CN102307984A - 用于培养哺乳动物细胞的生物反应器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有至少两个叶轮的大规模生物反应器、大规模生物反应器***和使用这些生物反应器大规模培养和增殖哺乳动物细胞的方法。

Description

用于培养哺乳动物细胞的生物反应器
本发明涉及生物反应器以及使用这些生物反应器大规模培养哺乳动物细胞的方法。
在哺乳动物细胞培养工艺中重要的是维持溶解氧、培养pH、温度和剪切敏感性方面的物理化学环境。营养环境的维持也是重要的。培养条件的维持限制了进行大规模哺乳动物细胞培养的可能性。特别是浓度梯度能够抑制在大规模生物反应器中哺乳动物细胞的细胞生长。
本发明的目的之一是提供允许大规模体积培养哺乳动物细胞的生物反应器和方法。此外，本发明的目的是提供生物反应器和方法，即使大规模体积生长，其也允许在最佳条件下培养哺乳动物细胞，并由此允许与生物反应器的尺寸无关的工艺性能和产量。
本发明的目的是提供大规模生物反应器，其允许在诸如pH、溶氧张力(DOT)和温度之类的工艺参数方面的均相环境下培养哺乳动物细胞，在所述生物反应器中保持良好的细胞悬浮和使营养补料(feed)混合。
此外，本发明的目的是提供设备和方法，所述设备和方法允许以大规模的方式生产哺乳动物细胞和哺乳动物细胞产物，尤其是由哺乳动物细胞合成的蛋白、肽、抗体或氨基酸。
通过提供如权利要求书中所述的用于培养真核细胞、特别是哺乳动物细胞的生物反应器、生物反应器***和方法，本发明解决了构成本发明的基础的技术问题。
尤其是通过提供用于培养哺乳动物细胞的生物反应器，本发明解决构成本发明基础的技术问题，所述生物反应器特征在于其具有至少两个叶轮。此外，通过提供用于培养和增殖哺乳动物细胞的方法，本发明解决了构成本发明基础的技术问题，所述方法特征在于在具有至少两个叶轮的生物反应器中，在合适的条件下和合适的培养基中培养至少一个哺乳动物细胞。此外，通过提供用于培养哺乳动物细胞的生物反应器***，本发明解决了构成本发明基础的技术问题，所述生物反应器***特征在于：具有至少500升体积的a)第一生物反应器与体积大于所述第一生物反应器并具有至少2000升体积的b)第二生物反应器连接，并且其中所述具有至少2000升体积的第二生物反应器与体积大于所述第二生物反应器体积并具有至少两个叶轮和至少10000升体积的c)第三生物反应器连接。
此外，通过提供培养和增殖哺乳动物细胞的方法，本发明解决了构成本发明基础的技术问题，所述方法特征在于：a)在具有至少500升体积的第一生物反应器中，在合适的条件下和合适的培养基中培养至少一个哺乳动物细胞，b)将通过增殖至少一个哺乳动物细胞获得的含细胞培养基转移入具有至少2000升体积的第二生物反应器，c)在所述具有至少2000升体积的第二生物反应器中培养被转移的细胞，d)将在步骤c)中获得的含细胞培养基转移入具有至少10000升体积的第三生物反应器以及e)在所述具有至少10000升体积的第三生物反应器中培养所述被转移的细胞。
根据本发明，培养细胞为真核细胞，优选动物细胞，更优选哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞可以为例如人类细胞系、小鼠骨髓瘤(NOS)细胞系，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系或杂交瘤细胞系。优选的哺乳动物细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
培养细胞优选用于生产抗体，更优选单克隆抗体，和/或重组蛋白，更优选用于治疗应用的重组蛋白。所述细胞当然可以生产肽、氨基酸、脂肪酸或其它有用的生化中间体或代谢产物。根据本发明，通过培养细胞生产的蛋白的目标浓度为大于0.5g/l，优选大于2.0g/l，最优选大于10.0g/l。能够以分批或补料分批的方式使用本发明的方法。虽然在本发明的方法中使用的细胞培养基优选为无蛋白培养基，但该设计不排除使用含蛋白流体(stream)。
根据本发明，生物反应器为具有附加设备的生物相容性罐或容器，所述附加设备例如叶轮、挡板、分布器(sparger)和/或孔(port)，其尤其允许用于培养和增殖哺乳动物细胞。优选所述罐或容器为管道的形式，在管道的两末端(其优选构建罐的顶和底)具有平板。这些平板被称为顶板和基板。在本发明的一种特别优选实施方案中，基板为American Society of MechanicalEngineers Flanged and Dished(ASME F&D，美国机械工程师协会F&D)设计的基板。所述顶板设计优选符合人孔或优选装凸缘的顶板以允许安装/拆卸叶轮。
总罐高为从罐的底部的罐内侧至罐的顶部的罐内侧的切线。
将自由空间(freeboard，净空)高度定义为当将生物反应器填充至其操作体积时，在液体顶部之上直线侧的长度。最小自由空间高度必需考虑在操作过程中形成泡沫的程度、在允许的最大搅拌和通气下气体容纳以及液体测量误差。
本发明的生物反应器具有的体积为优选至少500升，更优选至少1000升，更优选至少4000升，甚至更优选至少10000升，甚至更优选至少20000升。最优选地，本发明的生物反应器具有的体积为1000升、1307升、4000升、5398升、20000升或27934升。
优选，生物反应器具有最大体积100000升，更优选，生物反应器具有最大体积50000升，最优选生物反应器具有最大体积30000升。
本发明的生物反应器的设计保证在所述生物反应器中诸如pH、溶氧张力(DOT)和温度之类的工艺参数方面的均相环境，保持良好混合细胞悬浮和使营养补料混合。这为最佳的细胞生长、产物积累和产物质量提供了必要的物理化学环境。本发明的生物反应器的设计进一步保证了维持几何相似性。这允许在12升实验室规模和500升中试规模开发按比例缩小的模型。
本发明的用于培养哺乳动物细胞的生物反应器具有至少两个叶轮。更优选，所述生物反应器具有两个叶轮，甚至更优选顶部叶轮(top impeller)和底部叶轮(bottom impeller)。
本发明的用于培养哺乳动物细胞的生物反应器优选具有至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮，其中顶部叶轮优选水翼式叶轮(hydrofoil impeller)。
本发明的用于培养哺乳动物细胞的生物反应器优选具有至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮，其中顶部叶轮为水翼式叶轮。
本发明的用于培养哺乳动物细胞的生物反应器优选具有至少1000升的体积以及至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮，其中顶部叶轮为水翼式叶轮。
本发明用于培养哺乳动物细胞的生物反应器优选具有至少4000升的体积以及至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮，其中顶部叶轮优选水翼式叶轮。
本发明用于培养哺乳动物细胞的生物反应器优选具有至少4000升的体积以及至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮，其中顶部叶轮为水翼式叶轮。
在本发明一种优选的实施方案中，顶部叶轮为水翼式叶轮。优选可使用顶部叶轮以提供强的主体混合。
在本发明一种优选的实施方案中，底部叶轮为水翼式叶轮。在本发明一种优选的实施方案中，顶部叶轮和底部叶轮为水翼式叶轮。
在本发明一种优选的实施方案中，至少顶部叶轮为水翼式叶轮。在本发明的一种优选实施方案中，所有叶轮都为水翼式叶轮。
根据本发明的一种优选实施方案，底部叶轮为大稠度斜叶式叶轮(high-solidity pitch-blade impeller)或大稠度水翼式叶轮。优选可使用底部叶轮以分散分布的(sparged)气体。
优选地，水翼式叶轮提供大得多的液体运动，对于给定量的功率输入导致更大的主体混合。这也可依赖于流量数(flow number，Nq)。
优选地，非水翼式叶轮能够提供液体运动，但是在更大的功率输入下提供。这对于剪切敏感性哺乳动物细胞的健康具有重要性。
在本发明一种优选的实施方案中，水翼式叶轮为向下流动叶轮或向上流动叶轮。
在本发明一种优选的实施方案中，顶部叶轮为向下流动叶轮。在本发明一种优选的实施方案中，顶部叶轮为向下流动轴向水翼式叶轮。
在本发明一种优选的实施方案中，使用顶部叶轮下推特性来混合充分充气的液体表面和液体主体。
在本发明的一种优选实施方案中，水翼式叶轮为高效水翼式叶轮。在本发明的一种优选实施方案中，水翼式叶轮为Chemineer-SC-3型叶轮、LIGHTNIN-A310或A510型叶轮、Promix-PHF型系列叶轮或CleavelandEastern Mixers叶轮。
在本发明的一种优选实施方案中，顶部叶轮为高效水翼式叶轮。在本发明的一种优选实施方案中，顶部叶轮为Chemineer-SC-3型叶轮、LIGHTNIN-A310或A510型叶轮、Promix-PHF型系列叶轮或Cleaveland Eastern Mixers叶轮。
顶部叶轮优选三叶水翼式设计的叶轮，例如来自LIGHTNIN的A310型叶轮。底部叶轮优选四斜叶大稠度叶轮，例如来自LIGHTNIN的A315型叶轮。顶部叶轮(D顶/T)和/或底部叶轮(D底/T)的叶轮与罐直径之比优选0.35以上至0.55以下，更优选0.40以上至0.48以下，最优选0.44以上至0.46以下。大于0.5的直径导致破坏轴向流动，由此导致差的搅拌和充气。
顶部叶轮功率数(power number，Np)优选0.1以上至0.9以下，更优选0.25以上至0.35以下，最优选0.3。顶部叶轮流量数(Nq)优选0.4以上至0.9以下，更优选0.50以上至0.60以下，最优选0.56。底部叶轮功率数(Np)优选0.5以上至0.9以下，更优选0.70以上至0.80以下，最优选0.75。底部叶轮流量数(Nq)优选0.50以上至0.85以下，更优选0.70以上至0.80以下，最优选0.73。
叶轮功率数(Np)为将旋转叶轮叶片的动能传递至流体的叶轮效率的度量。量化气体分散是重要的。叶轮流量数(Nq)为叶轮泵送能力的度量标准且在量化流体主体运动方面是重要的。
所述至少两个叶轮的搅拌速率由规模决定。然而，在本发明一种特别优选的实施方案中，所述至少两个叶轮的搅拌速率为200转/分钟(rpm)以下，更优选165rpm以下。
叶轮间距(DS)为所述至少两个叶轮间的距离。在本发明一种特别优选的实施方案中，其为1×底部叶轮的直径(D底)以上至2×D底以下，更优选其为1.229×D底或2×D底。这将允许两叶轮在最小接种后体积下均保持浸没。
在本发明一种特别优选的实施方案中，上叶轮(upper impeller)以上的液体高度(DO)为0.3×顶部叶轮的直径(D顶)以上至2.5×D顶以下。更优选其为0.5×D顶以上至2.0×D顶。
底部间隙(DC)为罐底部与底部叶轮中心线间的间隙。在本发明一种特别优选的实施方案中，其为0.35×D底以上，更优选其为0.4×D底或0.75×D底。
在本发明的生物反应器中，叶轮的设计在主体混合、气体分散和低剪切力方面提供了最佳的流体动力学特性。通过经由本发明的叶轮***的搅拌，将哺乳动物细胞保持在匀相悬浮液中。
在本发明的生物反应器中，叶轮的设计提供了快速混合、保持匀相、保持哺乳动物细胞悬浮和气泡分散。在本发明的生物反应器中，叶轮的设计使由剪切力造成的细胞损伤最小化，所述剪切力源自叶轮几何结构以及在叶轮叶片后面产生的漩涡或涡流。
