CN102260632A - 一种酵母工程菌、其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明适用于基因工程技术领域，提供一种酵母工程菌、其制备方法和应用。本发明的酵母工程菌，包含由酵母穿梭质粒和美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因重组构成的重组质粒，美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因序列如SEQ ID NO：1所示。本发明实施例的酵母工程菌，使用酵母作为美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的表达***，实现了基因安全、高效的表达，适用于工业化生产。

Description

一种酵母工程菌、其制备方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种酵母工程菌、其制备方法和应用。 

背景技术

抗菌肽是生物体内在防御外源病原体入侵时产生的小分子多肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，除具有广谱抗细菌、真菌和病毒等病原体作用外，还有抗肿瘤细胞作用和免疫调节作用，在医药卫生、农业生产、食品工业等领域具有广泛的应用前景。抗菌肽作用机制独特，不易产生耐药菌，被认为是传统抗生素替代品。美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05是一种新型的抗菌肽，具有巨大的应用前景。 

但是抗菌肽在体内含量低，分离提纯困难，是制约抗菌肽大规模工业化生产的难题。而且现有的表达***本身也有不足：抗菌肽自身对病原菌具有抑制和杀灭作用，这就难以用原核生物中的大肠杆菌做为表达***；使用病毒表达***存在实验步骤繁琐，条件不易控制等问题；抗菌肽对真核细胞没有抑制作用，但多细胞真核表达***具有生产周期长，生产成本高的缺点。这些都很难实现大规模的工业生产。 

因此，美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的表达***问题，成为影 响美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05应用的一大瓶颈。 

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供一种酵母工程菌，以解决现有技术中美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因不能安全、高效表达的技术问题。 

本发明实施例是这样实现的， 

一种酵母工程菌，该酵母工程菌包含由酵母穿梭质粒和美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因重组构成的重组质粒，美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因序列如SEQ ID NO：1所示。 

以及一种酵母工程菌的制备方法，具体步骤如下： 

扩增美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因； 

将美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因和酵母穿梭质粒重组，得到重组质粒； 

将重组质粒转化至酵母细胞中，恢复培养，得到含有美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的酵母工程菌，美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因序列如SEQ ID NO：1所示。 

本发明实施例进一步提供上述酵母工程菌在食品、防腐剂、饲料或医药领域的应用。 

本发明实施例的酵母工程菌，使用酵母作为美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的表达***，实现了基因安全、高效的表达，适用于工业化生产。 

附图说明

图1是本发明实施例的重组质粒的结构示意图； 

图2是本发明实施例的重组质粒的表达框示意图； 

图3是本发明实施例的酵母工程菌PCR凝胶电泳结果图； 

图4是本发明实施例的美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05进行SDS-PAGE鉴定结果图； 

图5是本发明实施例美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05抑菌试验结果图。 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

一种酵母工程菌，该酵母工程菌包含由酵母穿梭质粒和美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因重组构成的重组质粒，美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因序列如SEQ ID NO：1所示。 

本发明实施例的酵母工程菌中，重组质粒由酵母穿梭质粒和美洲商路抗菌肽Pa-AMP05基因重组而成，该重组质粒在酵母细胞基因组之外，游离于酵母细胞质之中。酵母穿梭质粒是美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的表达载体。将酵母工程菌扩大培养，其基因组得到表达，同时本发明实施例的酵母工程菌中的重组质粒也得到表达。 

本发明实施例中的酵母，包括各种酵母，例如毕赤酵母、酿酒酵母，优选的为酿酒酵母，其中酿酒酵母，包括但不限于酒精酵母、汉逊酵母、假丝酵母等，优选的为酿酒酵母S78。酿酒酵母含有符合机体需求的优质蛋白、膳食纤维、复合维生素B和有机铬、锌、硒、铁、钙等元素，其本身即是一种纯天然、无污染、生物态的健康营养源。酿酒酵母是食品级的表达***，其表达产物安全无毒，使得本发明实施例的酵母工程菌的表达产物中不会掺杂有害物质。同时酵母遗传背景清楚，适用于工业化生产。 

