CN105018361A

CN105018361A - 一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法

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Publication number: CN105018361A
Application number: CN201510410296.9A
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 刘佳; 樊祥臣; 罗秋玲
Original assignee: Wuxi Chen Ming Bioisystech Co Ltd; Jiangnan University
Current assignee: Angel Yeast Dehong Co ltd
Priority date: 2015-07-13
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2035-07-13
Also published as: CN105018361B

Abstract

本发明公开了一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法，属于发酵工程技术领域。以研究室从啤酒废酵母和白酒酒糟中筛选的酿酒酵母为生产菌株，在7L罐中进行高密度发酵培养，利用两阶段补料策略和发酵过程中通气量和搅拌的控制，最终酿酒酵母干重达到109.2g/L。本发明利用简单廉价的发酵培养基和补料培养基，通过科学合理控制发酵过程中各项参数，实现酿酒酵母的高密度发酵，为工业生产中酿酒酵母的高密度培养提供借鉴。

Description

一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法

技术领域

本发明涉及一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法，属于生物工程领域。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母或出芽酵母，是一种以出芽生殖为主的单细胞真菌。酿酒酵母是与人类关系最为密切的微生物，酵母工业其具有特殊的优越性。因为酿酒酵母生长繁殖快，酶活性较强，生产蛋白和生物活性物质的速率是动植物所不能比拟的。其次，酵母营养丰富，每克干酵母中含有蛋白质50％～60％、碳水化合物30％～35％、核糖核酸4.5％～8.3％、脂肪1％～5％。此外，还含有丰富的维生素、矿物质、氨基酸等其它的营养成分。第三，酵母菌生产不受季节、气候和地区的限制，生产稳定，发酵产泡沫少，能抗重金属，环境适应性强。

酿酒酵母现已经广泛应用于食品、制药和饲料等领域。食品行业中活性干酵母用于制作面包和馒头；性状优良的酿酒酵母用于酿造啤酒、白酒和葡萄酒；制作酵母天然调味品、酵母蛋白肽等。在生物制药行业，废酵母泥用于转化生产1,6-二磷酸果糖和三磷酸核苷；酵母高密度发酵提取谷胱甘肽、麦角固醇等活性物质。饲料行业利用废酵母泥生产培养微生物的酵母浸膏和酵母提取物，同时酵母菌是用于配制畜类、鱼虾、珍贵毛皮动物的理想蛋白质原料。

由于酿酒酵母的广泛应用，利用新的发酵工艺对酿酒酵母进行高密度发酵，得到生产成本低廉、质量稳定的酿酒酵母是势在必行的。

酵母菌的高密度发酵是一个相对概念，一般指发酵液中酵母浓度在30g/L以上。营养供给不适宜、发酵液中溶解氧不足、生产抑制性物质的积累和发酵液流变学特性的影响都会限制酵母在发酵液中的积累。

在高密度发酵时，随着菌体的大量积累，发酵液粘度大幅度增加，为非牛顿型流体，对氧的传递和营养物的传质都产生较大影响。改变这种现象需要通过改变发酵罐的结构来实现。因此在酵母常规发酵过程中，需要采用精细化的补料策略，才能实现酵母快速生长和生物量的积累。

发明内容

本发明的目的是提供一种实现酿酒酵母高密度发酵的方法。在发酵前期，利用溶氧的变化来调节补加培养基的速率，维持菌体生长所需要的营养物质，发酵后期菌体生长变慢，葡萄糖的利用速率降低，此时逐步降低补料速率，延长发酵周期；在整个发酵过程中随着酿酒酵母代谢活跃度增加，菌体量不断积累，逐步提高搅拌速率和通气量，能够保证足够的通风，从而实现酵母菌稳定快速的高密度发酵。使用购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的CICC编号为1511或32280的酿酒酵母进行高密度发酵，均得到较好的实验结果

