CN101392231A - 一种重组大肠杆菌及应用其以生物质原料生产phb的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组大肠杆菌并利用重组大肠杆菌发酵廉价的生物质原料生产PHB的方法。本发明通过同源重组技术敲除了大肠杆菌MG1655中的ptsG基因，然后向其中转入来源于真养产碱杆菌的phbCAB基因簇得到大肠杆菌Q3，该菌株已于2008年7月9日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO：M 208105。大肠杆菌Q3能够高效利用农业生物质原料水解液合成PHB，在发酵开始后的24小时菌体达到最大浓度8.88克/升；在发酵开始后20小时PHB达到最大浓度6.42克/升，胞内PHB含量达到72.3％。在相同的发酵条件下，该技术可以达到与未改造大肠杆菌利用葡萄糖生产PHB产量相当的水平，而其生产成本却比单纯利用葡萄糖大大降低，在实际应用中有较大的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组大肠杆菌及其生产生物可降解塑料聚羟基丁酸酯(PHB)的方法，尤其涉及一种产PHB的重组大肠杆菌及其利用重组大肠杆菌发酵廉价的生物质原料生产PHB的方法，属于基因工程和微生物发酵领域。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoat，简称PHA)，是由微生物合成的功能性生物聚酯。PHA具有生物可降解性、生物相容性、气体阻隔性、压电性、非线性光学活性以及由官能团引起的其它特殊性能。PHA的性质决定了它具有可作为生物可降解塑料、组织工程的支架材料等许多潜在的应用前景，因此，国内外都对其进行大量的基础和应用开发研究。
聚羟基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate，PHB)是PHA家族中最简单，也是研究的最多、最透彻的成员。PHB在细胞内呈颗粒状，分子量一般为106(随培养条件，抽提方法不同而变化)，熔点为18℃，具有高结晶性、光学活性和压电性质，是立体规整的聚合物。与常用的热塑性塑料相比较，PHB有相对较高的E模量，但在室温下抗冲击强度较低，在低压力下不能延伸。最近，PHB与中链脂肪酸的共聚物PHB-co-PHA由于在机械性能上有很大程度的提高，成为国际上研究的热点。
PHB的合成途径已经比较清楚。以葡萄糖为原料，可以通过乙酰辅酶A缩合形成聚合物的前体物酰基辅酶A，然后在聚合酶的作用下合成PHB。目前，已经能够利用代谢工程技术在重组大肠杆菌中生产PHB。PHB产量已经达到菌体干重的90％以上。但是由于原料成本较高，PHB的工业生产仍然受到限制。目前，市场上PHB的价格大约为20美元/千克，为普通石化塑料的10倍，因此，PHB还无法与石化塑料相竞争。在发酵产品中，一般原料价格占总价值的三分之一。这是目前在从葡萄糖到PHB生产技术比较成熟的条件下仍然不能大规模工业化的主要原因。因此，降低原材料价格，寻求PHB生产的廉价底物是解决当前问题的必需途径。
天然纤维素原料是地球上最丰富的可再生的有机物质。在全世界通过光合作用产生的植物物质每年约10,000亿吨，其中89％目前未被人类利用。我国的天然纤维素原料也很丰富，每年产量为11.45亿吨，仅农作物秸秆、皮壳一项，每年就可达7亿多吨。这些秸秆大部分被用作燃料或在田间直接烧掉，不但破坏了生态平衡，使土壤肥力衰竭，造成农业上的恶性循环，而且污染环境，还存在火灾隐患。这些天然的纤维素、半纤维素类原料经水解后，可产生大量的单糖(葡萄糖、木糖、***糖等)，是淀粉质原料的最佳替代物。国际市场上，1千克葡萄糖的价格为0.493美元，而含有同样质量糖的半纤维素类原料水解物(其中的木糖、***糖等都折算为葡萄糖)的价格仅为0.069美元。大肠杆菌能够代谢多种糖类，同时，大肠杆菌还具有其它微生物无可比拟的优越性：生长迅速，营养要求简单；是代谢和生理了解最清楚的微生物；是基因工程方法建立最完全的生物。因此，大肠杆菌是利用生物质原料进行生产的首选菌种。
