KR20110137302A - 포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 두 개의 임펠러를 갖는 대규모 생물반응기, 대규모 생물반응기 시스템, 그리고 이들 생물반응기를 이용한 포유류 세포의 대규모 배양 및 증식 방법에 관련된다.

Description

포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기{BIOREACTOR FOR THE CULTIVATION OF MAMMALIAN CELLS}
본 발명은 생물반응기 및 이들 생물반응기를 이용한 포유류 세포의 대규모 배양 방법에 관한 것이다.
포유류 세포 배양 과정에서는 용존 산소, 배양 pH, 온도 및 전단 감도를 고려하여 물리화학적 환경을 유지하는 것이 중요하다. 또한, 영양 환경의 유지도 중요하다. 배양 조건의 유지는 포유류 세포의 대규모 배양을 수행하기 위한 가능성을 제한한다. 특히, 농도 구배는 대규모 생물배양기에서 포유류 세포의 세포 성장을 저해할 수 있다.
본 발명의 목적의 하나는 대규모 용량으로 포유류 세포의 배양을 허용하는 생물 반응기 및 방법을 제공하는 것이다. 또한, 대규모 용량에서도 최적 조건 하에서 포유류 세포의 배양을 허용하고 따라서 생물반응기의 크기와 무관하게 공정 수행과 생산물 품질을 허용하는 생물반응기 및 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
생물반응기 내에서 잘 혼합된 세포 현탁액과 영양 재료 혼합을 유지하도록 pH, 용존 산소 장력(DOT; dissolved oxygen tension) 및 온도와 같은 공정 변수에 대하여 균질한 환경에서 포유류 세포의 배양을 허용하는 대규모 생물 반응기를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
또한, 포유류 세포 및 포유류 세포에 의하여 합성된 포유류 세포의 산물, 특히 단백질, 펩타이드, 항생제 또는 아미노산의 생산을 대규모 방식으로 허용하는 장치 및 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명은 청구항에 따른 진핵 세포, 특히 포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기 시스템 및 방법을 제공하는 것에 의하여 본 발명에 내재된 기술적 문제를 해결한다.
본 발명은 특히 포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기의 제공에 의하여 본 발명에 내재된 기술적 문제를 해결하는데, 상기 생물반응기는 적어도 두 개의 임펠러를 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 적어도 하나의 포유류 세포가 적어도 두 개의 임펠러를 갖는 생물반응기 내의 적절한 배양 배지에서 적절한 조건 하에 배양되는 것을 특징으로 하는 포유류 세포의 배양 및 증식 방법을 제공하는 것에 의해 본 발명에 내재된 기술적 문제를 해결한다. 또한, 본 발명은 a) 적어도 500 L의 용적을 갖는 제 1 생물반응기가 b) 적어도 2000 L의 용적을 갖는 제 2 생물반응기와 연결되는데, 제 2 생물반응기는 제 1 생물반응기보다 큰 용적을 갖고 적어도 2000 L의 용적을 갖는 제 2 생물반응기는 c) 적어도 두 개의 임펠러와 적어도 10,000 L의 용적을 갖는 제 3 생물반응기와 연결되는데, 이는 제 2 생물반응기 보다 큰 용적을 갖는 것을 특징으로 하는 포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기 시스템의 제공에 의해 본 발명에 내재된 기술적 문제를 해결한다.
본 발명은 a) 적어도 하나의 포유류 세포가 적어도 500 L의 용적을 갖는 제 1 반응기에서 적절한 배양 배지 중에 적절한 조건 하에서 배양되고, b) 적어도 하나의 포유류 세포의 증식에 의해 얻어지는 세포를 포함하는 배지가 적어도 2000 L의 용적을 갖는 제 2 생물반응기로 이송되고, c) 이송된 세포는 적어도 2000 L의 용적을 갖는 제 2 생물반응기에서 배양되고, d) 단계 c)에서 얻어진 세포를 포함하는 배지는 적어도 10,000 L의 용적을 갖는 제 3 생물반응기로 이송되고, 그리고 e) 이송된 세포는 적어도 10,000 L의 용적을 갖는 제 3 생물반응기에서 배양되는 것을 특징으로 하는 포유류 세포의 배양 및 증식 방법을 제공하는 것에 의하여 본 발명에 내재된 기술적 문제를 해결한다.
본 발명에 따르면, 배양되는 세포는 진핵세포, 바람직하게는 동물 세포, 더욱 바람직하게는 포유류 세포이다. 포유류 세포는 예를 들어 인간 세포주, 마우스 골수종(NS0)-세포주, 차이니즈 햄스터 오바리(CHO)-세포주 또는 하이브리도마-세포주가 될 수 있다. 바람직하게는, 포유류 세포는 CHO-세포주이다.
바람직하게는, 배양된 세포는 항체, 더욱 바람직하게는 단클론 항체, 및/또는 재조합 단백질, 더욱 바람직하게는 치료용 재조합 단백질을 생산하는 데 사용된다. 물론 이들 세포는 펩타이드, 아미노산, 지방산 또는 다른 유용한 생화학적 중간체 또는 대사산물을 생산할 수 있다. 본 발명에 따르면, 배양된 세포에 의해 생산된 단백질의 목포 농도는 0.5 g/L 보다 높고, 바람직하게는 2.0 g/L 보다 높고, 가장 바람직하게는 10.0 g/L 보다 높다. 본 발명에 따른 방법은 비연속(batch) 또는 유가(fed-batch) 공정으로 사용될 수 있다. 비록 본 발명에 따른 방법에 사용되는 세포-배양-배지는 무단백질 배지가 바람직하지만, 단백질 함유 흐름의 사용도 배재하지 않는다.
본 발명에 따르면, 생물반응기는 추가의 장비, 예를 들어 임펠러, 배플(baffles), 스퍼저(spargers) 및/또는 출입구(port)를 갖는 생체적합성 탱크 또는 용기로, 포유류 세포의 배양 및 증식을 특이적으로 허용한다. 바람직하게는 이 탱크 또는 용기는 바람직하게는 탱크의 상부 및 하부를 구축하는 양끝에 플레이트를 갖는 튜브 형태이다. 이 플레이트는 헤드 플레이트(head plate)와 기부 플레이트(base plate)라고 한다. 특히 바람직한 본 발명의 태양에서 기부 플레이트는 ASME F&D(American Society of Mechanical Engineers Flanged and Dished)에서 디자인한 기부 플레이트이다. 헤드-플레이트 디자인은 바람직하게는 통로를 수용하거나, 바람직하게는 임펠러의 제거/접근을 허용하기 위한 플랜지를 갖는 헤드 플레이트이다.
총 탱크 높이는 기부의 내부 탱크 측으로부터 탱크 헤드의 내부 탱크 측면으로의 탄젠트 라인이다.
여유고 높이(freeboard height)는 생물반응기가 그 작동 용적까지 채워졌을 때 액체 헤드 위의 일직선 측 길이로서 정의된다. 최소 여유고 높이는 작동 중 거품 형성과 최대 가스를 지탱하여 교반과 통기를 허용하고 액체 계량의 오차 정도를 고려할 필요가 있다.
본 발명에 따른 생물반응기는 바람직하게는 적어도 500 L, 더욱 바람직하게는 적어도 1000 L, 보다 바람직하게는 적어도 4000 L, 한층 더 바람직하게는 적어도 10,000 L, 한층 더 바람직하게는 적어도 20,000 L의 용적을 갖는다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 생물반응기는 1000 L, 1307 L, 4000 L, 5398 L, 20,000 L 또는 27,934 L의 용적을 갖는다.
바람직하게는, 본 생물반응기는 100,000 L의 최대 용적을 갖고, 더욱 바람직하게는, 본 생물반응기는 50,000 L의 최대 용적을 갖고, 가장 바람직하게는, 본 생물반응기는 30,000 L의 최대 용적을 갖는다.
본 발명에 따른 생물반응기의 디자인은 pH, 용존 산소 장력(DOT) 및 온도와 같은 공정 변수에 대하여 균질한 환경을 보장하여 생물반응기 내에서 잘 혼합된 세포 현탁액과 영양 재료의 혼합을 유지한다. 이는 최적의 세포 성장, 생산물 축적 및 생산물 품질을 위해 필요한 물리화학적 환경을 제공한다. 본 발명에 따른 생물반응기의 디자인은 또한 기하학적 유사성의 유지를 보장한다. 이는 12 리터 실험실 규모 및 500 리터 파일럿 규모의 소규모 모델이 개발되도록 허용한다.
본 발명에 따른 포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기는 적어도 두 개의 임펠러를 갖는다. 더욱 바람직하게는, 본 생물반응기는 두 개의 임펠러, 한층 더 바람직하게는 상부 임펠러와 하부 임펠러를 갖는다.
본 발명에 따른 포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기는 바람직하게는 적어도 하나의 상부 임펠러와 적어도 하나의 하부 임펠러를 갖는데, 상부 임펠러는 바람직하게는 수중익(hydrofoil) 임펠러이다.
본 발명에 따른 포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기는 바람직하게는 적어도 하나의 상부 임펠러와 적어도 하나의 하부 임펠러를 갖는데, 상부 임펠러는 수중익 임펠러이다.
본 발명에 따른 포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기는 바람직하게는 적어도 1000 L의 용적과 적어도 하나의 상부 임펠러 및 적어도 하나의 하부 임펠러를 갖는데, 상부 임펠러는 수중익 임펠러이다.
본 발명에 따른 포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기는 바람직하게는 적어도 4000 L의 용적과 적어도 하나의 상부 임펠러 및 적어도 하나의 하부 임펠러를 갖는데, 상부 임펠러는 바람직하게는 수중익 임펠러이다.
본 발명에 따른 포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기는 바람직하게는 적어도 4000 L의 용적과 적어도 하나의 상부 임펠러 및 적어도 하나의 하부 임펠러를 갖는데, 상부 임펠러는 수중익 임펠러이다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 상부 임펠러는 수중익 임펠러이다. 상부 임펠러는 바람직하게는 강한 벌크(bulk) 혼합을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 하부 임펠러는 수중익 임펠러이다. 본 발명의 바람직한 태양에서 상부 임펠러 및 하부 임펠러는 수중익 임펠러이다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 적어도 상부 임펠러는 수중익 임펠러이다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 모든 임펠러는 수중익 임펠러이다.
본 발명의 바람직한 태양에 따르면, 하부 임펠러는 고-견고성 피치-날(pitch-blade) 임펠러 또는 고-견고성 수중익 임펠러이다. 하부 임펠러는 바람직하게는 분사된 가스의 소산을 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, 수중익 임펠러는 훨씬 많은 액체 운동을 제공하여, 주어진 양의 동력 투입에 대하여 더 좋은 벌크-혼합을 야기한다. 이는 흐름 계수(flow number; Nq)에 의존할 수도 있다.
바람직하게는, 비-수중익 임펠러가 액체 운동을 제공할 수 있지만 더 많은 동력 투입에서 가능하다. 이는 전단-감응성 포유류 세포의 건강에 영향을 줄 수 있다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 수중익 임펠러는 하향 임펠러 또는 상향 임펠러이다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 상부 임펠러는 하향 임펠러이다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 상부 임펠러는 하향 축(axial) 수중익 임펠러이다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 상부 임펠러의 끌어내리는 특성은 잘 통기된 액체 표면을 액체 벌크와 혼합하는 데 사용된다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 수중익 임펠러는 고효율 수중익 임펠러이다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 수중익 임펠러는 Chemineer - 모델 SC-3 임펠러, LIGHTNIN 모델 A310 또는 A510 임펠러, Promix 모델 PHF 시리즈 임펠러 또는 Cleaveland Eastern Mixers 임펠러이다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 상부 임펠러는 고효율 수중익 임펠러이다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 상부 임펠러는 Chemineer - 모델 SC-3 임펠러, LIGHTNIN - 모델 A310 또는 A510 임펠러, Promix - 모델 PHF 시리즈 임펠러 또는 Cleaveland Eastern Mixers 임펠러이다.
상부 임펠러는 바람직하게는 3-날의 수중익 디자인 임펠러, 예를 들어 LIGHTNIN의 A310-타입 임펠러이다. 하부 임펠러는 바람직하게는 4-피치-날의 고 견고성 임펠러, 예를 들어 LIGHTNIN의 A315-타입이다. 상부 임펠러(Dtop/T) 및/또는 하부 임펠러(Dbottom/T)의 탱크 직경 비율은 바람직하게는 적어도 0.35 및 최대 0.55, 더욱 바람직하게는 적어도 0.40 및 최대 0.48, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 0.44 및 최대 0.46이다. 0.5 보다 큰 직경은 축 흐름의 붕괴로, 불량한 교반과 통기를 야기한다.
상부 임펠러 동력수(Np)는 바람직하게는 적어도 0.1 및 최대 0.9, 더욱 바람직하게는 적어도 0.25 및 최대 0.35, 가장 바람직하게는 0.3이다. 상부 임펠러 흐름수(Nq)는 바람직하게는 적어도 0.4 및 최대 0.9, 바람직하게는 적어도 0.50 및 최대 0.60, 가장 바람직하게는 0.56이다. 하부 임펠러 동력수(Np)는 바람직하게는 적어도 0.5 및 최대 0.9, 더욱 바람직하게는 적어도 0.70 및 최대 0.80, 가장 바람직하게는 0.75이다. 하부 임펠러 흐름수(Nq)는 바람직하게는 적어도 0.50 및 최대 0.85, 더욱 바람직하게는 적어도 0.70 및 최대 0.80, 가장 바람직하게는 0.73이다.
임펠러 동력수(Np)는 회전하는 임펠러 날의 운동 에너지를 액체에 부여하기 위한 임펠러 효율의 척도이다. 이는 가스 분산의 수량화에 중요하다. 임펠러 흐름수(Nq)는 임펠러의 펌핑 능력의 척도이고 유체의 벌크 운동의 수량화에 중요하다.
적어도 두 개의 임펠러의 교반율은 규모에 의존한다. 그러나, 본 발명의 특히 바람직한 태양에서 적어도 두 개의 임펠러의 교반율은 최대 200 분당회전수(rpm), 더욱 바람직하게는 최대 165 rpm이다.
임펠러 간격(Ds)은 적어도 두 개의 임펠러 사이의 공간이다. 본 발명의 특히 바람직한 태양에서 이는 적어도 1×하부 임펠러의 직경(Dbottom) 및 최대 2×Dbottom, 더욱 바람직하게는 1.229×Dbottom 또는 2×Dbottom이다. 이는 두 임펠러 모두 가장 낮은 접종 후 용적에서 물속에 잠겨 있는 것을 허용할 것이다.
상부 임펠러 위의 액체 높이(D0)는 본 발명의 특히 바람직한 태양에서 적어도 0.3×상부 임펠러의 직경(Dtop) 및 최대 2.5×Dtop이다. 더욱 바람직하게는, 적어도 0.5×Dtop 및 최대 2.0×Dtop이다.
하부 간격(bottom clearance; Dc)은 하부 임펠러의 중심-선과 탱크 바닥 사이의 간격이다. 본 발명의 특히 바람직한 태양에서 이는 적어도 0.35×Dbottom, 더욱 바람직하게는 0.4×Dbottom 또는 0.75×Dbottom이다.
본 발명에 따른 생물반응기의 임펠러 디자인은 벌크 혼합, 가스 분산 및 낮은 전단에 관하여 최적의 유체역학적 특성을 제공한다. 포유류 세포는 본 발명에 따른 임펠러 시스템을 통하여 교반에 의해 균질 현탁액을 유지한다.
본 발명에 따른 생물반응기에서 임펠러의 디자인은 신속한 혼합을 제공하고, 균질성을 유지하고, 현탁액 및 가스 거품 분산액에서 포유류 세포를 유지한다. 본 발명에 따른 생물반응기에서 임펠러 디자인은 임펠러 날 뒤에서 생성되는 와류 또는 소용돌이, 그리고 임펠러 기하학으로부터 생성되는 전단력을 통한 세포 손상을 최소화한다.
본 발명의 특히 바람직한 태양에서, 적어도 두 개의 임펠러는 상부 구동 교반기 시스템이다.
공기, 특히 압축된 공기, 또는 특정 가스, 바람직하게는 산소, 질소 및/또는 CO2의 공급은 바람직하게는 적어도 하나의 스퍼저(sparger)를 통하여 실현된다.
본 발명에 따른 생물반응기는 바람직하게는 적어도 하나의 스퍼저를 갖고, 더욱 바람직하게는 본 생물반응기는 하나의 스퍼저 또는 두 개의 스퍼저를 갖는다. 본 발명에 따른 생물반응기는 바람직하게는 두 개의 스퍼저를 갖는다. 바람직하게는, 본 생물반응기는 파이프-기하학의 적어도 하나의 스퍼저를 갖는다. 바람직하게는, 적어도 하나의 스퍼저는 플루트(flute)-타입이다. 특히 바람직한 본 발명의 태양에서는, 크레센트(crescent) 파이프가 연구된다. 크레센트의 곡율은 바람직하게는 0.8×Dbottom이다. 생물반응기의 측면 입구로부터의 제거 및 장착을 돕기 위해, 크레센트의 원주는 바람직하게는 0.8×Dbottom의 완전한 원주의 240°이다.
적어도 하나의 스퍼저는 배양의 산소 요구에 부응하기 위하여 충분한 산소 매스(mass) 이송(KLa를 특징으로 하는)을 제공한다. 적어도 하나의 스퍼저는 시간 당 5 mmol/L의 산소 섭취율로 ㎖ 당 20×106 세포까지 도달하는 배양을 위해 20 h-1까지의 KLa를 제공한다. 이중 스퍼저 시스템으로서 두 개의 스퍼저는 용존 CO2의 제거 및 용존 산소 장력(DOT)의 제어를 허용한다. 플루트형 스퍼저는 보다 용이한 CIP(cleaning in place) 및 SIP(sterilisation in place)의 이점을 제공하고 dCO2 제거를 돕고 다양한 용도로서 작동 비용을 감소시킨다. 소결된 스퍼저는 더 높은 KLa 값을 제공한다. 플루트형 스퍼저 디자인의 낮은 KLa 값은 산소가 풍부한 공기를 사용하는 것에 의하여 보상될 수 있다. 가스 흐름 속도는 일정한 표면 가스 속도를 기준으로 커진다.
포유류 세포의 대규모 배양에서는 용존 산소, 배양 pH, 및 온도, 그리고 용존 CO2, 영양소 및 대사 산물 농도 구배 면에서 균질한 물리화학적 환경을 유지하는 것이 중요하다. 적절한 교반 및 통기를 통하여 물리화학적 환경을 균질하게 보장하면서, 선택된 작동 교반 및 통기 조건이 불리한 전단 환경을 일으키지 않도록 보장하는 것이 중요하다. 전단 환경의 역효과를 최소화하는 것과 포유류 세포 배양 과정의 생산성과 양호한 세포 성장을 촉진할 균질한 환경을 보장하는 것 사이의 적절한 균형이 본 발명에서 다루어진다. 이것은 상기의 특정 생물반응기 기하학, 임펠러 디자인 및 배치, 스퍼저 디자인 및 배치, 그리고 교반 및 통기 속도에서의 특정 작동 한계를 통하여 달성된다.
교반 및 분사되는 생물반응기에서 포유류 세포에 대한 주된 손상은 계면 전단으로부터 온다. 계면 전단은 분사된 가스 거품 응집 및 파열에서 생긴다[참고: Ma N, Koelling KW, Chalmers JJ. Biotechnol Bioeng. 2002 Nov 20;80(4): 428-37. Erratum in: Biotechnol Bioeng. 2003 Feb 5;81(3):379]. 따라서, 분사 가스 흐름 및 거품의 과도한 조립을 최소화하는 것이 바람직하다. 계면 전단은, 첫째로 액체 표면과 액체 벌크의 양호한 혼합을 통한 표면 통기를 촉진하는 것과, 둘째로 바람직하게는 두 개의 스퍼저를 통한 배양물의 별도의 산소화에 의한 더 높은 산소 구동력에 의한 접근을 조합함으로써 최소화될 수 있다.
상기 수중익 임펠러의 액체 표면 아래의 배치, 특히 상부 임펠러 위의 액체 높이, 바람직하게는 약 0.5×Dtop인 Do는 액체 표면과 액체 벌크의 강하고 연속적인 교환과 이에 의해 잘 산소화된 액체 표면과 덜 산소화된 액체 벌크의 혼합을 도울 수 있다. 상기 임펠러 간격은 바람직하게는 Ds=1×Dbottom 내지 2×Dbottom으로, 상부 임펠러에 의해 발생되는 액체의 하향 흐름을 허용하여 하부 임펠러로 액체 흐름을 보내서 전체 액체 벌크가 잘 혼합되고 분리된 혼합 영역이 만들어지지 않도록 보장할 수 있다. 상기 임펠러 하부 간격은 바람직하게는 Dc=0.35×D 내지 0.75×D로, 벌크 흐름이 만곡된 ASME F&D 기부에 부딪혀 방향이 바뀌고 생물반응기의 벽을 따라 위로 올라가도록 보장할 수 있다.