所述方法，是在酵母发酵培养过程中分阶段控制培养基补料速率，前期不补料，中期逐步提高补料速度，后期逐步降低补料速度，同时在中期逐步提高搅拌速率和通气量。

所述方法是：(1)将酵母种子液接入发酵罐中，初始转速为400rpm，初始通气量为4.5L/min；(2)当葡萄糖耗尽、溶氧突然提高至30％以上时，开始以8-16mL/h的速率进行补料，并逐步提高补料速率、搅拌速率和通气量，直至补料速率提高到80-85mL/h、搅拌速率和通气量提高到发酵设备所能达到的最大搅拌速率和通气量；(3)当酵母生长速率持续降低达2h以上时，逐步降低补料速率直至发酵结束。

所述逐步提高补料速率，在本发明的一种实施方式中，是指每4h提高14-25mL/h。

所述酵母生长速率持续降低达2h以上时，在本发明的一种实施方式中，是指发酵28h时。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括如下步骤：(1)将酵母种子液接入发酵罐中，初始转速为400rpm，初始通气量为4.5L/min，发酵培养10h；(2)10h后以8-16mL/h的速率进行补料，并每4h提高补料速率14-25mL/h；同时每隔4h将搅拌速率提高100rpm直至达到发酵设备所能达到的最大搅拌速率，每隔4-8h将通气量提高1.5-3L/min直至达到发酵设备所能达到的最大通气量；(3)保持最大搅拌速率和通气量进行发酵，当发酵28h后，按照每4h的降低10-20mL/h的速度逐步降低补料速率，发酵32-36h即停止发酵。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：(1)种子液按10％接种量接种于发酵罐中进行发酵，培养温度为30℃，控制pH为5.5，初始转速为400rpm，初始通气量为4.5L/min；(2)发酵10h后开始以8mL/h速率开始补料，当溶氧突然提高至30％以上时增加补料速率，按每4h提高补料速率14-25mL/h直至提高至80-85mL/h；同时每隔4h将搅拌速率提高100rpm，直至26h搅拌调至800rpm；发酵14h后将通气量提高至6L/min，发酵22h后将通气量提高至9L/min；(3)发酵28h后，按照每4h降低10-20mL/h的速度降低补料速率，发酵32-36h即发酵结束。

所述发酵结束，在本发明的一种实施方式中，是发酵34h即结束发酵。

所述酿酒酵母，在本发明的一种实施方式中，是购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的CICC编号为1511或32280的酿酒酵母。本发明的方法对酿酒酵母具有普适性，不仅仅局限于这两株菌。

本发明的有益效果：

(1)分两阶段控制培养基补料速率，发酵中期根据溶氧变化进行补料速率的逐步提高，发酵后期根据酵母生长速率逐步降低补料速率；通过逐步提高搅拌速率和通气量，实现酿酒酵母快速稳定的生长，常规酵母高密度发酵周期一般在40h以上，本发明采用34h即可，发酵周期短，提高了发酵罐利用率，降低了能耗，减少了染菌机会；

(2)发酵控制策略简单，通过溶氧和生长速率(OD)变化来控制搅拌转速、通气量、补料速率即可，不需要其他特殊检测装置，比如残糖检测、乙醇监测、尾气分析等装置，对发酵设备要求低，一般工厂的普通发酵设备即可实现高密度发酵，可避免设备改造，降低成本。同时培养基成分简单，价格低廉，有利于控制成本。

(3)该发明所提供的方法对于酿酒酵母具有普适性，得到酿酒酵母产量可达109.2g/L。

附图说明

图1为实施例1中酿酒酵母(CICC 1511)发酵过程曲线图；其中，▲为发酵液的酵过程中葡萄糖浓度变化曲线，■为发酵过程中酿酒酵母细胞干重的变化曲线，●为发酵过程中发酵液中的乙醇浓度变化曲线；

