CN110607255B - 一种德氏乳杆菌及直投式德氏乳杆菌发酵剂的制备方法和应用 - Google Patents

一种德氏乳杆菌及直投式德氏乳杆菌发酵剂的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种德氏乳杆菌及直投式德氏乳杆菌发酵剂的制备方法和应用，所述德氏乳杆菌为(Lactobacillus delbrueckii)DMLD‑H1，已于2019年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，保藏编号为GDMCC NO.60645。本发明菌株经高密度培养，制备的冻干粉活菌数高达1010～1011CFU/g，该冻干粉水分含量低于3％，不易结块、复水性好，具有广泛应用，如制备冰淇淋、果冻、奶片、凝固型酸奶、搅拌型酸奶、酸奶饮料或奶酪等。

Description

一种德氏乳杆菌及直投式德氏乳杆菌发酵剂的制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种德氏乳杆菌，以及直投式德氏乳杆菌冻干粉，具体是指一种德氏乳杆菌高密度培养方法及制得的冻干粉及其应用。
背景技术
乳酸菌的高密度培养技术也称高密度发酵技术(high cell density culture，HCDC)，一般是指在液体环境中培养菌株，使细胞密度增多，超过常规培养的10倍以上的生长状态或培养技术，从而能达到提高菌体的发酵密度、提高产物的比生产率等目的。利用高密度培养技术可有效提高生产效率，从而提高经济效益。
直投式发酵剂(Direct-to-vat cultures，即DVS)是浓缩型发酵剂的一种，特点是不用经过菌种活化.、中间继代培养、扩培等步骤，可直接投入应用于发酵生产、活菌含量高(1010～1012g-1)、接种量少(相比传统发酵剂可降低一百到一千倍)、保质期长(冻藏DVS>90天；冻干DVS>1年)、贮藏方便。DVS 可使得每批发酵产品质量相对稳定，避免了传统发酵菌种常常遇到的退化污染现象，也降低了在菌种车间的占地和有关设备的开支，有效提高了工厂酸奶产品质量和发酵酸奶劳动生产率。
我国现有国产发酵剂存在活菌含量较低，需要经过活化、扩培后才能用于 生产，导致发酵乳及发酵发酵乳饮料质量不稳定和口感差。研究学者也普遍认 为，由于不同族群人的遗传背景、生活环境、生活习惯的差异，肠道菌群存在 巨大差别，来自本族群的原生菌或原籍菌最适合与本族人体。当这种核心菌种 90％以上来自西方人体，核心技术90％以上掌握在国外企业的时候，存在潜在 的健康安全隐患和高额垄断价格。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术存在的不足，提供一种活菌数含量为1010～1011CFU/g、用于生产发酵时间短、复水性好、安全性高的直投式德氏乳杆菌冻干粉的研制方法。该直投式德氏乳杆菌冻干粉可用于发酵生产冰淇淋、果冻、奶片、搅拌型酸奶、凝固型酸奶、酸奶饮料、奶酪等。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种德氏乳杆菌，所述德氏乳杆菌为(Lactobacillus delbrueckii)DMLD-H1，已于2019年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，保藏编号为GDMCCNO.60645，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
一种直投式德氏乳杆菌发酵剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将德氏乳杆菌的冻干粉置于MRS培养基中分别进行两次活化后得种子发酵剂，该种子发酵剂的菌含量为108～109CFU/mL；
(2)以体积比为3～8：100的比例，将种子发酵剂接入高密度培养基中，于36～40℃下进行发酵培养，16～24h后收集发酵菌液；
(3)将发酵液离心，舍弃上清液，用灭菌后的生理盐水清洗沉淀，收集菌泥；
(4)在菌泥中，按复合保护剂与菌泥的体积比为1～5:1加入复合保护剂，混合均匀后得到保护剂菌液；
(5)将含保护剂的菌悬液在-20～-60℃下预冻2～6h后与真空冷冻干燥机中干燥18～36h得冻干粉。
优选地，以重量份数计，所述高密度培养基的配方为：酪蛋白消化物0.8～1.0 份，牛肉膏粉0.6～1.0份，酵母膏粉0.3～0.5份，柠檬酸三铵0.1～0.2份，乙酸钠0.4～0.5份，硫酸锰0.005～0.010份，磷酸氢二钾0.1～0.2份，葡萄糖1.5～2.0 份，吐温80 0.1～0.2份，低聚果糖1.8～2.2份，细菌学蛋白胨1.8～2.0份，硫酸镁0.04～0.06份。
优选地，所述高密度培养基的制备：将上述原料用蒸馏水定容至100份，调节pH至5.7，搅拌溶解均匀后于0.08～0.10MPa，灭菌15～20min，冷却至 36～40℃。
优选地，以重量份数计，所述的复合保护剂为：脱脂乳粉8～12份，海藻糖 6～10份，谷氨酸钠4～6份。