밸러스트 스퍼저(ballast sparger)를 통한 비-산소화된 분사 가스(CO2, 공기 및 질소 밸러스트와 같은)로부터 제어 스퍼저를 통한 ‘주문식(on-demand)' 산소화된 분사 가스의 격리는 액체 벌크 밖 공간부분으로 벗어나기 전 액체 벌크 내에서 고도로 산소화된 분사 가스 거품의 더 긴 체류 시간 및 경로 길이를 허용할 수 있다. 이는 주어진 용량의 매스 이송 계수 kLa에서 더 큰 산소 이송율을 허용할 수 있다. 분사 가스 거품의 체류 시간 및 경로 길이는 액체 표면 및 액체 벌크를 연속적으로 끌어내리는 하향 축 수중익 임펠러를 특정화하는 것을 통해 더 연장될 수 있다.
본 발명에 따른 생물반응기는 바람직하게는 적어도 하나의 배플(baffle), 더욱 바람직하게는 적어도 두 개의 배플을 갖는다. 본 발명에 따른 생물반응기는 가장 바람직하게는 네 개의 배플을 갖는다.
배플은 수직 방사상으로 위치하는 플레이트이다. 배플은 깔대기 형성과 소용돌이 형성을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 적어도 하나의 배플의 길이는 1.1×생물반응기의 전체 일직선 높이(H)이다. 배플의 폭(W)은 바람직하게는 0.1×탱크의 내부 직경(T)이다. 배플 간격(Wc)는 바람직하게는 0.01×탱크의 내부 직경(T)이다. 적어도 하나의 배플의 높이(Hbaffle)는 바람직하게는 1.1×전체 일직선 높이(H) - 생물반응기-헤드 높이(Hh)이다. 따라서 Hbaffle은 바람직하게는 식 Hbaffle=1.1×H - Hh에 따라 계산된다.
적어도 하나의 배플의 두께는 특정되지 않지만 이 두께는 액체 흐름의 방사상 성분에 대한 강성을 보장할 필요가 있다. 추가로 두께는 배플 플레이트가 SIP 동안 왜곡되어 배플 대 탱크 벽 간격에 영향을 주지 않도록 보장할 필요가 있다.
본 발명에 따른 생물반응기는 바람직하게는 알칼리 첨가를 위한 적어도 2 개의 출입구를 갖는다. 더욱 바람직하게는, 본 생물반응기는 알칼리 첨가를 위한 2 개의 출입구를 갖는다. 가장 바람직하게는, 본 생물반응기는 알칼리 첨가를 위한 2 개의 출입구를 갖는데, 제 1 출입구는 하부 임펠러의 중심선에 위치하고 제 2 출입구는 상부 임펠러의 중심선에 위치한다. 바람직하게는, pH 프로브가 생물반응기로의 알칼리 첨가 위치에 직경 반대방향으로 위치한다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 본 생물반응기는 1000 L의 용적을 갖는다. 1000 L 생물반응기의 헤드 용적(Vh)은 바람직하게는 적어도 45 L 및 최대 65 L, 더욱 바람직하게는 헤드 용적은 55 L이다. 1000 L 생물반응기의 기부 용적(Vb)은 바람직하게는 적어도 45 L 및 최대 65 L, 더욱 바람직하게는 기부 용적은 55 L이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기의 탱크 내부 직경(T)은 바람직하게는 적어도 850 ㎜ 및 최대 900 ㎜, 더욱 바람직하게는 탱크 내부 직경은 864 ㎜이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기의 탱크 횡단면적(A)은 바람직하게는 적어도 0.55 ㎡ 및 최대 0.65 ㎡, 더욱 바람직하게는 탱크 횡단면적은 0.586 ㎡이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기의 헤드-플레이트의 높이인 헤드 높이(Hh), 및/또는 기부-플레이트의 높이인 기부 높이(Hb)는 바람직하게는 적어도 120 ㎜ 및 최대 180 ㎜, 더욱 바람직하게는 헤드 높이 및/또는 기부 높이는 151 ㎜이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기의 총 탱크 높이는 바람직하게는 적어도 2000 ㎜ 및 최대 2600 ㎜, 더욱 바람직하게는 총 탱크 높이는 2347 ㎜이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기의 상부 임펠러 직경(Dtop) 및/또는 하부 임펠러 직경(Dbottom)은 바람직하게는 적어도 350 ㎜ 및 최대 400 ㎜, 더욱 바람직하게는 상부 임펠러 직경 및/또는 하부 임펠러 직경은 381 ㎜이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기의 탱크 바닥과 하부 임펠러의 중심선 사이의 간격(Dc)는 바람직하게는 적어도 120 ㎜ 및 최대 180 ㎜, 더욱 바람직하게는 간격은 152 ㎜이다. 적어도 2 개의 임펠러 사이의 거리는 임펠러 격차(Ds; impeller separation)로도 알려져 있으며, 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기에서는 바람직하게는 적어도 730 ㎜ 및 최대 790 ㎜, 더욱 바람직하게는 임펠러 격차는 762 ㎜이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기의 임펠러 샤프트 직경은 바람직하게는 적어도 102 ㎜ 및 최대 152 ㎜이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기가 배플을 갖는다면, 배플의 길이는 바람직하게는 적어도 2000 ㎜ 및 최대 2400 ㎜, 더욱 바람직하게는 길이는 2250 ㎜이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기의 배플의 폭은 바람직하게는 적어도 70 ㎜ 및 최대 100 ㎜, 더욱 바람직하게는 폭은 86 ㎜이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기의 배플 간격은 바람직하게는 적어도 7 ㎜ 및 최대 11 ㎜, 더욱 바람직하게는 배플 간격은 9 ㎜이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기의 배플 높이(Hbaffle)는 바람직하게는 적어도 2000 ㎜ 및 최대 2200 ㎜, 더욱 바람직하게는 배플 높이는 2099 ㎜이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기는 바람직하게는 적어도 하나의 스퍼저를 갖고, 더욱 바람직하게는 하나의 스퍼저를 갖는다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기의 적어도 하나의 스퍼저는 바람직하게는 적어도 1.5 ㎜ 및 최대 2.5 ㎜의 구멍- 또는 기공-크기를 갖고, 더욱 바람직하게는 구멍- 또는 기공-크기는 2 ㎜이다. 구멍- 또는 기공-수는 바람직하게는 적어도 20 및 최대 40이고, 더욱 바람직하게는 구멍- 또는 기공-수는 30이다. 스퍼저 길이(SL; sperger length)는 적어도 150 ㎜ 및 최대 550 ㎜, 더욱 바람직하게는 스퍼저 길이는 305 ㎜이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기의 스퍼저 대 탱크 바닥 간격(Sc)는 바람직하게는 적어도 50 ㎜ 및 최대 75 ㎜, 더욱 바람직하게는 스퍼저 대 탱크 바닥 간격은 64 ㎜이다. 본 발명에 따른 1000 L 생물반응기의 스퍼저 대 하부 임펠러 간격(Dc-Sc)는 바람직하게는 적어도 75 ㎜ 및 최대 100 ㎜, 더욱 바람직하게는 스퍼저 대 하부 임펠러 간격은 88 ㎜이다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 본 생물반응기는 4000 L의 용적을 갖는다. 4000 L 생물반응기의 헤드 용적(Vh)은 바람직하게는 적어도 340 L 및 최대 370 L, 더욱 바람직하게는 헤드 용적은 359 L이다. 4000 L 생물반응기의 기부 용적(Vb)은 바람직하게는 적어도 340 L 및 최대 370 L, 더욱 바람직하게는 기부 용적은 359 L이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 탱크 내부 직경(T)은 바람직하게는 적어도 1600 ㎜ 및 최대 1650 ㎜, 더욱 바람직하게는 탱크 내부 직경은 1626 ㎜이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 탱크 횡단면적(A)은 바람직하게는 적어도 1.90 ㎡ 및 최대 2.30 ㎡, 더욱 바람직하게는 탱크 횡단면적은 2.076 ㎡이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 헤드 높이(Hh) 및/또는 기부 높이(Hb)는 바람직하게는 적어도 260 ㎜ 및 최대 300 ㎜, 더욱 바람직하게는 헤드 높이 및/또는 기부 높이는 282 ㎜이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 총 탱크 높이는 바람직하게는 적어도 2300 ㎜ 및 최대 3100 ㎜, 더욱 바람직하게는 총 탱크 높이는 2817 ㎜이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 상부 임펠러 직경(Dtop) 및/또는 하부 임펠러 직경(Dbottom)은 바람직하게는 적어도 680 ㎜ 및 최대 740 ㎜, 더욱 바람직하게는 상부 임펠러 직경 및/또는 하부 임펠러 직경은 710 ㎜이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 탱크 바닥과 하부 임펠러의 중심선 사이의 간격(Dc)는 바람직하게는 적어도 500 ㎜ 및 최대 560 ㎜, 더욱 바람직하게는 간격은 531 ㎜이다. 적어도 2 개의 임펠러 사이의 거리는 임펠러 격차(Ds; impeller separation)로도 알려져 있으며, 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기에서는 바람직하게는 적어도 840 ㎜ 및 최대 900 ㎜, 더욱 바람직하게는 임펠러 격차는 872 ㎜이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 임펠러 샤프트 직경은 바람직하게는 적어도 51 ㎜ 및 최대 64 ㎜이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기가 배플을 갖는다면, 배플의 길이는 바람직하게는 적어도 2200 ㎜ 및 최대 2600 ㎜, 더욱 바람직하게는 길이는 2477 ㎜이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 배플의 폭은 바람직하게는 적어도 150 ㎜ 및 최대 180 ㎜, 더욱 바람직하게는 폭은 163 ㎜이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 배플 간격은 바람직하게는 적어도 12 ㎜ 및 최대 20 ㎜, 더욱 바람직하게는 배플 간격은 16 ㎜이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 배플 높이(Hbaffle)는 바람직하게는 적어도 2100 ㎜ 및 최대 2300 ㎜, 더욱 바람직하게는 배플 높이는 2195 ㎜이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기는 바람직하게는 적어도 하나의 스퍼저를 갖고, 더욱 바람직하게는 하나의 스퍼저를 갖는다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 적어도 하나의 스퍼저는 바람직하게는 적어도 1.5 ㎜ 및 최대 2.5 ㎜의 구멍- 또는 기공-크기를 갖고, 더욱 바람직하게는 구멍- 또는 기공-크기는 2 ㎜이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 구멍- 또는 기공-수는 바람직하게는 적어도 80 및 최대 120이고, 더욱 바람직하게는 구멍- 또는 기공-수는 100이다. 스퍼저 길이(SL)는 바람직하게는 적어도 250 ㎜ 및 최대 800 ㎜, 더욱 바람직하게는 스퍼저 길이는 568 ㎜이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 스퍼저 대 탱크 바닥 간격(Sc)는 바람직하게는 적어도 315 ㎜ 및 최대 360 ㎜, 더욱 바람직하게는 스퍼저 대 탱크 바닥 간격은 337 ㎜이다. 본 발명에 따른 4000 L 생물반응기의 스퍼저 대 하부 임펠러 간격(Dc-Sc)는 바람직하게는 적어도 180 ㎜ 및 최대 205 ㎜, 더욱 바람직하게는 스퍼저 대 하부 임펠러 간격은 194 ㎜이다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 본 생물반응기는 20,000 L의 용적을 갖는다. 20,000 L 생물반응기의 헤드 용적(Vh)은 바람직하게는 적어도 1600 L 및 최대 2000 L, 더욱 바람직하게는 헤드 용적은 1803 L이다. 20,000 L 생물반응기의 기부 용적(Vb)은 바람직하게는 적어도 1600 L 및 최대 2000 L, 더욱 바람직하게는 기부 용적은 1803 L이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 탱크 내부 직경(T)은 바람직하게는 적어도 2500 ㎜ 및 최대 3000 ㎜, 더욱 바람직하게는 탱크 내부 직경은 2794 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 탱크 횡단면적(A)은 바람직하게는 적어도 5.8 ㎡ 및 최대 6.5 ㎡, 더욱 바람직하게는 탱크 횡단면적은 6.131 ㎡이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 헤드 높이(Hh) 및/또는 기부 높이(Hb)는 바람직하게는 적어도 460 ㎜ 및 최대 500 ㎜, 더욱 바람직하게는 헤드 높이 및/또는 기부 높이는 485 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 총 탱크 높이는 바람직하게는 적어도 4800 ㎜ 및 최대 5100 ㎜, 더욱 바람직하게는 총 탱크 높이는 4933 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 상부 임펠러 직경(Dtop) 및/또는 하부 임펠러 직경(Dbottom)은 바람직하게는 적어도 1100 ㎜ 및 최대 1300 ㎜, 더욱 바람직하게는 상부 임펠러 직경 및/또는 하부 임펠러 직경은 1219 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 탱크 바닥과 하부 임펠러의 중심선 사이의 간격(Dc)는 바람직하게는 적어도 890 ㎜ 및 최대 945 ㎜, 더욱 바람직하게는 간격은 913 ㎜이다. 적어도 2 개의 임펠러 사이의 거리는 임펠러 격차(Ds; impeller separation)로도 알려져 있으며, 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기에서는 바람직하게는 적어도 1200 ㎜ 및 최대 1700 ㎜, 더욱 바람직하게는 임펠러 격차는 1498 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 임펠러 샤프트 직경은 바람직하게는 적어도 51 ㎜ 및 최대 64 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기가 배플을 갖는다면, 배플의 길이는 바람직하게는 적어도 4000 ㎜ 및 최대 4600 ㎜, 더욱 바람직하게는 길이는 4365 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 배플의 폭은 바람직하게는 적어도 260 ㎜ 및 최대 290 ㎜, 더욱 바람직하게는 폭은 279 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 배플 간격은 바람직하게는 적어도 20 ㎜ 및 최대 35 ㎜, 더욱 바람직하게는 배플 간격은 28 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 배플 높이(Hbaffle)는 바람직하게는 적어도 3600 ㎜ 및 최대 4050 ㎜, 더욱 바람직하게는 배플 높이는 3882 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기는 바람직하게는 적어도 하나의 스퍼저를 갖고, 더욱 바람직하게는 두 개의 스퍼저를 갖는다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기가 두 개의 스퍼저를 갖는다면, 하나는 바람직하게는 제어 스퍼저이고 또 하나는 바람직하게는 밸러스트 스퍼저이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 제어 스퍼저는 바람직하게는 적어도 3 ㎜ 및 최대 5 ㎜의 구멍- 또는 기공-크기를 갖고, 더욱 바람직하게는 구멍- 또는 기공-크기는 4 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 밸러스트 스퍼저는 바람직하게는 적어도 5 ㎜ 및 최대 7 ㎜의 구멍- 또는 기공-크기를 갖고, 더욱 바람직하게는 구멍- 또는 기공-크기는 6 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 제어 스퍼저의 구멍/기공 수는 바람직하게는 적어도 230 및 최대 270이고, 더욱 바람직하게는 구멍- 또는 기공-수는 250이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 밸러스트 스퍼저의 구멍/기공 수는 바람직하게는 적어도 85 및 최대 115이고, 더욱 바람직하게는 구멍- 또는 기공-수는 100이다. 제어 및/또는 밸러스트 스퍼저의 스퍼저 길이(SL)는 바람직하게는 적어도 500 ㎜ 및 최대 2000 ㎜, 더욱 바람직하게는 스퍼저 길이는 1077 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 스퍼저 대 탱크 바닥 간격(Sc)는 바람직하게는 제어 및/또는 밸러스트 스퍼저에서 적어도 560 ㎜ 및 최대 620 ㎜, 더욱 바람직하게는 스퍼저 대 탱크 바닥 간격은 593 ㎜이다. 본 발명에 따른 20,000 L 생물반응기의 스퍼저 대 하부 임펠러 간격(Dc-Sc)는 제어 및/또는 밸러스트 스퍼저에서 바람직하게는 적어도 300 ㎜ 및 최대 340 ㎜, 더욱 바람직하게는 스퍼저 대 하부 임펠러 간격은 320 ㎜이다. 별개의 스퍼저로부터 밸러스트를 부가하는 데 필요한 것, 밸러스트 스퍼저는 산소 또는 산소 풍부한 DOT 요구 가스가 밸러스트 가스로 희석되는 것을 방지한다. 이는 스퍼저로부터 나오는 거품의 산소 농도 구배가 최대이므로, 최고의 산소 이송 속도(OTR; oxygen transfer rate)을 보장한다. 이차적으로, 밸러스트 스퍼저의 사용은 pCO2 제어를 위해 원하는 밸러스트의 전달에 대한 DOT 제어의 영향을 방지하기 위해 스퍼저가 다른 위치에 배치되는 것을 허용한다. 밸러스트 스퍼저는 제어 스퍼저와 독립적으로 디자인될 수 있다.
본 발명에 따른 생물반응기 디자인으로, 다른 계대배양율(sub-culture ratio)이 실시될 수 있다. 특히 바람직한 태양에서, 실시되는 계대배양율은 적어도 1/5(20%v/v) 및 최대 1/9(11%v/v), 더욱 바람직하게는 1/5(20%v/v) 또는 1/9(11%v/v)이다.
본 발명은 또한, 적어도 하나의 포유류 세포가 본 발명에 따른 생물반응기 내에서 적절한 배양 배지 중 적절한 조건 하에서 배양되는 것을 특징으로 하는 포유류 세포의 배양 및 증식 방법을 포함한다.
본 발명에 따른 생물반응기는 적어도 두 개의 임펠러를 갖고 상기 기술한 적어도 하나의 특징 또는 다른 특징의 조합을 보여주는 모든 생물반응기를 포함한다.
본 발명에 따른 방법에서, 생물반응기의 적어도 두 개의 임펠러의 교반 속도는 바람직하게는 적어도 55 W/㎥ 및 최대 85 W/㎥이다. 바람직하게는, 공기는 적어도 5×10-5 m/s, 더욱 바람직하게는 적어도 10×10-5 m/s의 속도로 배양 배지 내로 분사된다.
특히 바람직한 본 발명의 태양에서, 바람직하게는 서로 간격을 두고 분리된 알칼리 분배를 위한 두 개의 부가 출입구를 통해 알칼리가 부가된다. 이는 탱크 내 재-순환 시간이 길어질 경우 알칼리의 더 빠른 혼합을 보장한다. CO2는 바람직하게는 제어 스퍼저를 통해 부가된다.
알칼리 및/또는 CO2는 바람직하게는 배양-배지의 pH를 조절하기 위해 사용된다.
