CN101233234A - 使用毛细管膜生产次级代谢物 - Google Patents

使用毛细管膜生产次级代谢物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了在限氧或厌氧培养条件下生产次级代谢物和重组产物的方法。该方法包括：提供具有第一侧和第二侧并且具有与其第一侧附着的微生物的生物膜的多孔基质，并且使营养物溶液在限氧或厌氧培养条件下以从其第一侧到其第二侧的方向流过生物膜和基质。所述的微生物包括梭状芽孢杆菌属(Clostridium sp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)、Anaeromyxobacter sp.、脱硫弧菌属(Desulphovibrio sp.)和假丝酵母属(Candida sp.)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)、毕赤氏酵母属(Pichia sp.)、假丝酵母属(Candida sp.)、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)和啤酒糖酵母(Sacharomyces cerevisiae)。

Description

使用毛细管膜生产次级代谢物
发明领域
本发明涉及次级代谢物或重组产物的生产方法，特别地，本发明涉及在限氧条件或厌氧条件下生产次级代谢物和/或重组产物的方法并且涉及在限氧条件或厌氧条件下生产所述次级代谢物和/或重组产物的设备。
发明背景
次级代谢物
已经研发了用于生产天然产物的大部分技术以便改善在需氧发酵中的氧传递(oxygen mass transfer)。几乎从未利用它们产生次级代谢物的能力。研发厌氧发酵主要用于废水处理和转染有机物或乙醇生产这类生物工艺。
次级代谢物在固体培养物中的分化时和/或在液体培养物中的稳定期时产生。它们一般在分批或补料分批模式中的浸没液体培养物中产生。一般遵循分批培养的这些事件为：
1.将接种物导入准备的生物反应器。它一般表现出迟滞期，而生物体或培养物适合于其环境。
2.一旦生物体一般通过二***开始生长，指数期随之发生，其中培养物生物量浓度快速增加，同时营养物耗尽。初级代谢产物和代谢废物累积。
3.最终培养物中的营养物耗尽并且废物累积至培养物生物量浓度不再增加的程度。这种不再生长期称作稳定期。就在此过程中产生次级代谢物。补料分批培养包括以低水平添加营养物和或稀释废物以便延长稳定期。
影响次级代谢物产量的生物反应器的容量生产能力(VolumetricProductivity)的因素包括：低剪切环境；高生物量浓度；培养物的分化；用于固定生物量的固相基质的存在；和良好的营养物生物量转移。尽管已经研发了用于在需氧培养条件下提高次级代谢物产量的***，但是在厌氧条件下有效生产次级代谢物几乎被忽略。
厌氧微生物的次级代谢物与生命科学具有高度关联性。自此以后，厌氧微生物一般居留于罕见的生态环境中并且为具有罕见环境耐受性的代谢物和用于药物筛选的新代谢物的有意义的来源。此外，致病生物体的数量在厌氧条件下繁殖并且它们产生的代谢物为细胞信号传导机制的有价值的指示剂，致病因素，潜在药物靶标的鉴定标记或指示剂。因此，用于生产次级代谢物，特别是使生物膜形成和培养物分化的次级代谢物的有效方法对生命科学工业而言具有相当的价值。
由于在培养基领域取得了显著发展，所以用于在限氧条件下以高细胞密度培养微生物的最佳策略是可能的。目前可以对上述在需氧条件下检验的生物体进行筛选以便生产可以在限氧条件下诱导的天然产物，诸如在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)生产表面活性肽(Davies等1999)。
重组产物
由微生物产生几种工业上重要的化合物(包括天然和重组产物)。药物和其它工业的重组产物的市场在近年来得到增加。由各种微生物表达***产生重组产物，所述重组产物包括但不限于酶、激素、抗体、抗体片段、病毒-类颗粒、肽类、DNA和RNA片段。产物还可以包括由重组合成酶的表达产物产生的化学品。
已经改造了各种表达宿主以便优化重组产物生产、溶解和分泌。表达宿主包括许多细菌种类、真菌、植物细胞、昆虫细胞、原生动物和哺乳动物细胞。大部分表达***为需氧的，由此需要输入相当大的能量以便在浸没培养生物反应器中维持高氧传递。大部分生物加工技术集中在一般通过补量分批培养方式在生物反应器中获得极高的细胞浓度。高起始基质浓度和培养物流动性是实现高细胞密度生长的主要障碍。通常的情况是，一旦存在足够的生物量，就诱导生产宿主表达所关注的重组产物。这种诱导一般为在适当时间加入的分子，或为作为废物，初级或次级代谢物由生产宿主产生的代谢物。一旦培养物处于稳定期，则生产重组蛋白的策略为典型的，因为：
1)它能够生产对生产生物体而言无毒性的产物。
2)如果生物量浓度在反应器中极高，那么容量生产能力得到改善。
3)生产产物的前体一般为在初级生长期过程中累积的初级代谢产物。
通常难以以最佳方式定时添加重组蛋白诱导物，使得在培养物达到稳定期并且不再过快或过晚时添加诱导物。当在最佳实验过程中的不同条件下进行平行多重培养时特别困难。因此，已经研发了″自发-诱导″表达***，已经将其进行了改造以便一旦培养物达到稳定期，就自动启动重组蛋白表达(Studier，2005)。
尽管大部分重组蛋白表达宿主为需氧生物体，但是因氧传递限制而导致高密度培养受限。因此，已经证实在研发能够厌氧生长的表达宿主，诸如乳酸菌(LAB)方面中有意义。
已经考虑到LAB作为重组蛋白表达宿主具有重要意义。这是因为LAB是革兰氏阳性菌并且由此更适于分泌蛋白质，且产生通常污染来自革兰氏阴性表达宿主的产物的免疫原性膜成分的可能性低。它们为兼性厌氧菌，由此一般在浸没培养中经历的限制氧传递的生长限制并不适用。还研发了在稳定期开始时具有″自动诱导″重组蛋白表达的某些LAB表达宿主(Kuipers等，1997；de Vos，1999)。某些实例如下：
1)乳链菌肽的诱导：乳链菌肽是LAB产生的次级代谢物和细胞信号传导分子。因此，它在培养物成熟并且处于稳定期时产生并且在正确时间时自动调节重组蛋白生产诱导(Xu Xia Zhou等2006)。
2)低pH，乳酸累积和/或稳定期开始的诱导：用于由乳球菌属(Lactococcus sp.)表达重组蛋白的p170***通过累积乳酸/乳酸盐诱导，而乳酸/乳酸盐为在LAB生长期过程中累积的代谢废物，导致pH下降，这可能充分减缓生长以便诱导稳定期开始。除被乳酸/乳酸盐浓度增加诱导外，该***还因营养物限制而导致通过稳定期开始诱导。该***由此在适当时间自动调节蛋白质产物表达的诱导(Madsen等1999)。
在分批培养中这些***产生的问题在于生产期一般十分短，这是因生长抑制或毒性代谢废物的典型过度类累积并且因为过度营养物压迫杀伤培养物所致。因此，能够连续除去废物和延长至少部分培养物的稳定期的技术对重组蛋白生产***的性能具有积极影响。