大肠杆菌碳源的转运及磷酸化是由依赖于磷酸烯醇式丙酮酸盐的磷酸转移酶***(carbohydrate phosphotransferase system，PTS)完成的。在大肠杆菌中，介导葡萄糖进入细胞从而使PTS***发挥作用的蛋白是EIIAglc。其大体的作用机制如下：在混合碳源中，当有葡萄糖存在时，EIIAglc以非磷酸化的形式存在，这种形式的EIIAglc能与其他碳源的透性酶结合，从而阻止了其他碳源进入细胞，这就是通常所说的分解代谢阻遏
(carbon catabolite repression，CCR)。膜蛋白II CBGlc(由ptsG基因编码)在这个运输***中起着关键作用。Cordaro JC等人研究了ptsG基因失活的突变株利用混合碳源的情况。在以葡萄糖加木糖或葡萄糖加***糖的培养基中，野生菌株出现葡萄糖—戊糖先后利用的现象，而ptsG突变株则是两种碳源同时利用，发酵时间也比野生菌缩短了近50％。从近几年的研究来看，利用基因工程技术改造糖代谢的膜运输***是当前解决碳源分解代谢阻遏的有效方法，也是发酵工程应用的新趋势。在PHB生产领域，研究者们对于糖代谢的研究也做了大量的工作。然而，到目前为止，还没有以重组大肠杆菌高效利用混合糖原料生产PHB的相关报道。利用基因工程技术对大肠杆菌进行改造后，使其能够同时利用多种糖类生产PHB，对于解决目前PHB生产成本过高以及农业废弃物利用率太低的问题都具有非常重要的意义。
发明内容
针对现有技术中PHB生产成本过高以及生物质原料利用率不高的问题，本发明的目的是提供一种重组大肠杆菌并利用重组大肠杆菌发酵廉价的生物质原料生产PHB的方法。
本发明所述产PHB的重组大肠杆菌，其特征在于：该菌株名为大肠杆菌(Escherichiacoli)Q3，该菌株已于2008年7月9日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO：M 208105。
本发明所述产PHB的重组大肠杆菌的出发菌株是大肠杆菌MG1655、DH5α、JM109、W3110，XL1-Blue中的一种，其中优选菌株为大肠杆菌MG1655。
本发明所述产PHB的重组大肠杆菌Q3外形呈杆状，大小为0.4～0.7微米×1～3微米，无芽胞。有普通菌毛与性菌毛，属于革兰氏阴性杆菌。此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。
本发明所述应用重组大肠杆菌以廉价农业生物质为原料生产PHB的方法，步骤如下：
(1)菌种选择：大肠杆菌(Escherichia coli)Q3 CCTCC NO：M 208105；
(2)平板培养：将菌种接种于含有质量百分比为1.5～2.0％的琼脂并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，25～42℃条件下，静置培养8～16小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄青霉素的LB液体培养基中，25～42℃条件下，150～250转/分钟摇床振荡培养8～16小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以5～15％的体积比的接种量，将种子液接种于200～1000mL并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄青霉素的LB液体培养基中，25～42℃条件下，150～250转/分钟振荡培养8～16小时，制得扩大培养菌液；
(5)发酵培养：以5～15％的体积比的接种量，将步骤(4)所述扩大培养菌液接种于培养基工作体积为2.5～3.5升的5升发酵罐中，其中发酵培养基是加有终浓度为50～150微克/毫升氨苄青霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并使其终浓度达到0.2～0.6毫摩尔/升；在25～40℃下诱导培养1～3小时使菌体OD600达到1～2，之后向菌液中加入生物质原料水解液，使菌液中的总糖含量达到5～20克/升，维持pH值在5.5～9.0，搅拌转速为100-500转/分钟，25～42℃条件下，发酵培养24～72小时；
(6)收集细胞：发酵结束后，将发酵液在5,000转/分钟的转速下离心10～30分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2～3次后，5,000转/分钟离心10-30分钟收集细胞，烘干后称其干重；