제어 및 백업 프로브는 탱크 바닥으로부터 913 ㎜에서 하부 출입구 링에 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 방법은 1000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 실시된다. 1000 L 생물반응기를 사용하는 방법에서 사용되는 배양 배지의 용적은 바람직하게는 접종-전 50 L 내지 250 L이다. 접종-후 배양 배지의 용적은 바람직하게는 적어도 300 L 및 최대 960 L이다. 이송 전/수확 시기에, 1000 L 생물반응기의 배양 배지 용적은 바람직하게는 적어도 300 L 및 최대 960 L이다. 본 발명에 따른 1000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 최소 작동 용적(Vmin)은 바람직하게는 80 L 내지 120 L 사이에 있고, 더욱 바람직하게는 최소 작동 용적은 100 L이고, 최대 작동 용적(V)은 바람직하게는 적어도 900 L 및 최대 1100 L이고, 최대 작동 용적은 더욱 바람직하게는 1000 L이다. 최소 교반 용적은 바람직하게는 적어도 230 L 및 최대 255 L, 더욱 바람직하게는 최소 교반 용적은 245 L이다. 1000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 최소 작동 용적에서 액체 높이(Hmin)는 바람직하게는 적어도 210 ㎜ 및 최대 240 ㎜, 더욱 바람직하게는 최소 작동 용적에서 액체 높이는 228 ㎜이다. 1000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 최대 작동 용적에서 액체 높이(HL)는 바람직하게는 적어도 1500 ㎜ 및 최대 1900 ㎜, 더욱 바람직하게는 최대 작동 용적에서 액체 높이는 1764 ㎜이다. 최소 길이직경비(minimum aspect ratio; Hmin/T)는 바람직하게는 적어도 0.15 및 최대 0.19, 더욱 바람직하게는 최소 길이직경비는 0.17이다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는 1000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 최대 길이직경비(maximum aspect ratio; HL-T)는 바람직하게는 적어도 1.8 및 최대 2.1, 더욱 바람직하게는 최대 길이직경비는 1.96이다. 여유고 용적은 바람직하게는 적어도 270 L 및 최대 310 L, 더욱 바람직하게는 여유고 용적은 293 L이다. 여유고 높이는 바람직하게는 적어도 450 ㎜ 및 최대 550 ㎜, 더욱 바람직하게는 여유고 높이는 500 ㎜이다. 총 직선 높이(H)는 바람직하게는 적어도 1900 ㎜ 및 최대 2200 ㎜, 더욱 바람직하게는 총 직선 높이는 2045 ㎜이다. 상부 프로브- 또는 샘플-링의 높이는 바람직하게는 적어도 900 ㎜ 및 최대 1200 ㎜, 더욱 바람직하게는 상부 프로브- 또는 샘플-링의 높이는 1093 ㎜이다. 하부 프로브-샘플 링의 높이는 바람직하게는 적어도 152 ㎜ 및 최대 286 ㎜이다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 방법은 4000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 실시된다. 4000 L 생물반응기를 사용하는 방법에서 사용되는 배양 배지의 용적은 바람직하게는 접종-전에 1914 L 내지 3077 L이다. 접종-후 배양 배지의 용적은 바람직하게는 적어도 2153 L 및 최대 3846 L이다. 이송 전/수확 시기에, 4000 L 생물반응기의 배양 배지 용적은 바람직하게는 적어도 2153 L 및 최대 3846 L이다. 본 발명에 따른 4000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 최소 작동 용적(Vmin)은 바람직하게는 1500 L 내지 2200 L 사이에 있고, 더욱 바람직하게는 최소 작동 용적은 1900 L이고, 최대 작동 용적(V)은 바람직하게는 적어도 3800 L 및 최대 4200 L이고, 최대 작동 용적은 더욱 바람직하게는 4000 L이다. 최소 교반 용적은 바람직하게는 적어도 1500 L 및 최대 1800 L, 더욱 바람직하게는 최소 교반 용적은 1654 L이다. 4000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 최소 작동 용적에서 액체 높이(Hmin)는 바람직하게는 적어도 800 ㎜ 및 최대 1200 ㎜, 더욱 바람직하게는 최소 작동 용적에서 액체 높이는 1024 ㎜이다. 4000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 최대 작동 용적에서 액체 높이(HL)는 바람직하게는 적어도 1800 ㎜ 및 최대 2200 ㎜, 더욱 바람직하게는 최대 작동 용적에서 액체 높이는 2034 ㎜이다. 최소 길이직경비(Hmin/T)는 바람직하게는 적어도 0.55 및 최대 0.75, 더욱 바람직하게는 최소 길이직경비는 0.63이다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는 4000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 최대 길이직경비(HL-T)는 바람직하게는 적어도 1.1 및 최대 1.4, 더욱 바람직하게는 최대 길이직경비는 1.25이다. 여유고 용적은 바람직하게는 적어도 850 L 및 최대 1250 L, 더욱 바람직하게는 여유고 용적은 1039 L이다. 여유고 높이는 바람직하게는 적어도 450 ㎜ 및 최대 550 ㎜, 더욱 바람직하게는 여유고 높이는 500 ㎜이다. 총 직선 높이(H)는 바람직하게는 적어도 2000 ㎜ 및 최대 2400 ㎜, 더욱 바람직하게는 총 직선 높이는 2252 ㎜이다. 상부 프로브- 또는 샘플-링의 높이는 바람직하게는 적어도 1200 ㎜ 및 최대 1600 ㎜, 더욱 바람직하게는 상부 프로브- 또는 샘플-링의 높이는 1403 ㎜이다. 하부 프로브- 또는 샘플- 링의 높이는 바람직하게는 적어도 500 ㎜ 및 최대 550 ㎜, 더욱 바람직하게는 하부 프로브- 또는 샘플-링의 높이는 531 ㎜이다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 방법은 20,000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 실시된다. 20,000 L 생물반응기를 사용하는 방법에서 사용되는 배양 배지의 용적은 바람직하게는 접종-전에 13,913 L 내지 17,096 L이다. 접종-후 배양 배지의 용적은 바람직하게는 적어도 17,391 L 및 최대 19,231 L이다. 이송 전/수확 시기에, 20,000 L 생물반응기의 배양 배지 용적은 바람직하게는 적어도 20,000 L 및 최대 21,739 L이다. 본 발명에 따른 20,000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 최소 작동 용적(Vmin)은 바람직하게는 9000 L 내지 16,000 L 사이에 있고, 더욱 바람직하게는 최소 작동 용적은 13,000 L이고, 최대 작동 용적(V)은 바람직하게는 적어도 19,000 L 및 최대 25,000 L이고, 최대 작동 용적은 더욱 바람직하게는 22,000 L이다. 최소 교반 용적은 바람직하게는 적어도 8100 L 및 최대 8500 L, 더욱 바람직하게는 최소 교반 용적은 8379 L이다. 20,000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 최소 작동 용적에서 액체 높이(Hmin)는 바람직하게는 적어도 2100 ㎜ 및 최대 2500 ㎜, 더욱 바람직하게는 최소 작동 용적에서 액체 높이는 2309 ㎜이다. 20,000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 최대 작동 용적에서 액체 높이(HL)는 바람직하게는 적어도 3550 ㎜ 및 최대 3950 ㎜, 더욱 바람직하게는 최대 작동 용적에서 액체 높이는 3777 ㎜이다. 최소 길이직경비(Hmin/T)는 바람직하게는 적어도 0.70 및 최대 0.99, 더욱 바람직하게는 최소 길이직경비는 0.83이다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는 20,000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 최대 길이직경비(HL-T)는 바람직하게는 적어도 1.2 및 최대 1.5, 더욱 바람직하게는 최대 길이직경비는 1.35이다. 여유고 용적은 바람직하게는 적어도 5750 L 및 최대 6500 L, 더욱 바람직하게는 여유고 용적은 6131 L이다. 여유고 높이는 바람직하게는 적어도 900 ㎜ 및 최대 1100 ㎜, 더욱 바람직하게는 여유고 높이는 1000 ㎜이다. 총 직선 높이(H)는 바람직하게는 적어도 3700 ㎜ 및 최대 4100 ㎜, 더욱 바람직하게는 총 직선 높이는 3968 ㎜이다. 상부 프로브- 또는 샘플-링의 높이는 바람직하게는 적어도 2200 ㎜ 및 최대 2650 ㎜, 더욱 바람직하게는 상부 프로브- 또는 샘플-링의 높이는 2411 ㎜이다. 하부 프로브- 또는 샘플- 링의 높이는 바람직하게는 적어도 880 ㎜ 및 최대 940 ㎜, 더욱 바람직하게는 하부 프로브- 또는 샘플-링의 높이는 913 ㎜이다.
20,000 L 용적을 갖는 생물반응기에서 사용되는 바람직한 식종 비율(seeding ratio)은 접종후 용적의 4%v/v 내지 25%v/v의 바람직한 공급 적용으로 11%v/v(1/9 희석) 또는 20%v/v(1/5 희석)이다. 20,000 L 생물반응기에서 접종후 용적은, 바람직하게는 15%까지의 공급 적용을 위해 조절되어, 모든 공급의 부가가 종료된 후 수확시의 최종 용적이 20,000 L에서 끝나도록 한다. 그러나, 15%v/v 보다 큰 공급 적용을 위하여, 접종후 용적이 바람직하게는 15%v/v 공급으로 조정되지만 공급 적용 이후 최종 수확-전 용적은 최소 20,000 L 및 최대 22,000 L일 것이다. 20,000 L 생물반응기는 배치 종료시 총 20,000 L 내지 22,000 L를 수용하도록 기대된다.
20,000 L 용적을 갖는 생물반응기는 바람직하게는 10 내지 15 일 동안 비연속(batch) 또는 유가(fed batch) 방식으로 작동된다.
본 발명은 또한 a) 적어도 500 L, 바람직하게는 적어도 1000 L의 용적을 갖는 제 1 생물반응기가 b) 적어도 2000 L, 바람직하게는 적어도 4000 L의 용적을 갖는, 제 1 생물반응기 보다 큰 용적의 제 2 생물반응기와 연결되고, 적어도 2000 L, 바람직하게는 적어도 4000 L의 용적을 갖는 제 2 생물반응기가 c) 적어도 10,000 L, 바람직하게는 적어도 20,000 L의 용적을 갖는, 제 2 생물반응기 보다 큰 용적의 본 발명에 따른 제 3 생물반응기와 연결되는 것을 특징으로 하는 포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기 시스템을 포함한다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 생물반응기 시스템은 적어도 하나의 생물반응기가 본 발명에 따른 생물반응기인 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는, 생물반응기 시스템의 모든 생물반응기가 본 발명에 따른 생물반응기이다.
본 발명에 따른 생물반응기는 이와 관련하여 본 명세서, 실시예 및 청구항에 기재된 모든 생물반응기이다.
본 발명에 따른 생물반응기 시스템은 또한 생물반응기 장치(train) 또는 기구이다.
본 생물반응기 장치(train)는 바람직하게는 다른 생물반응기를 포함하는데, 이는 단계(stage)라고도 한다. 적어도 500 L, 바람직하게는 적어도 1000 L의 용적을 갖는 생물반응기는 단계 N-3 및/또는 N-2에 해당한다. 적어도 2000 L, 바람직하게는 적어도 4000 L의 용적을 갖는 생물반응기는 단계 N-1에 해당한다. 적어도 10,000 L, 바람직하게는 적어도 20,000 L의 용적을 갖는 생물반응기는 단계 N에 해당한다.
생물반응기 장치(train)의 디자인은 pH, 용존 산소 장력(DOT) 및 온도와 같은 공정 변수에 대한 균질한 환경을 보장하여 생물반응기 내에서 잘 혼합된 세포 현탁액과 영양 재료의 혼합을 유지하기 위한 필요성에 기초한다. 생물반응기 장치(train)의 생물반응기들은 바람직하게는 기하학적 유사성을 보여준다. 이는, 예를 들어 12 L 실험실 규모 또는 500 L 파일럿 규모에서의 개발을 위한 소규모화된 모델을 허용한다. 단계 N-3, N-2 및 N-1의 생물반응기는 접종-생물반응기로서 사용된다. 단계 N의 생물반응기는 생산-생물반응기로서 사용된다. 접종- 및 생산- 생물반응기의 디자인은 바람직하게는 동일한 원리에 기초한다. 그러나, 공정에서 유연성을 허용하기 위해 필요한 어떤 일탈이 요구될 수 있다.
본 발명의 바람직한 태양에서 길이직경비 HL/T는 적어도 0.17 및 최대 1.96이다.
본 발명의 바람직한 태양에서는, 추가의 생물반응기, 특히 단계 N-4에 해당하는 50 L 생물반응기가 존재한다.
본 발명의 바람직한 태양에서, N-4 생물반응기는 S-200 시드 웨이브(seed wave) 생물반응기 또는 100 L 교반 탱크 반응기이다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 액체, 예를 들어 배양 배지는 기압에 따른 흐름 또는 연동 펌프에 의해 하나의 생물반응기에서 다른 생물반응기로 이송될 수 있다.
본 발명은 또한 a) 적어도 하나의 포유류 세포가 적어도 500 L의 용적, 바람직하게는 적어도 1000 L의 용적을 갖는 제 1 생물반응기에서 적절한 배양 배지 중에 적절한 조건 하에서 배양되고, b) 적어도 하나의 포유류 세포로부터 증식에 의해 얻어진 세포를 포함하는 배지가 적어도 2000 L의 용적, 바람직하게는 적어도 4000 L의 용적을 갖는 제 2 생물반응기로 이송되고, c) 이송된 세포가 적어도 2000 L의 용적, 바람직하게는 적어도 4000 L의 용적을 갖는 제 2 생물반응기에서 배양되고, d) 단계 c)에서 얻어진 세포를 포함하는 배지가 적어도 10,000 L의 용적, 바람직하게는 적어도 20,000 L의 용적을 갖는 제 3 생물반응기로 이송되고, 그리고 e) 이송된 세포가 적어도 10,000 L의 용적, 바람직하게는 적어도 20,000 L의 용적을 갖는 제 3 생물반응기에서 배양되는 것을 특징으로 하는 포유류 세포의 배양 및 증식 방법을 포함한다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 본 방법은 사용되는 생물반응기의 적어도 하나가 본 발명에 따른 생물반응기이고, 더욱 바람직하게는 사용되는 모든 생물반응기가 본 발명에 따른 생물반응기인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 생물반응기는 이와 관련하여 본 명세서, 실시예 및 청구항에 기재된 모든 생물반응기이다.
단계 e)의 생물반응기는 바람직하게는 비연속(batch) 또는 유가(fed batch) 방식으로 작동된다. 세포는 단계 e)에서 바람직하게는 10 내지 15 일 동안 배양된다.
단계 a)는 또한 단계 N-3 및/또는 N-2라고 하기도 한다. 단계 c)는 또한 단계 N-1이라고도 한다. 단계 e)는 또한 단계 N이라고도 한다.
바람직하게는 단계 a), c) 및 e)의 생물반응기에서 배양 조건은 동일하다. 더욱 바람직하게는, 단계 a), c) 및 e)의 생물반응기에서 배양 조건은 pH, 용존 산소 장력 및 온도와 같은 공정 변수에 대하여 균질한 환경을 갖는다. 바람직하게는 단계 a), c) 및 e)의 생물반응기에서 pH, 용존 산소 장력 및 온도는 동일하다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 이송 단계 b) 및/또는 d) 이후의 식종(seeding) 비율은 적어도 10%v/v, 바람직하게는 적어도 11%v/v(1/9 희석) 및 최대 30%v/v, 더욱 바람직하게는 20%v/v(1/5 희석)이다.
바람직하게는 전체 배지 또는 배지의 일부가 단계 b) 및 d)에서 전달된다.
또한, 본 발명의 바람직한 태양은 종속 청구항의 주제이다.
본 발명은 다음 실시예 및 첨부 도면에서 더욱 구체적으로 예시된다.
본 발명에 따르면 대규모 용량으로 최적 조건 하에서 포유류 세포의 배양이 허용되고, 또한 포유류 세포 및 포유류 세포에 의하여 합성된 포유류 세포의 산물, 특히 단백질, 펩타이드, 항생제 또는 아미노산의 생산이 대규모 방식으로 허용된다.
도 1은 본 발명에 따른 생물반응기를 보여준다. 1은 생물반응기이다. 10은 탱크의 직경(T)이다. 20은 생물반응기의 총 직선 높이(H)이다. 30은 생물반응기의 기부 높이(Hb)이다. 40은 생물반응기의 헤드 높이(Hh)이다. 50은 최대 작동 용적에서의 액체 높이(HL)이다. 60은 상부 임펠러 직경(Dtop)이다. 68은 상부 임펠러이다. 70은 하부 임펠러 직경(Dbottom)이다. 78은 하부 임펠러이다. 80은 탱크 바닥과 하부 임펠러의 중심선 사이의 간격(Dc)이다. 90은 임펠러 거리(Ds)이다. 100은 액체 표면 아래의 상부 임펠러의 간격(Do)이다. 108은 스퍼저이다. 110은 스퍼저 대 탱크 바닥 간격(Sc)이다. 120은 스퍼저 대 하부 임펠러 간격(Dc-Sc)이다. 128은 배플이다. 138은 하부 링에 위치한 출입구이다. 148은 상부 임펠러 68의 중심선에 위치한 출입구이다.
도 2는 본 발명의 생물반응기 시스템을 보여준다. 111은 1000 L 용적을 갖는 생물반응기이다. 11은 4000 L 용적을 갖는 생물반응기이다. 1은 20,000 L 용적을 갖는 본 발명에 따른 생물반응기이다.
실시예 1: 20,000 L 생물반응기
본 20,000 L 생물반응기는 포유류 세포의 배양을 위해 10 내지 15 일 동안 비연속(batch) 또는 유가(fed batch) 방식으로 작동된다. 포유류 세포는 임펠러 시스템을 통한 교반에 의해 균질 현탁액으로 유지된다.
용기 기하학
20,000 리터 생물반응기의 용기 기하학은 최대 작동 용적, 여유고 직선측 거리, 길이직경비 HL/T 및 임펠러 대 탱크 직경, D/T 비율이 적절한 길이직경비가 달성될 때까지 변경되는 반복 디자인 베이스로 결정되었다.
생물반응기 길이직경비 H L /T
이 중요한 디자인 변수는 생물반응기 기하학의 특성화를 허용한다. 더 높은 길이직경비를 갖는 탱크는 더 긴 가스 체류 시간을 제공하여 더 큰 KLa를 허용한다. 그러나, 증가된 헤드 압력이 가용성 가스의 형성을 야기할 수 있다. 탱크 내의 더 작은 길이직경비 HL/T는 더 짧은 가스 체류 시간을 야기하여 통기를 위해 더 큰 가스 흐름을 요구하여 더 많은 거품이 형성될 수 있다. KLa를 증가시키기 위한 임펠러 구동 교반은 또한 HL/T에 의해 제한되는데, 낮은 길이직경비에서 하부 임펠러 회전시 표면 파손과 소용돌이 생성이 일어날 것이기 때문이다. 따라서 길이직경비의 선택은 다음 표 1에 표시된 문제에 대한 약간의 고찰과 함께 주로 경험에 기초한다.
표 1: 다양한 길이직경비의 효과 요약
공정 인자 높은 길이직경비 낮은 길이직경비
방사상 혼합 더 효율적 절 효율적
혼합 시간 더 높음 더 낮음
산소 전달율 용존 산소 제어에 의해 결정 용존 산소 제어에 의해 결정
가스 흐름 속도 더 낮음 더 높음
세포 손상 더 적음 더 많음
이산화탄소 제거 덜 효율적 더 효율적
압력 변화 더 높음 더 낮음
규모 확대/축소 용이성
(규모 데이터 접근성)		 현재 사용되는 길이직경비를 떠나서 더 어려움 현재 사용되는 길이직경비를 떠나서 더 어려움
세정도 길이직경비에 의해 직접적으로 영향을 받지 않음 길이직경비에 의해 직접적으로 영향을 받지 않음
용적 유연성 더 적음 더 많음
표 2는 여러 작동 용적에서 정상적인 공정 중 20,000 리터 생물반응기의 길이직경비를 기술한다. 길이직경비는 500 리터 규모에서 시험되고, 단위 용적 당 동력과 표면 가스 속도가 일정하다면 KLa는 일정하게 유지된다.
표 2: 20,000 리터 생물반응기에서 핵심 작동 용적 및 길이직경비
용적, L 액체 헤드, ㎜ 길이직경비, HL/T
접종-전 13913-17096 2458-2977 0.88-1.07
접종 후 17391-19231 3025-3325 1.08-1.19
수확 20000-21739 3451-3734 1.23-1.34
탱크 직경
탱크 직경은 최적 길이직경비 HL/T를 얻기 위해 변경된다. 탱크 내부 직경(ID)의 변화는 허용되는 길이직경비와 플랜트 풋프린트에 의하여 제한된다. ID는 2.794 m이다.
탱크 높이
탱크 높이는 최대 작동 용적, 길이직경비 HL/T, 여유고 직선측 길이, 하부 및 상부 플레이트 디자인으로부터 결정된다. 최종 탱크 높이는 거품, 플랜트 높이 및 임펠러 샤프트 길이를 위한 예비 용적으로부터 결정되는 절충 값이다. 기부에서 헤드 탄젠트 라인까지 탱크 높이는 4.933 m이다.
여유고( freeboard ) 높이
여유고 높이는 생물반응기가 그 최대 작동 용적까지 채워졌을 때 액체 헤드 위의 직선측 길이로서 정의된다. 이는 다음의 크기를 고려하여 결정된다:
● 작동 중 거품이 형성되는 것
● 최대 허용되는 교반 및 통기에서 가스가 견디는 것
● 액체 칭량 오류
전체 규모에서 공정을 예비 시험하면서 각각의 정확한 기여를 알지 못하면 보통 예상치가 만들어진다. 여유고 높이의 양은 상부-구동 시스템에서 임펠러 샤프트 길이를 감소시키기 위한 요구와 균형을 이루는데, 여분의 길이는 가능한 기계적 밀봉의 선택과 디자인, 안정된 베어링을 위한 요구 또는 임펠러 링의 안정화를 복잡하게 할 수 있다. 이에 따라 1000 ㎜의 최소 여유고 높이(또는 6100 리터 용적 수용량 또는 최대 작동 용적의 28%v/v)가 사용된다.
헤드 및 기부 플레이트
헤드 및 기부 플레이트 디자인의 선택은 원하는 기계적 강도, 자유로운 배수 청소 디자인 및 유체 흐름을 고려하여 만들어진다. 규모 축소와 충분한 규모 사이에서 일정한 플레이트 디자인을 유지하는 것은 기하학적 유사성을 유지하도록 기여할 것이다. 기부 플레이트는 American Society of Mechanical Engineers Flanged and Dished (ASME F&D) 디자인의 것이다. 헤드 플레이트 디자인은 임펠러의 제거/접근을 허용하기 위한 플랜지 헤드 플레이트 또는 통로를 수용한다.
생물반응기 교반 요구
생물반응기의 교반은 신속한 혼합을 달성하고, 균질성을 유지하고, 포유류 세포를 현탁액 및 가스 거품 분산액 중에 유지하기 위한 것이다. 상기 목적을 달성하는 데 내포된 문제는 임펠러 기하학으로부터 발생하는 전단력 및 임펠러 날 뒤에 생성되는 와류 또는 소용돌이를 통한 세포 손상을 최소화하는 것이다. 상기 목적의 절충은 적절한 임펠러 타입의 선택에 의해 달성될 수 있다.
하부 대 상부 구동 임펠러 샤프트
생물반응기의 상부 또는 하부로부터 교반기 샤프트를 구동하기 위한 결정은 중요하고 다음 표 3에 표시된 많은 문제를 검토하여 결정된다.