优选地，所述的复合保护剂的制备：将上述原料用蒸馏水定容至100份，溶解后搅拌均匀，于0.08～0.10MPa，灭菌15～20min，冷却至常温。
优选地，所述的离心转速为4000～6000rpm，离心时间为10min～20min。
优选地，步骤(5)所得冻干粉，先用湿度为50～60％的恒湿空气将其温度恢复到常温，再用气流包装机进行铝塑包装。
上述方法制备的直投式德氏乳杆菌发酵剂，其特征在于，所述发酵剂的水分含量低于3％，活菌数达到1010～1011CFU/g。
所述直投式德氏乳杆菌发酵剂在制备冰淇淋、果冻、奶片、凝固型酸奶、搅拌型酸奶、酸奶饮料或奶酪中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明公开了一株德氏乳杆菌菌株DMLD-H1，该菌筛选自中国传统发酵乳制品——内蒙古家庭自制酸奶，经急性毒理证明食用安全，相对国外进口菌株更适合中国人的肠道，且成本更低。
(2)本发明所用的低聚果糖、细菌学蛋白胨、硫酸镁都能保证菌体生长过程所需要的营养物质，促进菌体大量生长。
(3)本发明所用的冻干保护剂含脱脂乳粉8～12％，海藻糖6～10％，谷氨酸钠4～6％。所用的培养基均为可食用的，保护剂脱脂乳粉、海藻糖及谷氨酸钠也为可食用的食品配料，同时该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
(4)本发明制备的冻干粉活菌数高达1010～1011CFU/g，不易结块、复水性好。该冻干粉水分含量低于3％。
(5)本发明制备的冻干粉具有复水性好、色泽好、流动性好、保存方便，易用于工艺生产，减少接种、扩培环节而减少污染发生，保证产品质量的稳定性，缩短发酵周期，解决生产食品的安全问题，符合规模化生产的需要，同时应用范围广。
本发明德氏乳杆菌为DMLD-H1，已于2019年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，保藏编号为GDMCC NO.60645。广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼。
附图说明
图1实施例1德氏乳杆菌生长曲线(a)及酸化曲线图(b)。
图2实施例2靛基质试验检测结果图：左边锥形瓶为质控菌株金黄色葡萄球菌的对照组组；右边锥形瓶为德氏乳杆菌的实验组。
图3实施例2硝基还原酶检测结果图：左边的试管加入德氏乳杆菌 DMLD-H1的实验组，中间为空白试验，右边为加入质控菌株金黄色葡萄球菌的实验组。
图4实施例2溶血活性检测结果图：(a)为德氏乳杆菌DMLD-H1血平板实验平板划线接种(b)DMLD-H1血平板实验穿刺接种(c)为质控菌株金黄色葡萄球菌的血平板实验(d)为空白血平板对照。
图5实施例3单因素试验中不同碳源优化结果图：(a)为葡萄糖优化图， (b)为低聚果糖优化图。
图6实施例3单因素试验中不同氮源优化结果图：(a)为细菌学蛋白胨优化图，(b)为大豆蛋白胨优化图。
图7实施例3单因素试验中不同生长因子优化结果图：(a)为硫酸锰优化图，(b)为硫酸镁优化图，(c)为碳酸钙优化图，(d)为番茄汁优化图，(e) 为抗坏血酸优化图。
图8实施例3Box-Behnken优化试验拟合曲面交互作用影响图：(a)为A：低聚果糖与B：细菌学蛋白胨交互作用影响等高线图，(b)为A：低聚果糖与 B：细菌学蛋白胨交互作用影响3D曲面图，(c)为A：低聚果糖与C：硫酸镁交互作用影响等高线图，(d)为A：低聚果糖与C：硫酸镁交互作用影响 3D曲面图，(e)为B：细菌学蛋白胨与C：硫酸镁交互作用影响等高线图，(f) 为B：细菌学蛋白胨与C：硫酸镁交互作用影响3D曲面图。
图9实施例4Box-Behnken优化试验拟合曲面交互作用影响图：(a)为A：海藻糖与B：谷氨酸钠交互作用影响等高线图，(b)为A：海藻糖与B：谷氨酸钠交互作用影响3D曲面图，(c)为A：海藻糖与C：脱脂***互作用影响等高线图，(d)为A：海藻糖与C：脱脂***互作用影响3D曲面图，(e)为 B：谷氨酸钠与C：脱脂***互作用影响等高线图，(f)为B：谷氨酸钠与C：脱脂***互作用影响3D曲面图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
实施例1一株源于中国本土传统发酵乳制品的德氏乳杆菌DMLD-H1
本实施例为一株源于中国本土传统发酵乳制品的德氏乳杆菌DMLD-H1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC)，保藏编号为GDMCC 60645。该德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)菌株DMLD-H1的生物学特征是：在MRS培养基平板上划线分离，37℃培养48h，菌落为圆形，凸起，边缘整齐，菌落乳白色，表面湿润光滑。经革兰氏染色镜检可知为革兰氏阳性菌，菌体长杆状，无鞭毛，无芽孢。生理生化试验结果表明菌株KOH试验阴性，过氧化氢酶试验阴性，兼性厌氧，能水解淀粉，不液化明胶，吲哚试验阴性。根据16SrDNA寡核苷酸序列(如SEQ ID NO：1所示)，生理生化特性鉴定DMLD-H1为德氏乳杆菌。