主要在高密度细胞培养物中培养最广泛实验的细菌表达宿主大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。尽管该生物体的特定生长率在需氧条件下最高，但是它能够在厌氧条件下生长。已经改造了大肠杆菌(E.coli)表达***以便生产难以表达的、毒性的和/或不溶性产物。能够连续生产和提取在较高浓度下不溶或对宿主生物体具有毒性的产物的发酵技术提供了超过传统浸没发酵技术的优点。
定义：
本文任意处涉及的″微生物″必须解释为意旨涉及包括能够在限氧或厌氧条件下生长和代谢的细菌和真菌。
本文任意处涉及的″稳定期″必须解释为意旨受限生长或基本上平衡生长和死亡的期限，该期限一般在补料分批培养或连续培养微生物中的生长初期后即刻发生。
本文任意处涉及的″重组蛋白″与″重组产物″为同义词并且必须解释为意旨任意的重组产物或其产物，只要它为与表达宿主同源或异源的生物合成产物，其生产可以在稳定期开始时或过程中通过某些机制诱导。该产物可以由表达宿主分泌入胞外环境或保留在胞内。重组产物不限于蛋白质。
本文任意处涉及的″营养物溶液″必须解释为意旨包含微生物生长所需的一种或多种营养物并且包括至少一种限制生长的营养物的液体溶液。该营养物溶液还可以携带启动重组产物表达所需的诱导物。
本文任意处涉及的″诱导物″必须解释为意旨在所述营养物溶液或生物合成产物中包括的生物或合成化学品，所述的生物合成产物由固定化表达宿主在生长过程中产生并且用作在调节所述重组蛋白表达的相关启动子控制下调节重组蛋白生产的工具。
本文任意处涉及的″渗透物(permeate)″必须解释为意旨已经通过生物膜和基质并且可以携带分泌的产物，代谢废物和/或营养物溶液通过生物膜过程中微生物未代谢的营养物的剩余部分的消耗的营养物溶液或产物流。
发明概述
本发明的一个方面提供了在限氧或厌氧培养条件下生产次级代谢物的方法，该方法包括：
提供具有第一侧和第二侧的多孔基质，并且所述多孔基质上具有与其第一侧附着的微生物的生物膜(biofilm of microorganisms)，该基质的构造允许次级代谢物通过其中并且防止微生物细胞通过其中；并且
使营养物溶液在限氧或厌氧培养条件下以从其第一侧到达其第二侧的方向流过生物膜和基质，速率足够低以便建立通过生物膜的营养物梯度，其中远离基质的营养物浓度相对较高并且足够高以便支持微生物的初级生长，并且其中接近基质的营养物浓度相对较低并且足够低以使诱导和维持微生物的稳定期且由此导致微生物产生至少一种次级代谢物，通过基质的营养物溶液的流携带所述次级代谢物经过该基质到达其第二侧，在那里可以收集分泌的次级代谢物，而同时来自生物膜的微生物细胞保持在其第一侧上。
所谓限氧或厌氧条件意旨没有或基本上没有氧存在的条件。然而，可以想像在某些情况中，如果存在低氧浓度，那么仍然可以实施本发明的方法。
所述的微生物可以为微生物菌株的基本上纯的培养物或不同微生物的混合培养物。这些微生物可以选自梭状芽孢杆菌属(Clostridiumsp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)、脱硫脱硫弧菌(Desulphovibrio desulfuricans)和假丝酵母属(Candida sp.)。
生产次级代谢物的方法可以在微生物的生长和产物形成范围内的温度下进行。生产次级代谢物的方法可以在2-109℃，优选在20-32℃，例如在30℃的温度下进行。
生产次级代谢物的方法可以在微生物生长和产物形成范围内的初始pH下进行。生产次级代谢物的方法可以在1-13，优选5.5-8.5，例如7的初始pH下进行。
生产次级代谢物的方法可以进行只要生物膜或培养物保持存活和能够生产并且不过度致密到阻止产物流过基质的程度。生产次级代谢物的方法可以进行1-30天，优选2-10天，例如4天的期限。
次级代谢物可以由微生物在胞内或胞外产生。可以对分泌由生物膜分泌入营养物流并且在渗透物中收集的胞外代谢物采样并且连续提取，从而改善这类产物的稳定性和容量生产能力。可以通过透化细胞，渗透压休克(osmotic shock)或细胞裂解操作步骤从生物膜中提取胞内次级代谢物。可以从处理的生物量中分离提取胞内产物，其通过使提供给生物膜并从生物反应器中渗透物去除的营养物溶液以相同的方式经基质从第一侧到第二侧过滤提取物。高密度生物膜培养物确保了与生物量相关的代谢物的高产率。
可以理解生物膜的厚度依赖于营养物溶液的营养物含量和培养的微生物类型。该生物膜应具有足够的厚度以便建立通过生物膜的营养物梯度，使得部分生物膜经历营养物饥饿并且进入和维持稳定期生长和次级代谢物产生。该生物膜可以具有0.1-10mm，优选0.1-4mm，例如3mm厚度。
营养物溶液通过生物膜和基质从第一侧到第二侧的流速应使得微生物保持固定化并且次级代谢物生产的最佳容量生产能力得以维持。流速可以为0.01-10个体积营养物溶液/生物反应器体积。
本发明的另一个方面提供了用于在限氧或厌氧条件下生产次级代谢物的设备，该设备包括：
至少一种具有第一侧和第二侧的多孔基质；和
用于在限氧或厌氧培养条件下将营养物溶液进料以便接触微生物的进料装置，在应用中，所述的微生物在基质第一侧上附着并且形成生物膜，所述的进料装置是可操作的以使营养物溶液以从其第一侧到其第二侧的方向流过生物膜和基质，速率足够低以便建立通过生物膜的营养物梯度，其中远离基质的营养物浓度相对较高并且足够高以便支持微生物的初级生长，并且其中接近基质的营养物浓度相对较低并且足够低以使诱导和维持微生物的稳定期且由此导致微生物产生次生代谢产物，基质的构造使得包含产物的营养物溶液通过该基质到达其第二侧并且防止来自生物膜的微生物细胞通过该基质。
进料装置可以包括机械源和气动源中的至少一种，所述的气动源用于使营养物溶液进料以便接触生物膜并且导致营养物溶液流过生物膜和基质。
所述的设备可以包括用于从基质的第二侧收集渗透物的渗透物收集装置。
所述的基质可以包含多孔膜，该多孔膜具有允许包含产物的营养物溶液从其中通过的足够大的孔，但这些孔足够小以防止微生物细胞从其中通过。膜的确切构造可以显著改变。在具体的实施方案中，膜可以为中空纤维膜，毛细管膜的形式，或可以具有管形或平片状构造。
所述的设备可以包括用于多孔基质的外罩(housing)，该外罩在空间上与多孔基质分离。该外罩具有用于营养物溶液的入口和用于从罩中排出渗透物的出口。
本发明的另一个方面提供了在限氧或厌氧培养条件下生产至少一种重组产物的方法，该方法包括：
提供具有第一侧和第二侧并且具有附着在其第一侧上的微生物的生物膜的多孔基质，该基质的构造允许重组产物通过其中并且防止微生物细胞通过其中；并且
使营养物溶液在限氧或厌氧培养条件下以从其第一侧到其第二侧的方向流过生物膜和基质，速率足够低以便建立通过生物膜的具有浓度差的营养物梯度，其中远离基质的营养物浓度相对较高并且足够高以便支持微生物的初级生长，并且其中接近基质的营养物浓度相对较低并且足够低以便进入和维持微生物的稳定期，由此诱导微生物产生至少一种重组产物，通过基质的营养物溶液流携带该重组产物流经过该基质到达其第二侧，在那里可以收集重组产物，而同时来自生物膜的微生物细胞保持在其第一侧上。