표 3: 임펠러 샤프트의 상부 대 하부 진입의 선택을 위한 핵심 디자인 문제
상부 진입 하부 진입
샤프트 길이 길다 짧다
샤프트 중량 높다 낮다
샤프트 직경 더 크다 더 작다
임펠러 샤프트 현장 장착
및 유지 보수를 위한 제거		 더 큰 플랜트 높이 더 작은 플랜트 높이
이동 및 고정 밀봉면에
세포 배양의 노출		 노출 없음 노출
1밀봉과 용기 사이의 가압 더 낮음 액체 헤드로 인해 더 높음
밀봉 윤활제 누출율 더 낮음 더 높음
기부 플레이트 디자인 단순함 복잡함
스퍼저와 탱크 하부 배치 제한되지 않음 제한됨
CIP 확인 단순함 수중 기계적 밀봉에 의해 복잡화
규모 확대 및 축소 일관성 실험실 및 파일럿 규모와 일치 실험실 및 파일럿 규모와 일치
(1) 윤활과 냉각에 중요한 밀봉과 생물반응기 사이의 압력 차이
상부-진입 임펠러 샤프트는 하부-진입 보다 길이가 긴 경향이 있는데, 이는 샤프트를 더 무겁고 더 큰 직경이 되도록 한다. 또한, 기계적 밀봉의 두 면 사이의 고유 간격와 함께 샤프트 길이가, 과도한 “샤프트 떨림(shaft wobble)"을 방지하기 위한 링의 안정화 또는 안정된 베어링에 대한 요구를 좌우할 수 있다. 보수 및 유지는 교반기, 기어박스 및 밀봉 조합 주위의 가능한 공간에 의하여 영향을 받고, 현장의 샤프트 설치 및 제거는 플랜트 높이에 의해 제한된다.
탱크 하부의 임펠러 샤프트 및 밀봉의 돌출은 탱크 하부 근처 스퍼저의 배치를 제한한다. 그 치수는 탱크 유체역학에 영향을 미치고, 따라서 이의 변화에 대한 수용성은 최적 디자인을 특정하는 게 중요하다.
액체 헤드와 함께 하향 펌핑 임펠러의 하향 부하는 밀봉의 정지 면과 이동 사이에서 (상향 펌핑 또는 상부-진입 샤프트에 비해) 축적된 더 큰 부하를 갖고 밀봉면의 더 큰 마모를 야기한다. 또한, 밀봉을 공급하는 응축 라인에서 과도한 압력의 손실은 배지가 밀봉으로 누출되도록 한다. 이는 표면 밀봉을 덜 위생적인 디자인으로 만든다.
수중 밀봉은 수확 배수 밸브의 위치를 절충하는 것에 의해 프리 배수 생물반응기의 디자인을 복잡하게 한다. 둘째로, 수확 노즐의 직경은 제한될 수도 있고, 따라서 수확 흐름의 속도를 제한한다. 그러므로, 상부 진입 임펠러 샤프트가 20,000 리터 생물반응기에 사용된다.
배플( Baffles )
중앙에 장착된 임펠러를 위한 배플의 요건은 소용돌이 형성을 방지하는 데 중요하다. 배플과 관련된 중요한 문제는 배플 수, 배플 폭(W), 배플 길이(Hbaffle) 및 배플 대 탱크벽 간격(Wc)이다.
4 개의 동일 간격 배플에 대한 권고는 0.1×T 또는 279 ㎜ 폭, 1.1×H-Hh 또는 3882 ㎜ 길이 및 배플 대 탱크 벽 간격 Wc가 0.01×T 또는 28 ㎜이다.
배플의 두께는 특정되지 않지만 유체 흐름의 방사상 요소에 대한 강성을 보장할 필요가 있다. 또한, 두께는 배플 플레이트가 SIP 중에 뒤틀리지 않아서 배플 대 탱크 벽 간격에 영향을 주지 않을 필요가 있다.
임펠러 타입
Rushton(또는 Rushton-type)과 같은 고전단 임펠러는 가스 분산을 위해 높은 동력 소산을 제공하지만 혼합과 균질성에 필요한 축방향 흐름에는 부족하다. 또한, 고전단 임펠러로부터의 교반은 과도한 세포 손상의 위험이 있다.
표 4는 동등한 유체역학 및 세포 성장 실시를 주는 실험실 규모(12.2 리터)에서 시험한 임펠러를 보여준다. 수중익은 고강도 피치 날 임펠러 위에 장착된다.
표 4에 기재된 D/T 비율에서 Lightnin A310 및 A315가 생물반응기에 사용된다.
표 4: 규모 축소 연구를 위한 짧은 목록의 임펠러 타입
임펠러 D/T 비율 1 N p / 2 N q 판매자 설명
A310 0.44 0.30 / 0.56 Lightnin 3 날의 수중익 디자인
A315 0.46 0.75 / 0.73 Lightnin 4 개의 피치-날을 갖는
고 견고성의 임펠러
SC-3 0.40 0.90 / 0.90 Chemineer 3 날의 수중익 디자인
3HS39 0.46 0.53 / 0.58 Philadelphia Mixers 4 개의 피치-날을 갖는
고 견고성 임펠러
(1) Np는 특징적인 임펠러 동력수이다. 이는 액체에 대하여 회전하는 임펠러 날의 역학 에너지를 전하기 위한 임펠러 효올의 척도이다. 이는 가스 분산을 정량하는 데 중요하다.
(2) Nq는 특징적인 임펠러 흐름수이다. 이는 임펠러의 펌핑 능력의 척도이고, 벌크 흐름 이동을 정량하는 데 중요하다.
임펠러 대 탱크 직경 , D/T 비율
축방향 흐름 임펠러의 직경은 0.5×T 보다 작은 것이 권장된다. 이보다 큰 직경은 축방향 흐름을 파괴하여 교반 및 통기가 불량하게 된다.
생물반응기로의 동력 소산 및 레이놀즈 수는 또한 난류(부하된) 체제를 유지하기 위해 충분히 높을 필요가 있다. 따라서, 임펠러 직경의 선택은 생물반응기의 유체역학적 특성을 초과하지 않으면서 적절한 균질 혼합을 보장하기 위해 충분히 큰 직경을 선택하는 타협이다. 이들은 축방향 흐름의 조절, 불충분한 동력 소산, 임펠러 팁 속도 상한의 초과 및 불량 혼합된 층 영역의 생성을 포함한다.
일단 직경이 선택되면, 기하학적 유사성을 유지하는 규모 연구의 중심되는 추정을 유지하기 위해 파일럿 용기의 규모 감축 사이에 일정한 D/T 비율을 유지하는 것이 중요하다.
12.2 리터에서 KLa 확대 상관관계는 표 4에 나타낸 D/T 비율에서 4 개의 임펠러에 대하여 결정된다. 기하학적 유사성 관점으로부터 A310 직경 1.229 m(D/T 0.44) 및 A315 직경 1.285 m(D/T 0.46)가 권장된다. 그러나, 통로 직경은 설치 및 제거될 수 있는 가장 큰 임펠러 직경을 1.219 m까지 제한할 수 있다. 따라서, 1.219 m 직경의 A310 및 A315가 사용되고, 이에 의해 임펠러 설치 및 제거의 용이성을 유지하고 규모 축소 연구에서 제안되는 기하학적 유사성에 근접하도록 유지한다.
임펠러 간격 D c 및 거리 D s
복수의 임펠러를 갖는 생물반응기에서 임펠러 사이의 거리는 고려되는 중요한 치수이다. 이중 Rushton 터빈(방사상 흐름)을 갖는 생물반응기에서 비가스처리된(ungassed) 동력 소비는, 이중 임펠러가 샤프트를 따라 0.5×D 보다 작은 거리일 때, 단일 임펠러와 동등하다. 2×D의 거리에서 동력 소비는 부가적으로 된다. 따라서 임펠러의 효율은 임펠러 거리가 0.5×D 보다 작게 될 때 감소하고 다중 임펠러의 필요성은 불필요하게 된다. 임펠러 간격이 생물반응기 내에 데드 존(불량 혼합된 영역)을 생성할 가능성에 영향을 미치기도 한다는 데 주목하는 것이 중요하다. 임펠러 거리의 선택에 대한 추가의 제약은 생물반응기 내에서 요구되는 별도의 작동 용적이다.
임펠러 거리, 1.229×Dbottom(1498 ㎜)의 Ds는, 상부 임펠러 위의 액체 헤드 Do가 0.5×Dtop(615 ㎜)이고 하부 간격 Dc가 0.75×Dbottom(913 ㎜)이면서, 양쪽 임펠러가 가장 낮은 접종-후 용적 17,392 리터에서 수면 아래에 유지되도록 허용한다.
표 5는 임펠러 위에서 액체 표면 또는 낮은 액체 커버를 형성하는 용적을 표시한다. 이들 임계 용적에서 거품 형성을 피하기 위해 교반은 변경될 필요가 있다.
표 5: 임펠러 및 액체 표면과 상호작용을 야기하는 핵심 작동 용적
상호작용 용적, L 잠재적 작동
0.5DA310 액체 커버를 갖는
수중 상부 임펠러		 17399 최소 접종후 용적 17391 L
상부 임펠러의 상부 가장자리에 접촉하는 액체 표면 13973 접종-전 용적 13913 L 액체 표면 파손
상부 임펠러의 하부 가장자리에 접촉하는 액체 표면 13283 접종-전 매체의 볼루스 부가가
이 액체 헤드를 통과할 것임
0.5DA315 액체 커버를 갖는
수중 하부 임펠러		 8381 접종-전 매체의 볼루스 부가가
이 액체 헤드를 통과할 것임.
하부 임펠러의 상부 가장자리에 접촉하는 액체 표면 5592 접종-전 매체의 볼루스 부가가
이 액체 헤드를 통과할 것임.
하부 임펠러의 하부 가장자리에 접촉하는 액체 표면 3291 접종-전 매체의 볼루스 첨가가
이 액체 헤드를 통과할 것임.
(1) 수중 하부 임펠러에서의 최소 작동 용적은 8379 리터이고 수중 양쪽 임펠러에서의 최소 작동 용적은 17399 리터이다.
(2) 작동 용적 범위는 13913 내지 21739 리터이다.
액체 표면 아래 상부 임펠러의 간격, Do .
액체 표면 위 임펠러 날의 파손은 임펠러의 동력 소산과 흐름을 무효하게 만들므로 바람직하지 않다. 또한, 이는 헤드스페이스 가스의 액체 및 과도한 거품으로의 중요한 표면 포집으로 인한 미지의 KLa 값을 생성할 것이다. Do는 방사상 흐름 임펠러의 경우 0.3×D이고 A310과 같은 축방향 흐름 임펠러의 경우 0.5×D이다. 그러나, Do가 2×D에 접근하면 임펠러는 온화한 혼합 사용을 제공한다. 이는 KLa 연구에서 생물반응기 KLa는 주로 하부 A315 임펠러에 의해 영향을 받고 상부 A310 임펠러는 벌크 혼합에 기여한다는 것이 나타났으므로 생산 생물반응기 응용에서 허용될 수 있다.
Dc 및 Ds의 값을 고정한 결과 Do는 생산 생물반응기 작동의 지속을 위한 최적 범위로 유지된다. 배치의 진행 동안 상부 임펠러 위의 액체 커버는 0.5×DA310 및 1.08×DA310으로부터 변화할 것이다. 상부 임펠러 위의 액체 커버는 일정한 pH를 유지하도록 생물반응기가 알칼리 및 영양소 공급을 받으면 증가할 것이다. 표 6은 작동 용적의 범위에 대한 상부 임펠러 위 액체 커버의 범위를 보여준다.
표 6: 핵심 작동 용적 및 상부 임펠러 위 액체 커버 Do
작동 용적, L 원통 높이, H ㎜ (인치) Do, ㎜ (인치) DA310의 비율로서의 Do
수확-전, 21739 L 3252 (128〃) 1324 (52〃) 1.08DA310
수확-전, 20000 L 2968 (117〃) 1040 (41〃) 0.85DA310
접종-후, 19231 L 2843 (112〃) 915 (36〃) 0.74DA310
접종-후, 17391 L 2543 (100〃) 615 (24〃) 0.5DA310
접종-전, 15385 L 2215 (87〃) 287 (11〃) 0.23DA310
접종-전, 13913 L 1973 (78〃) 45 (2〃) 0.04DA310
(1) 오프 하부 임펠러 간격, Dc = 913㎜ (0.75DA315), 임펠러 거리, Ds = 1498㎜ (1.229DA315), 2794㎜의 탱크 ID 및 ASME F&D 기부 플레이트의 높이, Hb = 483㎜
(2) Do = H -Ds - (Dc - Hb)
교반 속도 - rpm , P/V 및 팁 속도
아래 표 7은 20,000 리터 생물반응기의 교반 속도를 특정한다. 본 생물반응기는 통상 20-260 W/㎥, 바람직하게는 55-85 100 W/㎥으로 교반된다. 교반 전략은 500 리터 파일럿 발효 중에 개발될 것이다. 따라서 0 내지 80±1 rpm의 교반 속도가 작동 범위로서 사용된다.
표 7: 20,000 L 생물반응기에서의 교반 속도
교반 속도, rpm 단위 용적당 동력, W.m-3 팁 속도, m/s
접종-전 통상적으로 28-30
보다 높을 수 있음		 통상적으로 20
보다 높을 수 있음		 1.8 - 1.9
접종-후 수확까지 통상적으로 56,
80까지 될 수 있음		 통상적으로 103,
260까지 될 수 있음		 3.6
5.1까지 될 수 있음
기계적 밀봉 명세
생물반응기에서 모든 밀봉은 최대 “소모(run out)" 또는 동요 내성 0.2 ㎜를 갖는 이중 기계적 밀봉이다. 3 타입이 고려되며, 이들은 다음을 포함한다:
● 살균 응축수로 윤활되는 습식 밀봉.
● N2 또는 CA와 같은 살균 가스로 윤활되는 건식 밀봉.
● 비-윤활 또는 부유 밀봉으로 단-회전인 것.
모든 기계적 밀봉은 1년 기준으로 사용할 것이 권장된다. 이는 생물반응기로부터 밀봉의 제거 및 밀봉 조립품을 판매사에 보낼 것을 요구한다. 따라서, 디자인은 정기적인 유지의 용이성이 고려되어야 한다.
건식 타입 밀봉(John Crane - 528D 타입)은 1년 당 3g의 수지 함침된 카본으로 구성된 탈피(밀봉 면과 밀봉 시트 재료)를 생산할 것이다. 이는 1년 동안 연속적으로 24 시간 작동한 것을 기준으로 한다. 습식 밀봉에서 탈피의 양은 유의적으로 적다. 따라서, 습식 응축수-윤활된 밀봉이 모든 생물반응기 이중 밀봉에 채택된다.
생물반응기 통기 요구도 및 가스 처리 전략
20,000 리터 생물반응기의 통기 사용은 다음에 의해 좌우된다:
● KLa 요구.
● DOT 제어 전략.
● pCO2 제어/제거 전략.
● 소결 또는 플루트형 스퍼저의 사용.
본 20,000 리터 생물반응기는 5 mmol×L-1×h-1의 산소 섭취 속도의 공정에서 20 h-1까지의 KLa 값을 제공하도록 디자인된다. 본 생물반응기 디자인은 20×106 세포×mL-1에 도달하는 공정의 배양을 허용하기에 충분하도록 유연성이 있을 필요가 있다.
통기 요건은 많은 다른 접근에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 피크 산소 요구 동안 산소 이송 속도(OTR)의 어떠한 결손이라도 보충하기 위해 공기 및 산소가풍부한 플루트형 스퍼저가 사용되었다. 이러한 접근의 이점은 다음과 같다:
● 플루트형 스퍼저 디자인의 보다 용이한 CIP 및 SIP 인증.
● 용존 CO2 제거를 돕기 위한 보다 큰 공기 처리량.
● 단일 사용 소결 요소의 구매 회피를 통해 감소되는 작동 비용.
상기에서 선택된 접근의 단점 또한 고려될 필요가 있다. 이들은 다음을 포함한다:
● 선택된 저동력수 임펠러에서 고유의 낮은 KLa.
따라서, 생물반응기 통기 디자인은 원하는 KLa에 부합되도록 변경되는 유연성을 가져야 한다.
표 8은 20,000 리터 생물반응기에서의 가스처리 요건을 나타낸다. 가스 흐름 속도는 일정한 표면 가스 속도에서 확대되었다.
두 개의 스퍼저가 사용된다. 주 또는 “DOT 제어” 스퍼저는 이중 범위 세척 공기, 매스 흐름 제어기(MFC; mass flow controller) 및 산소 MFC가 산 pH 제어 루프를 통한 CO2 MFC 및 DOT 제어 루프를 통해 칭량되는 가스 흐름과 함께 공급된다. 이중 범위 MFC는 원하는 작동 범위의 극단에서 정확한 흐름 제어를 달성하기 위해 사용된다.
제 2 또는 "밸러스트" 스퍼저는 CA MFC에 의해 공급되고 여기에 질소도 공급된다. 조기 DOT 제어는 조기 DOT 요구에서 보조하기 위해 작은 질소 밸러스트를 요구하고 포인트 설정을 위해 DOT를 낮추도록 측정된다. 밸러스트 스퍼저는 또한 과도한 pCO2의 제거를 용이하게 하기 위해 밸러스트 공기를 칭량한다.
헤드스페이스 제거는 헤드스페이스로부터 CO2 및 산소의 제거를 허용하도록 사용된다. 이는 환경으로 배기 전에 보다 양호한 pH 및 pCO2 제어 및 높은 산소 혼합의 희석을 용이하게 한다. 헤드스페이스 흐름 속도를 변화시키는 능력은 산소 농축 및 제어 포인트 pCO2의 다른 혼합을 요구하는 다양한 공정을 위한 가스 처리 전략의 디자인을 허용한다.
표 8: 20,000 리터 생물반응기에서 가스 흐름 속도 및 MFC 작동 범위
가스 작동 범위 의견
헤드스페이스1
1) 깨끗한 공기
2) 질소
3) 헬륨
1) 0-1000 SLPM
2) 정격 이용
3) 정격 이용
1) CO2 및 O2의 헤드스페이스 제거
2) 신속한 DOT 프로브 영점 맞춤을 위해
3) 탱크 완전성 시험
DOT 제어 스퍼저
1) 깨끗한 공기2
2) 산소
3) 이산화탄소3
1) 10-500 SLPM
2) 10-100 SLPM
3) 2-150 SLPM
1) DOT 제어 하의 가스 흐름
2) DOT 제어 하의 가스 흐름
3) pH 제어 하의 가스 흐름
밸러스트 스퍼저
1) 깨끗한 공기
2) 질소4
1)20-500 SLPM
2) 20-500 SLPM
1) dCO2 제거를 위한 다양한 밸러스트
2) 다양한 흐름에 의한 조기 DOT 제어
(1) 헤드스페이스로의 공기 및 질소 가스 흐름은 post SIP 탱크 가압을 위해 우회로를 통해 들어간다.
(2) 각각 5-50 SLPM 및 50-500 SLPM에서 이중 CA MFC에 의해 달성되는 깨끗한 공기 가스 흐름 작동 범위.
(3) 각각 2-30 SLPM 및 30-150 SLPM에서 이중 CO2 MFC에 의해 달성되는 CO2 가스 흐름 작동 범위.
(4) 공통의 CA MFC로부터 칭량된 공기 및 질소 가스 흐름.
스퍼저 설치를 위한 생물반응기 출입구는 51 ㎜ 직경의 파이프 디자인에 맞추도록 디자인된다. 출입구의 위치는 제어 스퍼저의 배치(Dc-Sc)가 하부 임펠러의 하부 가장자리 아래 320 ㎜의 거리에서 탱크 바닥으로부터(Sc) 593 ㎜ 보다 크지 않도록 허용되어야 한다.
이는 593 ㎜ 또는 (0.65×Dc)의 Sc 값을 야기하고, 이는 허용되는 범위인 0.2×Dc 내지 0.6×Dc의 바깥에 있다. 그러나, 500 L에서 유체역학적 시도는 0.41 내지 0.71×Dc의 Sc 간격이 측정된 KLa에 영향이 없도록 제안한다.
밸러스트 스퍼저의 설치를 위한 분리된 출입구도 구축되었다. 이 출입구의 위치는 밸러스트 스퍼저의 배치가 하부 임펠러의 하부 가장자리 아래 (Dc-Sc) 320 ㎜의 거리에서 탱크 바닥으로부터(Sc) 593 ㎜ 보다 크지 않도록 허용한다. 분리된 스퍼저로부터 밸러스트를 부가하기 위한 요구는 다음 3 가지 이유에 기인한다:
● 첫째, 이것은 산소 또는 산소 풍부한 DOT 요구 가스가 밸러스트 가스로 희석되는 것을 방지한다. 이는 스퍼저로부터 나오는 거품의 산소 농도 구배가 최대로 되므로 최적 OTR을 보장한다.
● 둘째, 이것은 pCO2 제어를 위해 원하는 밸러스트를 전달하는 데 있어서 DOT 제어에 충격을 주는 것을 피하기 위해 밸러스트 스퍼저가 DOT 제어 스퍼저와 다른 위치에 배치되도록 허용한다.
● 셋째, 밸러스트 스퍼저는 DOT 제어 스퍼저와는 독립적으로 디자인될 수 있다.
구멍 크기 및 구멍의 개수의 계산은, 연쇄 거품 체계 동안 거품의 SMD (Sauter mean diameter)가 10-20 ㎜이고 구멍으로부터 나오는 가스의 표적 레이노드수, Re가 <2000일 때까지 반복된다. 표 9는 20,000 리터 생물반응기를 위한 밸러스트 스퍼저 및 제어의 핵심 명세를 보여준다.