通过对德氏乳杆菌DMLD-H1的培养条件的深入研究，以发酵时间对德氏乳杆菌DMLD-H1活菌数的对数值做曲线如图1，从图1可以看出，18h后活菌数达到最高值，此时活菌数为4.18×108CFU/mL。
所述MRS液体培养基为：以重量份数计，酪蛋白消化物0.8～1.0份，牛肉膏粉0.6～1.0份，酵母膏粉0.3～0.5份，柠檬酸三铵0.1～0.2份，乙酸钠0.4～0.5 份，硫酸锰0.005～0.010份，磷酸氢二钾0.1～0.2份，葡萄糖1.5～2.0份，吐温80 0.1～0.2份，硫酸镁0.01～0.03份。灭菌前pH为5.7。
实施例2：德氏乳杆菌DMLD-H1安全性评价研究
2.1靛基质试验
将活化好的德氏乳杆菌DMLD-H1菌株以及质控菌株金黄色葡萄球菌加入到靛基质检测培养基中，接种量为3％，37℃恒温培养72h。然后向培养液中加入少量***，振荡混匀。当在培养液表面开始出现***层后，滴加Kovacas 氏试剂8滴，观察并拍照记录。若在培养液表面呈红色则靛基质试验为阳性。结果图如图1所示，质控菌株金黄色葡萄球菌的实验组接触面呈红色圆环，说明结果呈阳性；而德氏乳杆菌DMLD-H1的结果呈阴性，说明德氏乳杆菌 DMLD-H1是安全的，不会分解蛋白胨中的色氨酸。
2.2硝基还原酶检测
将活化好的德氏乳杆菌DMLD-H1菌株以及用LB肉汤培养基活化好的质控菌株金黄色葡萄球菌加入到硝基还原酶检测培养基中，接种量为3％，37℃恒温培养72h。依次加入α-萘胺溶液和对氨基苯甲磺酸溶液，混匀，观察培养基颜色变化并拍照记录。培养基变红表明检测结果为阳性，否则为阴性。结果如图2所示，含质控菌株的培养基呈红色，说明结果呈阳性，产生硝基还原酶。而德氏乳杆菌DMLD-H1培养基未出现红色，不具有硝基还原酶活性，不产生硝基还原酶，结果呈阴性，是安全的。
2.3溶血活性检测
将活化好的德氏乳杆菌DMLD-H1菌株和用LB肉汤培养基活化好的质控菌株金黄色葡萄球菌用灭菌的接菌环划线接种于哥伦比亚血琼脂平板中，并且将活化好的德氏乳杆菌DMLD-H1菌株穿刺接种于哥伦比亚血琼脂平板中，于37℃培养48h，同时做空白试验，观察菌落周围有无溶血圈出现，拍照记录。结果如图3所示，哥伦比亚血平板上划线接种质控菌株金黄色葡萄球菌菌落附近出现明显的溶血圈。而穿刺或划线接种的德氏乳杆菌DMLD-H1菌落附近没有出现溶血圈，说明德氏乳杆菌DMLD-H1的溶血活性检测结果为阴性。
实施例3：德氏乳杆菌DMLD-H1高密度培养研究
所述高密度培养基和生产培养基通过以下单因素优化、Plackett-Burmen 试验和Box-Behnken优化试验而获得，具体如下：
3.1高密度培养单因素优化
3.1.1碳源优化
(1)葡萄糖优化
由图5可知，当在基础MRS培养基基础上增加葡萄糖的用量时，对德氏乳杆菌DMLD-H1的生长有一定的促进作用。当添加2.5倍，即50.0g/L葡萄糖时，菌液中活菌数最高，为6.30×108cfu/mL，为空白对照的3.06倍。但添加量大于2.5倍后，菌液中活菌数降低，说明过多的葡萄糖会产生抑制作用，不利于德氏乳杆菌DMLD-H1的生长。
(2)低聚果糖优化
由图5可知，当在基础MRS培养基基础上增加低聚果糖的用量时，对德氏乳杆菌DMLD-H1的生长有一定的促进作用。当添加1.5倍，即30.0g/L低聚果糖时，菌液中活菌数最高，为6.60×108cfu/mL，是空白对照的1.57倍。但添加量大于1.5倍后，菌液中活菌数不断降低，说明过多的低聚果糖会产生抑制作用，不利于德氏乳杆菌DMLD-H1的生长。
3.1.2氮源优化
(1)细菌学蛋白胨优化
由图6可知，当在基础MRS培养基基础上增加细菌学蛋白胨的用量时，添加1.5倍，即15.0g/L细菌学蛋白胨时，菌液中活菌数增加，说明该浓度下的细菌学蛋白胨对德氏乳杆菌DMLD-H1生长有明显促进作用。且添加1.5倍细菌学蛋白胨时为最高活菌数，为8.57×108cfu/mL，是空白对照的1.95倍。但添加量大于1.5倍后，菌液中活菌数又降低，说明过多的细菌学蛋白胨会产生抑制作用，不利于德氏乳杆菌DMLD-H1的生长。
(2)大豆蛋白胨优化
由图6可知，当在基础MRS培养基基础上增加大豆蛋白胨的用量时，对德氏乳杆菌DMLD-H1的生长有一定的促进作用。当添加1.5倍，即15.0g/L 大豆蛋白胨时，菌液中活菌数最高，为6.40×108cfu/mL，为空白对照的1.45 倍。但添加量大于1.5倍后，菌液中活菌数不断降低，说明过多的大豆蛋白胨会产生抑制作用，不利于德氏乳杆菌DMLD-H1的生长。
3.1.3生长因子优化
(1)硫酸锰优化
由图7可知，当在基础MRS培养基的基础上增加硫酸锰的用量时，对德氏乳杆菌DMLD-H1的生长有一定的促进作用。当添加3.0倍，即0.15g/L硫酸锰时，菌液中活菌数最高，为4.07×108cfu/mL，为空白对照的2.63倍。但添加量大于3.0倍后，菌液中活菌数缓慢降低，说明过多的硫酸锰会产生一定的抑制作用，不利于德氏乳杆菌DMLD-H1的生长。
(2)硫酸镁优化