本发明实施例对酵母穿梭质粒没有具体的限制，可以为各种酵母穿梭质粒，只要能够在酵母细胞中作为表达载体即可，包括含有诱导型启动子的酵母穿梭质粒，还包括含有非诱导型启动子的酵母穿梭质粒，这些酵母穿梭质粒都能够作为美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的表达载体，使得美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因在酿酒酵母中能够得到表达。诱导型启动子，在基因表达中，需要加入诱导剂才能启动基因的表达，非诱导型的启动子即在基因表达中不需要加入诱导剂，基因也能够得到表达。例如酵母穿梭质粒pYES2，以半乳糖为诱导剂；酵母穿梭质粒pYES6/CT，也以半乳糖为诱导剂以及酵母穿梭质粒pYX212等。非诱导型启动子优选的为酵母穿梭质粒pVT102U/α。酵母穿梭质粒pVT102U/α含有非诱导型启动子，使得上述重组质粒在表达过程中，不需要加入任何的诱导剂，避免了表达产物中混入诱导剂杂质，例如甲醇，保证了表达产物的安全。本酵母穿梭质粒pVT102U/α是分泌型表达载体，通过α因子的信号肽的作用，能够将 表达产物分泌到酵母细胞外，也简化了表达产物分离提纯的过程，节约成本。 

另外，请参见图2，图2显示以酵母穿梭质粒pVT102U/α作为美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的表达载体时，重组质粒所具有的表达框： 

ADH1-α-MFL-抗菌肽Pa-AMP05-TT 

其中ADH1为启动子，α-MFL为α因子信号肽的碱基序列，TT是终止子，抗菌肽Pa-AMP05是指美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05的碱基序列，具体见于SEQ ID NO：1。美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因表达的抗菌肽蛋白Pa-AMP05的N端区域与α因子的信号肽融合，信号肽引导着整个融合蛋白分泌到酵母细胞外的培养基中；α因子的信号肽带有前体加工酶Kex2的酶切位点，融合蛋白在酵母本身分泌的Kex2的作用下切掉信号肽而直接得到具有天然构象和生物活性的目标抗菌肽Pa-AMP05蛋白。 

本发明实施例还提供一种酵母工程菌的制备方法，包括以下步骤： 

a)扩增美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因； 

b)将美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因和酵母穿梭质粒重组，得到重组质粒； 

c)将重组质粒转化至酵母细胞中，恢复培养，得到含有美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的酵母工程菌，美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因序列如SEQ ID NO：1所示。 

将本发明实施例的制备方法所得到的酵母工程菌需要进行扩大培养，然后进行分离提纯，即可以得到美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05，美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因所表达的美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05的氨基酸序列见于SEQ ID NO：4。 

具体地，本发明实施例的制备方法如下： 

在步骤S01中扩增美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因。 

本发明实施例所使用的美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因来源于美洲商陆抗菌肽种子CDNA文库(专利号：200810065860.8)。 

设计美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的上游引物和下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物序列如SEQ ID NO：3所示。在上游引物序列中引入限制性内切酶XbaI的酶切位点，下游引物序列中引入限制性内切酶HindIII的酶切位点。具体如下： 

上游引物：5’-CTAGAGATCTGCTGGTTGTATT-3’，下划线为限制性内切酶XbaI的酶切位点； 

下游引物：5’-CCGGGTTCGAATTATCTA-3’，下划线为限制性内切酶HindIII的酶切位点， 

以pPICZ/Pa-AMP05质粒为模板，进行PCR扩增反应，PCR的条件为：94℃5min一个循环；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min 30个循环；72℃10min一个循环，PCR反应体系为 

pPICZ/Pa-AMP05        1μl 

上游引物(5uM)         1μl 

下游引物(5uM)         1μl 

rTaq             12.5μl 

水               9.5μl 

其中，pPICZ/Pa-AMP05质粒为pPICZ质粒和美洲抗菌肽Pa-AMP05基因重组后的质粒，该重组方法为常规的重组方法，在此不做阐述。 

在步骤S02中对PCR扩增产物的测序验证。 

进一步，在美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因扩增后，需要对扩增后的基因片段进行测定，利用DNA测序试剂盒进行测序。测序的过程为：反应总体系为10μl：T载体(PMD18-T Simple Vector)0.5μl，Solution I(即T载体试剂盒中的Solution I)5μl，PCR基因产物4.5μl。以上反应物于4℃条件下连接15小时，将上述PCR基因产物连入T载体得到含有美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的T载体。然后转入大肠杆菌E.coli TOP10感受态中，利用T载体自身带有的抗氨苄青霉素(Amp)的特性进行筛选，挑取阳性单菌落克隆进行菌落PCR验证，PCR反应体系和扩增条件和步骤S01中相同。 