표 9: 20,000 리터 생물반응기 스퍼저의 디자인 명세
변수 DOT 제어 스퍼저 밸러스트 스퍼저
가스 흐름, SLPM 850 500
스퍼저 구멍 개수 250 100
구멍 직경, do, m 0.004 0.006
가스 흐름, ㎥.s-1 1.42E-02 8.33E-03
구멍 면적, ㎡ 1.26E-05 2.83E-05
총 구멍 면적, ㎡ 3.14E-03 2.83E-03
공기 밀도, Kg.m-3 1.166 1.166
점도, Nm.s-2 1.85E-05 1.85E-05
SMD, dvs, ㎜ (dvs = 1.17 Vo 0 .4 do 0 .8 g-0.2) 16.34 19.06
중력가속도, g m.s-2 9.807 9.807
밀도 차이, Kg.m-3 1048.834 1048.834
레이노드수, >2000 제트 체계 1139 1117
스퍼저에서의 가스 속도, Vo, m/s 4.51 2.95
스퍼저 길이, SL, m 1.077 1.077
필요한 구멍을 뚫기 위한 전체 길이, m 1.000 0.6
길이 SL 안에 필요한 구멍을 맞추기 위한 열의 수 2 1
스퍼저 대 탱크 바닥 간격, Sc, m 0.593 0.593
스퍼저 대 하부 임펠러 간격, Dc-Sc, m 0.320 0.320
임펠러 허브가 아닌 날 아래 구멍을 분배하기 위해 0.8×Dbottom(하부 A-315 임펠러 직경의 80% 직경)의 링 스퍼저가 사용된다. 그러나, 이 구조의 설치 및 CIP는 어렵다. 따라서, 구멍을 분배하기에 최적으로 일치하는 방식으로 구멍의 원하는 개수의 분배를 허용하는 스퍼저 기하학의 선택 및 위생 디자인이 또한 사용될 수 있다.
선택으로서 일직선 파이프 보다는 초승달형이 분석된다. 초승달형의 곡률은 0.8×Dbottom이다. 생물반응기의 측면 출입구로부터의 제거 및 설치를 돕기 위해 초승달형의 원주는 0.8×Dbottom 링의 완전한 원주의 240°로, 이는 1077 ㎜이다.
DOT 제어 스퍼저는 1077 ㎜ 길이이고 51 ㎜ 직경을 갖는다. 구멍은 4 ㎜ 직경을 갖는다. 등쪽(수직)으로부터 45°에서 2열로 나뉜(2×125) 총 250 개의 구멍이 사용된다. 스퍼저의 양쪽 단부에 4 ㎜ 직경의 배수 구멍이 스퍼저의 배쪽에 뚫려 스퍼저의 자유로운 CIP 배수를 돕는다.
밸러스트 스퍼저는 1077 ㎜ 길이 및 51 ㎜ 직경이고 단일의 등쪽 열에 총 100 개의 6 ㎜ 직경의 구멍을 갖는다. 스퍼저의 양쪽 단부에 4 ㎜ 직경의 배수 구멍이 스퍼저의 배쪽에 뚫려 스퍼저의 자유로운 CIP 배수를 돕는다.
프로브의 위치, 부가 및 샘플 출입구
프로브 링 위치는 생물반응기의 잘-혼합되는 대표적 영역에 설치되어야 한다. 추가적인 고려 사항에는 작업 용적 범위 및 인체공학적 작동이 포함된다. 프로브 출입구, 샘플 밸브 및 부가 포인트의 위치는 일시적인 스파이크를 피하기 위해 함께 고려된다. 또한, 프로브 제어와 관련하여 샘플 밸브의 위치는 측정된 공정 변수의 오프-라인 확인의 정확한 추정을 허용할 필요가 있다. 이는 표 10에 나타낸다.
표 10: 20,000 리터 생물반응기의 프로브, 부가 및 샘플 출입구 명세
프로브/출입구 위치 2직경, ㎜ (인치) 1위치, ㎜ (인치) Rational
온도 (주) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1) 913 (36〃)
2) 30°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
온도 (백업) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1) 913 (36〃)
2) 170°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
pH (주) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1) 913 (36〃)
2) 10°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
pH (백업) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1) 913 (36〃)
2) 20°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
DOT (주) 하부 링 25.0 (0.98〃) 1) 913 (36〃)
2) 150°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
DOT (백업) 하부 링 25.0 (0.98〃) 1) 913 (36〃)
2) 160°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
pCO2(스페어) 하부 링 50.8 (2〃)tbd 1) 913 (36〃)
2) 20°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
생물량(스페어) 하부 링 50.8 (2〃) 1) 913 (36〃)
2) 160°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
스페어 프로브
출입구(DOT-타입)		 하부 링 25.0 (0.98〃) 1) 913 (36〃)
2) 150°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
스페어 프로브
출입구(pH-타입)		 하부 링 38.1 (1.5〃) 1) 913 (36〃)
2) 10°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
샘플 밸브 (주) 하부 링 12.7 (0.5〃) 1) 913 (36〃)
2) 40°		 NovAseptic
타입
샘플 밸브 (백업) 하부 링 12.7 (0.5〃) 1) 913 (36〃)
2) 50°		 NovAseptic
타입
알칼리 부가 1 -
탱크 1		 하부 링 50.8 (2〃) 1) 913 (36〃)
2) 190°		 pH 프로브
직경 반대쪽
알칼리 부가 2 -
탱크 1		 상부 임펠러
중심선		 50.8 (2〃) 1) 2411 (95〃)
2) 190°		 pH 프로브
직경 반대쪽
연속적 재료 공급
1 - 탱크 2		 하부 링 50.8 (2〃) 1) 913 (36〃)
2) 200°		 pH 프로브
직경 반대쪽
연속적 재료 공급
2 - 탱크 3		 하부 링 50.8 (2〃) 1) 913 (36〃)
2) 210°		 pH 프로브
직경 반대쪽
DOT 제어 스퍼저
구멍		 N/A 101.6 (4〃) 1) 593 (23〃)
2) 0°		 밸러스트 스퍼저
직경 반대쪽
밸러스트 스퍼저
구멍		 N/A 101.6 (4〃) 1) 593 (23〃)
2) 180°		 제어 스퍼저
직경 반대쪽
오버레이 가스 헤드
플레이트		 101.6 (4〃) 1) N/A
2) 135°		 배출구
직경 반대쪽
배기가스 배출구 임펠러
플랜지
플레이트		 50.8 (2〃) 1) N/A
2) 315°		 오버레이 가스 인
직경 반대쪽
수확 밸브 기부
플레이트		 76.2 (3.0〃) 1) N/A
2) 중앙		 자유로운 배출을 허용하는 NovAseptic 타입
소포제 부가 헤드
플레이트		 50.8 (2〃) 1) N/A
2) 170°		 액체 표면/탱크 중앙으로부터 0.25T
숏 재료 공급 1 -
LS1		 헤드
플레이트		 50.8 (2〃) 1) N/A
2) 190°		 액체 표면
숏 재료 공급 2 -
글루코스 숏		 헤드
플레이트		 50.8 (2〃) 1) N/A
2) 180°		 액체 표면
소량 부가 -
스페어		 헤드
플레이트		 50.8 (2〃) 1) N/A
2) 200°		 액체 표면 -
용기 벽으로 향함
배지 입구 헤드
플레이트		 101.6 (4〃) 1) N/A
2) 310°		 용기 벽으로 향한 노즐
4000L에서 20000L
까지 접종물 이송		 헤드
플레이트		 101.6 (4〃) 3) N/A
4) 320°		 용기 벽으로 향한 노즐
CIP - 스프레이 볼 임펠러
플랜지
플레이트		 76.2 (3〃) 1) N/A
2) 270°		 최고점의 CIP'ing
CIP - 스프레이 볼 헤드
플레이트		 76.2 (3〃) 1) N/A
2) 60°		 CIP 디자인에 따름
CIP - 스프레이 볼 헤드
플레이트		 76.2 (3〃) 1) N/A
2) 180°		 CIP 디자인에 따름
CIP - 스프레이 볼 헤드
플레이트		 76.2 (3〃) 1) N/A
2) 300°		 CIP 디자인에 따름
압력 지시 전송기
(PIT)		 헤드
플레이트		 38.1 (1.5〃) 1) N/A
2) 60°		 용기 판매사 디자인에
따름
압력 게이지 헤드
플레이트		 38.1 (1.5〃) 1) N/A
2) 50°		 용기 판매사 디자인에
따름
파열 디스크 헤드
플레이트		 101.6 (4〃) 1) N/A
2) 280°		 용기 판매사 디자인에
따름
스페어 노즐 헤드
플레이트		 101.6 (4〃) 1) N/A
2) 160°		 용기 판매사 디자인에
따름
검사 유리창 헤드
플레이트		 101.6 (4〃) 1) N/A
2) 70°		 용기 판매사 디자인에
따름
광 유리 헤드
플레이트		 76.2 (3〃) 1) N/A
2) 75°		 용기 판매사 디자인에
따름
통로 헤드
플레이트		 457.2 (18〃) 1) N/A
2) 90°		 인원 출입
교반기 헤드/
플랜지		 헤드
플레이트		 1320.8 (52〃) N/A 출입/제거
임펠러 샤프트 및
밀봉 통로		 교반기 헤드/
플랜지		 304.8 (12〃) N/A 출입/제거
(1) 바닥 플레이트의 탄젠트 라인으로부터 측정됨. 각도는 시계방향 회전 면과 관련된다.
(2) 생물반응기에서 노즐의 직경
부가 출입구, 표면 및 표면-아래
액체 표면 및 표면아래에서 끝나는 부가 출입구를 결정할 필요성은 공정 제어에서 재료 공급 전략의 효과 및 작동 시나리오에 의해 결정된다.
현재 무단백질 공정은 생물반응기의 잘-혼합된 영역에서 배출될 필요가 있는 두 개의 연속적 재료 공급을 갖는다. 글루코스 및 “LS1-타입” 숏(shot) 부가를 위한 부가 설비는 또한 잘 혼합된 영역에서 통합된다. 거품은 1/10 희석된 C-유제의 표면 부가에 의해 제어된다. 접종-전 생물반응기로 시드(seed)의 접종은 배지의 표면으로 배양물이 떨어지면서 일어날 거품의 형성을 막는 것에 의해 제공된다. 다음 출입구가 디자인된다:
● 배지 입구, 접종물 입구, 다른 것들이 탱크 벽으로부터 떨어진 액체 표면 위로 떨어지는 동안 용기의 벽으로 향하는 하나의 작은 부가 입구를 갖는 6 개의 표면 부가.
● 두 개의 재료 공급 탱크로부터의 입구 및 알칼리 탱크로부터의 이단식 입구로 구성되는 4 개의 표면 부가.
샘플 출입구
샘플 출입구 디자인은 대표적인 샘플이 생물반응기로부터 채취되는 것을 허용한다. 따라서, 어떠한 잔류물도 가능한 한 적어야 한다. 채취된 샘플은 용존 가스, pH, 영양소 및 생물량 농도의 오프라인 검사를 결정하기 위해 사용된다. 출입구 개구의 구멍은 체질(sieving)이 생물량 응집의 유지를 야기하는 것을 방지하기 위해 충분히 크다. 2 ㎜ 구멍 NovaSeptum 샘플링 도구가 사용되었다. 그러나, 이것은 출입구의 잔류 용적을 낮게 유지하기 위한 의도와 균형을 이루어야 한다. 출입구는 오프-라인 검사에 의하여 입증될 필요가 있고 노즐 위치를 통해 결정될 프로브에 인접한 잘-혼합된 영역에 위치할 필요가 있다(표 10 참조).
부가 탱크
비용과 시간을 절감하기 위해, 생물반응기에 공급하는 부가-탱크는 모듈식 디자인의 것이다. 생산 생물반응기는 3 개의 2500 리터 표시 용적의 부가 탱크를 갖는다. 부가 탱크는 25 L/min으로 채워진다. 부가 탱크로부터 생물반응기로의 재료 공급 유속은 시간 당 접종-후 생물반응기 용적 리터 당 0.2 내지 1.0 밀리리터의 재료 공급으로 제어된다(㎖/ℓ/h). 재료 공급 속도는 ±5%의 설정점으로 제어될 것이 기대된다.
생산 생물반응기는 세 개의 3 개의 1372 ㎜ ID × 1880 ㎜ 부가 탱크에 의해 운전된다. 이들 탱크는 독립적으로 및 생산 생물반응기와 함께 세척 및 살균될 용량을 갖는다.
통로
생물반응기로의 접근은 어떤 운전 작동을 위해 요구된다. 접근은 플랜지 헤드 플레이트를 고려하거나 헤드 플레이트로의 통로 도입에 의해 얻어질 수 있다. 생물반응기 접근의 필요성은 다음과 같다:
● 임펠러의 설치.
● 임펠러 및 임펠러 샤프트의 설치 및 교체.
● 기계적 밀봉의 설치 및 교체.
● 용기 기구의 수리.
● 원하는 유체역학적 특성을 얻기 위한 스퍼저 위치의 변경 가능성.
통로의 크기는 상기 목적을 위한 접근을 허용하기에 충분해야 한다. 사용되는 통로는 1219 ㎜ 직경의 두 개의 임펠러의 제거를 허용하기에 충분한 직경의 것이다.
용적 측정
본 디자인은 어떠한 센서라도 작동 범위 주변에서 용적 측정에 충분한 정확성을 부여하는 것을 보장한다.
생물반응기에서 용적 측정은 13,000 내지 25,000 리터 범위를 측정할 수 있다. 센서 감도는 전체 범위의 적어도 0.5%일 필요가 있다.
재료 공급 부가-탱크 및 알칼리 탱크에서의 용적 측정은 각각 0 내지 2200 및 2500 리터를 측정할 수 있다. 센서 감도는 전체 범위의 적어도 0.2%일 필요가 있다. 이것은 부가 탱크에서 용적 감소를 측정하는 것에 의해 시간 당 3.5ℓ 또는 시간 당 0.2 ㎖/ℓ의 최소 유속에서 재료 공급 유속의 매시간 검증을 허용할 것이다.
생물반응기 온도 제어
배지는 공정 제어에 의해 작동 온도 및 pH로 된다. 이것은 (용기 벽의 고온을 피하기 위해) 재킷의 “온화한” 가열에 의해 달성된다. 작동 중 온도 제어 범위는 설정점에서 ±0.2 ℃의 정확도로 36 내지 38 ℃이다.
재킷(Jacket)
생물반응기 재킷 면적은 다음 사항을 고려하여 특정된다:
● 121-125 ℃에서의 증기 살균.
● <2h에 10 ℃로부터 36.5 ℃까지 배지의 가열.
● 생물반응기 내의 모든 점은 열전대에 의해 측정시 설정점의 ±0.2 ℃, 통상적으로 36.5 ℃에 도달하여야 한다.
● <2h에 36.5 ℃로부터 10 ℃까지 배지의 냉각.
생물반응기 pH 제어
공정 pH는 전송기를 통해 DCS 베이스의 공정 제어기로 연결된 프로브에 의해 모니터링 및 제어된다. 이 공정은 설정점으로 pH를 낮추기 위한 CO2의 부가 및 설정점으로 pH를 올리기 위한 알칼리의 부가에 의해 제어된다. pH는 설정점의 ±0.03으로 제어된다.
알칼리는 알칼리를 분배하기 위한 두 개의 부가점을 통해 부가된다. 이는 탱크 내 긴 재순환 시간의 경우, 보다 신속한 알칼리의 혼합을 보장한다. CO2는 제어 스퍼저를 통해 부가된다.
제어 및 백업 프로브는 탱크 바닥으로부터 913 ㎜(표 10 참조)에 하부 출입구 링에 위치한다. 추가로, pH 프로브는 생물반응기로의 알칼리 부가점과 직경 반대쪽에 위치한다.
생물반응기 DOT 제어
용존 산소는 전기분해자동기록기의 DOT 프로브(polarographic DOT probe)로 모니터링 및 제어된다. DOT 설정점은 다음의 분사에 의해 유지된다:
● 요구시 초기 N2 밸러스트 및/또는 공기.
● 요구시 공기와 함께 공기 밸러스트.
● 요구시 산소와 함께 공기 밸러스트.
● 일단 산소 요구 감소시 가스 사용 역전.
캐스케이드 DOT 제어는 DOT 설정점이 교반기 속도의 증가와 관련된 요구 가스 및 밸러스트에서의 변화를 통해 유지되도록 허용한다.
pCO2를 제어하기 위해서는, 과도한 dCO2를 제거하는 데 필요한 밸러스트가 DOT 제어에 영향을 준다. 따라서, DOT 제어는 대사성 CO2가 해방되는 공정을 위한 pCO2 제어와 함께 고려된다. DOT는 설정점의 ±2%에서 제어된다. 제어 및 백업 프로브는 탱크 바닥으로부터 913 ㎜에 하부 출입구 링에 위치한다.
생물반응기 용존 CO 2 제어
공정 dCO2는 pCO2 프로브로 모니터링되고 과잉 dCO2는 밸러스트 스퍼저를 통해 CA 가스처리 하는 것에 의해 제거된다. 이 프로브의 최적 위치는 pH 프로브 근처이다.
공급재료 부가 제어( Feed addition control )
공급재료(SF22 및 아미노산)는 pH 및 삼투압이 높다. 따라서, 양호한 pH 제어를 유지하기 위하여 볼루스 부가는 피할 필요가 있다. 그러나, 원하는 유속(설정점의 ±5%)의 제어는 기술적으로 어렵다. 따라서, 전달 모드에서 부가 점을 포함하는 부가 전략은 공급 재료 볼루스의 순환 및 pH 제어의 변경 가능성을 회피한다.
따라서, 부가 점은 공급 재료 볼루스의 신속한 혼합을 돕기 위해 탱크 바닥으로부터 913 ㎜에 있는 하부 임펠러의 중심선의 평면에 있다.
소포제 부가 제어
소포제(C-유제) 부가는 생물반응기 액체 표면을 거품이 없이 유지하기 위해 요구되는만큼 부가된다. 1/10 희석된 C-유제의 작업 저장액이 액체 표면에 투여될 수 있다. 소포제 현탁액은 분획을 방지하기 위해 저장 용기에서 연속적으로 교반된다. 소포제가 부착될 탱크 벽으로 소포제를 운반하는 액체 흐름의 방사상 성분의 효과를 감소시키기 위해 소포제를 탱크의 중앙 가까이 투여하는 것이 중요하다. 따라서, 부가 점은 탱크 중앙을 향하여 0.25×T 또는 탱크 중앙으로부터 699 ㎜이다.
실시예 2: 4000 L 생물반응기
용기 기하학
4000 리터 생물반응기의 용기 기하학은 최대 작동 용적, 여유고 직선측 거리, 길이직경비(HL/T) 및 임펠러 대 탱크 직경 비율(D/T)이 적절한 길이직경비가 달성될 때까지 변경되는 반복 디자인 베이스로 결정되었다.
생물반응기 길이직경비 H L /T
표 11은 여러 작동 용적에서 정상적인 공정 중 4000 리터 생물반응기의 길이직경비를 기술한다. 이들 길이직경비는 탱크 ID의 선택 및 요구되는 작동 용적으로부터 나온다. 공정 처리 관점으로부터, 3 가지 작동 조건에서의 혼합 요구도는 다르다. 접종 전 단계 동안 생물반응기 혼합은 배지가 최소 KLa 요구와 평형을 이루도록 허용하는 것이 중요하다. 그러나, 접종-후 및 이송-전 단계에서는 혼합과 KLa 둘 다 중요한 고려사항이다. 따라서, 이들 특성 모두를 길이직경비 범위에서 시험하였다.
표 11: 4000 리터 생물반응기에서 핵심 작동 용적과 길이직경비
용적, L 액체 헤드, ㎜ 길이직경비, HL/T
접종-전 1) 1914
2) 2782
3) 3077		 1) 1031
2) 1448
3) 1590		 1) 0.63
2) 0.89
3) 0.98
접종 후 &
이송-전		 1) 2153
2) 3478
3) 3846		 1) 1146
2) 1783
3) 1960		 1) 0.70
2) 1.10
3) 1.21
탱크 직경
탱크 직경은 최적 길이직경비 HL/T를 얻기 위해 변경된다. 탱크 내부 직경의 변화는 허용되는 길이직경비와 플랜트 풋프린트에 의하여 제한된다. ID는 1626 ㎜이다.
탱크 높이
탱크 높이는 최대 작동 용적, 길이직경비 HL/T, 여유고 직선측 길이, 하부 및 상부 플레이트 디자인으로부터 결정된다. 최종 탱크 높이는 거품, 플랜트 높이 및 허용되는 임펠러 샤프트 길이를 위한 예비 용적으로부터 결정된 절충 값이다. 헤드에서 기부까지 탄젠트 라인 높이는 2817 ㎜이다.
여유고 높이
본 시드 생물반응기에서는 여유고 높이 500 ㎜(최대 작동 용적의 27%v/v 또는 1039 리터)가 사용된다.