由图7可知，当在基础MRS培养基基础上增加硫酸镁的用量时，对德氏乳杆菌DMLD-H1的生长有一定的促进作用。当添加2.0倍，即0.40g/L硫酸镁时，菌液中活菌数最高，为4.70×108cfu/mL，为空白对照的1.60倍。但添加量大于2.0倍后，菌液中活菌数明显降低，说明过多的硫酸锰会产生一定的抑制作用，不利于德氏乳杆菌DMLD-H1的生长。因而选择2.0倍作为硫酸镁单因素优化实验的最佳浓度。
(3)碳酸钙优化
由图7可知，当在基础MRS培养基基础上增加碳酸钙的用量时，对德氏乳杆菌DMLD-H1的生长有一定的促进作用。与菌体生长过程中产生的乳酸结合后，碳酸钙转变成可溶的乳酸钙，从而有效降低低pH值对菌体生长的抑制作用。当添加0.10％，即1.0g/L碳酸钙时，培养后的菌液中活菌数最高，为 7.67×108cfu/mL，为空白对照的1.85倍。当碳酸钙添加量高于0.10％时，活菌数开始有下降趋势，因而选择0.10％作为碳酸钙单因素优化实验的最佳浓度。
(4)番茄汁优化
由图7可知，当在基础MRS培养基基础上增加番茄汁的用量时，对德氏乳杆菌DMLD-H1的生长有明显的促进作用。当添加4.0％，即40.0mL/L番茄汁时，菌液中活菌数最高，为7.27×108cfu/mL，为空白对照的2.95倍。本实验得出添加量大于4.0％后，菌液中活菌数略有下降，说明过多的番茄汁反而使对德氏乳杆菌DMLD-H1的促进作用相对减弱。
(5)抗坏血酸优化
由图7可知，当在基础MRS培养基基础上增加抗坏血酸的用量时，添加 0.04％，即0.4g/L抗坏血酸时，菌液中活菌数增加，说明该浓度下的抗坏血酸对德氏乳杆菌DMLD-H1生长有明显促进作用。且添加0.04％抗坏血酸时达到最高活菌数，为5.60×108cfu/mL，为空白对照的2.13倍。但添加量大于0.04％后，菌液中活菌数又降低，说明过多的抗坏血酸会产生抑制作用，不利于德氏乳杆菌DMLD-H1的生长。
3.2培养基配方优化试验设计
在单因素试验基础上，利用Plackett-Burman试验设计法，对上述影响因素进行筛选。每个因素分别取低(-1)和高(+1)两个水平，共12个试验组合。每个处理重复3次，取平均值即为试验结果。
表1 Plackett-Burman实验结果
Figure BDA0002182248710000111
利用Design Expert 8.0.6软件，对Plackett-Burman实验结果分析如下表2：
表2 Plackett-Burman实验结果分析
Figure BDA0002182248710000112
由上表可得，Plackett-Burman实验结果分析中贡献率排序为F(硫酸镁) ＞C(细菌学蛋白胨)＞B(低聚果糖)＞J(碳酸钙)＞E(硫酸锰)＞H(番茄汁)＞A(葡萄糖)＞D(大豆蛋白胨)＞G(抗坏血酸)。可知硫酸镁、细菌学蛋白胨和低聚果糖这三个因素的贡献率在九个因素的贡献率中最高，分别为22.39％、17.15％、15.11％。其次是贡献率分别为12.60％和10.31％的碳酸钙和硫酸锰；剩余四个因素的贡献率均低于3.00％。说明硫酸镁、细菌学蛋白胨和低聚果糖对德氏乳杆菌DMLD-H1生长的影响程度较高。因此选择硫酸镁、细菌学蛋白胨和低聚果糖这三个因素来进行下一步的实验。
3.3Box-Behnken实验
在Plackett-Burman实验基础上可得，低聚果糖、细菌学蛋白胨、硫酸镁这三个因素对德氏乳杆菌DMLD-H1的生长影响最显著。因此选取这三个因素及其对应水平，利用响应面分析法对德氏乳杆菌DMLD-H1培养基配方进行优化。 Box-Behnken实验设计结果如表3：
表3 Box-Behnken实验设计结果
Figure BDA0002182248710000121
利用Box-Benhken的中心组合设计试验数据进行分析，然后利用Design Expert8.0.6软件进行分析。
表4 Box-Behnken实验设计分析
Figure BDA0002182248710000131
对表3中的数据进行多元二次回归拟合，由表2-10可得对模型进行方差分析的结果。分析得知活菌数(Y)对低聚果糖(A)、细菌学蛋白胨(B)、硫酸镁(C)的二次多项式回归方程为： Y＝+32.30000-0.81250A+12.12500B+29.31250C-4.00000AB+ 5.87500AC-28.25000BC-5.53750A2-6.33750B2-24.03750C2。该拟合模型的 p＝0.0084＜0.05，说明该模型是显著的；相关系数R2＝0.9019，说明该模型与实际情况拟合良好；R2 Adj＝0.7757，即该模型能解释77.57％的响应面值变化；失拟项能评估数据可靠性，F值为6.20，p＝0.0551＞0.05，说明失拟项是不显著的。分析结果表明，低聚果糖、细菌学蛋白胨、硫酸镁对德氏乳杆菌 DMLD-H1的活菌数有明显的影响，特别是硫酸镁，对德氏乳杆菌DMLD-H1 的活菌数有极显著的影响。根据回归方程的一次项系数及表4分析可得，各因素对菌粉活菌数影响程度为硫酸镁＞细菌学蛋白胨＞低聚果糖。根据回归方程的二次项系数及对表4分析可得，BC的交互系数较大，说明硫酸镁与细菌学蛋白胨两因素之间的交互效应大；而硫酸镁与低聚果糖、低聚果糖与细菌学蛋白胨两组因素之间的交互效应较小是由AB、AC的交互系数较小反映出的。