将上述菌落PCR初步验证正确的阳性克隆进行细胞培养，抽提质粒，进行DNA测序，测序得到美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因序列如下： 

GCTGGTTGTATTAAAAATGGTGGTAGATGTGTTGCTTCTGGTGGTCCACCATATTGTTGTTCTAATTATTGTTATAGACAAGTTGGTTGGGCTCATAGATATTGTAAAAATAGATAA。将测序所得到的序列和SEQ ID NO：1对比后可知，步骤S01中扩增美洲商陆抗菌肽 Pa-AMP05基因是成功的。 

在步骤S03中将美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因和酵母穿梭质粒重组。 

将上述步骤S02中经过测序验证正确的质粒和酵母穿梭质粒用限制性内切酶XbaI和HindIII进行双酶切。双酶切反应体系如下： 

另外，步骤S01之后不经过步骤S02的测序，进行步骤S03的双酶切，反应体系为： 

将双酶切后的产物进行回收，将美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因与酵母穿梭质粒按5～10：1的摩尔比将上述双酶切产物混合，并加入1μl的T4DNA连接酶和2μl的10×连接缓冲液，16℃水浴中连接反应15小时，构建美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因和酵母穿梭质粒的重组质粒。 

在步骤S04中将重组质粒转入酵母细胞中，得到含有美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的酵母工程菌。 

取80μl酵母细胞感受态与5～10μl重组质粒混合均匀，转入到冰预冷的0.2cm电转槽中，将混合液在冰上放置5min；进行1500V，5ms电击，加入1ml恢复培养液，于30℃培养箱中恢复培养，培养 时间没有限制，一般为1小时以上，优选为2小时，得到含有美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的酵母工程菌。 

本发明的有益效果： 

本发明实施例的酵母工程菌，通过使用酵母穿梭质粒pVT102U/α，酵母穿梭质粒pVT102U/α含有非诱导型启动子，使得上述重组质粒在表达过程中，不需要加入任何的诱导剂，避免了表达产物中混入诱导剂杂质，例如甲醇，保证了表达产物的安全性； 

同时使得本实施例的重组质粒含有如下的表达框： 

ADH1-α-MFL-抗菌肽Pa-AMP05-TT， 

其中ADH1为启动子，α-MFL为α因子信号肽的碱基序列，TT是终止子，抗菌肽Pa-AMP05是指美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05的碱基序列，具体见于SEQ ID NO：1。美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因表达的抗菌肽蛋白Pa-AMP05的N端区域与α因子的信号肽融合，信号肽引导着整个融合蛋白分泌到酵母细胞外的培养基中；α因子的信号肽带有前体加工酶Kex2的酶切位点，融合蛋白在酵母本身分泌的Kex2的作用下切掉信号肽而直接得到具有天然构象和生物活性的目标抗菌肽Pa-AMP05蛋白，另外，由于α因子的信号肽的作用，将抗菌肽蛋白Pa-AMP05的表达产物引导分泌在酿酒酵母细胞之外，这也大大简化了表达产物的分离提纯过程，降低了成本，同时也保持了美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05的活性； 

酿酒酵母是食品级的表达***，其表达产物安全无毒，本发明实施例以酿酒酵母作为美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的表达***，保 证了表达产物安全无毒，不会掺杂有害的表达产物，同时酵母作为单细胞真核表达***，遗传背景清楚，适用于工业化生产。由于使用酿酒酵母S78，使得酵母工程菌在后续的扩大培养中所使用的培养基成本低廉、组分简单，这大大简化了表达产物的分离、纯化过程，降低了成本。 

本发明实施例的制备方法，操作简单，简便，适用于工业化生产。 

以下结合实施例对本发明实施例进行详细阐述： 

实施例一 

一种酵母工程菌，该酵母为酿酒酵母S78，该酵母工程菌包含酵母穿梭质粒pVT102U/α和美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因重组构成的重组质粒，美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因序列如SEQ ID NO：1所示，该酿酒酵母工程菌的保藏号为CGMCC 3681。 