在本发明一种特别优选的实施方案中，所述至少两个叶轮为顶部驱动搅拌***。
优选通过至少一个分布器释放来供应空气，尤其是压缩空气，或特定气体，优选氧气、氮气和/或CO2。
本发明的生物反应器优选具有至少一个分布器，更优选所述生物反应器具有一个分布器或两个分布器。本发明的生物反应器优选具有两个分布器。优选所述生物反应器具有至少一个管几何结构分布器。优选至少一个分布器为槽式(flute-type)或为烧结的分布器。优选至少一个分布器为槽式。在本发明特别优选的实施方案中，采用了新月形管道。新月形的曲率优选为0.8×D底。为了有助于从生物反应器的侧孔安装和移出，所述新月形圆周优选0.8×D底圈的完整圆周的240°。
至少一个分布器提供充分的氧传质(通过体积传质系数(KLa)来表征)以满足培养物的氧需求。所述至少一个分布器提供KLa高达20h-1，用于培养具有每小时5mmol/l氧摄取速率的多达每毫升20×106个细胞的培养物。用作双分布器***的两个分布器允许去除溶解的CO2和控制溶氧张力(DOT)。槽式分布器提供了容易就地清洗(CIP)和就地消毒(SIP)、帮助dCO2去除并由于其多种用途而减少操作成本的益处。烧结分布器提供较高的KLa值。槽式分布器设计的较低固有KLa值能够通过使用富氧空气得到补偿。气体流动速度在恒定表观气速的基础上按比例增加。
在哺乳动物细胞的大规模培养中，重要的是保持在溶解氧、培养pH和温度、以及溶解CO2、营养物和代谢物浓度梯度方面的均相物理化学环境。在通过使用适当搅拌和充气而确保物理化学环境为均相的同时，重要的是确保所选的搅拌和充气操作条件不产生不利的剪切环境。本发明涉及在确保均相环境和同时使剪切环境的不利影响最小化之间的适当平衡，所述均相环境将促进良好的细胞生长和哺乳动物细胞培养工艺的产率。这将通过限定以下来实现：特定生物反应器几何结构、叶轮设计和定位、分布器设计和定位以及特定的用于搅拌和充气速率的操作限制。
在搅动和分布的生物反应器中对哺乳动物细胞的主要损害来自界面剪切。当分布气泡合并和破裂时发生界面剪切[参考文献：Ma N，Koelling KW，Chalmers JJ.Biotechnol Bioeng.2002 Nov 20；80(4)：428-37.勘误于：BiotechnolBioeng.2003 Feb 5；81(3)：379]。因此，期望使分布气体的流动和泡沫的过度产生最小化。界面剪切能够通过合并以下方法而最小化：首先，通过借助液体表面和液体主体的良好混合来促进表面充气，其次，通过借助优选两个分布器来分开进行培养物的充氧。
水翼式叶轮的指定位置，尤其是上叶轮以上的液体高度(DO)，优选为液体表面下约0.5×D顶，这能够帮助强且连续的液体表面和液体主体的交换，从而使充分充氧的液体表面和不充分充氧的液体主体混合。规定的叶轮间距优选为Ds＝1×D底至2×D底，这能够允许由上叶轮产生的液体的向下流动去补充流入下叶轮(lower impeller)的液体，由此保证整个流动主体良好混合且不产生单独的混合区域。规定的叶轮底部间隙优选为Dc＝0.35×D至0.75×D，这能确保主体流动能够偏离弯曲的ASME F&D基底并沿着生物反应器的壁上升。
流经控制分布器的“按需”充氧分布气体从流经镇流分布器(ballastsparger)的非充氧分布气体(如CO2、空气和氮气镇流(ballast))的分离，能够允许在流体中的高度充氧的分布气泡在从流体主体中分离并进入顶部空间之前更长的驻留时间和路径长度。对于给定容积的传质系数kLa，这能够允许提供更大的氧传输速率。分布气泡的驻留时间和路径长度还可以通过限定向下流动轴向水翼式叶轮来进一步延长，所述向下流动轴向水翼式叶轮连续向下推动液体表面和液体主体。
本发明的生物反应器优选具有至少一个挡板，更优选具有至少两个挡板。本发明的生物反应器最优选具有四个挡板。
挡板为垂直辐射状设置的板。挡板用于防止形成漏斗或形成涡旋。
在本发明一种优选的实施方案中，所述至少一个挡板的长度为1.1×生物反应器的总直线高度。挡板宽度(W)优选为0.1×罐内部直径(T)。挡板间隙(Wc)优选为0.01×罐内部直径(T)。所述至少一个挡板的高度(H挡板)优选为1.1×总直线高度(H)-生物反应器顶部高度(Hh)。因此，H挡板优选根据式H挡 板＝1.1×H-Hh来计算。
不限定所述至少一个挡板的厚度，但该厚度应确保对流体流的径向分量的刚性。需要额外的厚度以确保在SIP期间挡板不被变形从而影响挡板至罐壁的间隙。
本发明的生物反应器优选具有至少两个用于添加碱的孔。更优选，所述生物反应器具有两个用于添加碱的孔。最优选，生物反应器具有两个用于添加碱的孔，其中第一个孔位于底部叶轮的中线，第二个孔位于顶部叶轮的中线。优选，pH探头(probe)与碱添加孔在直径方向相对地位于生物反应器中。
在本发明一种优选的实施方案中，生物反应器具有1000升的体积。1000升的生物反应器的顶部体积(Vh)优选45升以上至65升以下，更优选顶部体积为55升。1000升的生物反应器的基部体积(Vb)优选45升以上至65升以下，更优选基部体积为55升。本发明的1000升生物反应器的罐内部直径(T)优选850mm以上至900mm以下，更优选罐内部直径为864mm。本发明的1000升生物反应器的罐横截面面积(A)优选0.55m2以上至0.65m2以下，更优选罐横截面面积为0.586m2。本发明的1000升生物反应器的顶部高度(Hh)(其为顶板的高度)，和/或基部高度(Hb)(其为基板的高度)优选为120mm以上至180mm以下，更优选顶部高度和/或基部高度为151mm。本发明的1000升生物反应器的总罐高度优选2000mm以上至2600mm以下，更优选总罐高度为2347mm。本发明的1000升生物反应器的顶部叶轮直径(D顶)和/或底部叶轮直径(D底)优选350mm以上至400mm以下，更优选顶部叶轮直径和/或底部叶轮直径为381mm。本发明的1000升生物反应器的罐底部与底部叶轮中线的间隙(Dc)优选120mm以上至180mm以下，更优选该间隙为152mm。本发明的1000升生物反应器的所述至少两个叶轮间的距离(也称为叶轮间距(DS)优选730mm以上至790mm以下，更优选该叶轮间距为762mm。本发明的1000升生物反应器的叶轮轴直径优选为102mm以上至152mm以下。如果本发明的1000升生物反应器具有挡板，则挡板的长度优选2000mm以上至2400mm以下，更优选该长度为2250mm。本发明的1000升生物反应器的挡板宽度优选70mm以上至100mm以下，更优选该宽度为86mm。本发明的1000升生物反应器的挡板间隙优选7mm以上至11mm以下，更优选该挡板间隙为9mm。本发明的1000升生物反应器的挡板高度(H挡板)优选2000mm以上至2200mm以下，更优选该挡板高度为2099mm。本发明的1000升生物反应器优选具有至少一个分布器，更优选其具有一个分布器。本发明的1000升生物反应器的至少一个分布器优选具有1.5mm以上至2.5mm以下的喷嘴径或孔径，更优选该喷嘴径或孔径为2mm。喷嘴数或孔数优选为20以上至40以下，更优选该喷嘴数或孔数为30。分布器长度(SL)优选为150mm以上至550mm以下，更优选该分布器长度为305mm。本发明的1000升生物反应器的分布器至罐底的间隙(Sc)优选50mm以上至75mm以下，更优选分布器至罐底的间隙为64mm。本发明的1000升生物反应器的分布器至底部叶轮的间隙(Dc-Sc)优选75mm以上至100mm以下，更优选分布器至底部叶轮的间隙为88mm。
在本发明一种优选的实施方案中，生物反应器具有体积4000升。4000升的生物反应器的顶部体积(Vh)优选340升以上至370升以下，更优选顶部体积为359升。4000升的生物反应器的基部体积(Vb)优选340升以上至370升以下，更优选基部体积为359升。本发明的4000升生物反应器的罐内部直径(T)优选1600mm以上至1650mm以下，更优选罐内部直径为1626mm。本发明的4000升生物反应器的罐横截面面积(A)优选1.90m2以上至2.30m2以下，更优选罐横截面面积为2.076m2。本发明的4000升生物反应器的顶部高度(Hh)和/或基部高度(Hb)优选260mm以上至300mm以下，更优选该顶部高度和/或基部高度为282mm。本发明的4000升生物反应器的总罐高度优选2300mm以上至3100mm以下，更优选总罐高度为2817mm。本发明的4000升生物反应器的顶部叶轮直径(D顶)和/或底部叶轮直径(D底)优选680mm以上至740mm以下，更优选顶部叶轮直径和/或底部叶轮直径为710mm。本发明的4000升生物反应器的罐底部与底部叶轮中线的间隙(Dc)优选500mm以上至560mm以下，更优选该间隙为531mm。本发明的4000升生物反应器的所述至少两个叶轮间的距离(也称为叶轮间距(Ds)优选840mm以上至900mm以下，更优选该叶轮间距为872mm。本发明的4000升生物反应器的叶轮轴直径优选为51mm以上至64mm以下。如果本发明的4000升生物反应器具有挡板，则该挡板的长度优选为2200mm以上至2600mm以下，更优选该长度为2477mm。本发明的4000升生物反应器的挡板宽度优选150mm以上至180mm以下，更优选该宽度为163mm。本发明的4000升生物反应器的挡板间隙优选12mm以上至20mm以下，更优选该挡板间隙为16mm。本发明的4000升生物反应器的挡板高度(H挡板)优选2100mm以上至2300mm以下，更优选该挡板高度为2195mm。本发明的4000升生物反应器优选具有至少一个分布器，更优选其具有一个分布器。本发明的4000升生物反应器的至少一个分布器优选具有1.5mm以上至2.5mm以下的喷嘴径或孔径，更优选该喷嘴径或孔径为2mm。本发明的4000升生物反应器的喷嘴数或孔数优选为80以上至120以下，更优选该喷嘴数或孔数为100。分布器长度(SL)优选为250mm以上至800mm以下，更优选该分布器长度为568mm。本发明的4000升生物反应器的分布器至罐底部的间隙(Sc)优选315mm以上至360mm以下，更优选分布器至罐底部的间隙为337mm。本发明的1000升生物反应器的分布器至底部叶轮的间隙(Dc-Sc)优选180mm以上至205mm以下，更优选分布器至底部叶轮的间隙为194mm。