如图8所示，通过Design Expert 8.0.6软件绘制因子两两交互作用的响应面分析图和等高线，分析德氏乳杆菌DMLD-H1生长情况受低聚果糖(A)、细菌学蛋白胨(B)、硫酸镁(C)的不同组合的影响。
根据响应面建立的数学模型分析，各因子水平为添加低聚果糖(A)1.01 倍、细菌学蛋白胨(B)1.97倍、硫酸镁(C)2.98倍时，响应值Y(活菌数) 达到最大值。即在基础MRS培养基中添加20.2g/L低聚果糖、19.7g/L细菌学蛋白胨、0.596g/L硫酸镁为培养基优化最佳配方。在此条件下预测的德氏乳杆菌DMLD-H1的菌体浓度为1.32×109cfu/mL。
实施例4冻干粉的制备优化研究
通过对德氏乳杆菌DMLD-H1冻干条件进行冻干保护剂的筛选单因素优化和Box-Behnken优化实验设计。
4.1.德氏乳杆菌的冻干保护剂的筛选
4.1.1冻干保护剂的单因素筛选
准备足够数量的10mL离心管，称量每一个离心管的重量，并标注于离心管上，配制足量的MRS基础培养基，接种量为3％，往MRS培养基中接种德氏乳杆菌DMLD-H1，培养18h，于6000rpm下离心10min，无菌生理盐水洗涤2～3 次后，收集菌泥备用。
配制不同浓度的备选冻干保护剂溶液，按离心后的菌泥和配制的冻干保护剂溶液体积为1:3的比例混合均匀，放入10mL离心管中，放置于真空冷冻干燥机内冷冻干燥，完全冻干后，称量10mL离心管及所获得菌粉的总重量、计算出所获得的菌粉的重量，往菌粉中加入无菌水定容至10mL复溶，稀释平板计数，比较不同备选冻干保护剂及各个浓度下获得的每克菌粉的活菌数(cfu/g)。
(1)海藻糖浓度的选择
表5 不同浓度海藻糖对德氏乳杆菌DMLD-H1菌粉的影响
Figure BDA0002182248710000151
由上表可得，在冷冻干燥过程中，海藻糖对德氏乳杆菌DMLD-H1的菌粉有明显的保护作用。特别是10.0％海藻糖保护下，菌粉活菌数最高，为 8.56×109cfu/g。但当加入更高浓度的海藻糖时，每克菌粉中含有的活菌数反而下降。而相比于蔗糖和麦芽糊精，海藻糖的保护效果更佳，因此在糖类保护剂中选择海藻糖作为后续优化的冻干保护剂。
(2)蔗糖浓度的选择
表6 不同浓度蔗糖对德氏乳杆菌DMLD-H1菌粉的影响
Figure BDA0002182248710000152
由上表可得，在冷冻干燥过程中，蔗糖对德氏乳杆菌DMLD-H1的菌粉有明显的保护作用。特别是16.0％蔗糖保护下，菌粉活菌数最高，为4.04×109cfu/g。但相比于其他两种糖类，其保护效果不如海藻糖，因而不选择蔗糖作为后续优化的冻干保护剂。
(3)甘油浓度的选择
表7 不同浓度甘油对德氏乳杆菌DMLD-H1菌粉的影响
Figure BDA0002182248710000153
Figure BDA0002182248710000161
由上表可得，在冷冻干燥过程中，部分浓度的甘油对德氏乳杆菌 DMLD-H1的菌粉有明显的保护作用。在6.0％甘油保护下，菌粉活菌数最高，为7.95×108cfu/g。相较于其他保护剂，对德氏乳杆菌DMLD-H1的菌粉保护效果较低。因而不选择甘油作为后续优化的冻干保护剂。
(4)谷氨酸钠浓度的选择
表8 不同浓度谷氨酸钠对德氏乳杆菌DMLD-H1菌粉的影响
Figure BDA0002182248710000162
由上表可得，在冷冻干燥过程中，谷氨酸钠对德氏乳杆菌DMLD-H1的菌粉有明显的保护作用。特别是5.0％谷氨酸钠的保护下，菌粉活菌数最高，为 6.93×109cfu/g。浓度继续增加后，菌粉活菌数反而下降。因而选择谷氨酸钠作为后续优化的冻干保护剂。
(5)脱脂乳
表9 不同浓度脱脂乳对德氏乳杆菌DMLD-H1菌粉的影响
Figure BDA0002182248710000163
由上表可得，在冷冻干燥过程中，部分浓度脱脂乳对德氏乳杆菌 DMLD-H1的菌粉有保护作用。在添加低浓度脱脂乳时，菌粉活菌数随着浓度的增加而增加；在10.0％脱脂乳的保护下，菌粉最高活菌数为2.463×109cfu/g；继续增大脱脂乳的浓度时，菌粉活菌数不断下降。高浓度脱脂乳对乳杆菌菌粉保护作用下降。因而10％脱脂乳是最适宜的，选择蛋白类保护剂脱脂乳作为后续优化的冻干保护剂。
利用Design Expert 8.0.6软件对上表中的数据进行分析，结果如下：
表10 Box-Behnken实验设计结果
Figure BDA0002182248710000171
利用响应面的中心组合设计实验数据进行，然后利用Design Expert 8.0.6软件进行分析。
表11 Box-Behnken实验设计分析
Figure BDA0002182248710000172