请参阅图1，图1显示本发明实施例工程菌中重组质粒的结构图，该重组质粒以酵母穿梭质粒pVT102U/α为载体，重组了美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因，该重组质粒的表达框为ADH1-α-MFL-Pa-AMP05-TT，其中ADH1为启动子，α-MFL为α因子信号肽的碱基序列，TT是终止子，抗菌肽Pa-AMP05是指美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05的碱基序列。 

实施例二 

本发明实施例酵母工程菌的制备方法，具体步骤如下： 

步骤S201扩增美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因。 

设计美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的上游引物和下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物序列如SEQ ID NO：3所示。在上游引物序列中引入限制性内切酶XbaI的酶切位点，下游引物序列中引入限制性内切酶HindIII的酶切位点。具体如下： 

上游引物：5’-CTAGAGATCTGCTGGTTGTATT-3’，下划线为限制性内切酶XbaI的酶切位点； 

下游引物：5’-CCGGGTTCGAATTATCTA-3’，下划线为限制性内切酶HindIII的酶切位点， 

以pPICZ/Pa-AMP05质粒为模板，进行PCR扩增反应，PCR的条件为：94℃5min一个循环；94℃30see，55℃30see，72℃1min 30个循环；72℃10min一个循环，PCR反应体系为25μl体系： 

pPICZ/Pa-AMP05       1μl 

上游引物(5uM)        1μl 

下游引物(5uM)        1μl 

rTaq                 12.5μl 

水                   9.5μl 

步骤S202对PCR扩增产物的测序验证。 

测序的过程为：反应总体系为10μl：T载体(PMD18-T Simple Vector)0.5μl，Solution I 5μl，PCR基因产物4.5μl。以上反应物于5℃条件下连接17小时，将上述PCR基因产物连入T载体得到含有美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的T载体。然后转入大肠杆菌E.coliTOP10感受态中，利用T载体自身带有的抗氨苄青霉素(Amp)的 特性进行筛选，挑取阳性单菌落克隆进行菌落PCR验证，PCR反应体系和扩增条件和步骤S201中相同。 

将上述菌落PCR初步验证正确的阳性克隆进行细胞培养，抽提质粒，进行DNA测序，测序得到美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因序列如下： 

GCTGGTTGTATTAAAAATGGTGGTAGATGTGTTGCTTCTGGTGGTCCACCATATTGTTGTTCTAATTATTGTTATAGACAAGTTGGTTGGGCTCATAGATATTGTAAAAATAGATAA。将测序所得到的序列和SEQ ID NO：1对比后可知，步骤S201中扩增美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因是成功的。美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因所表达的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。 

在步骤S203中将美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因和酵母穿梭质粒重组。 

将上述步骤S202中经过测序验证正确的含有美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的T载体和酵母穿梭质粒pVT102U/α用限制性内切酶XbaI和HindIII进行双酶切。双酶切反应体系如下： 

将双酶切后的产物进行回收，按美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因与酵母穿梭质粒pVT102U/α摩尔比为6：1的比例将上述双酶切产物混合，并加入1μl的T4DNA连接酶和2μl的10×连接缓冲液，17℃水浴中连接反应14小时，构建美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因和酵母穿梭质粒pVT102U/α的重组质粒。 

在步骤S104中将重组质粒转入酿酒酵母S78中，得到含有美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的酵母工程菌。 

取80μl酿酒酵母S78感受态细胞与6μl重组质粒混合均匀，转入到冰预冷的0.2cm电转槽中，将混合液在冰上放置5min；进行1500V，5ms电击，加入1ml恢复培养液，于30℃培养箱中培养2h得到含有美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的酵母工程菌，即酵母工程菌S78/Pa-AMP05。 

上述含有美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的酵母工程菌的鉴定 

制备得到上述酵母工程菌S78/Pa-AMP05后，将恢复培养液涂布于筛选培养基(SCR)中，30℃培养至单菌落出现。挑取阳性克隆进行液体培养，提取质粒，对所提取的质粒用XbaI及HindIII限制性内切酶进行双酶切及PCR鉴定，PCR的条件和步骤S101中相同。 