所谓限氧或厌氧条件意旨在稳定期生长过程中没有或基本上没有氧存在的条件。然而，可以想像，在某些情况下，如果存在低浓度的氧，也仍然可以实施本发明的方法。
可以以各种方式产生诱导，诸如通过营养耗尽，添加诱导物分子，累积在营养物限制条件下产生的初级代谢产物或次级代谢物等。换句话说，该方法可以使用去阻抑和/或诱导重组基因表达。诱导可以通过将诱导物分子添加到营养物溶液或通过累积在营养物限制条件下产生的初级代谢产物或次级代谢物进行，使得营养物溶液携带所述的诱导物从第一侧经生物膜到达第二侧经过基质和生物膜由此诱导微生物产生所述重组产物。
诱导物可以为任意合适的分子，诸如L-***糖(0.00002-2％)、异丙基b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(0.1-1mM)和甲醇(0.5-1.5％)，它与特异性启动子发生相互作用，使用该特异性启动子改造重组表达***。诱导物的浓度可以改变以便优化可溶性正确折叠的重组或蛋白质产物的表达。
微生物可以为微生物菌株的基本上纯的培养物或不同微生物的混合培养物。所述的微生物可以选自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、大肠埃希氏杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)、毕赤氏酵母属(Pichia sp.)、假丝酵母属、多形汉逊氏酵母(Hansenulapolymorpha)和啤酒糖酵母(Sacharomyces cerevisiae)。
生产重组产物的方法可以在微生物生长和产物形成范围内的温度下进行。生产重组产物的方法可以在2-109℃，优选20-40℃，例如30℃的温度下进行。
就乳酸乳球菌培养物而言，该方法可以在25-32℃的温度下进行。最佳生长温度为30℃。然而，诸如25℃这类较低的生长温度为生长限制性的并且可以延长重组产物生产过程。
就大肠埃希氏杆菌培养物而言，该方法可以在30-40℃的温度下进行。最佳生长温度为37℃。然而，诸如30℃这类较低的生长温度为生长限制性的并且可以用于延长重组产物生产过程期限。
生产重组产物的方法可以在微生物生长和产物形成范围内的初始pH下进行。生产重组产物的方法可以在1-13，优选5.5-8.5，例如7的初始pH下进行。
就乳酸乳球菌培养物而言，该方法可以在5.5-8.5的初始pH下进行。
就大肠埃希氏杆菌培养物而言，该方法可以在5.5-8.5的初始pH下进行。
生产重组产物的方法可以进行只要生物膜或培养物保持存活和能够生产并且不至于过度致密的而阻止产物流过基质即可。生产重组产物的方法可以进行1-30天，优选2-10天，例如4天。
就乳酸乳球菌而言，该方法可以进行4天。
就大肠埃希氏杆菌而言，该方法可以进行1天。
重组产物可以由微生物在胞内或胞外产生。如果微生物分泌，那么可以从第一侧中收集重组产物，或如果微生物在胞内保持，那么可以从生物膜中收集重组产物。胞内代谢物可以保持在胞质内或分泌至周质空间并且使用细胞裂解或细胞透化操作步骤，诸如渗透压休克提取。
营养物溶液可以以足以维持和固定微生物，同时维持通过生物膜的营养物梯度的速率通过生物膜和基质。流速可以根据营养物溶液的营养物含量或培养的微生物类型的不同而不同。流速可以在0.001-10个体积营养物溶液/反应体积/小时。
生物膜厚度可以依赖于营养物溶液的营养物含量和培养的微生物类型。就乳酸乳球菌而言，生物膜可以具有0.1-10mm，例如1-3mm的厚度并且应受到限制，以便将营养物溶液的流速维持在用于保持存活和生产性并且不会过厚而阻止产物流过基质的生物膜或培养物的合适的范围内。
本发明的另一个方面提供了在限氧或厌氧条件下生产重组产物的设备，该设备包括：
至少一种具有第一侧和第二侧的多孔基质；和
用于在限氧或厌氧培养条件下提供营养物溶液进料以便接触微生物的进料装置，在应用中，所述的微生物在基质第一侧上附着并且形成生物膜，所述的进料装置是可操作的以使营养物溶液以从其第一侧到其第二侧的方向流过生物膜和基质，速率足够低以便建立通过生物膜的营养物梯度，其中远离基质的营养物浓度相对较高并且足够高以便支持微生物的初级生长，并且其中接近基质的营养物浓度相对较低并且足够低以使诱导和维持微生物的稳定期，由此诱导微生物产生至少一种重组产物，基质的构造使得包含产物的营养物溶液通过该基质到达其第二侧并且防止微生物细胞从第一侧上的生物膜通过该基质到达第二侧。
进料装置可以包括机械源和气动源，诸如压缩气体中的至少一种，所述的气动源用于使营养物溶液进料以便接触生物膜并且导致营养物溶液流过生物膜和基质。
所述的设备可以包括用于从基质的第二侧收集产物的产物收集装置。
所述的基质可以包含多孔膜，该多孔膜具有允许包含产物的营养物溶液从其中通过的足够大的孔，但这些孔足够小以防止微生物细胞从其中通过。膜的确切构造可以显著改变。在具体的实施方案中，膜可以为中空纤维膜，毛细管膜的形式，或可以具有管形或平片状构造。
所述的设备可以包括用于多孔基质的外罩，该外罩在空间上与多孔基质分离。该外罩具有用于营养物溶液的入口和用于从罩中排出渗透物的出口。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。在本文件中，包括定义中如果出现矛盾之处，那么应放弃本领域技术人员通常理解的术语。优选的方法和设备如下所述，不过，与本文所述类似或等同的方法和设备可以用于实施或测试本发明。将本文提及的所有公开文献，专利申请和其它参考文献完整地引入作为参考。本文披露的方法，设备和实施例仅用于解释目的，但并不指定起限定作用。
附图简述
下文借助于本发明的非限制性实施例，并且参照和如附图中所例示的描述本发明的额外特征。
图1表示本发明设备的侧视立面图。
图2表示图1设备的多孔基质部分的侧视立面图，在其外侧上涂敷了生物膜并且例示了通过该生物膜的营养物溶液流动方式；
图3表示图2的多孔基质的截面平面图，该图沿图2的截面线III-III截取；
图4A-4D表示例示营养物溶液提供给图1设备并且从其中收集产物的不同流体流动方式的方框图；
图5A和5B为表示使用单纤维膜生物反应器(B)在Fluka表面活性肽标准品(A)和在限制氧条件下枯草芽孢杆菌产生的典型样品中检测的表面活性肽异构体分离的HPLC色谱图；
图6A和6B表示使用图1的设备进行乳酸乳球菌PRA290的β-内酰胺酶生产的示意图。使用包含200mM磷酸钠缓冲液(A)或400mM磷酸钠缓冲液(B)的营养物溶液操作生物反应器；且
图7A和7B为SDS-PAGE凝胶照片，其表示在使用生长培养基培养的生物反应器中大肠杆菌pBAD/g111/钙调节蛋白的钙调节蛋白生产，所述的生长培养基中包含0％(对照组)，0.00002％，0.002％或2％的诱导物分子L-***糖。(A)通过渗透压休克操作步骤由生物膜制备蛋白质提取物。(B)通过直接分析变性的相同缓冲液或细胞裂解操作步骤中的可溶性级分中的生物膜制备蛋白质提取物。