进行多元二次回归拟合借助于Design Expert 8.0.6软件分析处理表3-12中的数据，由表3-13可得对二次模型进行方差分析的结果。分析得知活菌数(Y) 对海藻糖(A)、谷氨酸钠(B)、脱脂乳(C)的二次多项式回归方程为： Y＝+10.55320-0.98525A-1.35425B-0.32950C-0.094250AB+0.22825AC-0.37525B C-0.43773A2-2.34923B2-1.95623C2。该拟合模型的p＝0.0039＜0.05，说明该模型是显著的；相关系数R2＝0.9224，说明与实际情况拟合良好；R2 Adj＝0.8227，即该模型能解释82.27％的响应面值变化；失拟项F值5.89，p＝0.0598＞0.05，说明失拟项是不显著的。分析结果表明，海藻糖、谷氨酸钠对德氏乳杆菌DMLD-H1菌粉的活菌数有显著的影响。根据回归方程的一次项系数以及表11 分析可得，各因素对菌粉活菌数影响程度为谷氨酸钠＞海藻糖＞脱脂乳。根据回归方程的二次项系数以及表11分析可得，BC、AC、AB的交互系数都不大，说明海藻糖与谷氨酸钠、谷氨酸钠与脱脂乳、海藻糖与脱脂乳之间的交互效应小，交互作用不显著。
如图9所示，通过Design Expert 8.0.6软件绘制因子两两交互作用的响应面分析图和等高线，分析德氏乳杆菌DMLD-H1生长情况受海藻糖(A)、谷氨酸钠(B)、脱脂乳(C)的不同组合的影响。
由上图可知，3个响应面图均为在所选范围内存在极值的呈开口向下的凸形曲面。表明了当三个因素中其中一个因素为0水平时，其他两个因素的交互作用对德氏乳杆菌DMLD-H1菌粉活菌数的影响。两因子之间的交互作用大时，呈椭圆形并且等高线线间距较密。而响应曲面倾斜度大也说明两因子之间的交互作用大[38]。可得与方差分析结果一致，各因素对菌粉活菌数影响程度为谷氨酸钠(B)＞海藻糖(A)＞脱脂乳(C)。对德氏乳杆菌DMLD-H1生长的影响程度为BC＞AC＞AB。
根据响应面建立的数学模型分析，各因子水平为海藻糖(A)8.00％、谷氨酸钠(B)4.72％、脱脂乳(C)9.76％时，响应值Y(活菌数)达到最大值，即为对德氏乳杆菌DMLD-H1菌粉起最佳保护效果的复合冻干保护剂配比。此条件下预测的德氏乳杆菌DMLD-H1的菌体浓度为1.13×1010cfu/g。
实施例5直投式德氏乳杆菌发酵剂的制备方法
一种直投式德氏乳杆菌发酵剂的制备方法，包括以下步骤：
第一步将德氏乳杆菌DMLD-H1菌粉置于MRS培养基2次活化后收集发酵培养液；以体积比3:100的比例，将发酵培养液接入高密度培养基中，于37℃下发酵培养，18h后收集发酵培养液：以重量份计，所述的高密度培养基为酪蛋白消化物1.0份，牛肉膏粉1.0份，酵母膏粉0.4份，柠檬酸三铵0.2份，乙酸钠0.5份，硫酸锰0.005份，磷酸氢二钾0.2份，葡萄糖2.0份，吐温80 0.108 份，低聚果糖2.0份，细菌学蛋白胨1.9份，硫酸镁0.05份，用蒸馏水定容至 100份，调节pH至5.7。搅拌溶解均匀后于0.10MPa灭菌15min，冷却至37℃备用；
第二步将发酵菌液于6000rpm，离心10min，舍弃上清液，用灭菌后的生理盐水清洗菌泥并收集。
第三步在菌泥中，按复合保护剂溶液与菌泥的体积比为3：1加入复合保护剂溶液，混合均匀为保护剂菌悬液；以重量份数计，所述的复合保护剂溶液配方为：脱脂乳粉9.8％，海藻糖8.0％，谷氨酸钠5％，用蒸馏水定容至100 份，溶解后搅拌均匀，于0.10MPa，灭菌15min，冷却至常温备用。
第四步将保护剂菌悬液置于干燥器中，在-40℃下预冻4h后置于真空冷冻干燥机中干燥24h得冻干粉，用恒湿空气(湿度为60％)将冻干粉的温度恢复到常温，用气流进行铝塑包装即可，冻干粉水分含量低于3％，活菌数达到1010cfu/g。
所述的MRS基础培养基配方：酪蛋白消化物1.0份，牛肉膏粉1.0份，酵母膏粉0.4份，柠檬酸三铵0.2份，乙酸钠0.5份，硫酸镁0.02份，硫酸锰 0.005份，磷酸氢二钾0.2份，葡萄糖2.0份，吐温80 0.108份。
采用此方法制备的直投式乳杆菌发酵剂活菌数可达1.31x1010cfu/g，与预测值吻合，说明通过Box-Behnken实验设计建立的数学模型是准确可靠的。
实施例6：德氏乳杆菌DMLD-H1应用于发酵冰淇淋的生产
将德氏乳杆菌DMLD-H1冻干粉置于MRS培养基中，于30～40℃静止培养 18～36h后，制成种子液，使其的活菌数分别达到108cfu/mL以上；以1～10％的体积百分比，将德氏乳杆菌种子液分别置于发酵培养基中，于30～40℃静止培养18～36h后，制成发酵液，使其的活菌数分别达到108cfu/mL以上；将牛奶、奶油、全脂奶粉、甜炼乳、黄油、白砂糖、蛋黄粉以转速为300r/min搅拌10min混合均匀得到混合物，加热到75℃,保温25min杀菌，将杀菌后的混合物均质处理，加入3～6％德氏乳杆菌，静置6～10h完成发酵，得到冰淇淋基料；将冰块重量三分之一的食盐加入0℃冰块中，即食盐于冰块的质量比1:3 将水的温度降至-20℃，得到冷却液,用40r/min进行搅拌冰淇淋即可得富含德氏乳杆菌的发酵冰淇淋，活菌数为107cfu/mL以上，酸度为75～80°T，蛋白质为3.0～3.2g/100g，脂肪含量为3.1～3.4g/100g，非脂乳固体含量为8.1～9.0g/100g。
实施例7：德氏乳杆菌DMLD-H1应用于发酵奶片的生产