图2为实施例2中酿酒酵母(CICC 1511)发酵过程曲线；其中不同曲线表征的发酵过程参数同图1；

图3为实施例3中酿酒酵母(CICC 1511)发酵过程曲线；其中不同曲线表征的发酵过程参数同图1；

图4为实施例4中酿酒酵母(CICC 1511)高密度发酵的发酵过程曲线；其中不同曲线表征的发酵过程参数同图1；

图5为实施例5中酿酒酵母(CICC 32280)高密度发酵的发酵过程曲线；其中不同曲线表征的发酵过程参数同图1。

具体实施方式

斜面保藏培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，琼脂25。

种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10。

发酵培养基(g/L)：工业葡萄糖65，尿素1.8，工业玉米粉10，KH₂PO₄ 10，MgSO₄ 4，ZnSO₄10mg/L，FeSO₄ 12mg/L，MnSO₄ 2mg/L。

补料培养基：500g/L葡萄糖溶液。

实施例1：

取酿酒酵母CICC 1511，按以下方法制备种子液：

(1)种子培养基配置完成，分装于500mL摇瓶中，115℃灭菌20min，冷却至室温。

(2)取一环保存于斜面培养基中的酿酒酵母菌，接种于种子培养基中，培养温度为30℃，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养24h。

(3)7L罐中使用4种不同的发酵培养基和补料培养基，培养基成分如下：

发酵培养基1：工业葡萄糖65g/L，尿素1.8g/L，工业玉米粉10g/L，KH₂PO₄ 10g/L，MgSO₄4，ZnSO₄ 10mg/L，FeSO₄ 12mg/L，MnSO₄ 2mg/L。

补料培养基1：500g/L葡萄糖溶液

发酵培养基2：糖蜜102.5g/L，玉米浆168.7g/L。

补料培养基(v/v)2：糖蜜10％+玉米浆40％

发酵培养基3：葡萄糖30g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，KH₂PO₄5g/L。

补料培养基(v/v)3：50％糖蜜溶液。

发酵培养基4：葡萄糖10g/L，酵母粉4.0g/L甘油20g/L，(NH₄)₂SO₄ 3.0g/L，KH₂PO₄ 3.0g/L，CaCl₂ 0.3g/L，MgCl₂ 0.3g/L。

补料培养基4：葡萄糖100g/L+甘油200g/L。

(4)将酿酒酵母CICC 1511种子液按10％接种量接种于7L发酵罐中进行发酵，培养温度为30℃，控制pH为5.5，装液量为3L/7L，初始转速为600rpm，初始通气量为6L/min。发酵过程中发酵至10h开始以20mL/h速率开始补料，发酵培养28h终止发酵，具体控制参数如表1。不同发酵培养基中发酵结果如表2。本发明的发酵培养基1中发酵过程如图1所示，发酵26h，酿酒酵母细胞干重为44.3g/L，在4种培养基中发酵周期最短、菌体干重最高，因此以下实施案例中均选用发酵培养基1。

表1

表2

实施例2：

制备酿酒酵母CICC 1511种子液，按10％接种量接种于7L发酵罐中进行发酵，培养温度为30℃，控制pH为5.5，装液量为3L/7L，初始转速为600rpm，初始通气量为6L/min。发酵至10h开始以6mL/h速率开始补料，发酵中后期根据溶氧变化，如果溶氧突然提高至30％以上，则稍微增加补料速率，28h以后开始恒速补料，具体控制参数如表3。发酵结果如图2所示，发酵28h，酿酒酵母细胞干重为65.7g/L。

表3

实施例3：

制备酿酒酵母CICC 1511种子液，按10％接种量接种于7L发酵罐中进行发酵，培养温度为30℃，控制pH为5.5，装液量为3L/7L，初始转速为400rpm，初始通气量为4.5L/min。发酵至10h开始以6mL/h速率开始补料，发酵中后期根据溶氧变化，如果溶氧突然提高至30％以上，则稍微增加补料速率，28h以后开始恒速补料。发酵10h开始每隔4h将搅拌速率提高100rpm，直至26h搅拌调至800rpm。发酵18h将通气量提高至6L/min，发酵26h将通气量提高至9L/min，具体控制参数如表4。发酵结果如图3所示，发酵30h，酿酒酵母细胞干重为83.6g/L。