优选实施方案的描述
次级代谢物：
就附图中的图1-4而言，一般将本发明在限氧或厌氧条件下生产次级代谢物的设备设计成参比数字10。该设备为实验室规模的附图中的图1中所示的生物反应器10形式，然而，可以理解生物反应器中具体实施的原理可以应用于按比例扩大的或商业化实施方案。
生物反应器10包括陶瓷中空纤维毛细管膜12，其中该膜的末端上***塑料***物14，16与包含陶瓷***物的环氧树脂18。应理解还可以使用其它树脂或机械密封物。玻璃的外罩或反应器外壳20与毛细管膜12同轴排列并且配有在玻璃外罩20上拧紧的末端帽22和23。外罩20包括：用于导入液体营养物进料溶液的进料入口26以使微生物进入多孔基质与外罩之间的空间24；和用于将接种物导入外罩以便附着膜12的接种入口25。外罩进一步包括从外罩中排出进料溶液的进料出口27。陶瓷***物12，14，16包括从外罩中排出渗透物的产物出口28。
在使用中，生物膜32建立在毛细管膜12的外表面30上。这可以通过经毛细管膜12过滤所需微生物的孢子或营养型接种物并且从腔34中并且通过出口28排出任意渗透物实现。腔34由此与出口28保持流通。接种物由此被固定在膜表面30上。膜12具有在内侧上相对薄的多孔表面层36和从表面层36向外呈放射状的相对厚的指状无外表面层的空隙结构38。一般而言，膜12具有约2mm的外径。
将微生物的适当营养物溶液通过营养物入口26导入外罩。使该营养物溶液以从膜的外侧到其内侧的方向流过膜12。产生次级代谢物的基础在于压迫微生物且由此控制次级代谢物产生的营养物饥饿概念。使用膜固定的生物膜生物反应器10，通过经生物膜32产生放射状营养物浓度梯度达到上述结果。作为结果，在暴露的生物膜32外表面的营养物浓度较高，而在膜/生物膜界面30的营养物浓度较低。在附图的图2和3中，为解释的目的，用参比数字I命名高营养物浓度区并且用参比数字II命名低营养物浓度区。在I区中，营养物浓度足够高以便支持微生物的初级生长，而在II区中，营养物浓度足够低以便导致压迫微生物的营养物饥饿，由此诱导和维持微生物的稳定期。在暴露的膜外表面上建立生长和再生细胞的生物膜群，而使次级代谢物在生物膜的II区中延长生产期限。在图3中，示意图″A″描绘了营养物浓度水平(y轴)与距膜表面距离(x轴)的关系。
膜12的多孔性使得次级代谢物能够通过膜进入腔34，同时防止微生物细胞通过膜。作为结果，生物膜的II区中产生的次级代谢物通过从膜外侧进入腔34的营养物溶液流被向内携带入膜的腔34。使用诸如压缩气体气动源或诸如泵这类机械源或压缩气体与泵的组合在压力下促使液体生长培养基通过膜12。当新的生物量由于培养物在营养物溶液中的生长而导致下降(laid down)时，生物膜的厚度增加，直到部分生物膜饥饿并且建立上文所述的营养物梯度。该过程能够使次级代谢物延长生产的期限。该期限在裂解死亡细胞释放污染物或在生物膜耐受性过高而无法通过生长培养基透入膜12时终止。
就附图中的图4A而言，气动源40，诸如压缩气体用于给包含在用于营养物溶液在压力下进料入毛细管外空间44的储器42中的营养物溶液加压的典型流体流动方式确定在生物反应器10外罩与膜12之间。在通过膜12后，在产物收集容器46中收集包含产物的营养物溶液。
就图4B而言，机械源48用于将营养物溶液泵入毛细管外空间44。在通过生物反应器后，从返回至储器42的包含产物的营养物溶液中分离产物。在产物收集容器46中收集分离的产物。
就图4C而言，将气动源40和机械源48组合用于使营养物溶液进料入生物反应器并且从其中提取包含产物的营养物溶液。气动源40位于使营养物溶液进料入毛细管外空间44的生物反应器上游，而机械源位于生物反应器下游并且作为从腔34中提取包含产物的营养物溶液的抽吸泵或真空泵运转，在产物收集容器46中收集包含产物的营养物溶液。
图4D中所示的流体流动方式与图4C中所示的流体流动方式类似，其中唯一的差别在于不使用气动源。
可以理解生物反应器和流体流动方式的确切配置可以显著改变，而仍然可以构成上文确定的基本特征。
本发明的生物反应器因液体营养物溶液通过膜对流而能够将营养物向微生物细胞进行高量转移。这种流动还可以提供从生物反应器中快速移除分泌的产物，同时防止分泌的产物通过膜的任何逆流返回。由于生产后迅速去除产物这一事实，所以因腐败导致的产物损耗最少。生物反应器无需可能损害微生物细胞的机械搅拌。作为结果，生物反应器10中的微生物培养物更具生产性并且产物腐败得以减少。此外，无发泡发生，从而避免了对消泡剂的需求并且能够使用较大比例的反应器容量。当生物量保持在反应器中时，因为无需收集并且产物具有相对高的纯度，所以单元操作减少。生物反应器允许每单位体积中有相对高的细胞密度，导致胞内和胞外产物的容量生产能力较高。在操作时，生物反应器能够延长产生分泌的次级代谢物或与高产率生物量相关的胞内代谢物。
代谢废物的浓度在营养物溶液灌注生物膜时增加，它还可以调节代谢废物累积诱导次级代谢物产生的培养物中产物的形成。
实施例1
枯草芽孢杆菌ATCC 21332-在限氧条件下的表面活性肽(Surfactin)产生
表面活性肽枯草芽孢杆菌不同菌株产生的脂肽类生物表面活性剂。生物表面活性剂通常具有超过化学合成的表面活性剂的生物可降解性，降低的毒性和生物适合性的优点并且在极端温度，pH和盐度下保持其功能(Georgiou等，1992)。表面活性肽还表现出抗微生物(Vollenbrioch等1997a)，抗病毒(Vollenbrioch等1997b)，血纤蛋白凝固抑制(Bernheimer等1970)和抗炎特性。
通常将枯草芽孢杆菌描述为严格需氧细菌，但也有报导可能为厌氧生长(Nakano等1999；Davis等1999)。此外，已经证实表面活性肽的产生水平在限氧生长条件下得到提高(Davis等1999)。还主要通过培养基优化(Cooper等1981；Wei和Chu 1998；Davis等1999；Wei等2003；Wei等2004)，高细胞密度培养和从发酵罐中浓缩和提取泡沫形式的表面活性肽(Davis等2001；Yeh等2006)研发了用于表面活性肽生产的改进的生物反应器和方法设计。
将硝酸铵添加到生长培养基中改善了限氧条件下的生物量产率并且证实促进了表面活性肽产生(Davis等1999)。证实生长培养基缓冲容量的(Wei等2003)，MgSO4和FeSO4(Cooper等1981；Wei等2004)的改善也改善了表面活性肽产率(Wei和Chu 1998；Wei等2003)。
灭菌：
按照标准操作步骤(SOP)对生物反应器进行高压灭菌并且设定厌氧操作。以无菌方式将过滤消毒的各培养基配入培养基供给容器，此后开始进行实验。
接种：
在30℃下用在营养肉汤(Merck)中培养的3ml枯草芽孢杆菌ATCC预接种物接种生物反应器24小时。按照SOP以无菌方式将接种物直接注入各生物反应器的毛细管外空间(ECS)。
操作：