在本发明一种优选的实施方案中，生物反应器具有20000升的体积。20000升的生物反应器的顶部体积(Vh)优选1600升以上至2000升以下，更优选顶部体积为1803升。20000升的生物反应器的基部体积(Vb)优选1600升以上至2000升以下，更优选基部体积为1803升。本发明的20000升生物反应器的罐内部直径(T)优选2500mm以上至3000mm以下，更优选罐内部直径为2794mm。本发明的20000升生物反应器的罐横截面面积(A)优选5.8m2以上至6.5m2以下，更优选罐横截面面积为6.131m2。本发明的20000升生物反应器的顶部高度(Hh)和/或基部高度(Hb)优选460mm以上至500mm以下，更优选该顶部高度和/或基部高度为485mm。本发明的20000升生物反应器的总罐高度优选4800mm以上至5100mm以下，更优选总罐高度为4933mm。本发明的20000升生物反应器的顶部叶轮直径(D顶)和/或底部叶轮直径(D底)优选1100mm以上至1300mm以下，更优选顶部叶轮直径和/或底部叶轮直径为1219mm。本发明的20000升生物反应器的罐底部与底部叶轮中线的间隙(Dc)优选890mm以上至945mm以下，更优选该间隙为913mm。本发明的20000升生物反应器的所述至少两个叶轮间的距离(也称为叶轮间距(Ds)优选1200mm以上至1700mm以下，更优选该叶轮间距为1498mm。本发明的20000升生物反应器的叶轮轴直径优选为51mm以上至64mm以下。如果本发明的20000升生物反应器具有挡板，则挡板的长度优选4000mm以上至4600mm以下，更优选该长度为4365mm。本发明的20000升生物反应器的挡板宽度优选260mm以上至290mm以下，更优选该宽度为279mm。本发明的20000升生物反应器的挡板间隙优选20mm以上至35mm以下，更优选该挡板间隙为28mm。本发明的20000升生物反应器的挡板高度(H挡板)优选3600mm以上至4050mm以下，更优选该挡板高度为3882mm。本发明的20000升生物反应器优选具有至少一个分布器，更优选其具有两个分布器。如果本发明的20000升生物反应器具有两个分布器，则一个优选为控制分布器，一个优选为镇流分布器。本发明的20000升生物反应器的控制分布器优选具有3mm以上至5mm以下的喷嘴径或孔径，更优选该喷嘴径或孔径为4mm。本发明的20000升生物反应器的镇流分布器优选具有5mm以上至7mm以下的喷嘴径或孔径，更优选该喷嘴径或孔径为6mm。本发明的20000升生物反应器的控制分布器的喷嘴数/孔数优选为230以上至270以下，更优选该喷嘴数或孔数为250。本发明的20000升生物反应器的镇流分布器的喷嘴数或孔数优选为85以上至115以下，更优选该喷嘴数或孔数为100。用于控制和/分布器或镇流分布器的分布器长度(SL)优选500mm以上至2000mm以下，更优选该分布器长度为1077mm。对于控制分布器和/或镇流分布器，本发明的20000升生物反应器的分布器至罐底的间隙(Sc)优选560mm以上至620mm以下，更优选分布器至罐底的间隙为593mm。对于控制分布器和/或镇流分布器，本发明的20000升生物反应器的分布器至底部叶轮的间隙(Dc-Sc)优选300mm以上至340mm以下，更优选分布器至底部叶轮的间隙为320mm。从分离的分布器添加镇流(镇流分布器)的要求，防止用镇流气体稀释氧或富氧DOT需求气体。为确保最好的氧传输速率(OTR)，从分布器形成的气泡的氧浓度梯度是最大的。其次，使用镇流分布器允许将分布器安置在不同的位置以避免为了pCO2控制而传递需要的镇流时影响DOT控制。镇流分布器能够独立于控制分布器而设计。
用本发明的生物反应器设计，能够完成不同的传代培养比。在一种特别优选的实施方案中，完成的传代培养比为1比5(20％V/V)以上至1比9(11％V/V)以下，更优选1比5(20％V/V)或1比9(11％V/V)的传代培养比。
本发明还包括培养和增殖哺乳动物细胞的方法，特征在于，在本发明的生物反应器中在合适的培养基中在合适的培养条件下培养至少一个哺乳动物细胞。
本发明的生物反应器包括具有至少两个叶轮并显示上述至少一个特征或不同特征的组合的所有生物反应器。
在本发明的方法中，生物反应器的至少两个叶轮的搅拌速率优选55W/m3以上至85W/m3以下。优选地，以至少5×10-5m/s的速度，更优选以至少10×10-5m/s的速度，将空气分布入培养基中。
在本发明一种特别优选的实施方案中，通过优选在空间上彼此分离的两个添加孔加入碱，以分散碱。如果在罐中发生长再循环时间，这确保碱的快速混合。优选通过控制分布器来添加CO2。
优选使用碱和/或CO2来调节培养基的pH。
优选控制探头和备用探头位于距罐底部913mm的下孔圈。
在本发明一种优选的实施方案中，本发明的方法发生于体积为1000升的生物反应器中。在使用1000升生物反应器的方法中，使用的培养基体积优选在接种前期间为50升至250升。在接种后期间，培养基的体积优选300升以上至960升以下。在转移前/收获期，在1000升生物反应器中的培养基体积优选300升以上至960升以下。在本发明的具有1000升体积的生物反应器中，最小操作体积(V最小)优选在80升至120升之间，更优选该最小操作体积为100升，最大操作体积(V)优选900升以上至1100升以下，该最大操作体积更优选为1000升。最小搅拌体积优选为230升以上至255升以下，更优选最小搅拌体积为245升。在具有1000升体积的生物反应器中，在最小操作体积时的液体高度(H最小)优选210mm以上至240mm以下，更优选在最小操作体积时该液体高度为228mm。在具有1000升体积的生物反应器中，在最大操作体积时的液体高度(HL)优选1500mm以上至1900mm以下，更优选在最大操作体积时该液体高度为1764mm。最小高宽比(H最小/T)优选0.15以上至0.19以下，更优选该最小高宽比为0.17。在本发明的方法中使用的具有1000升体积的生物反应器的最大高宽比(HL-T)优选1.8以上至2.1以下，更优选该最大高宽比为1.96。自由空间体积优选270升以上至310升以下，更优选该自由空间体积为293升。自由空间高度优选450mm以上至550mm以下，更优选该自由空间高度为500mm。总直线高度(H)优选1900mm以上至2200mm以下，更优选总直线高度为2045mm。上探头圈(probe-ring)或样品圈(sample-ring)的高度优选900mm以上至1200mm以下，更优选上探头圈或样品圈的高度为1093mm。下探头圈或样品圈的高度优选152mm以上至286mm以下。
在本发明一种优选的实施方案中，本发明的方法发生在体积为4000升的生物反应器中。在使用4000升生物反应器的方法中，使用的培养基体积优选在接种前期间为1914升至3077升。在接种后期间，培养基的体积优选2153升以上至3846升以下。在转移前/收获期，在4000升生物反应器中的培养基体积优选2153升以上至3846升以下。在本发明的具有4000升体积的生物反应器中，最小操作体积(V最小)优选在1500升至2200升之间，更优选该最小操作体积为1900升，最大操作体积(V)优选3800升以上至4200升以下，该最大操作体积更优选为4000升。最小搅拌体积优选1500升以上至1800升以下，更优选最小搅拌体积为1654升。在具有4000升体积的生物反应器中，在最小操作体积下的液体高度(H最小)优选800mm以上至1200mm以下，更优选在最小操作体积下的液体高度为1024mm。在具有4000升体积的生物反应器中，在最大操作体积时的液体高度(HL)优选1800mm以上至2200mm以下，更优选在最大操作体积时该液体高度为2034mm。最小高宽比(H最小/T)优选0.55以上至0.75以下，更优选该最小高宽比为0.63。在本发明的方法中使用的具有4000升体积的生物反应器的最大高宽比(HL-T)优选1.1以上至1.4以下，更优选该最大高宽比为1.25。自由空间体积优选850升以上至1250升以下，更优选该自由空间体积为1039升。自由空间高度优选450mm以上至550mm以下，更优选该自由空间高度为500mm。总直线高度(H)优选2000mm以上至2400mm以下，更优选总直线高度为2252mm。上探头圈或样品圈的高度优选1200mm以上至1600mm以下，更优选上探头圈或样品圈的高度为1403mm。下探头圈或样品圈的高度优选500mm以上至550mm以下，更优选下探头圈或样品圈的高度为531mm。
在本发明一种优选的实施方案中，本发明的方法发生在体积为20000升的生物反应器中。在使用20000升生物反应器的方法中，使用的培养基体积优选在接种前期间为13913升至17096升。在接种后期间培养基的体积优选17391升以上至19231升以下。在转移前/收获期，在20000升生物反应器中的培养基体积优选20000升以上至21739升以下。在本发明的具有20000升体积的生物反应器中，最小操作体积(V最小)优选在9000升至16000升之间，更优选该最小操作体积为13000升，最大操作体积(V)优选19000升以上至25000升以下，该最大操作体积更优选为22000升。最小搅拌体积优选为8100升以上至8500升以下，更优选最小搅拌体积为8379升。在具有20000升体积的生物反应器中，在最小操作体积时的液体高度(H最小)优选2100mm以上至2500mm以下，更优选在最小操作体积时该液体高度为2309mm。在具有20000升体积的生物反应器中，在最大操作体积时的液体高度(HL)优选3550mm以上至3950mm以下，更优选在最大操作体积时该液体高度为3777mm。最小高宽比(H最小/T)优选0.70以上至0.99以下，更优选该最小高宽比为0.83。在本发明的方法中使用的具有20000升体积的生物反应器的最大高宽比(HL-T)优选1.2以上至1.5以下，更优选该最大高宽比为1.35。自由空间体积优选5750升以上至6500升以下，更优选该自由空间体积为6131升。自由空间高度优选900mm以上至1100mm以下，更优选该自由空间高度为1000mm。总直线高度(H)优选3700mm以上至4100mm以下，更优选总直线高度为3968mm。上探头圈或样品圈的高度优选2200mm以上至2650mm以下，更优选上探头圈或样品圈的高度为2411mm。下探头圈或样品圈的高度优选880mm以上至940mm以下，更优选下探头圈或样品圈的高度为913mm。
对于具有20000升体积的生物反应器，优选使用的接种比为11％v/v(1比9稀释)或20％v/v(1比5稀释)，优选的补料应用为接种后体积的4％v/v至25％v/v。优选调整20000升生物反应器中接种后的体积，使补料应用达15％，以便在添加所有补料后到收获时最终体积为20000升。然而，对于大于15％v/v的补料应用，优选为了15％v/v补料而调整接种后体积，但在补料应用后，最终收获前体积将为最小20000升至最大22000升。期望20000升生物反应器在批次结束时容纳总共20000升至22000升。
具有20000升体积的生物反应器优选以10至15天的分批或分批补料模式来操作。
本发明还包括用于培养哺乳动物细胞的生物反应器***，所述生物反应器***特征在于：具有至少500升、优选至少1000升体积的a)第一生物反应器与体积大于第一生物反应器体积并具有至少2000升、优选至少4000升体积的b)第二生物反应器连接，并且其中所述具有至少2000升、优选至少4000升体积的第二生物反应器与本发明的体积大于第二生物反应器体积并具有至少10000升、优选至少20000升体积的c)第三生物反应器连接。
在本发明一种优选的实施方案中，生物反应器***特征在于生物反应器中至少一种为本发明的生物反应器。更优选，生物反应器***的所有生物反应器均为本发明的生物反应器。
在本文中，本发明的生物反应器为在说明书、实施例和权利要求书中描述的所有生物反应器。
本发明的生物反应器也称为生物反应器列(train)或设备。
生物反应器列优选包括不同的生物反应器，其也称为阶段。具有至少500升、优选至少1000升体积的生物反应器对应于阶段N-3和/或N-2。具有至少2000升、优选至少4000升体积的生物反应器对应于阶段N-1。具有至少10000升、优选至少20000升体积的生物反应器对应于阶段N。
根据需要设计生物反应器列，以确保诸如pH、溶氧张力(DOT)和温度之类的工艺参数方面的均相环境，在所述生物反应器中保持良好混合的细胞悬浮和使营养补料混合。生物反应器列的生物反应器优选显示几何相似性。这允许在例如12升实验室规模或500升中试规模开发按比例缩小模型。将阶段N-3、N-2和N-1的生物反应器用作种子生物反应器。将阶段N的生物反应器用作生产生物反应器。优选基于相同的原理设计种子生物反应器和生产生物反应器。然而，可以要求一些偏差以适应工艺中的灵活性。
在本发明一种优选的实施方案中，高宽比HL/T为0.17以上至1.96以下。