将德氏乳杆菌DMLD-H1冻干粉置于MRS培养基中，于30～40℃静止培养 18～36h后，制成种子液，使其的活菌数分别达到108cfu/mL以上；以1～10％的体积百分比，将德氏乳杆菌种子液分别置于发酵培养基中，于30～40℃静止培养18～36h后，制成发酵液，使其的活菌数分别达到108cfu/mL以上；经过冻干后得德氏乳杆菌冻干粉活菌数达1010cfu/g以上；将葡萄糖6％、白砂糖 6.8％、可压性淀粉5％、硬脂酸镁1.6％、糊精2.7％粉碎后过筛得到基粉，加入德氏乳杆菌DMLD-H1冻干粉6％、全脂奶粉12.5％、水果粉混合搅拌均匀后，进行压片即可制得富含德氏乳杆菌DMLD-H1的奶片，活菌数达1010cfu/g。
实施例8：德氏乳杆菌DMLD-H1应用于凝固型和搅拌型发酵乳生产将德氏乳杆菌DMLD-H1与市售发酵剂进行凝乳效果对比如下：
序号 凝乳时间 pH 酸度/°T
DMLD-H1 4.5 4.3 82.4
Y1(市售) 5 4.6 73
Y2(市售) 5.5 4.5 75
用1mL无菌水重悬植物乳杆菌冻干粉，然后全部转接至MRS液体培养基中，于37℃下培养16～20h，再以5～10％接种量转接至新鲜的液体培养基中活化3次，于6000r/min低温离心收集菌体，并将其全部转接至发酵用奶液在35℃下活化培养2～3次，即得德氏乳杆菌发酵剂；所述活化用奶液为12.5％的全脂乳粉、8.5％蔗糖等原料混合均匀后，经消毒而成。将鲜奶、8.5％蔗糖、0.1％稳定剂粉，按质量体积比混合均匀后,预热至60℃在18Mpa下均质，并于95℃消毒5min后降温至37℃，备用；接种和发酵按体积比5％的的德氏乳杆菌发酵剂加入发酵用奶液中，于37℃进行发酵，当滴定酸度达到75°T后终止发酵，得到发酵乳，发酵终点的、持水力和活菌数分别为4.3、86.03％和 9.20×109cfu/mL，口感质量符合要求，酸度为75～80°T，蛋白质为3.0～3.2g/100g，脂肪含量为3.1～3.4g/100g，非脂乳固体含量为8.1～9.0g/100g。若将经过上述步骤得到的凝固型发酵乳,经过蠕动泵破乳,即为搅拌型发酵乳。
实施例9：德氏乳杆菌DMLD-H1应用于酸奶饮料的生产
将德氏乳杆菌DMLD-H1冻干粉置于MRS培养基中，于30～40℃静止培养 18～36h后，制成种子液，使其的活菌数分别达到108cfu/mL以上；以1～10％的体积百分比，将德氏乳杆菌种子液分别置于发酵培养基中，于30～40℃静止培养18～36h后，制成发酵液，使其的活菌数分别达到108cfu/mL以上；经过冻干后得德氏乳杆菌冻干粉活菌数达1010cfu/g以上；按重量计，将牛奶80％，白砂糖6％，德氏乳杆菌DMLD-H1冻干粉，在37℃下发酵6小时，均质杀菌后进行冷却无菌罐装后即可获得酸奶饮料成品。所获得的水果酸奶饮料酸度达到75～80°T，口感酸爽适宜，适合工业化生产。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种德氏乳杆菌及直投式德氏乳杆菌发酵剂的制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1385
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcctataaa ggttatccca ccgactttgg gcattgcaga cttccatggt gtgacgggcg 60
gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcgtgct gatccgcgat tactagcgat 120
tccagcttcg tgcaggcgag ttgcagcctg cagtccgaac tgagaacagc tttaagagat 180
ccgcttaccc tcgcgggttc gcttctcgtt gtactgccca ttgtagcacg tgtgtagccc 240
aggtcataag gggcatgatg acttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc 300
agtctcttta gagtgcccaa cttaatgatg gcaactaaag acaagggttg cgctcgttgc 360
gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccatgcacca cctgtctctg 420
cgtccccgaa gggaaccacc tatctctagg tgtagcgcag gatgtcaaga cctggtaagg 480
ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat 540
tcctttgagt ttcaaccttg cggtcgtact ccccaggcgg agcgcttaat gcgtttgctg 600
cggcactgag gaccggaaag tccccaacac ctagcgctca tcgtttacgg catggactac 660