生物反应器的多支管***储存库，其中使用单源压缩空气调节培养基供给。给指定储存库内的20ml生物反应器各自提供来自其自身培养基供给容器的营养物。在各储存库内，给重复的生物反应器提供无机盐培养基(Cooper等1991)富含铁的无机盐培养基(Wei等2003)。
在接种后，在5kPa下将培养基提供给各生物反应器。间隔调整压力以便维持渗透物的pH高于pH6。
分析
定期从生物反应器取样并且记录体积和pH。使用浓HCl将样品的pH调节至～pH2以便沉淀和浓缩表面活性肽，此后在4℃下以4000rpm离心10分钟。倒出上清液并且按照1∶20体积无水乙醇重新悬浮沉淀。将浓缩物转入微量离心管并且在分析前使用微量离心管以14000rpm离心。
通过安装了Xterra C18柱(5μm，3.9mm×150mm)的反相HPLC(waters：分离模块2695，PDA 2696)测定表面活性肽浓度。流动相由30％3.8mM三氟乙酸和70％乙腈组成。所有溶剂均为HPLC级。样品大小为50μl并且洗脱速率为1ml/分钟。在205nm处监测洗脱液的吸收度。由Fluka(Cat.86196)计算表面活性肽。表面活性肽浓度计算基于在标准品中鉴定的8个主要峰(参见图5A)。
生产能力
使用对最佳表面活性肽生产公布的生长培养基的生物反应器中的枯草芽孢杆菌生长和表面活性肽生产因生长培养基随时间沉淀而受阻。培养基成分沉淀在包含增加水平的FeSO4的生长培养基中更为显著(Wei等，2006)。沉淀导致营养物溶液的pH降低，微生物生长抑制和不溶性表面活性肽形成。
就图5B而言，它表示在20ml生物反应器中培养的枯草芽孢杆菌ATCC 21332产生的表面活性肽的典型HPLC色谱图。尽管鉴定了样品中的所有8个主要峰，但是这些峰的比例不同于在标准品中观察到的结果(图5A)。除在Fluka标准品中鉴定的8个峰外，观察到(未经鉴定)样品中并不存在2个额外的主要的峰(图5B)。
在富含铁的生长培养基中表面活性肽的生产可以忽略不计。在具有所得pH低于5的这一培养基中观察到营养物沉淀随时间增加，从而抑制了微生物生长。通过将生长培养基改变成Cooper氏无机盐培养基，pH得到恢复并且生长和表面活性肽生产得到改善(数据未显示)。
表1中列出了使用Cooper氏矿物盐培养基培养的生物反应器中的生产能力。较高的表面活性肽水平与流速增加和较高pH水平相关。表面活性肽在低于pH6的溶液中沉淀。需要进一步优化培养基以使枯草芽孢杆菌的厌氧生长最大化，优化表面活性肽生产并且防止培养基沉淀。
表1：使用Cooper氏矿物盐培养基培养的生物反应器中表面活性肽产量(n＝2)
    时间(小时)     31     46     53     59     70     76
    kPa     5     5     5     10     10     10
    pH     6.7     6.7     6.3     6.0     6.0     6.0
    渗透物体积(ml)     133     159     22     26     36     19
    流量     19     11     3     4     3     3
    表面活性肽浓度(μg/ml)     18.480     14.500     5.000     0.260     0.080     0.300
    总表面活性肽(mg)     2.4551     2.2813     0.1100     0.0066     0.0014     0.0057
重组产物：
就附图中的图1-4而言，一般将本发明在限氧或厌氧条件下生产重组蛋白质的设备设计成参比数字10。该设备为实验室规模的附图中的图1中所示的生物反应器10形式，然而，可以理解生物反应器中具体实施的原理可以应用于按比例扩大的或商业化实施方案。
生物反应器10包括陶瓷中空纤维毛细管膜12，其中该膜的末端上***塑料***物14，16与包含陶瓷***物的环氧树脂18。应理解还可以使用其它树脂或机械密封物。玻璃的外罩或反应器外壳20与毛细管膜12同轴排列并且配有在玻璃外罩20上拧紧的末端帽22和23。外罩20包括：用于导入液体营养物进料溶液的进料入口26以使微生物进入多孔基质与外罩之间的空间24；和用于将接种物导入外罩以便附着膜12的接种入口25。外罩进一步包括从外罩中排出进料溶液的进料出口27。陶瓷***物12，14，16包括与用于从外罩中排出渗透物的毛细管腔34流通的产物出口28。
在使用中，生物膜32建立在毛细管膜12的外表面30上。这可以通过经毛细管膜12过滤所需微生物的孢子或营养型接种物并且从腔34中并且通过出口28排出任意渗透物实现。腔34由此与出口28保持流通。接种物由此被固定在膜表面30上。膜12具有在内侧上相对薄的多孔表面层36和从表面层36向外呈放射状的相对厚的指状无外表面层的空隙结构38。一般而言，膜12具有约3mm的外径。
将微生物的适当营养物溶液通过营养物入口26导入外罩。使该营养物溶液以从膜的外侧到其内侧的方向流过膜12。产生重组蛋白质的基础在于压迫微生物且由此控制重组蛋白质产生的营养物饥饿概念。使用膜固定的生物膜生物反应器10，通过经生物膜32产生放射状营养物浓度梯度达到上述结果。作为结果，在暴露的生物膜32外表面的营养物浓度较高，而在膜/生物膜界面30的营养物浓度较低。在附图的图2和3中，为解释的目的，用参比数字I命名高营养物浓度区并且用参比数字II命名低营养物浓度区。在I区中，营养物浓度足够高以便支持微生物的初级生长，而在II区中，营养物浓度足够低以便导致压迫微生物的营养物饥饿，由此诱导和维持微生物的稳定期。且诱导物的水平足够高以诱导产生重组蛋白质。在暴露的膜外表面上建立生长和再生细胞的生物膜群，其中重组蛋白质在生物膜的II区中以延长的期限产生。在图3中，示意图″A″描绘了营养物浓度水平(y轴)与距膜表面距离(x轴)的关系。
膜12的多孔性使得次级代谢物能够通过膜进入腔34，同时防止微生物细胞通过膜。作为结果，生物膜的II区中产生的重组蛋白质通过从膜外侧进入腔34的营养物溶液流被向内携带入膜的腔34。使用诸如压缩气体气动源或诸如泵这类机械源或压缩气体与泵的组合在压力下促使液体生长培养基通过膜12。当新的生物量由于培养物在营养物溶液中的生长而下降时，生物膜的厚度增加，直到部分生物膜饥饿并且建立上文所述的营养物梯度。该过程能够使次级代谢物产生延长的期限。该期限在裂解死亡细胞释放污染物或在生物膜耐受性过高而无法通过生长培养基透入膜12时终止。
就附图中的图4A而言，使用气动源40，诸如压缩气体的典型流体流动方式用于给包含在用于营养物溶液在压力下进料入毛细管外空间44的储器42中的营养物溶液加压的典型流体流动方式确定在生物反应器10外罩与膜12之间。在通过膜12后，在产物收集容器46中收集渗透物。
就图4B而言，机械源48用于将营养物溶液压入毛细管外空间44。在通过生物反应器后，从返回至储器42的包含产物的营养物溶液中分离产物。在产物收集容器46中收集渗透物。