在本发明一种优选的实施方案中，存在另一生物反应器，尤其是对应于阶段N-4的50升生物反应器。
在本发明一种优选的实施方案中，N-4生物反应器是S-200seed wave生物反应器或100升搅拌罐反应器。
在本发明的一种优选实施方案中，液体(例如培养基)能够通过气动辅助流动或通过蠕动泵从一个生物反应器运输至另一生物反应器。
本发明还包括培养和增殖哺乳动物细胞的方法，所述方法特征在于：a)在具有至少500升体积、优选具有至少1000升体积的第一生物反应器中，在合适的条件下在合适的培养基中培养至少一个哺乳动物细胞，b)将通过增殖至少一个哺乳动物细胞而获得的含细胞培养基转移入具有至少2000升体积、优选具有至少4000升体积的第二生物反应器，c)在所述具有至少2000升体积、优选具有至少4000升体积的第二生物反应器中培养被转移的细胞，d)将在步骤c)中获得的含细胞培养基转移入具有至少10000升体积、优选具有至少20000升体积的第三生物反应器，以及e)在具有至少10000升体积、优选具有至少20000升体积的第三生物反应器中培养所述被转移的细胞。
在本发明的一种优选实施方案中，所述方法特征在于所使用的生物反应器中至少一种为本发明的生物反应器，更优选所使用的所有生物反应器都是本发明的生物反应器。
在本文中，本发明的生物反应器为在说明书、实施例和权利要求书中描述的所有生物反应器。
步骤e)的生物反应器优选以分批或分批补料模式来操作。优选将细胞在步骤e)中培养10至15天。
步骤a)也称为阶段N-3和/或N-2。步骤c)也称为阶段N-1。步骤e)也称为阶段N。
优选在步骤a)、c)和e)的生物反应器中的培养条件相同。更优选，在步骤a)、c)和e)的生物反应器中的培养条件诸如pH、溶氧张力和温度的工艺参数方面的均相环境。优选在步骤a)、c)和e)中生物反应器中的pH、溶氧张力和温度相同。
在本发明的一种优选实施方案中，在转移步骤b)和/或d)之后的接种比为至少10％v/v，更优选11％v/v(1比9稀释)以上至30％v/v以下，更优选20％v/v(1比5稀释)。
优选在步骤b)和d)中转移全部培养基或仅部分培养基。
本发明进一步优选的实施方案为从属权利要求中的主题(subject-matter)。
在接下来的实施例和附图中将更详细地说明本发明。
图1显示了本发明的生物反应器。1为生物反应器。10为罐(T)的直径。20为生物反应器的总直线高度(H)。30为生物反应器的基部高度(Hb)。40为生物反应器的顶部高度(Hh)。50为最大操作体积时的液体高度(HL)。60为顶部叶轮直径(D顶)。68为顶部叶轮。70为底部叶轮直径(D底)。78为底部叶轮。80为罐底部与底部叶轮中线之间的间隙(Dc)。90为叶轮间距(Ds)。100为液体表面以下至顶部叶轮的间隙(Do)。108为分布器。110为分布器至罐底部的间隙(Sc)。120为分布器至底部叶轮的间隙(Dc-Sc)。128为挡板。138为位于下圈的孔。148为位于顶部叶轮68中线的孔。
图2显示了本发明的生物反应器***。111为具有1000升体积的生物反应器。11为具有4000升体积的生物反应。1为本发明的具有20000升体积的生物反应器。
实施例1：20000升生物反应器
对于哺乳动物细胞培养，20000升生物反应器以分批或分批补料的模式运行10至15天。通过经由叶轮***的搅拌从而将哺乳动物细胞保持在均相悬浮液中。
容器几何结构
用于20000升生物反应器的容器几何结构通过反复设计基础来确定，在所述反复设计基础中改变最大工作体积、自由空间直线侧距离、高宽比HL/T以及叶轮与罐直径D/T的比例，直到实现可接受的高宽比。
生物反应器高宽比H L /T
此关键设计参数允许对生物反应器几何结构进行表征。具有较高高宽比的罐提供较长气体驻留时间，其允许较大的KLa。然而，增加的顶部压力能够引起可溶气体的形成。在罐中较低的高宽比HL/T可导致较短的气体驻留时间，从而要求较大气流用于充气，导致更多的泡沫产生。还通过HL/T来限制叶轮驱动的搅拌以增加KLa，因为在低高宽比中将在下叶轮旋转时发生表面破坏(breakage)和产生涡旋。由此，高宽比的选择在很大程度上以在表1中列出的议题的经验为基础。
表1：各种高宽比的效果总结
  工艺要素   高高宽比   低高宽比
  径向混合   较高效   较低效
  混合时间   较长   较短
表1：各种高宽比的效果总结
Figure BPA00001420648300181
表2描述在常规处理期间在各种操作体积下20000升生物反应器中高宽比。已在500升中试规模下测试了所述高宽比，并假设保持表观气速和每单位体积的功率恒定，KLa维持恒定。
表2：在20000升生物反应器中的关键操作体积和高宽比
  体积，升   液体顶端，mm   高宽比，HL/T
  接种前   13913-17096   2458-2977   0.88-1.07
  接种后   17391-19231   3025-3325   1.08-1.19
  收获期   20000-21739   3451-3734   1.23-1.34
罐直径
改变罐直径以获得最佳的高宽比HL/T。罐内部直径(ID)的变化受限于可用高宽比和厂房占地面积。所述ID为2794m。
罐高度
罐高度从最大操作体积、高宽比HL/T、自由空间直线侧长度、基板和顶板设计来确定。最终罐高度为从泡沫、厂房高度和叶轮轴长度的测定体积随机值确定的折中值(compromise value)。从基部至顶部切线(tan line)的罐高度为4933m。
自由空间高度
将自由空间高度定义为当将生物反应器填充至其最大操作体积时在液体顶部以上直线侧的长度。这通过考虑以下各项的程度来确定：
●在操作期间产生的泡沫。
●在最大允许充气和搅拌下容纳的气体。
●液体测量中的误差。
在不知道各项在满量程时影响工艺的确切程度时，通常进行估计。自由空间高度的量用以下来平衡：减小用于顶部驱动***的叶轮轴长度(其中额外的长度会使设计和可用机械密封的选择复杂)的期望与稳定的轴承或使叶轮圈稳定的要求。由此采用1000mm(或6100升体积容量或最大操作体积的28％v/v)的最小自由空间高度。
顶板和基板
顶板和基板的设计通过考虑期望的机械长度、自由排水清洁设计和流体流动来进行选择。在按比例缩小尺寸和全尺寸之间保持一致的板设计有助于保持几何相似性。基板为美国机械工程师学会Flanged and Dished(ASMEF&D)设计。顶板设计成可容纳人孔或装凸缘的顶板以允许安装/移除叶轮。
生物反应器搅拌要求
生物反应器的搅拌用于实现快速混合、保持均相、保持哺乳动物细胞悬浮和气泡分散。实现上述目的的基本问题是使由剪切力造成的细胞损伤最小化，所述剪切力源自叶轮几何结构以及在叶轮叶片后面产生的漩涡或涡流。上述目的的折中可通过选择适当的叶轮类型而实现。
底部与顶部驱动叶轮轴
从生物反应器的顶部或底部来驱动搅拌轴的决定是重要的，该决定考虑在表3中所列诸多议题后确定。
表3：用于叶轮轴顶部与底部进入的选择的关键设计议题
Figure BPA00001420648300201
顶部进入叶轮轴倾向于比底部进入的更长，这导致该轴较重且直径更长。另外，轴长度与机械密封的两个面间的固有间隙可能一起规定了对于稳定的轴承或使圈稳定以防止过多“轴摆动”的要求。服务和维护受在搅拌器、变速箱和密封组件周围可用空间的影响，就地轴安装和拆卸受厂房高度限制。
在罐底部的密封和叶轮轴的凸起限制分布器接近罐底部的安置。这个尺寸影响罐的流体动力学，因此其顺从于变化在指定最佳设计中是重要的。
向下泵送叶轮的向下负载连同液体顶部在密封的移动和静止面间具有积累的较大负载(与向上泵送或顶部进入轴相比)，导致密封面的更大的磨损。此外，在提供密封的冷凝管中超压的丧失会导致培养物渗入密封中。这使得子表面(subsurface)密封为较不清洁的设计。
通过折中收获排水阀的位置，浸没的密封使自由排水生物反应器的设计复杂化。其次，收获管口的直径可能受限制，由此限制收获流的流速。因此，在20000升生物反应器中使用顶部进入叶轮轴。
挡板
对于中心安装的叶轮要求挡板是防止形成涡旋的关键。涉及挡板的关键问题是挡板数、挡板宽度(W)、挡板长度(H挡板)以及挡板至罐壁的间隙(Wc)。
对于四个相等地放置的挡板，推荐0.1×T或279mm宽，1.1×H-Hh或3882mm高且具有0.01×T或28mm的挡板至罐壁间隙Wc。
不限定挡板的厚度，但该厚度需确保对流体流的辐射分量的刚性，另外，厚度需确保在SIP期间挡板不会变形从而影响挡板至罐壁的间隙。
叶轮类型
如Rushton(或Rushton型)的高剪切叶轮对于气体分散提供大功率分散，但缺乏对于混合和均相所必需的轴向流动。另外，来自高剪切叶轮的搅拌存在过度细胞损伤的危险。
表4显示经在实验室规模(12.2升)测试的叶轮，所述叶轮提供同等的流体动力学和细胞生长性能。将水翼式叶轮安装在大稠度斜叶片叶轮之上。
在生物反应器中使用表4中描述的D/T比的Lightnin A310和A315。
表4：用于按比例缩小规模研究的叶轮类型的简要列表
Figure BPA00001420648300211
表4：用于按比例缩小规模研究的叶轮类型的简要列表
Figure BPA00001420648300221
叶轮与罐直径比，D/T比
对于轴向流动叶轮的直径推荐小于0.5×T。大于此的直径导致破坏轴向流动，从而使搅拌和充气不良。
还需要进入生物反应器中的功率耗散和雷诺(Reynold’s number)数足够高，以维持湍流(负载的)型态(turbulent(loaded)regime)。因此，叶轮的直径的选择是在选择足够大的直径以确保充分均相混合且不超出生物反应器的流体动力学特征之间的折中。这些包括节制(throttling)轴向流动、不充分的功率耗散、超过叶轮倾斜速度上限和产生不良混合分层区。
一旦选择了直径，则在按比例缩小的中试容器间保持恒定的D/T比就是关键的，以保持按比例研究的中心假设——保持几何相似性。
对于D/T比在表4中示出的四种叶轮，已确定了与12.2升相关的按比例放大KLa。从几何相似性的观点，推荐直径为1.229m(D/T为0.44)的A310和直径为1.285m(D/T为0.46)的A315。然而，人孔的直径可限制能够被安装和拆卸的最大叶轮直径为1.219m。因此，使用直径为1.219m的A310和A315，由此保持叶轮安装和拆卸的容易性，且保持接近在按比例缩小研究中所建议的几何相似性。
叶轮间隙D c 和间距D s
在具有多个叶轮的生物反应器中叶轮间的距离是需要考虑的重要尺寸。对于具有双Rushton涡轮机(辐向流动)的生物反应器，当所述双叶轮的间距小于沿轴的0.5×D时，不通气功率损耗(power consumption)与单个叶轮相等。在2×D的间距时，功率损耗变得汇集(adductive)。因此，当叶轮间距变得小于0.5×D时，叶轮的效率减小，对于多个叶轮的要求变得不必要。重要的是要注意在生物反应器中，叶轮间距还影响产生死区(不良混合区域)的可能性。对于叶轮间距的选择的其他限制为在生物反应器中要求的不连续工作体积。
1.229×D底(1498mm)的叶轮间距Ds允许两个叶轮保持浸没在17392升的最小接种后体积中，在上叶轮之上的液体顶部Do为0.5×D顶(615mm)，距底部间隙DC为0.75×D底(913mm)。
表5列出将在叶轮之上形成液体表面或更低的液体覆盖层的体积。在这些关键体积下，需要调节搅拌以避免起泡沫。
表5：引起叶轮和液体表面相互作用的关键操作体积
顶部叶轮在液体表面以下的间隙Do