헤드 및 기부 플레이트
기부 및 헤드 플레이트 디자인은 이러한 시드 생물반응기를 위한 ASME F&D 디자인이다.
생물반응기 교반 요구도
생물반응기의 교반은 신속한 혼합을 달성하고, 균질성을 유지하고, 포유류 세포를 현탁액 및 가스 거품 분산액 중에 유지하기 위한 것이다. 상기 목적을 달성하는 데 내포된 문제는 임펠러 기하학으로부터 발생하는 전단력 및 임펠러 날 뒤에 생성되는 와류 또는 소용돌이를 통한 세포 손상을 최소화하는 것이다. 상기 목적의 절충은 적절한 임펠러 타입의 선택에 의해 달성될 수 있다.
하부 대 상부 구동 임펠러 샤프트
모터 구동은 이미 강조된 이점을 위해 상부 장착된다.
배플
중앙에 장착된 임펠러의 배플 요구도는 소용돌이 형성을 방지하는 데 중요하다. 배플과 관련된 중요한 문제는 배플 수, 배플 폭(W), 배플 길이(Hbaffle) 및 배플 대 탱크 벽 간격(Wc)이다.
0.1×T 또는 163 ㎜ 폭, 1.1×H-Hh 또는 2195 ㎜ 길이 및 배플 대 탱크 벽 간격 Wc가 0.01×T 또는 16 ㎜인 4 개의 동일 간격 배플이 사용된다.
배플의 두께는 특정되지 않지만 유체 흐름의 방사상 요소에 대한 강성을 보장할 필요가 있다. 또한, 두께는 배플 플레이트가 SIP 중에 뒤틀리지 않아서 배플 대 탱크 벽 간격에 영향을 주지 않을 필요가 있다.
임펠러 타입, 크기 및 개수
본 생물반응기의 임펠러는 20,000 리터 용기와 동일하게 형성되고 동일한 D/T 비율 0.44를 갖는다. 하부 임펠러는 직경 710 ㎜에 Lightnin's A315이고 상부 임펠러는 직경 710 ㎜에 Lightnin's A310이다.
임펠러 간격 D c , D s 및 D o
상부 임펠러의 중심선과 하부 임펠러의 중심선 사이의 임펠러 간격 Ds는 1.229×Dbottom 또는 872 ㎜이다. 하부 임펠러 간격 Dc는 0.75×Dbottom 또는 531 ㎜이다. 이것은 상부 임펠러 위의 액체 헤드(Do)가 0.5×Dtop 또는 358 ㎜이면서, 하부 임펠러가 가장 낮은 접종-후 용적 2153 리터에서, 그리고 양쪽 임펠러가 3367 리터에서 수면 아래에 잠기도록 허용한다.
표 12는 임펠러 위에서 액체 표면 또는 낮은 액체 커버를 형성하는 용적을 표시한다. 이들 임계 용적에서 거품 형성을 피하기 위해 교반은 변경될 수 있다.
표 12: 임펠러 및 액체 표면과 상호작용을 야기하는 핵심 작동 용적
상호작용 용적, L 잠재적 작동
0.5DA310 액체 커버를 갖는
침수 상부 임펠러		 3433 1/5 공정의 접종 중 보이는 용적
상부 임펠러의 상부 가장자리에 접촉하는 액체 표면 2758 1/5 공정의 접종-전 충전 중 보이는 용적
상부 임펠러의 하부 가장자리에 접촉하는 액체 표면 2621 1/5 공정의 접종-전 충전 중 보이는 용적
0.5DA315 액체 커버를 갖는
침수 하부 임펠러		 1654 1/5 공정의 접종-전 충전 중 보이는 용적
하부 임펠러의 상부 가장자리에 접촉하는 액체 표면 1104 1/5 및 1/9 공정의 접종-전 충전 중 보이는 용적
하부 임펠러의 하부 가장자리에 접촉하는 액체 표면 650 1/5 및 1/9 공정의 접종-전 충전 중 보이는 용적
(1) 하부 임펠러가 침수되는 최소 작동 용적은 1654 리터이고 양쪽 임펠러가 침수되는 최소 작동 용적은 3433 리터이다.
(2) 작동 용적 범위는 1914 내지 3846 리터이다.
4000 L 생물반응기는 2 가지 별개의 접종-후 용적에서 작동할 수 있는데, 하나의 하부 임펠러가 물에 잠기거나( 1/9 식종(seeding) 공정의 배양 중) 양쪽 임펠러가 물에 잠기며(1/5 식종 공정 중), 표 13은 그 작동 중 상부 및 하부 임펠러에서 얻어지는 액체 커버를 보여준다.
하부 A315 임펠러 위 0.67 내지 0.82×Dbottom의 액체 커버는 1/9 식종 공정의 배양 중에 관찰된다. 이것은 0.5 내지 1×D의 권장사항 이내이다.
상부 A310 임펠러 위 0.06 내지 0.78×Dtop의 액체 커버는 1/5 식종 공정의 배양 중에 관찰된다. 하부 액체 커버는 권장사항 밖이다. 그러나, 이 액체 커버는 혼합과 교반이 덜 중요할 때 접종-전 동안 관찰된다.
표 13: 핵심 작동 용적 및 상부 임펠러 위 액체 커버 Do 및 하부 임펠러 DBo
작동 용적, L 원통 높이,
H (㎜)		 Do, ㎜ DBo, ㎜ DA310의 비율로서의 Do DA315의 비율로서의 DBo
접종-후 및
이송-전, 2153 L		 863 또는
34〃		 - 614 또는
24〃		 - 0.82DA315
접종-후 및
이송-전, 3478 L		 1501 또는
59〃		 380 또는
15〃		 - 0.53DA310 -
접종-후 및
이송-전, 3846 L		 1678 또는
66〃		 557 또는
22〃		 - 0.78DA310 -
접종-전, 1914 L 748 또는
29〃		 - 499 또는
20〃		 - 0.67DA315
접종-전, 2782 L 1166 또는
46〃		 45 또는
2〃		 - 0.06DA310 -
접종-전, 3077 L 1308 또는
52〃		 187 또는
7〃		 - 0.26DA310 -
(1) 오프 하부 임펠러 간격, Dc = 531㎜ (0.75DA315), 임펠러 거리, Ds = 872㎜ (1.229DA315), 1626㎜의 탱크 ID 및 ASME F&D 기부 플레이트의 높이, Hh = 282㎜
(2) Do = H - Ds - (Dc - Hh) 및 DBo = H - (Dc - Hh)
교반 속도 - rpm , P/V 및 팁 속도
아래 표 14는 4000 리터 생물반응기의 교반 속도를 특정한다. 본 생물반응기는 통상 20-260 W/㎥, 바람직하게는 55-85 W/㎥으로 교반된다. 교반 전략은 500 리터 파일럿 발효 중에 개발되었다. 따라서 0 내지 88±1 rpm의 교반 속도가 작동 범위로 사용된다.
표 14: 4000 L 생물반응기에서의 교반 속도
교반 속도, rpm 단위 용적 당 동력, W/㎥ 팁 속도, m/s
10-88 0-150 0.0-3.3
20-86 0-150 0.0-3.2
(1) 양쪽 임펠러가 침수될 때
(2) 하부 임펠러가 침수될 때
기계적 밀봉 명세
응축수 윤활되는 이중 기계적 밀봉이 상기와 같이 사용된다.
생물반응기 통기 요구도
표 15는 4000 리터 생물반응기에서 접종 팽창 중 DOT 및 pH 제어를 위한 일정한 표면 가스 속도의 증가에 기초한 가스 흐름을 보여준다. 산소는 DOT 제어에 요구되지 않는다. 그러나, 산소 풍부 공기는 과도한 거품 형성을 방지하기 위해 하부 가스처리를 용이하게 하도록 사용될 수 있다. 더 작은 범위의 N2 MFC는 초기 DOT 제어 및 일탈된 높은 수준의 DOT를 감소시키기 위해 질소를 공급할 것이 권장된다.
표 15: 4000 리터 생물반응기에서 가스 흐름 속도 및 MFC 작동 범위
가스 작동 범위 의견
헤드스페이스1
1. 깨끗한 공기
2. 질소
3. 헬륨
1. 0-200 SLPM
2. 정격 이용
3. 정격 이용
1) CO2 및 O2의 헤드스페이스 제거
2) 신속한 DOT 프로브 영점 맞춤을 위해
3) 탱크 완전성 시험
제어 스퍼저
1. 깨끗한 공기1
2. 산소
3. 이산화탄소
4. 질소2
5. 헬륨
1. 10-60 SLPM
2. 1.0-10 SLPM
3. 1.0-20 SLPM
4. 2.0-15 SLPM
5. 정격 이용
1. DOT 제어 하의 가스 흐름
2. DOT 제어 하의 가스 흐름
3. pH 제어 하의 가스 흐름
4. 밸러스트에 의한 초기 DOT 제어
5. 탱크 완전성 시험
(1) 공기 및 질소 가스 흐름은 SIP 탱크 가압 후를 위해 우회로를 통해 생물반응기로 들어간다.
(2) 질소는 2 내지 15 SLPM N2 MFC를 통해 전달되고 초기 DOT 제어 중에 사용될 수 있다.
홈이 있는 스퍼저에서 구멍 크기 및 구멍 개수의 계산은, 연쇄 거품 체계에서 Sauter 평균 거품 직경이 약 10 ㎜이고 구멍으로부터 나오는 가스의 표적 레이노드수가 <2000일 때까지 반복된다.
표 16은 4000 리터 생물반응기를 위한 핵심 스퍼저 디자인 명세를 보여준다. 568 ㎜의 스퍼저 길이 SL은 파이프 기하학을 위해 결정된다. 구멍은 A315 허브 바로 아래에서 가스가 나오는 것을 방지하기 위해 스퍼저의 어느 한 단부에 분배된다. 또는, 초승달형 기하학이 사용될 수도 있다. 파이프 직경은 원하는 구멍 개수의 공간배치를 돕기 위해 선택된다. 직경은 38 ㎜이다. 스퍼저의 자유로운 CIP 배수를 돕기 위해 배쪽 표면에 위치한 단일의 2 ㎜ 구멍을 갖는 스퍼저의 등쪽 표면에 100 개의 2 ㎜ 구멍이 위치한다.
스퍼저 설치를 위한 생물반응기 출입구는 38 ㎜ 직경의 파이프 디자인에 맞추도록 디자인된다. 출입구의 위치는 제어 스퍼저의 배치가 하부 임펠러의 하부 가장자리 아래 Dc-Sc 194 ㎜의 거리에서 탱크 바닥으로부터 Sc 337 ㎜ 보다 크지 않도록 허용한다.
표 16: 4000 리터 생물반응기 스퍼저의 디자인 명세
변수 제어 스퍼저
가스 흐름, SLPM 105
스퍼저 구멍 개수 100
구멍 직경, do, m 0.002
가스 흐름, ㎥.s-1 1.75E-03
구멍 면적, ㎡ 3.14E-06
총 구멍 면적, ㎡ 3.14E-04
공기 밀도, Kg.m-3 1.166
점도, Nm.s-2 1.85E-05
SMD, ㎜ (dvs = 1.17 Vo 0 .4 do 0 .8 g-0.2) 10.21
중력가속도, g, m.s-2 9.807
밀도 차이, Kg.m-3 1048.834
레이노드수, >2000 제트 체계 704
스퍼저에서의 가스 속도, Vo, m/s 5.57
스퍼저 길이, SL, m 0.568
필요한 구멍을 뚫기 위한 전체 길이, m 0.2
길이 SL 안에 필요한 구멍을 맞추기 위한 열의 수 1
스퍼저 대 탱크 바닥 간격, Sc, m 0.337 (13〃)
스퍼저 대 하부 임펠러 간격, Dc-Sc, m 0.194 (8〃)
프로브의 위치, 부가 및 샘플 출입구
프로브, 부가 및 샘플 출입구의 배치를 위한 디자인 근거는 실시예 1에서 다루고 표 17에 열거된다.
표 17: 4000 리터 생물반응기의 프로브, 부가 및 샘플 출입구 명세
프로브/출입구 위치 2직경, ㎜ (인치) 1위치, ㎜ (인치) Rational
온도 (주) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1) 531 (21〃)
2) 30°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
온도 (백업) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1) 531 (21〃)
2) 170°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
pH (주) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1) 531 (21〃)
2) 10°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
pH (백업) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1) 531 (21〃)
2) 20°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
DOT (주) 하부 링 25.0 (0.98〃) 1) 531 (21〃)
2) 150°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
DOT (백업) 하부 링 25.0 (0.98〃) 1) 531 (21〃)
2) 160°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
스페어-1
(영양소)		 하부 링 25.0 (0.98〃) 1) 531 (21〃)
2) 170°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
스페어-2
(pCO2)		 하부 링 38.1 (1.5〃) 1) 531 (21〃)
2) 180°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
스페어-3
(생물량)		 하부 링 50.8 (2〃) 1) 531 (21〃)
2) 190°		 하부 임펠러의
중심선의 평면
샘플 밸브 (주) 하부 링 12.7 (0.5〃) 1) 531 (21〃)
2) 40°		 NovAseptic
타입
알칼리 부가 하부 링 50.8 (2〃) 1) 531 (21〃)
2) 190°		 pH 프로브
직경 반대쪽
재료 공급 1 하부 링 50.8 (2〃) 1) 531 (21〃)
2) 200°		 pH 프로브
직경 반대쪽
재료 공급 2 하부 링 50.8 (2〃) 1) 531 (21〃)
2) 210°		 pH 프로브
직경 반대쪽
소포제 부가 헤드
플레이트		 50.8 (2〃) 1) N/A
2) 170°		 액체 표면/탱크 중앙으로부터 0.25T
스페어 표면 부가 헤드
플레이트		 50.8 (2〃) 3) N/A
4) 180°		 용기 벽을 향한 액체 표면
DOT 제어 스퍼저
구멍		 N/A 50.8 (2〃) 1) 337 (13〃)
2) 0°
오버레이 가스 헤드
플레이트		 101.6 (4〃) 1) N/A
2) 135°		 배출구
직경 반대쪽
배기가스 배출구 헤드
플레이트		 50.8 (2〃) 1) N/A
2) 315°		 오버레이 가스 인
직경 반대쪽
이송 밸브 기부
플레이트		 76.2 (3.0〃) 1) N/A
2) 중앙		 자유로운 배출을 허용하는 NovAseptic 타입
1000L에서 4000L
까지 접종물 이송		 헤드
플레이트		 101.6 (4〃) 1) N/A
2) 320°		 용기 벽으로 향함
배지 입구 헤드 플레이트 101.6 (4〃) 3) N/A
4) 310°		 용기 벽으로 향함
CIP - 스프레이 볼 임펠러 플랜지
플레이트		 76.2 (3〃) 1) N/A
2) 270°		 최고점의 CIP'ing
CIP - 스프레이 볼 헤드
플레이트		 76.2 (3〃) 1) N/A
2) 60°
CIP - 스프레이 볼 헤드
플레이트		 76.2 (3〃) 1) N/A
2) 180°
CIP - 스프레이 볼 헤드
플레이트		 76.2 (3〃) 1) N/A
2) 300°
압력 지시 전송기
(PIT)		 헤드
플레이트		 38.1 (1.5〃) 1) N/A
2) 60°
압력 게이지 헤드
플레이트		 38.1 (1.5〃) 1) N/A
2) 50°
파열 디스크 헤드
플레이트		 101.6 (4〃) 1) N/A
2) 280°
스페어 노즐 헤드
플레이트		 101.6 (4〃) 1) N/A
2) 160°
검사 유리창 헤드
플레이트		 101.6 (4〃) 1) N/A
2) 70°
광 유리 헤드
플레이트		 76.2 (3〃) 1) N/A
2) 75°
교반기
헤드/플랜지		 헤드
플레이트		 813 (32〃) N/A 출입/제거
임펠러 샤프트 및
밀봉 통로		 교반기
헤드/플랜지		 152 (6〃) N/A 출입/제거
(1) 기부 플레이트의 탄젠트 라인으로부터 측정됨. 각도는 시계방향 회전 면과 관련된다.
(2) 생물반응기에서 노즐의 직경
부가 출입구, 표면 및 표면-아래
액체 표면에서 종료되는 표면 아래의 부가 출입구를 결정할 필요성은 공정 제어에서 재료 공급 전략의 효과 및 작동 시나리오에 의해 결정된다.
4000 리터 생물반응기는 생물반응기의 잘-혼합된 영역에서 배출될 필요가 있는 알칼리 및 두 가지 표면 아래 재료 공급을 허용하도록 디자인된다. 거품은 1/10 희석된 C-유제의 표면 부가에 의해 제어된다. 용기 벽으로 향하는 표면 부가 출입구 위 하나의 스페어가 또한 이후의 유연성을 위해 디자인된다. 시드 생물반응기의 접종 중 배지의 표면으로 배양물이 튀는 것은 피할 수 있어 거품의 형성이 방지된다. 따라서, 접종물 부가 출입구는 표면 위에 있고 용기 벽을 향한다. 기부 플레이트에서 수확 출입구의 사용은 접종물의 이송 중 접종물의 제거를 위한 이상적인 출입구이다. 추가로, 배지 부가 출입구는 용기 벽을 향한다. 요약하면 총 부가 출입구는 다음과 같다:
● 배지 입구, 접종물 입구, 및 용기의 벽으로 향하는 작은 스페어 부가 및 용기 벽으로부터 떨어진 액체 표면으로 소포제를 떨어뜨리기 위한 부가 출입구를 갖는 4 개의 표면 부가.
● 재료 공급 및 알칼리를 위한 3 개의 표면 부가.
샘플 출입구
샘플 출입구 디자인은 20,000 리터 생물반응기에서 설명한 것과 유사하다.
용적 측정
높이 센서는 전체 범위의 ±0.5% 정확성을 갖고 4000 리터까지를 측정할 수 있다.
생물반응기 온도 제어
공정 제어에 의해 1914 내지 3077 리터의 배지가 작동 온도, 통상적으로 36.5℃로 된다. 이것은 용기 벽의 고온을 피하기 위해 재킷의 온화한 가열에 의해 달성된다.
재킷
생물반응기 재킷 면적은 다음 사항을 고려하여 특정된다:
● 121-125 ℃에서의 증기 살균.
● <2h에 10 ℃로부터 36.5 ℃까지 1914-3077 리터 배지의 가열.
● 생물반응기 내의 모든 점은 열전대에 의해 측정시 설정점의 ±0.2 ℃, 통상적으로 36.5 ℃에 도달하여야 한다.
● <2h에 36.5 ℃로부터 10 ℃까지 1914-3077 리터 배지의 냉각.
생물반응기 pH 제어
공정 pH는 전송기를 통해 DCS 베이스의 공정 제어기로 연결된 프로브에 의해 모니터링 및 제어된다. 이 공정 pH는 설정점으로 pH를 낮추기 위한 CO2의 부가 및 설정점으로 pH를 올리기 위한 알칼리의 부가에 의해 제어된다.
알칼리는 하부 임펠러의 중심선에서 적어도 하나의 표면아래 출입구를 통해 부가된다. CO2는 제어 스퍼저를 통해 부가될 것이다.
제어 및 백업 프로브는 표 17에 나타낸 바와 같이 탱크 바닥으로부터 531 ㎜에 하부 출입구 링에 있다.
생물반응기 DOT 제어
용존 산소는 전기분해자동기록기의 DOT 프로브로 모니터링 및 제어된다. DOT 설정점은 다음의 분사에 의해 유지된다:
● 요구시 초기 N2 밸러스트 및/또는 공기.
● 요구시 공기와 함께 공기 밸러스트.
● 요구시 산소와 함께 공기 밸러스트.
DOT 제어는 DOT 설정점이 요구 가스로서 공기 또는 산소의 호환성 사용을 통해 유지되도록 허용한다. pCO2 제어가 접종 생물반응기에 요구된다고는 예상되지 않는다. 제어 및 백업 프로브는 표 17에 나타낸 바와 같이 탱크 바닥으로부터 531 ㎜에 하부 출입구 링에 있다.
공급재료 부가 제어
부가 점은 공급재료 볼루스의 신속한 분산을 돕기 위해 탱크 바닥으로부터 531 ㎜에 있는 하부 임펠러 중심선의 평면에 있다.
소포제 부가 제어
부가 점은 탱크 중앙을 향하여 0.25×T 돌출되는 표면 또는 탱크 중앙으로부터 407 ㎜에 있다.
실시예 3: 1000 리터 생물반응기 명세
용기 기하학
1000 리터 생물반응기의 용기 기하학은 최대 작동 용적, 여유고 직선측 거리, 길이직경비(HL/T) 및 임펠러 대 탱크 직경 비율(D/T)이 적절한 길이직경비가 달성될 때까지 변경되는 반복 디자인 베이스로 결정되었다.
생물반응기 길이직경비 H L /T
표 18은 여러 작동 용적에서 정상적인 공정 중 1000 리터 생물반응기의 길이직경비를 기술한다. 이들 길이직경비는 탱크 ID의 선택 및 요구되는 작동 용적으로부터 나온다. 공정 처리 관점으로부터, 다른 작동 조건에서 혼합 요구도는 다르다. 접종 전 단계 동안 생물반응기 혼합은 배지가 최소 KLa 요구와 평형을 이루도록 허용하는 것이 중요하다. 그러나, 접종-후 및 이송-전 단계에서는 혼합과 KLa 둘 다 중요한 고려사항이다. 따라서, 이들 특성 양쪽을 길이직경비 범위에서 시험하였다.
