测量仔猪的平均日增重、料肉比及腹泻率。实验结果如表5所示：
表5枯草芽孢杆菌JLTH-146微生态制剂对仔猪生产性能的影响
组别 平均日增重（g） 料肉比F/G 腹泻率（%）
Ⅰ 311.11±14.22 1.99±0.01 17.52±1.71
Ⅱ 339.27±12.17 1.74±0.04 3.74±1.56
由上表中试验结果可以看出，40日喂养试验肉，Ⅱ组（实验组）仔猪平均日增重比Ⅰ组（对照组）增加28.16g，仔猪料肉比降低0.25，腹泻率降低13.7%。本试验结果表明日粮中添加枯草芽孢杆菌能显著提高仔猪养殖的生产性能，降低日常喂养成本，增加养殖户经济收益。枯草芽孢杆菌在仔猪饲料中添加有很好的应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种广谱抗致病菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JLTH-146，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌在2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 11164。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在饲料方面中的应用。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在发酵饲料发酵剂领域的应用。
4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在微生态试剂方面中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述微生态试剂的制备方法为：
（1）、种子液制备：挑一环新鲜的枯草芽孢杆菌JLTH-146菌泥，接种于100mLLB培养基中，500mL三角瓶装液200mL，恒温37℃、200rpm培养12-16h即成种子液；
（2）、工作发酵液培养：将上述种子液以8-12%接种量接种至灭菌液体LB培养基中，恒温37℃、200r/min培养16-24h，平板计数在108~1010CFU/mL时停止发酵培养；
（3）、菌粉制备：将工作发酵液离心，10000rpm、8min，收集菌体，加入糊精搅拌混匀，经过真空冷冻干燥成粉，制成含活菌量为100-1000亿/g的枯草芽孢杆菌微生态制剂。
6.根据权利要求4所述的应用，所述微生态试剂为枯草芽孢杆菌JLTH-146的菌粉，按质量百分比为0.1%~1.0%的比例添加至畜禽饲料中。
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