不期望叶轮叶片在液体表面之上伸出(breakage)，因为这将使叶轮的流动和功率耗散无效。另外，由于顶部空间气体至液体的明显的表面捕获和过量的泡沫，其将产生未知的KLa值。对于辐向流动叶轮，Do为0.3×D，对于轴向流动叶轮如A310，Do为0.5×D。然而，当Do达到2×D时，叶轮提供温和的混合作用。这对于生产生物反应器应用来说是可接受的，因为KLa研究已显示生物反应器KLa受底部A315叶轮的影响最大，顶部A310叶轮有助于主体混合。
作为设定Dc和Ds数值的结果，对于生产生物反应器的操作的持续时间，使Do保持在最佳的范围。在分批处理过程中，在顶部叶轮上的液体覆盖层将从0.5×DA310至1.08×DA310间变化。当生物反应器供入营养补料和碱以维持恒定pH时，在顶部叶轮上的液体覆盖层将增加。表6显示对于操作体积范围的在顶部叶轮之上的液体覆盖层的范围。
表6：关键操作体积以及在顶部叶轮之上的液体覆盖层，Do
搅拌速率-rpm，P/V以及叶尖速度
下表7说明了20000升生物反应器的搅拌速率。典型地，将生物反应器在20-260W/m3下搅拌，优选在55至85100W/m3下搅拌。在500升中试规模发酵期间研究了搅拌策略。因此，使用0至80±1rpm的搅拌速率作为操作范围。
表7：用于20000升生物反应器的搅拌速率
Figure BPA00001420648300251
机械密封说明
对于生物反应器，所有密封均为具有0.2mm的最大“误差(run out)”或摆动容差的双机械密封。考虑了三种类型，它们包括：
●湿密封，用无菌浓缩物(condensate)润滑。
●干密封，用无菌气体(如N2或CA)润滑。
●无润滑或单向旋转的浮动密封。
推荐所有机械密封以年度为基础进行保养。这要求从生物反应器拆卸密封并将所述密封组件送至供应商。因此，设计必须考虑日常维护的容易性。
干型密封(John Crane-5280D型)每年将产生3g由树脂浸渍碳组成的脱落物(密封表面和密封底座材料)。这是以1年的连续24小时操作为基础。对于湿密封，脱落物的量显著较少。因此，对于所有生物反应器双密封，均采用湿浓缩物润滑密封。
生物反应器充气要求和充气策略
20000升生物反应器的充气策略由以下决定：
●KLa要求
●DOT控制策略
●pCO2控制/去除策略
●使用烧结分布器或槽式分布器
对于具有5mmol×L-1×h-1的氧摄取速率的工艺，将20000升生物反应器设计为提供高达20h-1的KLa值。生物反应器的设计需要具有足够的灵活性，以允许达20×106个细胞×mL-1的培养过程。
充气要求能够通过许多不同的方式来实现。然而，采用使用富集空气和氧的有槽式分布器来补偿在峰值氧需求期间氧传输速率(OTR)的任何缺少。此方法的优点为：
●槽式分布器设计更容易CIP和SIP验证。
●更大的空气通过量以帮助溶解的CO2去除。
●通过避免购买一次性使用的烧结元件降低操作成本。
以上选择的方法的缺点也需要考虑。这些缺点包括：
●对于选择的低功率数叶轮的固有的低KLa。
因此，生物反应器充气设计必须具有可调节的灵活性以满足期望的KLa。
表8描述了用于20000升生物反应器的充气要求。将气体流动速率在恒定表观气速上按比例放大。
使用两个分布器。主要或“DOT控制”分布器提供有：双量程洁净空气、质量流量控制器(MFC)，和气流经由DOT控制圈测量的氧气MFC，以及经由酸pH控制圈测量气体的CO2MFC。使用双量程MFC以在所期望的操作范围的极末端实现精确的流动控制。
第二或镇流分布器由CA MFC提供，向该CA MFC中也提供氮气。据测量，早期DOT控制需要少量氮气镇流以辅助早期DOT需要并降低DOT至设定点。镇流分布器还测量镇流空气以利于去掉过量的pCO2。
使用顶部空间冲扫(purge)以允许从顶部空间除去CO2和氧。这有利于更好的pH和pCO2控制和在排放至环境前稀释高氧混合物的。改变顶部空间流动速率的能力允许为各种要求不同富氧混合物以及控制点pCO2的多种工艺设计充气策略。
表8：用于20000升生物反应器的气体流动速率和MFC操作范围
  气体   操作范围   备注
  顶部空间1
表8：用于20000升生物反应器的气体流动速率和MFC操作范围
Figure BPA00001420648300271
设计用于安装分布器的生物反应器孔以适合51mm直径的管设计。孔的位置应允许控制分布器(Dc-Sc)放置在低于下叶轮的底边320mm的距离且距罐底(Sc)不大于593mm。
这导致Sc值为593mm或(0.65×Dc)，这落在0.2×Dc至0.6×Dc的可接受范围之外。然而，在500升中的流体动力学试验显示0.41至0.71×Dc的Sc间隙对测量的KLa没有影响。
还构造了用于安装镇流分布器的分离的孔。这个孔的位置允许镇流分布器放置在低于下叶轮的底边320mm的距离(Dc-Sc)且距罐底不大于593mm(Sc)。要求从单独的分布器添加镇流是由于以下三个原因：
●首先，其防止氧或富氧DOT需求气体被镇流气体稀释。这确保最好的OTR，因为从分布器形成的气泡的氧浓度梯度是最大的。
●其次，其允许镇流分布器位于距DOT控制分布器的不同位置，以避免在递送期望的镇流用于pCO2控制时影响DOT控制。
●第三，镇流分布器能够独立于DOT控制分布器而设计。
孔径和孔数的计算是重复的，直到目标雷诺数，从孔产生的气体的雷诺数(Re)为＜2000，Sauter表示在连串鼓泡型态(chain bubble regime)期间气泡直径为10-20mm。表9示出用于20000升生物反应器的控制分布器和镇流分布器的关键规格。
表9：用于20000升生物反应器的分布器的设计规格
Figure BPA00001420648300281
表9：用于20000升生物反应器的分布器的设计规格
Figure BPA00001420648300291
使用0.8×D底(底部A-315叶轮直径的80％直径)的环分布器来分布在叶片下的孔，而不是使用叶轮轮毂。然而，CIP和此结构的安装困难。因此，也可以使用如下选择的分布器几何结构：该分布器几何结构允许以与孔的最佳分布和清洁设计一致的方式来分布期望的孔数。
作为选择，采用新月形管而不是直管。新月形的曲率优选为0.8×D底。为了有助于从生物反应器的侧孔安装和拆卸，所述新月形圆周为0.8×D底圈的完整圆周的240°，即1077mm。
DOT控制分布器为1077mm长且具有51mm直径。孔具有4mm直径。使用在距背部(垂直)45°分成2排(2×125)的总共250个孔。将在分布器两末端的直径4mm的排水孔钻在分布器的腹面，以有助于分布器的自由CIP排水。
镇流分布器为1077mm长和具有51mm直径，且在单背行具有总共1006mm的孔径。将在分布器两末端的直径4mm的排水孔钻在分布器的腹面，以有助于分布器的自由CIP排水。
探头位置、添加孔以及样品孔
必须将探头圈放置在生物反应器的良好混合的代表性区域。其它的考虑包括工作体积范围和人机工程学操作。一并考虑探测端口的位置、样品阀以及添加点位置，以避免暂时性的尖峰。此外，就控制探头而言的样品阀的位置需要允许测量的工艺参数的离线验证的精确估计。这在表10中列出。
表10：用于20000升生物反应器的探头、添加孔和样品孔规格
Figure BPA00001420648300292
表10：用于20000升生物反应器的探头、添加孔和样品孔规格
表10：用于20000升生物反应器的探头、添加孔和样品孔规格
表10：用于20000升生物反应器的探头、添加孔和样品孔规格
Figure BPA00001420648300321
表10：用于20000升生物反应器的探头、添加孔和样品孔规格
Figure BPA00001420648300331
添加孔、表面和子表面
决定终止于液体表面的添加孔以及终止于子表面的那些的需要，通过工艺控制中的操作方案和供料策略的效果来决定。
目前，无蛋白工艺具有需要投放在生物反应器的良好混合区域的两种连续的补料。额外的用于葡萄糖和“LS1-型”的喷射添加的供给也被整合至良好混合的区域。通过表面添加1比10稀释的C乳液来控制泡沫。以避免产生泡沫的方式将种子接种入接种前的生物反应器，所述泡沫将在培养物落在培养基表面上时产生。设计以下孔：
●六个表面添加孔，具有培养基入口、接种物入口、一个定向到容器壁的小添加入口，离开罐壁落在液体表面上的其它小添加入口。
●四个子表面添加孔，包括来自两个供料罐的入口以及来自碱罐的双向入口。
样品孔
样品孔的设计允许从生物反应器取代表性的样品。因此，任何残余材料都必须尽可能地少。使用所取的样品以离线确定溶解的气体、pH、营养和生物质浓度的检测。孔的喷嘴开得足够大以防止筛分造成生物质聚集体滞留。使用2mm喷嘴NovaSeptum样品设备。然而，这不得不与保持孔残余体积低的要求平衡。需要将孔设置在邻近探头的良好混合的区域，所述区域需通过离线检测证实并经由喷嘴位置确定(参见表10)。
添加罐
为了减少成本和时间，将供应生物反应器的添加罐以模块化设计。生产生物反应器具有三个2500升额定体积的添加罐。将添加罐以25升/分填充。将补料从添加罐至生物反应器的流动速率控制在每小时每升接种后生物反应器体积为0.2至1.0毫升补料(ml/l/h)。期望将补料速率控制在设定点±5％。
生产生物反应器通过三个1372mm ID通过1880mm的添加罐提供服务。这些罐具有独立地或与生产生物反应器一起被清洁和灭菌的性能。
人孔
特定的维修操作需要进入生物反应器。进入能够通过考虑装凸缘的顶板或将人孔并入顶板来实现。进入生物反应器的需要是用于：
●安装叶轮。
●安装和更换叶轮和叶轮轴。
●安装和更换机械密封。
●维护容器设施。
●分布器位置的可能的调整，以获得期望的流体动力学特性。
人孔的尺寸必须足以允许进入上述设备。所使用的人孔的直径足够允许拆卸两个1219mm直径的叶轮。
体积测量
设计确保任何传感器在操作范围附近的体积测量中给出足够的精确度。
在生物反应器中的体积测量能够测量13000至25000升的范围。传感器灵敏度需要为至少全范围的0.5％。
在补料添加罐和碱罐中，体积测量能够分别测量0至2200和2500升。传感器灵敏度需要为至少全范围的0.2％。这将允许通过测量在添加罐中的体积减少以每小时0.2ml/l的最小流速或每小时3.5升按小时核查补料流速。
生物反应器温度控制
通过工艺控制使培养基达到操作温度和pH。这通过“温和”加热外罩(避免容器壁高温)来实现。在操作期间的温度控制范围为36至38℃，精确度为设定点±0.2℃。
外罩
考虑以下方面限定生物反应器的外罩面积：
●在121-125℃蒸汽灭菌。
●在2小时内使培养基从10℃至36.5℃预热。
●在生物反应器中的所有点必须达到设定点±0.2℃，所述设定点典型地为36.5℃，通过热电藕测量。
●在2小时内从36.5℃至10℃冷却培养基。
生物反应器pH控制
工艺pH用探头来监测和控制，所述探头经由传感器连接至基于DCS的工艺控制器。通过添加CO2使pH降低至设定点和添加碱使pH上升至设定点来控制工艺。将pH控制在设定点±0.03。
通过两个添加点来添加碱以分散碱。如果在罐中发生长再循环时间，这确保碱的快速混合。通过控制分布器添加CO2。
控制探头和备用探头位于距罐底部913mm(参见表10)的下孔圈。另外，pH探头与碱添加孔在直径方向相对地位于生物反应器中。
生物反应器DOT控制
用极谱DOT探头监测和控制溶解氧。DOT设定点通过分布以下来维持：
●按需要的初始N2镇流和/或空气。
●按需要的具有空气的空气镇流。
●按需要的具有氧气的空气镇流。
●一旦氧需求减少则逆转气体使用情况。
级联DOT控制允许DOT设定点通过在镇流和需求气体中的变化与搅拌速度的改变(ramping)一起来维持。