就图4C而言，将诸如压缩空气这类气动源40和诸如泵这类机械源48组合用于使营养物溶液进料入生物反应器并且从其中提取包含产物的营养物溶液。气动源40位于使营养物溶液进料入毛细管外空间44的生物反应器上游，而机械源位于生物反应器下游并且作为从腔34中提取渗透物的抽吸泵或真空泵运转，在产物收集容器46中收集渗透物。
图4D中所示的流体流动方式与图4C中所示的流体流动方式类似，其中唯一的差别在于不使用压缩气体源。
可以理解生物反应器和流体流动方式的确切配置可以显著改变，而仍然可以构成上文确定的基本特征。
本发明的生物反应器因液体营养物溶液通过生物膜和基质的对流而能够将营养物向微生物细胞进行高量转移。这种流动还可以提供从生物反应器中快速移除分泌的产物，同时防止产物通过膜的任何逆流返回。由于生产后迅速移除产物这一事实，所以因腐败导致的产物损耗的最少。生物反应器无需可能损害微生物细胞的机械搅拌。作为结果，生物反应器10中的微生物培养物更具生产性并且产物腐败得以减少。此外，无发泡发生，从而避免了对消泡剂的需求并且能够使用较大比例的反应器容量。当生物量保持在反应器中时，因为无需收集并且产物具有相对高的纯度，所以单元操作减少。生物反应器允许每单位体积中有相对高的细胞密度，导致容量生产能力较高。在操作时，生物反应器允许延长产生重组蛋白。
代谢废物的浓度在营养物溶液灌注生物膜时增加，它还可以调节代谢废物累积调节基因表达的培养物中产物的形成。可以理解在建立营养物梯度后，可以通过低pH和有机酸累积诱导产物形成。
实施例2
乳酸乳球菌P170表达***(Bioneer)
乳酸乳球菌P170表达***为在限制葡萄糖的生长条件下并且使用在生长环境中由生物体产生的乳酸累积诱导的自体诱导表达***。用于诱导的最佳pH为pH5.5-6.5。产物是分泌的。
改造以便在P170控制下产生β-内酰胺酶的乳酸乳球菌菌株PRA290用于本实施例，使用基于头孢硝噻法(Oxoid)的96-孔微量滴定板操作步骤，通过分光光度测定法对渗透物中的β-内酰胺酶活性进行定量。
灭菌：
按照标准操作步骤(SOP)对生物反应器10进行高压灭菌并且设定厌氧操作。开始实验前以无菌方式将过滤消毒的培养基配入各培养基供给容器。
接种:
在30℃下用在M17-G5生长培养基(Oxoid)中培养的1ml乳酸乳球菌PRA290(产生β-内酰胺酶)预接种物将生物反应器10各自接种16小时。按照SOP将接种物直接注入各生物反应器的毛细管外空间(ECS)。
操作：
生物反应器10的多管***储存库，其中使用单源压缩空气调节培养基供给。给在指定的储存库内的各生物反应器提供来自其自身培养基供给容器的营养物。在各储存库内，给重复的生物反应器提供包含200mM或400mM磷酸钾缓冲液(pH7.2)的LM5-V100-G75。评价新鲜样品上的流量，pH和β-内酰胺酶活性
在接种后，在8kPa下将培养基提供给各SFR过夜。如下调节压力：
表2
    接种后时间(小时)     压力(kPa)
    0     8
    16     13
    22     18
    28     30
    30     50
    34     70
    36     80
生产能力
就附图中的图6A和6B而言，显示了例示生物反应器在生产重组酶β-内酰胺酶中的应用的示意图，在使用包含200mM(图6A)或400mM缓冲液(图6B)的生长培养基中操作的生物反应器中监测β-内酰胺酶产量。
从图6中可以观察到在操作的前14-22小时中存在β-内酰胺酶产生的最初迟滞期。这是因最初生物量累积所致，直到获得足够厚度的生物膜以允许建立通过生物膜的营养物梯度和额外产生的足够高水平的乳酸，以便诱导β-内酰胺酶形成。生物量的累积在使用较低摩尔浓度缓冲液缓冲的生长培养基中更为快速，这反映出在使用200mM缓冲培养基时β-内酰胺酶活性的早发(图6A)。使用400mM缓冲培养基时观察到的β-内酰胺酶产生较为急剧的增加(图6B)，这强调了P170表达***的pH-调节的诱导机制。可以观察到生产充分延长，超过了30小时。
将为使用200mM或400mM缓冲的生长培养基操作的生物反应器记录的生产水平列在表4中。在使用400mM缓冲培养基(表4)与记录的24685个单位/l最大值培养时观察到了平均较高的最大浓度。容量生产能力在不同的生长培养基之间没有显著性差异，而是与增加的流量相关。较高的流量可以将pH维持在最佳生产范围内(pH5.5-6.5)并且改善产物的溶解度，特别是在具有高盐浓度的生长培养基中的溶解度。
产物分泌入渗透物限制了胞内蛋白的污染，消除了通过离心除去生物量的需求并且有利于较为简化的下游纯化过程。
表3：乳酸乳球菌生长培养基的组成
    成分     LM5-V100-G75
    FeSO4     50μM
    CaCl2     2.5μM
    MgCl2     2.6μM
    (NH4)6Mo7O24     15nM
    H3BO3     2.0μM
    CoCl2     150nM
    CuSO4     50nM
    MnCl2     400nM
    ZnSO4     50nM
    K2SO4     1.38mM
    KH2PO4/K2HPO4     200mM/400mM
    生物素     0.5mg/l
    叶酸     5mg/l
    核黄素     5mg/l
    烟酰胺     5mg/l
    硫胺·盐酸     5mg/l
    泛酸钙     5mg/l
    吡哆醛·盐酸     10mg/l
    葡萄糖     75g/l
    乙酸钠     14.7mM
    酵母提取物     15g/l
    柠檬酸     0.5mM
    L-精氨酸     1.0g/l
    L-谷氨酰胺     0.5g/l
    L-丝氨酸     1.5g/l
表4：对使用200mM或400mM磷酸盐缓冲(pH7.2)的生长培养基操作的生物反应器记录的β-内酰胺酶活性和容量生产能力。在接种后T＝20小时到T＝53小时的33小时期限内对各生物反应器计算平均值。
  mM缓冲液   β-内酰胺酶活性(U/l)   容量生产能力(U/h/l.反应器体积)
  最大值   平均值   SD   最大值   平均值   SD
  SFR1   200   15629   10738   3746   9150   5121   1994
  SFR11   200   11918   7306   2630   6054   2842   1613
  SFR3   200   18472   10561   4305   9418   4369   1970
  SFR4   200   10914   7574   2443   11604   5999   3087
  SFR5   200   16434   9198   3698   13518   6694   3568