표 18: 1000 리터 생물반응기에서 핵심 작동 용적과 길이직경비
용적, L 액체 헤드, ㎜ 길이직경비, HL/T
단계 N-3
접종-전
250
484
0.56
단계 N-3
접종 후 & 이송-전/수확
300
570
0.66
단계 N-2
접종-전, 배수-후 재충전-전
1) 4001
2) 50-1001
3) 1922
1) 740
2) 143-228
3) 385
1) 0.86
2) 0.17-0.26
3) 0.45
단계 N-2
접종 후 & 이송-전/수확
1) 450
2) 450-9003
3) 9604
1) 826
2) 826-1594
3) 1696
1) 0.96
2) 0.96-1.84
3) 1.96
(1) 1/9 계대-배양 공정을 위한 접종-전 용적 및 롤링 시드 접종 용적.
(2) 1/5 계대-배양 공정을 위한 롤링 시드 접종 용적.
(3) 1/9 계대-배양 공정을 위한 롤링 시드 접종 후 & 이송-전 용적.
(4) 1/5 계대-배양 공정을 위한 롤링 시드 접종 후 & 이송-전 용적.
탱크 직경
탱크 직경은 최적 길이직경비 HL/T를 얻기 위해 변경된다. 탱크 내부 직경의 변화는 허용되는 길이직경비와 플랜트 풋프린트에 의하여 제한된다. ID는 0.864 m이다.
탱크 높이
탱크 높이는 최대 작동 용적, 길이직경비 HL/T, 여유고 직선측 길이, 하부 및 상부 플레이트 디자인으로부터 결정된다. 최종 탱크 높이는 거품, 플랜트 높이 및 허용되는 임펠러 샤프트 길이를 위한 예비 용적으로부터 결정된 절충 값이다. 헤드에서 기부 탄젠트 라인 높이는 2.347 m이다.
여유고 높이
본 시드 생물반응기에서는 여유고 높이 500 ㎜(최대 작동 용적의 31%v/v 또는 293 리터)가 사용된다.
헤드 및 기부 플레이트
기부 및 헤드 플레이트 디자인은 이러한 시드 생물반응기를 위한 ASME F&D 이다.
생물반응기 교반 요구도
생물반응기의 교반은 신속한 혼합을 달성하고, 균질성을 유지하고, 포유류 세포를 현탁액 및 가스 거품 분산액 중에 유지하기 위한 것이다. 상기 목적을 달성하는 데 내포된 문제는 임펠러 기하학으로부터 발생하는 전단력 및 임펠러 날 뒤에 생성되는 와류 또는 소용돌이를 통한 세포 손상을 최소화하는 것이다. 상기 목적의 절충은 적절한 임펠러 타입 및 가스처리 전략의 선택에 의해 달성될 수 있다.
하부 대 상부 구동 임펠러 샤프트
모터 구동은 이미 강조된 이점을 위해 상부 장착된다.
배플
중앙에 장착된 임펠러의 배플 요구도는 소용돌이 형성을 방지하는 데 중요하다. 배플과 관련된 중요한 문제는 배플 수, 배플 폭(W), 배플 길이(Hbaffle) 및 배플 대 탱크 벽 간격(Wc)이다.
0.1×T 또는 86 ㎜ 폭, 1.1×H-Hh 또는 2099 ㎜ 길이 및 배플 대 탱크 벽 간격 Wc가 0.01×T 또는 9 ㎜인 4 개의 동일 간격 배플이 사용된다.
배플의 두께는 특정되지 않지만 유체 흐름의 방사상 요소에 대한 강성을 보장할 필요가 있다. 또한, 두께는 배플 플레이트가 SIP 중에 뒤틀리지 않아서 배플 대 탱크 벽 간격에 영향을 주지 않을 필요가 있다.
임펠러 타입, 크기 및 개수
1000 L 생물반응기의 임펠러는 20,000 리터 용기와 동일하게 형성되고 동일한 D/T 비율을 갖는다. 따라서, 하부 임펠러는 직경 381 ㎜에 Lightnin's A315이고 상부 임펠러는 직경 381 ㎜에 Lightnin's A310이다.
임펠러 거리 D c , D s 및 D o
상부 임펠러의 중심선과 하부 임펠러의 중심선 사이의 임펠러 거리(Ds)는 2×Dbott om(762 ㎜)이다. 하부 임펠러 간격(Dc)는 0.4×Dbottom(152 ㎜)이다. 이것은 상부 임펠러 위의 액체 헤드 Do가 0.5×Dtop(190 ㎜)이면서, 하부 임펠러가 가장 낮은 접종-후 용적 167 리터에서, 그리고 양쪽 임펠러가 616 리터에서 수면 아래에 잠기도록 허용한다.
표 19는 임펠러 위에서 액체 표면 또는 낮은 액체 커버를 형성하는 용적을 표시한다. 이들 임계 용적에서 거품 형성을 피하기 위해 교반은 변경될 수 있다.
표 19: 임펠러 및 액체 표면과 상호작용을 야기하는 핵심 작동 용적
상호작용 용적, L 잠재적 작동
0.5DA310 액체 커버를 갖는
침수 상부 임펠러		 616 1/5 공정의 접종 및 1/9 공정의 롤링 작동 중 보이는 용적
상부 임펠러의 상부 가장자리에 접촉하는 액체 표면 512 1/5 공정의 접종 및 1/9 공정의 롤링 작동 중 보이는 용적
상부 임펠러의 하부 가장자리에 접촉하는 액체 표면 492 1/5 공정의 접종 및 1/9 공정의 롤링 작동 중 보이는 용적
0.5DA315 액체 커버를 갖는 침수 하부 임펠러 167 1/5 공정의 접종 및 1/9 공정의 롤링 작동 중 보이는 용적
하부 임펠러의 상부 가장자리에 접촉하는 액체 표면 90 1/9 공정의 롤링 작동 중 보이는 용적
하부 임펠러의 하부 가장자리에 접촉하는 액체 표면 21 1/5 및 1/9 공정의 접종-전 충전 중 보이는 용적
1000 L 생물반응기는 두 가지 별개의 접종-후 용적에서 작동할 수 있는데, 하부 임펠러가 1/5 공정 및 1/9 공정 중 물에 잠기거나 양쪽 임펠러가 1/5 공정의 N-2 단계 및 1/5와 1/9 공정 양쪽의 롤링 시드 작동 중 물에 잠긴다.
표 20은 1/5 및 1/9 계대-배양 공정의 작동 중 상부 및 하부 임펠러 위의 액체 커버를 보여준다. 1/5 및 1/9 공정의 롤링 작동 중 하부 임펠러 위의 액체 커버는 0.5×D 아래로 떨어진다. 따라서, 이렇게 낮은 용적에서 작동하는 동안은 표면 가스 포집을 방지하기 위하여 교반 속도를 저하시키는 것이 중요하다. 960 리터에서 2.05×Dtop의 액체 커버(Do)가 얻어진다. 이 수준에서 KLa는 부정적으로 영향을 주지 않는 것으로 보이고 벌크 혼합은 문제가 안된다.
표 20: 상부 임펠러 Do 및 하부 임펠러 DBo 위 액체 커버 및 핵심 작동 용적
작동 용적, L 원통 높이,
H (㎜)		 Do, ㎜ DBo, ㎜ DA310의 비율로서의 Do DA315의 비율로서의 DBo
접종-전, 250 L 334 - 332 - 0.87DA315
접종-전, 400 L 590 - 588 - 1.54DA315
접종-후 및
이송-전, 300 L		 419 - 417 - 1.10DA315
접종-후 및
이송-전, 450 L		 675 - 673 - 1.77DA315
배수 후,
벌크-전, 192 L		 235 - 233 - 0.61DA315
배수 후, 벌크-전,
50-100 L		 0-78 - 76 - 0.2DA315
접종-후 및
이송-전, 900 L		 1443 679 - 1.78DA310 -
접종-후 및
이송-전, 960 L		 1545 782 - 2.05DA310 -
(1) 오프 하부 임펠러 간격, Dc = 152㎜ (0.4DA315), 임펠러 거리, Ds = 762㎜ (2DA315), 864㎜의 탱크 ID 및 ASME F&D 기부 플레이트의 높이, Hh = 151㎜
(2) Do = H - Ds - (Dc - Hh) 및 DBo = H - (Dc - Hh)
교반 속도 - rpm , P/V 및 팁 속도
표 21은 1000 리터 생물반응기의 교반 속도를 특정한다. 본 생물반응기는 20-260 W/㎥, 바람직하게는 55-85 W/㎥으로 교반된다. 교반 전략은 500 리터 파일럿 발효 중에 개발되었다. 155±1 rpm까지의 교반 속도가 작동 범위로 사용된다.
표 21: 1000 L 생물반응기에서의 교반 속도
교반 속도, rpm 단위 용적 당 동력, W·m-3 팁 속도, m·s-1
10-155 0-150 3.1
20-145 0-145 2.9
(1) 양쪽 임펠러가 침수될 때
(2) 하부 임펠러가 침수될 때
기계적 밀봉 명세
응축수 윤활되는 이중 기계적 밀봉이 상기와 같이 사용된다.
생물반응기 통기 요구도
표 22는 1000 리터 생물반응기에서 접종 팽창 중 DOT 및 pH 제어를 위한 일정한 표면 가스 속도의 증가에 기초한 가스 흐름을 보여준다. 산소는 DOT 제어에 요구되지 않을 것이다. 그러나, 산소 풍부 공기는 과도한 거품 형성을 방지하기 위해 하부 가스처리를 용이하게 하도록 사용될 수 있다. 더 작은 범위의 CA MFC가 초기 DOT 제어 및 일탈된 높은 수준의 DOT를 감소시키기 위해 질소를 전달하도록 사용할 것이 권장된다.
표 22: 1000 리터 생물반응기에서 가스 흐름 속도 및 MFC 작동 범위
가스 작동 범위 의견
헤드스페이스1
1. 깨끗한 공기
2. 질소
3. 헬륨
1. 0-50 SLPM
2. 정격 이용
3. 정격 이용
1) CO2 및 O2의 헤드스페이스 제거
2) 신속한 DOT 프로브 영점 맞춤을 위해
3) 탱크 완전성 시험
제어 스퍼저
1. 깨끗한 공기1
2. 산소
3. 이산화탄소
4. 질소2
5. 헬륨
1. 2-20 SLPM
2. 0.2-5 SLPM
3. 0.2-10 SLPM
4. 0.2-5 SLPM
5. 정격 이용
1. DOT 제어 하의 가스 흐름
2. DOT 제어 하의 가스 흐름
3. pH 제어 하의 가스 흐름
4. 밸러스트에 의한 초기 DOT 제어
5. 탱크 완전성 시험
(1) 공기 및 질소 가스 흐름은 SIP 탱크 가압 후를 위해 우회로를 통해 생물반응기로 들어간다.
(2) 질소는 0 내지 5 SLPM CA MFC를 통해 전달되고 초기 DOT 제어 중에 사용될 수 있다.
구멍 크기 및 구멍 개수의 계산은, 연쇄 거품 체계에서 Sauter 평균 거품 직경이 10 ㎜이고 구멍으로부터 나오는 가스의 표적 레이노드수가 <2000일 때까지 반복된다.
표 23은 1000 리터 생물반응기를 위한 핵심 스퍼저 디자인 명세를 보여준다. 305 ㎜의 스퍼저 길이 SL은 파이프 기하학을 위해 결정된다. 구멍은 A315 허브 바로 아래에서 가스가 나오는 것을 방지하기 위해 스퍼저의 어느 한 단부에 분배된다. 또는, 초승달형 기하학이 고려될 수도 있다.
파이프 직경은 25 ㎜이다. 스퍼저의 자유로운 CIP 배수를 돕기 위해 배쪽 표면에 위치한 단일의 2 ㎜ 구멍을 갖는 스퍼저의 등쪽 표면에 30 개의 2 ㎜ 구멍이 위치한다.
스퍼저 설치를 위한 생물반응기 출입구는 25 ㎜ 직경의 파이프 디자인에 맞추도록 디자인된다. 출입구의 위치는 하부 임펠러의 하부 가장자리 아래 88 ㎜의 거리(Dc-Sc)에서 탱크 바닥으로부터(Sc) 64 ㎜ 보다 크지 않도록 제어 스퍼저의 배치를 허용한다.
표 23: 1000 리터 생물반응기 스퍼저의 디자인 명세
변수 제어 스퍼저
가스 흐름, SLPM 35
스퍼저 구멍 개수 30
구멍 직경, do, m 0.002
가스 흐름, ㎥.s-1 5.83E-04
구멍 면적, ㎡ 3.14E-06
총 구멍 면적, ㎡ 9.42E-05
공기 밀도, Kg.m-3 1.166
점도, Nm.s-2 1.85E-05
SMD, ㎜ (dvs = 1.17 Vo 0 .4 do 0 .8 g-0.2) 10.65
중력가속도, g, g m.s-2 9.807
밀도 차이, Kg.m-3 1048.834
레이노드수, >2000 제트 체계 782
스퍼저에서의 가스 속도, Vo, m/s 6.19
스퍼저 길이, SL, m 0.305
필요한 구멍을 뚫기 위한 전체 길이, m 0.06
길이 SL 안에 필요한 구멍을 맞추기 위한 열의 수 1
스퍼저 대 탱크 바닥 간격, Sc, m 0.064
스퍼저 대 하부 임펠러 간격, Dc-Sc, m 0.088
프로브의 위치, 부가 및 샘플 출입구
프로브, 부가 및 샘플 출입구의 배치를 위한 디자인 근거는 20,000 L 생물반응기에서와 동일하다.
표 24: 1000 리터 생물반응기의 프로브, 부가 및 샘플 출입구 명세
프로브/출입구 위치 직경, ㎜ (인치) 1위치, ㎜ (인치) Rational
온도 (주) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1. 286 (11〃)
2. 30°		 모니터링 용적을 최소화
하도록 위치
온도 (백업) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1. 286 (11〃)
2. 170°		 모니터링 용적을 최소화
하도록 위치
pH (주) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1. 286 (11〃)
2. 10°		 모니터링 용적을 최소화
하도록 위치
pH (백업) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1. 286 (11〃)
2. 20°		 모니터링 용적을 최소화
하도록 위치
DOT (주) 하부 링 25.0 (0.98〃) 1. 286 (11〃)
2. 150°		 모니터링 용적을 최소화
하도록 위치
DOT (백업) 하부 링 25.0 (0.98〃) 1. 286 (11〃)
2. 160°		 모니터링 용적을 최소화
하도록 위치
스페어-2
(스페어-pCO2)		 하부 링 38.1 (1.5〃) 1. 286 (11〃)
2. 180°		 모니터링 용적을 최소화
하도록 위치
스페어-3
(스페어-생물량)		 하부 링 50.8 (2〃) 1. 286 (11〃)
2. 190°		 모니터링 용적을 최소화
하도록 위치
샘플 밸브 (주) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1. 286 (11〃)
2. 40°		 NovAseptic
타입
샘플 밸브 (백업) 하부 링 38.1 (1.5〃) 1. 286 (11〃)
2. 40°		 NovAseptic
타입
알칼리 부가 하부 링 12.7 (0.5〃) 1. 286 (11〃)
2. 190°		 pH 프로브
직경 반대쪽
재료 공급 1 하부 링 12.7 (0.5〃) 1. 286 (11〃)
2. 200°		 pH 프로브
직경 반대쪽
재료 공급 2 하부 링 12.7 (0.5〃) 1. 286 (11〃)
2. 210°		 pH 프로브
직경 반대쪽
소포제 부가 헤드
플레이트		 50.8 (2〃) 1. N/A
2. 170°		 액체 표면/탱크 중앙으로부터 0.25T
스페어 표면 부가 헤드
플레이트		 50.8 (2〃) 1. N/A
2. 180°		 용기 벽을 향한 액체 표면
DOT 제어 스퍼저
구멍		 N/A 50.8 (2〃) 1. 64 (2.5〃)
2. 0°
오버레이 가스 헤드
플레이트		 38.1 (1.5〃) 1. N/A
2. 135°		 배출구
직경 반대쪽
배기가스 배출구 헤드
플레이트		 38.1 (1.5〃) 1. N/A
2. 315°		 오버레이 가스 인
직경 반대쪽
이송 밸브 기부
플레이트		 50.8 (2.0〃) 1. N/A
2. 중앙		 자유로운 배출을 허용하는 NovAseptic 타입
배지 입구 헤드
플레이트		 76.2 (3〃) 1. N/A
2. 310°		 용기 벽으로 향함
S200에서 1000L
까지 접종물 이송		 헤드
플레이트		 50.8 (2.0〃) 1. N/A
2. 320°		 용기 벽으로 향함
CIP - 스프레이 볼 헤드
플레이트		 76.2 (3〃) 1. N/A
2. 270°		 최고점의 CIP'ing
CIP - 스프레이 볼 헤드
플레이트		 76.2 (3〃) 1. N/A
2. 60°
압력 게이지 헤드
플레이트		 38.1 (1.5〃) 1.) N/A
2.) 50°
파열 디스크 헤드
플레이트		 50.8 (2〃) 1.) N/A
2.) 280°
스페어 노즐 헤드
플레이트		 101.6 (4〃) 1.) N/A
2.) 160°
1. 핸드 구멍
2. 검사 유리창		 헤드
플레이트		 1. 203.2 (8〃)
2. 101.6 (4〃)		 1.) N/A
2.) 70°		 두 가지 기능을 허용하는 하나의 출입구
교반기 샤프트
개구		 헤드
플레이트		 152.4 (6〃) 1.) N/A
2.) 75°		 헤드 플레이트의 중앙
(1) 기부 플레이트의 탄젠트 라인으로부터 측정됨. 각도는 시계방향 회전 면과 관련된다.
(2) 생물반응기에서 노즐의 직경
50 L 용적으로부터 샘플링, 모니터링 및 제어를 위하여, 프로브 및 출입구 링은 탱크 바닥으로부터 151 ㎜일 필요가 있다. 그러나, 프로브/출입구 링은 생물반응기의 직선 원통쪽 및 기부 플레이트의 용접 부위에 있으므로 이 열에 위치할 수가 없다. 프로브 및 출입구 링은 탱크 바닥으로부터 286 ㎜에 특정된다. 이는 134 리터의 용적이 모니터링, 제어 및 샘플링되도록 허용한다. 프로브/출입구 링은 모니터링/제어되는 용적을 최소화하기 위해 허용되는 한 탱크 바닥 가까이에 위치한다.
부가 출입구, 표면 및 표면-아래
1000 리터 생물반응기는 생물반응기의 잘-혼합된 영역으로 배출되는 알칼리 및 두 가지 표면아래 재료 공급을 허용하도록 디자인된다. 거품은 1/10 희석된 C-유제의 표면 부가에 의해 제어된다. 용기 벽으로 향하는 표면 부가 출입구 위 하나의 스페어가 또한 이후의 유연성을 위해 디자인된다. 시드 생물반응기의 접종 중 배지의 표면으로 배양물이 튀는 것은 거품의 형성을 방지하기 위하여 피해야 한다. 따라서, 접종 부가 출입구는 표면 위에 있고 용기 벽을 향한다. 기부 플레이트에서 수확 출입구의 사용은 접종물의 이송 중 접종물의 제거를 위한 이상적인 출입구이다. 추가로, 배지 부가 출입구는 용기 벽을 향한다. 요약하면 총 부가 출입구는 다음과 같다:
● 배지 입구, 접종물 입구, 및 용기의 벽으로 향하는 작은 스페어 부가 및 용기 벽으로부터 떨어진 액체 표면으로 소포제를 떨어뜨리기 위한 부가 출입구를 갖는 4 개의 표면 부가.
● 재료 공급 및 알칼리를 위한 3 개의 표면 부가.
샘플 출입구
샘플 출입구 디자인은 20,000 리터 생물반응기에서 설명한 것과 유사하다. 샘플 출입구는 샘플링될 수 있는 용적을 최소화하기 위해 탱크 바닥으로부터 286 ㎜에 위치한다.
용적 측정
높이 센서는 1000 리터까지 측정할 수 있다. 높이 센서 감도는 적어도 전체 범위의 0.25%이다.
생물반응기 온도 제어
공정 제어에 의해 초기 접종 및 “시드 롤링 작동” 중 250 내지 800 리터의 배지가 작동 온도, 통상적으로 36.5℃로 된다. 이것은 용기 벽의 고온을 피하기 위해 재킷의 온화한 가열에 의해 달성된다.
재킷
생물반응기 재킷 면적은 다음 사항을 고려하여 특정된다:
● 121-125 ℃에서의 증기 살균.
● <2h에 10 ℃로부터 36.5 ℃까지 배지 250-800 리터의 가열.
● 생물반응기 내의 모든 점은 열전대에 의해 측정시 설정점의 ±0.2 ℃, 통상적으로 36.5 ℃에 도달하여야 한다.
● <2h에 36.5 ℃로부터 10 ℃까지 배지 400 리터의 냉각.