为了控制pCO2，以去除多余的dCO2所要求的镇流影响DOT控制。因此，对于其中释放新陈代谢CO2的那些过程，与pCO2控制一起考虑DOT控制。将DOT控制在设定点±2％。控制探头和备用探头位于距罐底部913mm的下孔圈。
生物反应器溶解CO 2 控制
工艺dCO2用pCO2探头监测且过量的dCO2通过经镇流分布器的充气CA来去除。该探头的最佳位置接近pH探头。
补料添加控制
补料(SF22和氨基酸)是高pH和摩尔渗透压浓度的。因此，需要避免团添加以保持良好的pH控制。然而，期望的流速(设定点±5％)的控制在技术上具有挑战性。因此，包含具有递送模式的添加点的添加策略避免补料团的循环和pH控制的可能变化。
因此，添加点在距罐底部913mm的底部叶轮中线平面，以帮助快速混合补料团。
消泡剂添加控制
根据需要添加消泡剂(C乳液)添加剂以保持生物反应器液体表面无泡沫。可将工作储存液(1比10稀释的C乳液)投放在液体表面上。在储存容器中连续搅拌消泡剂悬浮液以防止分层。重要的是消泡剂的投放要接近罐中心，以减少流体流的辐射分量运载消泡剂至罐壁(消泡剂将粘附于此)的作用。因此，添加孔为0.25×T朝向罐中心或距罐中心699mm。
实施例2：4000升生物反应器
容器几何结构
用于4000升生物反应器的容器几何结构通过反复设计基础来确定，在所述反复设计基础中改变最大工作体积、自由空间直线侧距离、高宽比(HL/T)以及叶轮与罐直径(D/T)的比例，直到实现可接受的高宽比。
生物反应器高宽比H L /T
表11描述在常规工艺中在各种操作体积下4000升生物反应器的高宽比。这些高宽比由罐ID的选择和需要的操作体积而产生。从工艺的角度，在三个操作条件下的混合要求是不同的。在接种前阶段，生物反应器混合重要的是允许培养基与最小KLa需求平衡。然而，对于接种后和转移前阶段，混合和KLa都是重要的考虑因素。因此，在高宽比范围内对这些特征都进行了测试。
表11：4000升生物反应器中的关键操作体积和高宽比
Figure BPA00001420648300371
罐直径
改变罐直径以获得最佳的高宽比HL/T。罐内部直径(ID)的变化受限于可用高宽比和厂房占地面积。所述ID为1626mm。
罐高度
罐高度从最大操作体积、高宽比HL/T、自由空间直线侧长度、基板和顶板设计来确定。最终罐高度为从泡沫、厂房高度和可用叶轮轴长度的测定体积随机值确定的折中值。顶部至基部切线的高度为2817mm。
自由空间高度
对于这种种子生物反应器使用500mm(1039升，或最大操作体积的27％V/V)的自由空间高度。
顶板和基板
基板和顶部的设计为用于种子生物反应器的ASME F&D设计。
生物反应器搅拌要求
生物反应器的搅拌用于实现快速混合、保持均相、保持哺乳动物细胞悬浮和气泡分散。实现上述目的的基本问题是使由剪切力造成的细胞损伤最小化，所述剪切力源自叶轮几何结构以及在叶轮叶片后面产生的漩涡或涡流。上述目的的折中可通过选择适当的叶轮类型而实现。
底部与顶部驱动叶轮轴
为了已强调过的优点，使马达驱动顶部安装。
挡板
对于中心安装的叶轮要求挡板，是防止形成涡旋的关键。涉及挡板的关键问题是挡板数、挡板宽度(W)、挡板长度(H挡板)以及挡板至罐壁的间隙(Wc)。
使用四个相等地放置的挡板，它们为0.1×T或163mm宽，1.1×H-Hh或2.195mm高且具有0.01×T或16mm的挡板至罐壁间隙Wc。
不限定挡板的厚度，但该厚度需确保对流体流的辐射分量的刚性。需要额外的厚度以确保在SIP期间挡板不被变形从而影响挡板至罐壁的间隙。
叶轮类型、尺寸和数量
与20000升容器同样地形成此生物反应器的叶轮并具有同样的0.44的D/T比。底部叶轮为710mm直径的Lightnin A315，顶部叶轮为710mm直径的Lightnin A310。
叶轮间距，D c ，D s 和D o
在顶部叶轮的中线和下叶轮的中线间的叶轮间距Ds为1.229×D底或872mm。底部叶轮距底部间隙Dc为0.75×D底或531mm。这允许下叶轮在2153升的最小接种后体积下保持浸没，且两个叶轮均浸没于3367升体积，液体顶部在上叶轮之上(Do)0.5×D顶或358mm。
表12列出将在叶轮之上形成液体表面或更低的液体覆盖层的体积。在这些关键体积下，可调节搅拌以避免起泡沫。
表12：引起叶轮和液体表面相互作用的关键操作体积
能够在两个不连续的接种后体积操作4000升生物反应器，使下叶轮浸没(在1比9接种培养过程中)或两个叶轮都浸没(在1比5接种过程)，表13显示在此操作期间获得的对于上叶轮和下叶轮获得的液体覆盖层。
在1比9接种培养过程中，观察到在A315下叶轮上0.67至0.82×D底的液体覆盖层。这在0.5至1×D的推荐范围内。
在1比5接种培养过程中，观察到在A310顶部叶轮上0.06至0.78×D底的液体覆盖层。较低液体覆盖层在推荐范围之外。然而，此液体覆盖层是在接种后期间当混合和搅拌较不关键时观察到的。
表13：关键操作体积以及在顶部叶轮之上的液体覆盖层Do和底部叶轮之上的液体覆盖层DBo
Figure BPA00001420648300401
搅拌速率-rpm，P/V以及叶尖速度
表14说明了4000升生物反应器的搅拌速率。生物反应器将典型地在20-260W/m-3，优选在55-85W/m-3下搅拌。在500升中试发酵过程中研究了搅拌策略。因此，使用0至88±1rpm的搅拌速率作为操作范围。
表14：用于4000升生物反应器的搅拌速率
Figure BPA00001420648300411
机械密封说明
如前所述，使用被浓缩物润滑的双机械密封。
生物反应器充气要求
表15显示在4000升生物反应器中在接种物扩增过程中，用于DOT和pH控制的气流，所述气流基于恒定表观气速的按比例放大。对于DOT控制不需要氧气。然而，可以使用富氧空气以有助于较低充气(gassing)以防止过多泡沫。推荐较小范围的N2MFC应供应氮气，用于早期DOT控制和减少不正常的高水平DOT。
表15：用于4000升生物反应器的气体流率和MFC操作范围
Figure BPA00001420648300412
表15：用于4000升生物反应器的气体流率和MFC操作范围
Figure BPA00001420648300421
孔径和孔数的计算(对于槽式分布器)是重复的，直到从孔产生的气体的目标雷诺数为＜2000，Sauter表示在连串鼓泡型态期间气泡直径为约10mm。
表16显示用于4000升生物反应器的关键分布器设计规格。从管几何结构确定分布器长度SL为568mm。将孔分布在分布器的任一末端以防止气泡直接在A315轮毂下面释放。可选地，可使用新月形几何结构。选择罐直径以帮助间隔期望的孔数。所述直径为38mm。100个2mm孔位于分布器的背侧表面，单个2mm孔位于腹侧表面，以帮助分布器的自由CIP排水。
设计用于安装分布器的生物反应器孔，以适合直径38mm的管设计。孔的位置允许将控制分布器放置在低于下叶轮的底边194mm(Dc-Sc)的距离且距罐底Sc不大于337mm。
表16：
  参数   控制分布器
  气体流量，SLPM   105
  分布器孔数   100
  喷嘴直径，do，m   0.002
  气体流量，m3.s-1   1.75E-03
表16：
Figure BPA00001420648300431
探头位置、添加孔以及样品孔
用于安置探头、添加孔和样品孔的设计基础已在实施例1中涉及，并在表17中列出。
表17：用于4000升生物反应器的探头、添加孔和样品孔的规格
Figure BPA00001420648300432
表17：用于4000升生物反应器的探头、添加孔和样品孔的规格
表17：用于4000升生物反应器的探头、添加孔和样品孔的规格
表17：用于4000升生物反应器的探头、添加孔和样品孔的规格
添加孔、表面和子表面
终止于液体表面的添加孔以及终止于子表面的那些的分类的需求，通过工艺控制中的操作方案和供料策略的效果来决定。
已设计4000升生物反应器，以容纳需要在生物反应器的良好混合区域投放的两个子表面供料孔和碱孔。通过表面添加1比10稀释的C-乳液来控制泡沫。为了将来的灵活性，还在定向到容器壁的表面添加孔之上设计了单个备用孔。要避免在种子生物反应器的接种过程中培养物溅到培养基表面上，以防止形成泡沫。因此，接种物添加孔在表面之上且定向到容器壁。在基板中收获孔的使用是在接种物转移过程中用于除去接种物的理想的孔。另外，将培养基添加孔定向至容器壁。总之，所有添加孔为：
●四个表面添加孔，具有培养基入口、接种物入口和定向到容器壁的备用小添加孔以及离开容器壁落在液体表面上的消泡剂的添加孔。
●三个子表面添加孔，用于补料和碱。
样品孔
样品孔设计类似于指定用于20000升生物反应器的那些。
体积测量
水平传感器能够以准确度±满量程的0.5％测量多达4000升。
生物反应器温度控制
通过工艺控制，使1914至3077升培养基达到操作温度，所述操作温度典型地为36.5℃。这通过“温和”加热外罩和避免容器壁高温来实现。
外罩
考虑以下方面限定生物反应器的外罩面积：
●在121-125℃蒸汽灭菌。
●在2小时内，使1914-3077升培养基从10℃至36.5℃预热。
●在生物反应器中的所有点必须达到设定点±0.2℃，所述设定点典型地为36.5℃，通过热电藕测量。
●在2小时内使1914-3077升培养基从36±2℃冷却至10℃。
生物反应器pH控制
工艺pH用探头来监测和控制，所述探头经由传感器连接至基于DCS的工艺控制器。通过经由控制分布器添加CO2使pH降低至设定点和添加碱使pH上升至设定点来控制工艺pH。
经由至少一个在底部叶轮中线的子表面孔来添加碱。CO2将经由控制分布器添加。
如在表17中所示，控制探头和备用探头在距罐底部531mm的下圈。
生物反应器DOT控制
用极谱DOT探头监测和控制溶解氧。通过分布维持的DOT设定点为：
●按需要的初始N2镇流和/或空气
●按需要的具有空气的空气镇流。
●按需要的具有氧气的空气镇流。
DOT控制允许通过交互使用氧气或空气作为需求气体来维持DOT设定点。假设在接种物反应器中不需要pCO2控制。如在表17中所示，控制探头和备用探头在距罐底部531mm的下圈。
补料添加控制
添加点为距罐底531mm，在下叶轮的中线平面上，以有助于补料团的快速分散。
消泡剂添加控制
添加点在表面上，朝向罐中心伸出0.25×T或距罐中心407mm。
实施例3：1000升生物反应器说明：
容器几何结构
用于1000升生物反应器的容器几何结构通过反复设计基础来确定，在所述反复设计基础中改变最大工作体积、自由空间直线侧距离、高宽比(HL/T)以及叶轮与罐直径(D/T)的比例，直到实现可接受的高宽比。
生物反应器高宽比H L /T
下表18描述在常规工艺中在各种操作体积下1000升生物反应器中的高宽比。这些高宽比由罐ID的选择和需要的操作体积而产生。从工艺的角度，在三个不同操作条件下的混合要求是不同的。在接种前阶段，生物反应器混合重要的是允许培养基与最小KLa需求平衡。然而，对于接种后和转移前阶段，混合和KLa都是重要的考虑因素。因此，在高宽比范围内对这些特征都进行了测试。
表18：1000升生物反应器中的关键操作体积和高宽比
 体积，L   液体顶部，mm   高宽比，HL/T
  阶段N-3
表18：1000升生物反应器中的关键操作体积和高宽比
Figure BPA00001420648300491
罐直径
改变罐直径以获得最佳的高宽比HL/T。罐内部直径(ID)的变化受限于可用高宽比和厂房占地面积。所述ID为0.864m。
罐高度
罐高度从最大操作体积、高宽比HL/T、自由空间直线侧长度、基板和顶板设计来确定。最终罐高度为从泡沫、厂房高度和可用叶轮轴长度的测定体积随机值确定的折中值。顶部至基部切线的高度为2.347m.