  SFR6   200   17382   10814   4798   9260   4176   2126
  SFR9   200   14963   8592   3649   11283   4887   3417
  SFR10   400   24685   8424   8119   12006   3287   3881
  SFR12   400   23308   11010   6541   7056   3819   2479
  SFR7   400   16602   10005   3748   9442   5307   2184
  SFR8   400   21682   11672   6335   18183   5910   5576
实施例3
大肠埃希氏杆菌pBAD/g111表达***(Invitrogen)
pBAD/g111质粒是为在大肠杆菌中调节的、分泌的重组蛋白的表达和纯化而设计的pBR3222-衍生的表达载体。基因III信号序列用于将重组蛋白分泌入周质空间。araBAD启动子调节L-***糖诱导的表达。诱导物的浓度控制表达的水平。为了可溶性蛋白生产，可以对其进行优化。araBAD启动子在没有L-***糖和存在葡萄糖的情况下受到阻抑。
菌株和培养条件：
如对Invitrogen pBAD/g111表达试剂盒(Cat.No.V450-01)所述用对照质粒pBAD/g111/钙调节蛋白(产生钙调节蛋白)转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞。由接种含有100μg/ml氨苄西林的20mlTerrific Broth(表2)的单一菌落制备接种物并且在37℃，200rpm下孵育16小时。用于诱导的最佳pH为pH4-8。
生物反应器设定：
生物反应器的多管***储存库，其中使用单源压缩空气调节培养基供给。给在指定储存库内的各生物反应器提供来自其自身培养基供给容器的营养物。用于钙调节蛋白生产的生长培养基为含有100μg/ml氨苄西林的Terrific Broth。还使用0.0625M NaNO3加载(spike)培养基以便促进厌氧生长。三个生物反应器中的四个储存库各自用于检验4种不同水平的诱导物。
如下加载不同储存库：
储存库1：0.0625M NaNO3
储存库2：0.0625M NaNO3+0.00002％L-***糖
储存库3：0.0625M NaNO3+0.002％L-***糖
储存库4：0.0625M NaNO3+2％L-***糖
接种和操作：
按照SOP对生物反应器进行高压灭菌并且设定厌氧操作。在开始进行实验前将无菌生长培养基配入各培养基供给容器。
用大肠杆菌pBAD/g111/钙调节蛋白的1ml过夜培养物各自接种生物反应器。按照SOP将接种物直接注入各生物反应器的ECS。
接种后，在5kPa下将培养基提供给各生物反应器。使压力逐步增加以便固定生物量，限制浮游生物生长并且防止向回生长入营养物供应容器。如下调整压力：
表5
    接种后的时间(小时)     压力(kPa)
    0     5
    4     10
    5     15
    7     30
    8     80
    20     100
分析
接种后24小时，从各生物反应器模块中移除毛细管膜***物并且放入清洁的50ml离心管。使用同样的培养物，使用InvitrogenpBAD/g111说明书中所述的操作步骤从生物膜中提取钙调节蛋白：
1)渗透压休克操作步骤：用10ml冰冷的渗透压休克溶液1将各生物膜处理10分钟，以4000rpm离心10分钟并且弃去上清液。用10ml冰冷的渗透压休克溶液2将沉淀处理两次10分钟，以4000rpm离心10分钟。合并上清液并且储存在-20℃下。
2)细胞裂解操作步骤：将各生物膜经过2个冷冻/融化循环重新悬浮于10ml细胞裂解缓冲液中。以14000rpm将样品离心2分钟，除去上清液并且储存在-20℃下。
3)直接分析：将生物膜各自重新悬浮于2ml SDS-PAGE变性加样缓冲液中并且储存在-20℃下。
通过SDS-PAGE监测钙调节蛋白产生。
生长与生产能力
从表6中可以看出，每20ml生物反应器的生物量产率在所有生长条件下类似。在24小时后获得7.9g干细胞重量/反应器体积的最大细胞密度。使用渗透压休克操作步骤从生物膜中提取的可溶性蛋白表现出与未诱导的对照组相比，使用0.00002％L-***糖产生的钙调节蛋白诱导有限。在0.002％L-***糖下表现出的蛋白质合成增加为1.2倍，而使用2％L-***糖产生的诱导表现为在每mg干细胞重中产生的蛋白质增加为2.8倍。
表6：作为使用不同水平诱导物L-***糖培养的每20ml生物反应器中产生的，使用渗透压休克操作步骤从生物膜中提取的细胞的干细胞重和总可溶性蛋白。
    对照     0.00002％L-***糖     0.002％L-***糖     2％L-***糖
mg干细胞重     141     134     158     136
干细胞重/l反应器体积     7.1g     6.7g     7.9g     6.8g
μg/ml蛋白质     2.1     2.1     3.0     5.8
μg蛋白质     42.9     42.3     59.0     116.7
μg蛋白质/mg干细胞重     0.304     0.316     0.374     0.858
图7表示了通过大肠杆菌pBAD/g111/钙调节蛋白，使用应用渗透压休克操作步骤提取的生物反应器(图7A)或通过细胞裂解和直接分析(图7B)的重组蛋白生产。在对照生物反应器(无诱导物)中不检测诱导，也不使用0.00002％L-***糖处理生物反应器。使用渗透压休克操作提取的可溶性钙调节蛋白表现出具有L-***糖水平增加的改善的生产能力(图7A)。渗透压休克提取物表现出高于来自细胞裂解的蛋白质制品或由复制培养物制备的全细胞提取物的水平的纯度(图7B)。
建立的通过展开的生物膜的营养物梯度使得a raBAD启动子去阻抑，而在生长培养基中提供的诱导物分子L-***糖的水平增加有利于表达的诱导。通过细胞裂解从细胞中提取了较高水平的可溶性蛋白，不过，通过渗透压休克获得了更纯的产物。这种手段可以得到进一步优化并且在原位进行，从而在保留细胞的同时将蛋白质提取入渗透物，消除了对离心步骤的需求并且与较为简单的下游加工溶液整合。
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已经描述了本发明的许多实施方案。尽管如此，但是可以理解可以在不脱离本发明实质和范围的情况下进行各种变形。

Claims (30)

1.在限氧或厌氧培养条件下生产次级代谢物的方法，该方法包括：
提供具有第一侧和第二侧并且具有与其第一侧附着的微生物的生物膜的多孔基质，该基质的构造允许次级代谢物通过其中并且防止微生物细胞通过其中；并且