cagggtatct aatcctgttc gctacccatg ctttcgagcc tcagcgtcag ttgcagacca 720
gagagccgcc ttcgccactg gtgttcttcc atatatctac gcattccacc gctacacatg 780
gaattccact ctcctcttct gcactcaaga atgacagttt ccgatgcagt tccacggttg 840
agccgtgggc tttcacatca gacttatcat tccgcctgcg ctcgctttac gcccaataaa 900
tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtgac 960
tttctggttg attaccgtca aataaagacc agttactgcc tctatccttc ttcaccaaca 1020
acagagcttt acgatccgaa aaccttcttc actcacgcgg cgttgctcca tcagacttgc 1080
gtccattgtg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtttgggccg tgtctcagtc 1140
ccaatgtggc cgatcagtct ctcaactcgg ctacgcatca ttgccttggt aggcctttac 1200
cccaccaact agctaatgcg ccgcgggctc atcctaaagt gacagcttac gccgcctttc 1260
aaacttgaat catgcgattc atgttgttat ccggtattag cacctgtttc caagtggtat 1320
cccagtcttt agggcagatt gcccacgtgt tactcaccca tccgccgcta gcgtccaaca 1380
aatca 1385

Claims (8)

1.一种德氏乳杆菌，其特征在于，所述德氏乳杆菌为（Lactobacillus delbrueckii）DMLD-H1，已于2019年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，保藏编号为GDMCC NO.60645。
2.一种直投式德氏乳杆菌发酵剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将权利要求1所述德氏乳杆菌的冻干粉置于MRS培养基中分别进行两次活化后得种子发酵剂，该种子发酵剂的菌含量为108~109CFU/mL；
（2）以体积比为3~8：100的比例，将种子发酵剂接入高密度培养基中，于36~40℃下进行发酵培养，16~24h后收集发酵菌液；
（3）将发酵液离心，舍弃上清液，用灭菌后的生理盐水清洗沉淀，收集菌泥；
（4）在菌泥中，按复合保护剂与菌泥的体积比为1~5:1加入复合保护剂，混合均匀后得到保护剂菌液；
（5）将含保护剂的菌悬液在-20~-60℃下预冻2~6h后与真空冷冻干燥机中干燥18~36h得冻干粉；
以重量份计，所述高密度培养基的配方为：酪蛋白消化物0.8~1.0份，牛肉膏粉0.6~1.0份，酵母膏粉0.3~0.5份，柠檬酸三铵0.1~0.2份，乙酸钠0.4~0.5份，硫酸锰0.005~0.010份，磷酸氢二钾0.1~0.2份，葡萄糖1.5~2.0份，吐温80 0.1~0.2份，低聚果糖1.8~2.2份，细菌学蛋白胨1.8~2.0份，硫酸镁0.04~0.06份；
以重量份数计，所述的复合保护剂为：脱脂乳粉8~12份，海藻糖6~10份，谷氨酸钠4~6份。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述高密度培养基的制备：将上述原料用蒸馏水定容至100份，调节pH至5.7，搅拌溶解均匀后于0.08~0.10MPa，灭菌15~20min，冷却至36~40℃。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的复合保护剂的制备：将上述原料用蒸馏水定容至100份，溶解后搅拌均匀，于0.08~0.10MPa，灭菌15~20min，冷却至常温。
5.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，所述的离心转速为4000~6000rpm，离心时间为10min~20min。
6.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，步骤（5）所得冻干粉，先用湿度为50~60%的恒湿空气将其温度恢复到常温，再用气流包装机进行铝塑包装。
7.权利要求1~6任意一项所述方法制备的直投式德氏乳杆菌发酵剂，其特征在于，所述发酵剂的水分含量低于3%，活菌数达到1010~1011CFU/g。
8.权利要求7所述直投式德氏乳杆菌发酵剂在制备冰淇淋、果冻、奶片、凝固型酸奶、搅拌型酸奶、酸奶饮料或奶酪中的应用。
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