请参阅图3，图3显示本步骤中PCR结果。其中，1、2、3、4分别为含美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的酿酒酵母工程菌的凝胶电泳图；5为本实施例步骤S102中得到的含有美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的T载体的凝胶电泳图，含有美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的T载体作为阳性对照；M为美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的2000bp分子量标准。从图3可知，本发明实施例的制备方法成功完成抗菌肽Pa-AMP05基因的酿酒酵母表达载体构建，抗菌肽Pa-AMP05基因已成功重组到穿梭质粒pVT102U/α中。 

将筛选培养基中筛选得到的阳性本发明实施例的酿酒酵母工程菌S78/Pa-AMP05接种于YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中，30℃，200rpm进行培养36～48h后，离心取上清液。经CM-cellulose23柱层析纯化，平衡液为0.05mol/L HAc，梯度洗脱液为0.05～1mol/L HAc，流速为0.45ml/min。将收集的纯化样品经冷冻干燥后，进行SDS-PAGE鉴定，请参阅图4，图4显示本发明实施例的美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的表达产物美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05的分子量。其中，A：阴性对照：空载体酵母表达产物；B：阳性对照：猪白介素10；C：抗菌肽Pa-AMP-05，经过测定，本发 明实施例的美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05的分子量为4.1KD。 

将上述冷冻干燥的美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05蛋白用PBS溶解，按梯度稀释。准备0.563g/L蛋白标准液(-20℃冷冻保存)。反应体系如下： 

考马斯亮兰蛋白测定体系 

将以上各管溶液混匀，静置10min，于595nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测个管OD值。按公式计算抗菌肽蛋白的浓度分别为100ug/mL，200ug/mL，800ug/mL。 

采用标准琼脂稀释法，取系列浓度的美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05稀释液与双倍浓度MH琼脂等体积混合，摇匀后迅速倒平板，约20ml/板。同时，以氨苄青霉素为阳性对照，以空载体酵母发酵液为空白对照。将试验菌株制成浓度相当于相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液。1∶10稀释后，取1μl接种于琼脂平板表面(每点菌数约为10⁴cfu)。接种好后置37℃培养箱中孵育16～20h，观察结果。请参阅图5，图5显示美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05抑菌效果。其中，A：为阳性对照， 100μg/ml氨苄青霉素；B：为空白对照，空载体酵母发酵液，C：为美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05抑菌实验细菌生长情况。图中1：为大肠杆菌；2：为金黄色葡萄球菌。 

美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05对大肠杆菌的MIC值为5ug/mL； 

美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05对金黄葡萄球菌的的MIC值为2ug/mL。 

本发明实施例酿酒酵母工程菌保藏信息如下， 

保藏单位名称： 

中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心； 

保藏单位地址： 

北京市朝阳区北辰西路1号院3号； 

保藏日期： 

2010年3月20日； 

保藏编号： 

CGMCC No.3681 

拉丁文分类命名： 

Saccharomyces cerivisae。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

序列表

 

Claims (8)

1.一种酵母工程菌，其特征在于：所述酵母工程菌包含由酵母穿梭质粒和美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因重组构成的重组质粒，所述美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母穿梭质粒的启动子为非诱导型启动子。

3.如权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母穿梭质粒的启动子为诱导型启动子。

4.如权利要求2所述的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母穿梭质粒为酵母穿梭质粒pVT102U/α，所述重组质粒的表达框为ADH1-α-MFL-抗菌肽Pa-AMP05-TT，其中ADH1为启动子，α-MFL为α因子信号肽的碱基序列，TT为终止子。

5.如权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母S78。

6.一种酵母工程菌的制备方法，包括如下步骤：

扩增美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因；

将美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因和酵母穿梭质粒重组，得到重组质粒；

将重组质粒转化至酵母细胞中，恢复培养，得到含有美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的酵母工程菌，所述美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因序列如SEQ ID NO：1所示。

7.如权利要求6所述的酵母工程菌的制备方法，其特征在于，所述扩增美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05基因的步骤中，使用的上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，使用的下游引物序列如SEQ ID NO：3所示。

8.如权利要求1-5任一项所述的酵母工程菌在食品、防腐剂、饲料或医药中的应用。

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