使营养物溶液在限氧或厌氧培养条件下以从其第一侧到达其第二侧的方向流过生物膜和基质，速率足够低以便建立通过生物膜的营养物梯度，其中远离基质的营养物浓度相对较高并且足够高以便支持微生物的初级生长，并且其中接近基质的营养物浓度相对较低并且足够低以使诱导和维持微生物的稳定期且由此导致微生物产生至少一种次级代谢物，通过基质的营养物溶液的流携带所述次级代谢物经过该基质到达其第二侧，在那里可以收集分泌的次级代谢物，而同时来自生物膜的微生物细胞保持在其第一侧上。
2.权利要求1的方法，其中所述的微生物选自梭状芽孢杆菌属(Clostridium sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)、脱硫脱硫弧菌(Desulphovibriodesulfuricans)和假丝酵母属(Candida sp.)。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中营养物溶液从第一侧到第而侧的流速为0.01-10个体积的营养物溶液/生物反应器体积/小时。
4.权利要求1-3中任意一项的方法，其中该方法在2-109℃的温度下进行。
5.权利要求1-4中任意一项的方法，其中该方法在1-13的初始pH下进行。
6.权利要求1-5中任意一项的方法，其中该方法进行1-30天。
7.权利要求1-6中任意一项的方法，其中所述的生物膜的厚度为0.1-10mm。
8.权利要求1-7中任意一项的方法，其中由微生物在胞内产生次级代谢物。
9.权利要求1-7中任意一项的方法，其中由微生物在胞外产生次级代谢物。
10.在限氧或厌氧条件下生产次级代谢物的设备，该设备包括：
至少一种具有第一侧和第二侧的多孔基质；和
用于在限氧或厌氧培养条件下将营养物溶液进料以便接触微生物的进料装置，在应用中，所述的微生物在基质第一侧上附着并且形成生物膜，所述的进料装置是可操作的以使营养物溶液以从其第一侧到其第二侧的方向流过生物膜和基质，速率足够低以便建立通过生物膜的营养物梯度，其中远离基质的营养物浓度相对较高并且足够高以便支持微生物的初级生长，并且其中接近基质的营养物浓度相对较低并且足够低以使诱导和维持微生物的稳定期且由此导致微生物产生次生代谢产物，基质的构造使得包含产物的营养物溶液通过该基质到达其第二侧并且防止来自生物膜的微生物细胞通过该基质。
11.权利要求10所述的设备，其中进料装置包括机械源和气动源中的至少一种，所述的气动源用于使营养物溶液进料以便接触生物膜并且导致营养物溶液流过生物膜和基质。
12.权利要求10或权利要求11所述的设备，包括用于从基质的第二侧收集产物的产物收集装置。
13.权利要求10-12中任意一项所述的设备，其中多孔基质包含多孔膜，该多孔膜具有允许产物和营养物溶液从其中流过的足够大的孔，但这些孔足够小以防止微生物细胞从其中流过。
14.权利要求10-13中任意一项所述的设备，包括用于多孔基质的外罩，该外罩具有用于营养物溶液的入口和用于从罩中排出渗透物的出口，并且该外罩在空间上与多孔基质分离。
15.在限氧或厌氧培养条件下生产至少一种重组产物的方法，该方法包括：
提供具有第一侧和第二侧并且具有附着在其第一侧上的微生物的生物膜的多孔基质，该基质的构造允许重组产物流通过其中并且防止微生物细胞通过其中；并且
使营养物溶液在限氧或厌氧培养条件下以从其第一侧到其第二侧的方向流过生物膜和基质，速率足够低以便建立通过生物膜的具有浓度差的营养物梯度，其中远离基质的营养物浓度相对较高并且足够高以便支持微生物的初级生长，并且其中接近基质的营养物浓度相对较低并且足够低以便进入和维持微生物的稳定期，由此诱导微生物产生至少一种重组产物，通过基质的营养物溶液流携带该重组产物流经过该基质到达其第二侧，在那里可以收集重组产物，而同时来自生物膜的微生物细胞保持在其第一侧上。
16.权利要求15的方法，其中所述的微生物选自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)、毕赤氏酵母属(Pichia sp.)、假丝酵母属(Candida sp.)、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)和啤酒糖酵母(Sacharomyces cerevisiae)。
17.权利要求15或权利要求16的方法，其中该方法在2-109℃的温度下进行。
18.权利要求15-17中任意一项的方法，其中该方法在1-13的初始pH下进行。
19.权利要求15-18中任意一项的方法，其中该方法进行1-30天。
20.权利要求15-19中任意一项的方法，其中营养物溶液从第一侧到第二侧的流速为0.001-10个体积营养物溶液/生物反应器体积/小时。
21.权利要求15-20中任意一项的方法，其中所述的生物膜具有0.1-10mm厚度。
22.权利要求15-20中任意一项的方法，包括：将诱导物分子加入到营养物溶液中，使得从第一侧到第二侧通过基质的营养物溶液流中携带所述诱导物分子通过生物膜，由此诱导微生物产生所述的重组产物。
23.权利要求22的方法，其中所述的诱导物选自L-***糖、异丙基b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和甲醇中的至少一种。
24.权利要求15-23中任意一项的方法，其中所述的次级代谢物由微生物在胞内产生。
25.权利要求15-23中任意一项的方法，其中所述的次级代谢物由微生物在胞外产生。
26.在限氧或厌氧条件下生产重组产物的设备，该设备包括：
至少一种具有第一侧面和第二侧面的多孔基质，和
用于在限氧或厌氧培养条件下提供营养物溶液进料以便接触微生物的进料装置，在应用中，所述的微生物在基质第一侧上附着并且形成生物膜，所述的进料装置是可操作的以使营养物溶液以从其第一侧到其第二侧的方向流过生物膜和基质，速率足够低以便建立通过生物膜的营养物梯度，其中远离基质的营养物浓度相对较高并且足够高以便支持微生物的初级生长，并且其中接近基质的营养物浓度相对较低并且足够低以使诱导和维持微生物的稳定期，由此诱导微生物产生至少一种重组产物，基质的构造使得包含产物的营养物溶液通过该基质到达其第二侧并且防止微生物细胞从第一侧上的生物膜通过该基质到达第二侧。
27.权利要求26所述的设备，其中进料装置包括泵和加压气体源，它们用于使营养物溶液接触生物膜并且使得营养物溶液流过生物膜和基质。
28.权利要求26或权利要求27所述的设备，包括用于从基质第二侧收集产物的产物收集装置。
29.权利要求26-28中任意一项所述的设备，其中所述的基质包含多孔膜，该多孔膜具有允许重组产物和营养物溶液从其中流过的足够大的孔，但这些孔足够小以防止微生物细胞从其中流过。
30.权利要求26-29中任意一项所述的设备，包括用于多孔基质的外罩，该外罩具有用于营养物溶液的入口和用于从罩中排出渗透物的出口，并且该外罩与多孔基质隔离。
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