表4

实施例4：

制备酿酒酵母CICC 1511种子液，按10％接种量接种于7L发酵罐中进行发酵，培养温度为30℃，控制pH为5.5，装液量为3L/7L，初始转速为400rpm，初始通气量为4.5L/min。发酵至10h开始以6mL/h速率开始补料，发酵中后期根据溶氧变化，如果溶氧突然提高至30％以上，则稍微增加补料速率，发酵28h生长速率持续降低2h时，逐步降低补料速率。发酵10h开始每隔4h将搅拌速率提高100rpm，直至26h搅拌调至800rpm。发酵18h将通气量提高至6L/min，发酵26h将通气量提高至9L/min，具体控制参数如表5。发酵结果如图4所示，发酵34h，酿酒酵母细胞干重为109.2g/L。

表5

实施例5：

制备酿酒酵母CICC 32280的种子液，接种发酵。初始发酵参数同实施例4，发酵过程中补料速率根据溶氧变化和28h以后酵母生长速率的变化，具体控制参数如表6，发酵结果如图5所示，发酵34h，酿酒酵母FMME132细胞干重为107.8g/L。

表6

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种酿酒酵母高密度发酵的培养方法，其特征在于，所述方法是：在酵母发酵培养过程中分阶段控制培养基补料速率，前期不补料，中期逐步提高补料速度，后期逐步降低补料速度，同时在中期逐步提高搅拌速率和通气量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是：(1)将酵母种子液接入发酵罐中，初始转速为400rpm，初始通气量为4.5L/min；(2)当葡萄糖耗尽、溶氧突然提高至30％以上时，开始以8-16mL/h的速率进行补料，并逐步提高补料速率、搅拌速率和通气量，直至补料速率提高到80-85mL/h、搅拌速率和通气量提高到发酵设备所能达到的最大搅拌速率和通气量；(3)当酵母生长速率持续2h以上一直降低时，逐步降低补料速率直至发酵结束。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述逐步提高补料速率是指每4h提高14-25mL/h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)将酵母种子液接入发酵罐中，初始转速为400rpm，初始通气量为4.5L/min，发酵培养10h；(2)10h后以8-16mL/h的速率进行补料，并每4h提高补料速率14-25mL/h；同时每隔4h将搅拌速率提高100rpm直至达到发酵设备所能达到的最大搅拌速率，每隔4-8h将通气量提高1.5-3L/min直至达到发酵设备所能达到的最大通气量；(3)保持最大搅拌速率和通气量进行发酵，当发酵28h后，按照每4h的降低10-20mL/h的速度逐步降低补料速率，发酵32-36h即停止发酵。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)种子液按10％接种量接种于发酵罐中进行发酵，培养温度为30℃，控制pH为5.5，初始转速为400rpm，初始通气量为4.5L/min；(2)发酵10h后开始以8mL/h速率开始补料，当溶氧突然提高至30％以上时增加补料速率，按每4h提高补料速率14-25mL/h直至提高至80-85mL/h；同时每隔4h将搅拌速率提高100rpm，直至26h搅拌调至800rpm；发酵14h后将通气量提高至6L/min，发酵22h后将通气量提高至9L/min；(3)发酵28h后，按照每4h降低10-20mL/h的速度降低补料速率，发酵32-36h即发酵结束。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养使用的培养基为：每1L含有：葡萄糖65g，尿素1.8g，工业玉米粉10g，KH₂PO₄ 12g，MgSO₄ 4g，ZnSO₄ 10mg/L，FeSO₄12mg，MnSO₄ 2mg。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述补料使用的补料培养基为500g/L葡萄糖溶液。

8.根据权利要求1-7任一所述方法得到的酿酒酵母。

9.权利要求8所述酿酒酵母在食品、饲料以及制备药物方面的应用。