自由空间高度
对于这种种子生物反应器使用500mm(293升或最大操作体积的31％V/V)的自由空间高度。
顶板和基板
基板和顶板的设计为用于种子生物反应器的ASME F&D设计。
生物反应器搅拌要求
生物反应器的搅拌用于实现快速混合、保持均相、保持哺乳动物细胞悬浮和气泡分散。实现上述目的的基本问题是使由剪切力造成的细胞损伤最小化，所述剪切力源自叶轮几何结构以及在叶轮叶片后面产生的“漩涡”或涡流。上述目的的折中可通过选择适当的叶轮类型和充气策略而实现。
底部与顶部驱动轴
为了已强调过的优点，使马达驱动顶部安装。
挡板
对于中心安装的叶轮要求挡板，是防止形成涡旋的关键。涉及挡板的关键问题是挡板数、挡板宽度(W)、挡板长度(H挡板)以及挡板至罐壁的间隙(Wc)。
使用四个相等地放置的挡板，它们为0.1×T或86mm宽，1.1×H-Hh或2.099mm高且具有0.01×T或9mm的挡板至罐壁间隙Wc。
不限定挡板的厚度，但该厚度需确保对流体流的辐射分量的刚性。另外，厚度需确保在SIP期间挡板不会变形而影响挡板至罐壁的间隙。
叶轮类型、尺寸和数量
用于1000升生物反应器的叶轮应以同样的D/T比与20000升容器同样地形成。因此，底部叶轮为直径381mm的Lightnin A315，顶部叶轮为直径381mm的Lightnin A310。
叶轮间距，D c ，D s 和D o
在顶部叶轮的中线和底部叶轮的中线间的叶轮间距(Ds)为2×D底(762mm)。底部叶轮距底部间隙Dc为.4×D底(152mm)。这允许底部叶轮在167升的最小接种后体积下以0.5×D底或190mm的液体覆盖层(Do)保持浸没，且两个叶轮均在616升下浸没，液体顶部高于上叶轮Do为0,5×D顶(190mm)。
表19强调了将在叶轮之上形成液体表面或较低液体覆盖层的体积。在这些关键体积下，能够调节搅拌以避免泡沫。
表19：引起叶轮和液体表面相互作用的关键操作体积
Figure BPA00001420648300511
在两个不连续的接种后体积下操作1000升生物反应器，使底部叶轮浸没(在1比5和1比9过程期间)或使两个叶轮都浸没(在1比5过程的N-2阶段期间以及1比5和1比9过程的滚动种子操作期间)。
表20显示在1比5和1比9传代培养操作过程期间，在较高和下叶轮之上的液体覆盖层。在1比5和1比9的滚动操作过程期间，在下叶轮之上的液体覆盖层降至0.5×D以下。因此，重要的是当在此低体积下操作时降低搅拌速率，以避免表面气体雾沫。在960升时，获得2.05×D顶的液体覆盖层(Do)。在此水平下，KLa已显示不会受到不利影响且主体混合不是问题。
表20：关键操作体积以及在顶部叶轮之上的液体覆盖层Do和底部叶轮之上的液体覆盖层DBo
搅拌速率-rpm，P/V以及叶尖速度
表21说明了1000升生物反应器的搅拌速率。将生物反应器在约20-260W/m3下搅拌，优选在55至85W/m3下搅拌。在500升中试规模发酵期间研究了搅拌策略。使用高达155±1rpm的搅拌速率作为最佳的操作范围。
表21：用于4000升生物反应器的搅拌速率
Figure BPA00001420648300531
机械密封说明
如前所述，使用被浓缩物润滑的双机械密封。
生物反应器充气要求
表22显示在1000升生物反应器中在接种物扩增过程中，用于DOT和pH控制的气流，所述气流基于恒定表观气速的按比例放大。对于DOT控制不需要氧气。然而，可以使用富氧空气，以有助于降低充气以防止过量泡沫。推荐应使用较小范围的CA MFC以传递氮气，用于早期DOT控制以及减少不正常的高水平DOT。
表22：用于1000升生物反应器的气体流动速率和MFC操作范围
Figure BPA00001420648300532
表22：用于1000升生物反应器的气体流动速率和MFC操作范围
Figure BPA00001420648300541
孔尺寸和孔数的计算是重复的直到从孔产生的气体的目标雷诺数为＜2000，Sauter表示连串鼓泡型态的气泡直径为约10mm。
表23显示用于1000升生物反应器的关键分布器设计规格。从管几何结构确定分布器长度SL为305mm。将孔分布在分布器的任一末端以防止气泡直接在A315轮毂下面释放。可选地，可考虑新月形几何结构。
管直径为25mm。30个2mm孔位于分布器的背侧表面，单个2mm孔位于腹侧表面，以帮助分布器的自由CIP排水。
设计用于安装分布器的生物反应器孔，以适合直径25mm的管设计。孔的位置允许控制分布器放置在低于底部叶轮的底边88mm(Dc-Sc)的距离且距罐底(Sc)不大于64mm。
表23：用于1000升生物反应器分布器的关键规格
  参数   控制分布器
  气体流量，SLPM   35
  分布器孔数   30
  喷嘴直径，do，m   0.002
  气体流量，m3.s-1   5.83E-04
  喷嘴面积，m2   3.14E-06
  总喷嘴面积，m2   9.42E-05
表23：用于1000升生物反应器分布器的关键规格
  参数   控制分布器
  空气密度，Kg.m-3   1.166
  粘度，Nm.s-2   1.85E-05
  Sauter平均直径，mm(dvs＝1.17Vo 0.4do 0.8g-0.2)   10.65
  重力加速度，g，m.s-2   9.807
  密度差，Kg.m-3   1048.834
  雷诺数，＞2000喷射型态   782
  分布器气体流速，Vo，m/s   6.19
  分布器长度，SL，m   0.305
  钻出所要求的孔的合并长度，m   0.06
  在长度SL上适合需要的孔的排数，m   1
  分布器至罐底部间隙，Sc，m   0.064
  分布器至底部叶轮间隙，Dc-Sc，m   0.088
探头位置、添加孔以及样品孔
用于探头、添加孔和样品孔的设计基础与用于20000升生物反应器的那些相同。
表24：用于1000升生物反应器的探头、添加孔和样品孔的规格
Figure BPA00001420648300551
表24：用于1000升生物反应器的探头、添加孔和样品孔的规格
Figure BPA00001420648300561
表24：用于1000升生物反应器的探头、添加孔和样品孔的规格
Figure BPA00001420648300571
为了从50升的体积监测、控制和取样，探头和孔圈需要距罐底部151mm。然而，探头/孔圈不能位于如此低点，因为其落在基板和生物反应器的直线圆柱体侧的焊接处。将探头和孔圈设定在距罐底部286mm处。这允许监测、控制和取样134升的体积。使探头/孔圈位于尽可能地接近罐底部，以使被监测/控制的体积最小。
添加孔、表面和子表面(sub-surface)
已设计1000升生物反应器，以容纳需要在生物反应器的良好混合区域投放的两个子表面补料孔和碱孔。通过表面添加1比10稀释的C乳液来控制泡沫。为了将来的灵活性，还在定向到容器壁的表面备用添加孔之上整合了单个孔。应避免在种子生物反应器的接种过程中培养物溅到培养基表面上，以防止形成泡沫。因此，接种添加孔在表面之上且定向到容器壁。在基板中收获孔的使用是在接种物转移过程中用于除去接种物的理想的孔。另外，将培养基添加孔定向至容器壁。总之，所有添加孔为：
●四个表面添加孔，具有培养基入口、接种物入口和定向到容器壁的备用小添加孔以及离开容器壁落在液体表面上的消泡剂的添加孔。
●三个子表面添加孔，用于补料和碱。
样品孔
样品孔设计类似于指定用于20000升生物反应器的那些。使样品孔位于距罐底部286mm处，以使能够取样的体积最小化。
体积测量
水平传感器能够测量多达1000升。水平传感器灵敏度至少为满量程的0.25％。
生物反应器温度控制
在初始接种和“种子滚动操作”期间，通过工艺控制，使250至800升培养基达到典型地为36.5℃的操作温度。这通过“温和”加热外罩和避免容器壁高温来实现。
外罩
考虑以下方面限定生物反应器的外罩面积：
●在121-125℃蒸汽灭菌。
●在2小时内使250-800升培养基从10℃至36.5℃预热。
●在生物反应器中的所有点必须达到设定点±0.2℃，所述设定点典型地为36.5℃，通过热电藕测量。
●在2小时内使400升培养基从36±2℃冷却至10℃。
生物反应器pH控制
工艺pH用探头来监测和控制，所述探头经由传感器连接至基于DCS的工艺控制器。通过添加CO2使pH降低至设定点和添加碱使pH上升至设定点来控制工艺pH。经由至少一个在底部叶轮中线的子表面孔来添加碱。通过控制分布器添加CO2。
使控制探头和备用探头位于距罐底部286mm的下孔圈，以使如表24中所示的能够被监测的体积最小化。
生物反应器DOT控制
用极谱DOT探头监测和控制溶解氧。通过分布维持的DOT设定点为：
●按需要的初始N2镇流和/或空气
●按需要的具有空气的空气镇流。
●按需要的具有氧气的空气镇流。
DOT控制允许通过交互使用氧气或空气作为需求气体来维持DOT设定点。
使控制探头和备用探头位于距罐底部286mm的下孔圈，以使如表24中所示的能够被监测的体积最小化。
补料添加控制
添加点为距罐底286mm，在底部叶轮的中线附近，以有助于补料团的快速分散。
消泡剂添加控制
添加点在表面上，朝向罐中心伸出0.25×T或距罐中心216mm。
实施例4：生物反应器列
生物反应器设计是基于能够进行1比5(20％v/v)和1比9(11％v/v)两种传代培养比例的能力。生物反应器列由以下构成：1000升(阶段N-3和N-2)和4000升(阶段N-1)种子生物反应器，和随后的20000升生产生物反应器(阶段N)。用于各生物反应器的操作体积在实施例1至3中定义。生物反应器基于搅拌罐设计并使用顶部驱动搅拌***。
根据需要进行设计，以确保诸如pH、溶氧张力(DOT)和温度之类的工艺参数方面的均相环境，在所述生物反应器中保持良好混合的细胞悬浮液和使营养补料混合。这为最佳的细胞生长、产物积累和产量提供了必须的物理化学环境。设计原理的关键是需要保持几何结构上的相似性。这允许在12升实验室和500升中试规模上开发按比例缩小模型。虽然要求一些偏离以允许工艺中的灵活性，但种子和生产生物反应器的设计均基于相似的原理。所选择的高宽比(HL/T)为典型地用于哺乳动物细胞培养的那些且在0.17至1.96的接种后范围。
表25：关键生物反应器设计参数
表25：关键生物反应器设计参数
设计限制是基于11％v/v(1比9稀释)和20％v/v(1比5稀释)的接种比例，补料应用为接种后体积的4％v/v至25％v/v。调整生物反应器中的接种后体积，使补料应用达15％，以便在添加所有补料后到收获时最终体积达20000升。然而，对于大于15％v/v的补料应用，为了15％v/v补料而调整接种后体积，但在补料应用后，最终收获前体积将为最小20000至最大22000升。期望生产生物反应器在批次结束时容纳总共20000至22000升。表26显示三个接种物扩增阶段的各阶段以及生产生物反应器的接种前体积、接种体积和转移或收获体积。