생물반응기 pH 제어
공정 pH는 전송기를 통해 DCS 베이스의 공정 제어기로 연결된 프로브에 의해 모니터링 및 제어된다. 이 공정 pH는 설정점으로 pH를 낮추기 위한 CO2의 부가 및 설정점으로 pH를 올리기 위한 알칼리의 부가에 의해 제어된다. 알칼리는 하부 임펠러의 중심선에서 적어도 하나의 표면아래 출입구를 통해 부가된다. CO2는 제어 스퍼저를 통해 부가된다.
제어 및 백업 프로브는 표 24에 나타낸 바와 같이 모니터링 될 수 있는 용적을 최소화하기 위해 탱크 바닥으로부터 286 ㎜에 하부 출입구 링에 있다.
생물반응기 DOT 제어
용존 산소는 전기분해자동기록기의 DOT 프로브로 모니터링 및 제어된다. DOT 설정점은 다음의 분사에 의해 유지된다:
● 요구시 초기 N2 밸러스트 및/또는 공기.
● 요구시 공기와 함께 공기 밸러스트.
● 요구시 산소와 함께 공기 밸러스트.
DOT 제어는 DOT 설정점이 요구 가스로서 공기 또는 산소의 호환성 사용을 통해 유지되도록 허용한다.
제어 및 백업 프로브는 표 24에 나타낸 바와 같이 모니터링 될 수 있는 용적을 최소화하기 위해 탱크 바닥으로부터 286 ㎜에 하부 출입구 링에 있다.
공급재료 부가 제어
부가 점은 공급 재료 볼루스의 신속한 분산을 돕기 위해 하부 임펠러의 중심선 근처 탱크 바닥으로부터 286 ㎜에 있다.
소포제 부가 제어
부가 점은 탱크 중앙을 향하여 0.25×T 돌출되는 표면 또는 탱크 중앙으로부터 216 ㎜에 있다.
실시예 4: 생물반응기 훈련
생물반응기 디자인은 1/5(20%v/v) 및 1/9(11%v/v) 양쪽의 계대배양 비율을 수행하는 능력에 기초한다. 생물반응기 훈련은 2000 리터(단계 N-3 및 N-2) 및 4000 리터(단계 N-1) 시드 생물반응기에 이어서 20,000 리터 생산 생물반응기(단계 N)로 구성된다. 각 생물반응기의 작동 용적은 실시예 1 내지 3에서 정의된다. 생물반응기는 교반 탱크 디자인을 기초로 하고 상부 구동 교반 시스템이 사용되었다.
본 디자인은 pH, 용존 산소 장력(DOT) 및 온도와 같은 공정 변수에 대하여 균질 환경을 보장하여, 잘 혼합된 세포 현탁액을 유지하고 생물반응기 내에서 공급 영양소를 혼합할 필요성에 기초한다. 이는 최적 세포 성장, 생산물 축적 및 생산물 품질을 위해 필요한 물리화학적 환경을 제공한다. 디자인 철학의 핵심은 기하학적 유사성을 유지할 필요성이다. 이는 12 리터 실험실 및 500 리터 파일럿 규모에서 개발되는 소규모 모델을 허용한다. 시드 및 생산 생물반응기의 디자인은 비록 어느 정도의 차이가 공정에서의 유연성을 허용하는 데 요구되지만 동일한 원리에 기초한다. 선택된 길이직경비(HL/T)는 포유류 세포 배양에 사용되는 통상적인 것이고 0.17 내지 1.96 접종-후 범위에 있다.
표 25: 핵심 생물반응기 디자인 변수
1000 리터 4000 리터 20,000 리터
길이직경비(HL/T) 0.17 - 1.96 0.63 - 1.21 0.83 - 1.34
임펠러 대 탱크 직경(D/T) 0.44 - 0.46 0.44 - 0.46 0.44 - 0.46
작동 용적(L) 50 - 960 1914 - 3846 13913 - 21739
교반기 속도(rpm) 0 - 155 0 - 88 0 - 80
제어 스퍼저 CA(SLPM) 2 - 20 0 - 60 0 - 1000
밸러스트 스퍼저
CA/N2 흐름(SLPM)		 밸러스트 스퍼저
없음		 밸러스트 스퍼저
없음		 0 - 500
배양 지속 시간(일) 2 - 51 2 - 5 10 - 15
공급 재료 부가 2 표면
3 표면-아래		 2 표면
3 표면-아래		 4 표면
4 표면-아래
(1) 1000 리터 생물반응기에서 배양 지속 시간은 생물반응기가 반복적으로 표면-아래 또는 "롤링되는" 시간의 길이에 따라 더 높을 수 있다.
디자인의 제약은 접종-후 용적의 4%v/v 내지 25%v/v의 재료공급 적용에서 11%v/v(1/9 희석) 및 20%v/v(1/5 희석)의 식종 비율에 기초한다. 생산 생물반응기에서 접종-후 용적은 모든 공급 재료의 부가 후 수확시 최종 용적이 20,000 L에서 끝나도록 15%까지의 재료공급 적용에 적합화된다. 그러나, 15%v/v 보다 큰 재료공급 적용을 위해, 접종-후 용적은 15%v/v 재료공급에 적합화되지만 재료공급 적용 이후 최종 수확-전 용적은 최소 20,000 및 최대 22,000 리터가 될 것이다. 생산 생물반응기는 배치 종결시 총 20,000 내지 22,000 리터를 보유할 것이 기대된다. 표 26은 3 개의 접종 팽창 단계 각각 및 생산 생물반응기 각각에 대한 접종-전 용적, 접종 용적 및 이송 또는 수확 용적을 보여준다.
시드 생물반응기(단계 N-1 내지 N-3)는 재료공급되지 않을 것이고 따라서 최대 작동 용적은 접종시일 것이다. 4000 리터 시드 생물반응기(단계 N-1)의 작동 용적 범위는 1914 내지 3846 리터이다. 세포를 20%v/v 시드 분열 비율로부터 성장시킬 수 있는 생물반응기 디자인을 위해, 1000 리터 시드 생물반응기(단계 N-2 및 N-3)가 두 가지 작동 범위에서 작동할 것이다. 11%v/v 시드 분열 비율에서 생물반응기 훈련은 단일 팽창/계대-배양 단계에서 세포 농도 기준을 처리하는 데 부합하기 위한 충분한 배양물을 생산할 수 있다. 그러나, 생물반응기 훈련은 20%v/v 시드 분열 비율 공정을 위한 처리 기준에 부합하기 위해 두 팽창/계대-배양 단계를 필요로 한다. 따라서, 11%v/v 시드 분열 비율 공정을 위해 400 내지 450 리터의 작동 범위가 요구되고 20%v/v 시드 분열 비율 공정을 위해 250 내지 960 리터의 작동 용적 범위가 요구된다.
표 26: 생물반응기 훈련을 위한 용기 크기
1000 리터 4000 리터 20,000 리터
단계 N-3 N-2 N-1 N
4-25%v/v 생산 재료공급과 함께 11%v/v 시드
접종-전 용적(L)
접종 용적(L)
이송 또는 수확 용적(L)
400
450
450
-
-
-
1914
2153
2153
15456 - 17096
17391 - 19231
20000 - 21739
4-25%v/v 생산 재료공급과 함께 20%v/v 시드
접종-전 용적(L)
접종 용적(L)
이송 또는 수확 용적(L)
250
300
300
768
960
960
2782 - 3077
3478 - 3846
3478 - 3846
13913 - 15385
17391 - 19231
20000 - 21739
예상되는 작동 용적
최소 용적(L)
최대 용적(L)
최대용적/최소용적 비율
250
960
3.84
1914
3846
2.01
13913
21739
1.56
1000 리터 시드 생물반응기는 S200 웨이브(S200 Wave) 생물반응기에서 생산된 배양물로부터 접종되는 것이 권장된다.
1000 L: 본 생물반응기는 포유류 세포의 배양을 위해 공급재료의 잠재적 “숏 부가(shot addition)”로 5일까지의 배치로 작동된다. 그러나, 각 배치의 종결시 반복되는 배수 및 재충전 작동으로 인해 이 생물반응기에서 총 공정 체류 시간은 30일을 초과할 수 있다. 포유류 세포는 20,000 리터 생물반응기와 동일한 임펠러 시스템을 통한 교반에 의해 균질 현탁액 중에 유지된다. 추가로, 가능하다면 다른 특성이 20,000 리터 생물반응기와 기하학적으로 유사하게 유지될 것이다.
공기 또는 산소 및 공기 또는 질소의 분사는 각각 공정 DOT를 제어할 것이다. 공정 pH는 염기 제어를 위한 알칼리, 및 산 제어를 위한 분사된 CO2의 부가에 의해 제어된다.
본 생물반응기의 공정 작동 용적은 다른 작동 단계에서 변화한다. 초기에 생물반응기는 0.5 h 이내 250 내지 400 리터 배지의 볼루스로 무균적으로 채워진다. 생물반응기는 공정 변수가 예정된 설정점에 도달하도록 접종-전 단계로 작동한다. 압축공기 보조 흐름 또는 연동 펌프에 의해 25 내지 30 분 이내에 (N-4) S-200 시드 웨이브 생물반응기로부터 50 리터 배양물이 1/5 또는 1/9 희석으로 1000 리터 생물반응기로 접종된다. 접종-후 작동 용적은 1/5 및 1/9 시드 공정에서 각각 300 및 450 리터이다. 염기 제어를 위한 알칼리 및 거품 억제를 위한 1/10 소포제 현탁액의 부가가 최종 용적에 기여한다. 접종 배양물은 배양 간격이 예상 보다 길 경우 “숏 부가(shot addition)"에 의해 재료공급될 수 있다. 혼합 및 가스 처리의 결과로, 상기 액체 용적은 가스 보유로 인해 팽창될 것이다. 이러한 상승 정도는 사용되는 스퍼저 타입, 임펠러에 의해 부여되는 단위 용적 당 동력 및 분사 가스의 표면 가스 속도에 의존한다.
N-3 단계는 생존 세포 농도가 이송 기준에 도달할 때 종료된다. 1/5 공정에서 N-2 단계는 1.5 h 이내 192 리터 과잉 배양물의 배출 및 768 리터 신선 배지의 부가에 의해 용적이 960 리터로 증가하면서 시작된다. 696 내지 769 리터의 배양물은 N-2 단계 종결시 1/5 공정을 위해 4000 리터 생물반응기로 이송된다. 1/9 공정을 위해서는 239 리터가 4000 리터 생물반응기로 이송된다.
1000 L 생물반응기는 연속적으로 “배출 및 신선한 배지로 재충전”되거나 “롤링"되어 4000 리터 생물반응기를 위한 백업 배양물을 제공한다. 롤링 시드 작동의 지속은 생산 작전의 길이 및 시드 배양물의 허용 가능한 경과 세대 수에 의존한다. 통상적으로 롤링 시드 작동은 30 일이 넘을 것으로 예상된다. 롤링 작동은 960 리터 배양물의 약 192 리터를 보존하고 1/5 공정을 위해 768 리터의 신선한 배지로 희석하는 것으로 구성된다. 1/9 공정을 위해 1000 리터 생물반응기는 450 내지 900 리터 배양물의 50 내지 100 리터를 보존하고 400 내지 800 리터의 신선한 배지로 희석하는 것에 의해 "롤링"될 것으로 기대된다. 공정 제어 범위는 이 작동을 넘어서 완화된다. 롤링 작동 중 생물반응기로 부가된 배지는 30 ℃까지 가온된다.
4000 L: 본 생물반응기는 포유류 세포의 배양을 위해 공급재료의 잠재적 “숏 부가(shot addition)”로 5일이 넘지 않는 배치로 작동된다. 포유류 세포는 실시예 1에서 기술한 것과 동일한 임펠러 시스템을 통한 교반에 의해 균질 현탁액 중에 유지된다. 추가로, 용기는 20,000 리터 생물반응기와 기하학적으로 유사하다.
공기 또는 산소 및 공기 또는 질소의 분사는 각각 공정 DOT를 제어한다. 공정 pH는 염기 제어를 위한 알칼리, 그리고 산 제어를 위한 분사 CO2의 부가에 의해 제어된다.
본 생물반응기의 공정 작동 용적은 다른 작동 단계에서 변화한다. 초기에 생물반응기는 0.5 h 이내 1914 내지 3077 리터로 무단백질 배지의 볼루스로 무균적으로 채워진다. 생물반응기는 공정 변수가 예정된 설정점에 도달하도록 접종-전 단계로 작동된다. 1000 리터 (N-2) 시드 생물반응기로부터 배양물이 1/5 또는 1/9 희석으로 1 시간 이내 수송을 허용하는 유속으로 압축공기 흐름에 의해 접종된다. 접종-후 작동 용적은 2153 내지 3846 리터이다. 염기 제어를 위한 알칼리 및 거품 억제를 위한 1/10 소포제 현탁액의 부가가 최종 용적에 기여한다. 접종 배양물은 배양 간격이 예상 보다 길 경우 “숏 부가(shot addition)"에 의해 공급될 수 있다. 혼합 및 가스 처리의 결과, 액체 용적은 가스 보유로 인해 팽창된다. 이러한 상승 정도는 사용되는 스퍼저 타입, 임펠러에 의해 부여되는 단위 용적 당 동력 및 분사 가스의 표면 가스 속도에 의존한다.
20,000 L: 본 생물반응기는 포유류 세포의 배양을 위해 10 내지 15 일 동안 비연속(batch) 또는 유가(fed batch) 방식으로 작동된다. 포유류 세포는 임펠러 시스템을 통한 교반에 의해 균질 현탁액 중에 유지된다.
본 생물반응기의 공정 작동 용적은 다른 작동 단계에서 변화한다. 초기에 생물반응기는 1-2 h 이내 13913 내지 17096 리터로 세포 배양 배지로 무균적으로 채워진다. 생물반응기는 공정 변수가 예정된 설정점에 도달하도록 접종-전 단계로 작동된다. 4000 리터 시드 생물반응기(N-1)로부터 배양물이 <4000 L/h의 유속 범위로 압축공기 흐름에 의해 1/5 또는 1/9 희석으로 20,000 리터 생물반응기로 접종된다. 접종-후 작동 용적은 최대 20,000 리터까지의 표면-아래 재료 공급의 부가 이후 계속적으로 증가한다(총 4 내지 25%v/v까지 2 회의 재료 공급). 염기 제어를 위한 알칼리 및 거품 억제를 위한 1/10 소포제 현탁액의 부가가 각각 약 100 리터 및 20 리터를 설명한다. 혼합 및 가스 처리의 결과, 액체 용적은 가스 보유로 인해 팽창된다. 이러한 상승 정도는 사용되는 스퍼저 타입(홈이 있거나 소결된), 임펠러에 의해 부여되는 단위 용적 당 동력 및 분사 가스의 표면 가스 속도에 의존한다.
표 27은 정상적인 공정 중 다양한 작동 용적에서 20,000 리터 생물반응기의 길이직경비를 기술한다. 길이직경비는 500 리터 규모에서 시험되었고 단위 용적 당 동력 및 표면 가스 속도가 일정하게 유지된다면 KLa는 일정하게 유지된다.
표 27: 20,000 리터 생물반응기에서 핵심 작동 용적 및 길이직경비
용적, L 액체 헤드, ㎜ 길이직경비, HL/T
접종-전 13913 - 17096 2458 - 2977 0.88 - 1.07
접종 후 17391 - 19231 3025 - 3325 1.08 - 1.19
수확 20000 - 21739 3451 - 3734 1.23 - 1.34
[도 1]
1. 생물반응기;
10. 탱크의 직경(T);
20. 생물반응기의 총 직선 높이(H);
30. 생물반응기의 기부 높이(Hb);
40. 생물반응기의 헤드 높이(Hh);
50. 최대 작동 용적에서의 액체 높이(HL);
60. 상부 임펠러 직경(Dtop);
68. 상부 임펠러;
70. 하부 임펠러 직경(Dbottom);
78. 하부 임펠러;
80. 탱크 바닥과 하부 임펠러의 중심선 사이의 간격(Dc);
90. 임펠러 거리(Ds);
100. 액체 표면 아래의 상부 임펠러의 간격(Do);
108. 스퍼저;
110. 스퍼저 대 탱크 바닥 간격(Sc);
120. 스퍼저 대 하부 임펠러 간격(Dc-Sc);
128. 배플;
138. 하부 링에 위치한 출입구;
148. 상부 임펠러 68의 중심선에 위치한 출입구;
[도 2]
111은 1000 L 용적을 갖는 생물반응기;
11은 4000 L 용적을 갖는 생물반응기;
1은 20,000 L 용적을 갖는 본 발명에 따른 생물반응기.

Claims (18)

  1. 포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기에 있어서, 상기 생물반응기(1)는 적어도 4000 L의 용적 및 적어도 하나의 상부 임펠러(68) 및 적어도 하나의 하부 임펠러(78)을 갖고, 상부 임펠러(68)는 수중익 임펠러인을 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  2. 제 1 항에 있어서, 생물반응기(1)는 상부 임펠러(68), 바람직하게는 3 날의 수중익 디자인의 임펠러, 및 하부 임펠러(78), 바람직하게는 4 피치-날의 고 견고성 임펠러를 갖는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 임펠러 직경(60, 70) 대 탱크 직경(10)의 비율은 적어도 0.35 및 최대 0.55, 바람직하게는 적어도 0.40 및 최대 0.48, 가장 바람직하게는 적어도 0.44 및 최대 0.46인 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항에 있어서, 상부 임펠러 동력수(Np)는 적어도 0.1 및 최대 0.9인 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항의 어느 한 항에 있어서, 상부 임펠러 흐름수(Nq)는 적어도 0.4 및 최대 0.9인 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 있어서, 하부 임펠러 동력수(Np)는 적어도 0.5 및 최대 0.9인 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항의 어느 한 항에 있어서, 하부 임펠러 흐름수(Nq)는 적어도 0.50 및 최대 0.85인 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항의 어느 한 항에 있어서, 생물반응기(1)는 적어도 하나의 스퍼저(108)를 갖는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항의 어느 한 항에 있어서, 생물반응기(1)는 적어도 하나의 배플(128)를 갖는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항의 어느 한 항에 있어서, 생물반응기(1)는 알칼리 부가를 위한, 바람직하게는 서로 공간적으로 격리된 적어도 두 개의 출입구(138, 148)를 갖는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항의 어느 한 항에 있어서, 생물반응기(1)는 적어도 10,000 L, 가장 바람직하게는 적어도 20,000 L의 용적을 갖는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  12. 적어도 하나의 포유류 세포를 제 1 항 내지 제 11 항의 어느 한 항에 따른 생물반응기 내의 적절한 배양 배지에서 적절한 조건 하에 배양하는 것을 특징으로 하는 포유류 세포의 배양 및 증식 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 적어도 두 개의 임펠러의 교반 속도는 적어도 55 W/㎥ 및 최대 85 W/㎥인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. a) 적어도 500 L, 바람직하게는 적어도 1000 L의 용적을 갖는 제 1 생물반응기(111)가,
    b) 제 1 생물반응기(111) 보다 큰 용적을 갖고, 적어도 2000 L, 바람직하게는 적어도 4000 L의 용적을 갖는 제 2 생물반응기(11)와 연결되고, 여기에서 적어도 2000 L, 바람직하게는 적어도 4000 L의 용적을 갖는 제 2 생물반응기(11)는,
    c) 제 2 생물반응기(11) 보다 큰 용적을 갖고, 적어도 10,000 L, 바람직하게는 적어도 20,000 L의 용적을 갖는, 제1 항 내지 제 11 항의 어느 한 항에 따른 제 3 생물반응기(1)와 연결되는 것을 특징으로 하는 포유류 세포의 배양을 위한 생물반응기 시스템.
  15. 제 14 항에 있어서, 적어도 하나의 제 1 또는 제 2 생물반응기(111, 11)가 제 1 항 내지 제 11 항의 어느 한 항에 따른 생물반응기인 것을 특징으로 하는 생물반응기 시스템.
  16. a) 적어도 하나의 포유류 세포를 적어도 500 L의 용적, 바람직하게는 적어도 1000 L의 용적을 갖는 제 1 반응기에서 적절한 배양 배지 중에 적절한 조건 하에서 배양하고,
    b) 적어도 하나의 포유류 세포로부터의 증식에 의해 얻어진 세포를 포함하는 배지를 적어도 2000 L의 용적, 바람직하게는 적어도 4000 L의 용적을 갖는 제 2 생물반응기로 이송하고,
    c) 이송된 세포를 적어도 2000 L의 용적, 바람직하게는 적어도 4000 L의 용적을 갖는 제 2 생물반응기에서 배양하고,
    d) 단계 c)에서 얻어진 세포를 포함하는 배지를 적어도 10,000 L의 용적, 바람직하게는 적어도 20,000 L의 용적을 갖는 제 3 생물반응기로 이송하고, 그리고
    e) 이송된 세포를 적어도 10,000 L의 용적, 바람직하게는 적어도 20,000 L의 용적을 갖는 제 3 생물반응기에서 배양하는 것을 특징으로 하는 포유류 세포의 배양 및 증식 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 사용되는 생물반응기의 적어도 하나가 제 1 항 내지 제 11 항의 어느 한 항에 따른 생물반응기인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 배양-조건이 단계 a), c) 및 e)의 생물반응기에서 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
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