种子生物反应器(阶段N-1至N-3)不太可能被供料，因此最大操作体积将是接种时体积。用于4000升种子生物反应器(阶段N-1)的操作体积为1914至3846升。为了设计能够从20％v/v的种子分流比(seed split ratio)培养细胞的生物反应器，1000升种子生物反应器(阶段N-2和N-3)将在两个操作范围内操作。对于11％v/v种子分流比，生物反应器列能够生产足够的培养物以满足在单个扩增/传代培养阶段的迅速生长过程中的细胞浓度标准。然而，对于20％v/v种子分流比过程，生物反应器列要求两个扩增/传代培养阶段，以满足向前进行的处理标准。因此，对于11％v/v种子分流比过程，要求400至450升的操作范围，对于20％v/v种子分流比过程，要求250至960升操作体积范围。
表26：用于生物反应器列的容器尺寸
推荐用在S200 Wave生物反应器中生产的培养物接种1000升种子生物反应器。
1000升：对于哺乳动物细胞培养，以多达5天的分批处理来操作生物反应器，可能“喷射添加”补料。然而，由于在每一批次结束时的重复的排放和再填充操作，在此生物反应器中的总处理持续时间会超过30天。通过经由与20000升生物反应器的相同的叶轮***的搅拌，从而将哺乳动物细胞保持在均相悬浮液中。另外，在可能的情况下，其它特征将与20000升生物反应器保持几何结构上的相似性。
分别分布空气或氧气和空气或氮气将控制工艺DOT。通过添加用于碱性控制的碱和用于酸性控制的分布的CO2来控制工艺pH。
生物反应器的工艺操作体积在不同操作阶段变化。最初，在0.5小时内，将生物反应器在无菌条件下用培养基团填充至250至400升。在接种前阶段操作生物反应器，以将工艺变量达到预先确定的设定点。通过气动辅助流动或用蠕动泵泵送，在25至30分钟内向1000升生物反应器中，以1比5或1比9稀释接种来自(N-4)S-200 seed wave生物反应器的50升培养物。对于1比5和1比9接种工艺，接种后操作体积分别为300和450升。向最终体积加入用于碱性控制的碱以及用于悬浮泡沫的1比10的消泡剂悬浮液。如果培养间隔比预期的长，则通过“喷射添加”来给接种培养物供料。作为混合和充气的结果，由于容纳气体，如上所述的液体体积将膨胀。此上升的程度依赖于使用的分布器类型、由叶轮赋予的每单位体积功率以及分布气体的表观气速。
当活细胞浓度达到转移标准时，N-3阶段结束。通过在1.5小时内排放192升过量培养物和添加768升新鲜培养基，用于1比5过程的N-2阶段开始于体积扩大，达960升。在N-2阶段结束时，将696至769升培养物转移至4000升生物反应器用于1比5过程。对于1比9过程，将239升培养物转移至4000升生物反应器。
将1000升生物反应器连续“排出和用新鲜培养基再填充”或“滚动”，从而为4000升生物反应器提供后援培养物。滚动种子操作的持续时间依赖于生产活动的长度和种子培养物的可允许经历代数。典型地，设定滚动种子操作超过30天。滚动操作由以下组成：对于1比5过程，保留960升培养物的约192升，用768升新鲜培养基稀释。对于1比9过程，通过保留450至900升培养物的50至100升并用400至800升新鲜培养基稀释，来期望使1000升生物反应器“滚动”。在此操作中，工艺控制范围是不严格的。在滚动操作期间，将添加至生物反应器的培养基加热至30℃。
4000升：对于哺乳动物细胞培养，以不超过5天的分批处理来操作生物反应器，可能“喷射添加”补料。通过经由与实施例1中描述的相同的叶轮***的搅拌，从而将哺乳动物细胞保持在均相悬浮液中。另外，此容器在几何结构上与20000升生物反应器类似。
分别分布空气或氧气和空气或氮气从而控制工艺DOT。通过添加用于碱性控制的碱和用于酸性控制的分布的CO2来控制工艺pH。
生物反应器的工艺操作体积在不同操作阶段变化。最初，在1.5小时内，将生物反应器在无菌条件下用无蛋白培养基的团填充至1914至3077升。在接种前阶段操作生物反应器，以将工艺变量达到预先确定的设定点。通过以允许在1小时内转移的流动速率气动流动，使来自1000升(N-2)种子生物反应器的培养物以1比5或1比9稀释比例接种。接种后操作体积为2153至3846升。向最终体积加入用于碱性控制的碱以及用于悬浮泡沫的1比10的消泡剂悬浮液。如果培养间隔比预期的长，则通过“喷射添加”来给接种培养物供料。作为混合和充气的结果，由于容纳气体，液体体积膨胀。此上升的程度依赖于使用的分布器类型、由叶轮赋予的每单位体积功率以及分布气体的表观气速。
20000升：对于哺乳动物细胞培养，将生物反应器以分批或分批补料的模式运行10至15天。通过经由叶轮***的搅拌从而将哺乳动物细胞保持在均相悬浮液中。
生物反应器的工艺操作体积在不同操作阶段变化。最初，在1-2小时内，将生物反应器用细胞培养基无菌填充至13913至17096升。在接种前阶段操作生物反应器，以将工艺变量达到预先确定的设定点。通过以＜4000升/h的流动速率范围气动流动，使来自4000升种子生物反应器(N-1)的培养物以1比5或1比9稀释比例接种入20000升生物反应器。在应用子表面补料后，接种后体积连续增加至最大20000升(两次供料，总共4至25％v/v)。添加用于碱性控制的碱以及用于悬浮泡沫的1比10的消泡剂悬浮液分别总计为约100升和20升。作为混合和充气的结果，由于容纳气体，液体体积膨胀。此上升的程度依赖于使用的分布器类型(槽式或烧结的)、由叶轮赋予的每单位体积功率以及分布气体的表观气速。
表27描述在常规工艺中在各种操作体积下20000升生物反应器中的高宽比。已在500升规模下测试了所述高宽比，并假设保持表观气速和每单位体积的功率恒定，维持KLa恒定。
表27：20000升生物反应器中的关键操作体积和高宽比
  体积，升   液体顶部，mm   高宽比HL/T
  接种前   13913-17096   2458-2977   0.88-1.07
  接种后   17391-19231   3025-3325   1.08-1.19
  收获期   20000-21739   3451-3734   1.23-1.34

Claims (18)

1.一种用于培养哺乳动物细胞的生物反应器，其特征在于：所述生物反应器(1)具有至少4000升的体积，以及至少一个顶部叶轮(68)和至少一个底部叶轮(78)，其中所述顶部叶轮(68)为水翼式叶轮。
2.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于：所述生物反应器(1)具有顶部叶轮(68)和底部叶轮(78)，所述顶部叶轮(68)优选为三叶水翼式设计的叶轮，所述底部叶轮(78)优选为四斜叶大稠度叶轮。
3.根据前述任一权利要求中所述的生物反应器，其特征在于：所述叶轮(60，70)与罐(10)的直径比为0.35以上至0.55以下，优选0.40以上至0.48以下，最优选0.44以上至0.46以下。
4.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于：所述顶部叶轮的功率数(Np)为0.1以上至0.9以下。
5.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于：所述顶部叶轮的流量数(Nq)为0.4以上至0.9以下。
6.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于：所述底部叶轮的功率数(Np)为0.5以上至0.9以下。
7.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于：所述底部叶轮的流量数(Nq)为0.50以上至0.85以下。
8.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于：所述生物反应器(1)具有至少一个分布器(108)。
9.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于：所述生物反应器(1)具有至少一个挡板(128)。
10.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于：所述生物反应器(1)具有至少两个用于添加碱的(138，148)，所述孔优选空间上彼此分离。
11.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于：所述生物反应器(1)具有至少10000升的体积，最优选至少20000升的体积。
12.一种培养和增殖哺乳动物细胞的方法，其特征在于：在权利要求1至11任一项所述的生物反应器中，在合适的培养条件下，在合适的培养基中培养至少一个哺乳动物细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述至少两个叶轮的搅拌速率为55W/m3以上至85W/m3以下。
14.一种用于培养哺乳动物细胞的生物反应器***，其特征在于：
a)具有至少500升、优选至少1000升的体积的第一生物反应器(111)连接至
b)体积大于所述第一生物反应器(1)并具有至少2000升、优选至少4,000升的体积的第二生物反应器(11)，其中所述具有至少2000升、优选至少4000升的体积的第二生物反应器(11)连接至
c)权利要求1至16任一项所述的第三生物反应器(1)，所述第三生物反应器(1)具有至少10000升、优选至少20000升的体积，其体积大于所述第二生物反应器(11)的体积。
15.根据权利要求14所述的生物反应器***，其特征在于：所述第一或第二生物反应器(111、11)中的至少一种为权利要求1至11任一项所述的生物反应器。
16.一种培养和增殖哺乳动物细胞的方法，其特征在于：
a)在具有至少500升的体积、优选至少1000升的体积的第一生物反应器中，在合适的条件下，在合适的培养基中培养至少一个哺乳动物细胞，
b)将通过增殖所述至少一个哺乳动物细胞而获得的含细胞培养基转移至具有至少2000升的体积、优选至少4000升的体积的第二生物反应器，
c)在具有至少2000升的体积、优选至少4000升的体积的所述第二生物反应器中培养被转移的细胞，
d)将在步骤c)中获得的含有细胞培养基转移至第三生物反应器，所述第三生物反应器具有至少10000升的体积、优选至少20000升的体积，和
e)在所述具有至少10000升的体积、优选至少20000升的体积的所述第三生物反应器中培养所述被转移的细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：所使用的所述生物反应器中至少一种为权利要求1至11任一项所述的生物反应器。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于：在步骤a)、c)和e)的所述生物反应器中的培养条件相同。
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