(7)PHB提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中12～30小时，然后在冻干机中冻干；向获得的干菌体中加入其8-10倍体积的丙酮，50～60℃处理20～60分钟后，过滤除去丙酮，烘干；然后加入干菌体8～10倍体积的氯仿，40～60℃浸提1～3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得PHB产物。
其中，步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养温度优选是30～40℃；氨苄青霉素的终浓度优选是80～120微克/毫升；
其中，步骤(2)、(3)、(4)中所述的菌体培养时间优选为10～14小时；
其中，步骤(5)中所述的菌体发酵时间优选为36～60小时；
其中，步骤(4)、(5)中所述的接种量优选为8～12％；
其中，步骤(5)中所述的加入的IPTG的终浓度优选为0.3～0.5毫摩尔/升，诱导时间优选为2～3小时；
其中，步骤(5)中所述的生物质原料水解液是农作物的秸秆、皮壳或/和芯的水解液。
进一步的，步骤(5)中所述的生物质原料水解液优选玉米芯水解液。
其中，步骤(5)中所述的生物质原料水解液的制备方法是：将生物质原料粉碎至粒径25～35目，按固液比即克∶毫升＝1∶10的量向生物质原料粉粒中加入1.0％的H2SO4，在110℃下水解3～5小时，然后抽滤除去固体残渣，水解液在50℃下真空浓缩至原体积的1/10～1/5，且水解液含糖量以重量比计不低于10％，浓缩水解液用石灰乳中和至pH10.0，抽滤除去CaSO4沉淀后，用85％的H3PO4回调pH至6.0，抽滤除去Ca3(PO4)2沉淀，所得水解液即生物质原料水解液，4℃冷藏备用；
上述生物质原料是指农作物的秸秆、皮壳或/和芯。
其中，步骤(5)中所述菌液中的总糖含量优选7～12克/升。
本发明创造性地利用重组大肠杆菌，使其能够高效利用廉价的生物质原料生产PHB，在发酵开始后20小时PHB达到最大浓度6.42克/升，胞内PHB含量达到72.3％。与未经改造的大肠杆菌相比，大大缩短了PHB的发酵周期；在相同的发酵条件下，本发明可以达到与未改造大肠杆菌利用葡萄糖生产PHB产量相当的水平，而其生产成本却比单纯利用葡萄糖大大降低；同时，解决了农业废弃物利用率不高的问题，为农业废弃物的合理利用找到了新的出路，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
实施例1.菌株构建
(a).ptsG基因的敲除：
I)同源重组片断的克隆
设计引物P1与P2，以质粒pDESTTM10(购自invitrogen)为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有氯霉素抗性的重组片断。
其中，P1、P2引物序列为：
P1：5′-ACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′
P2：5′-AGCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′
PCR反应体系如下：(引物浓度为20微摩尔/升)
10×缓冲液 5微升；
25mmol/LMgCl2 4微升；
10mmol/L四种dNTP混合液 1微升；
上下游引物各1微升；
TaqDNA聚合酶 0.5微升；
模板DNA1微升，加水补至 50微升；
PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60秒，58℃退火30秒，72℃延伸90秒，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。通过DpnI内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片断。
II)电转化感受态细胞的制备
A)挑取待敲除的大肠杆菌MG1655，转入LB培养基中，培养OD600至0.6；
B)冰浴15分钟，离心菌体，然后利用10％的甘油洗涤三次；
C)加入10％的甘油，浓缩50倍，分装感受态细胞。
III)电转化，筛选重组子
A)吸取7-10微升的上述(I)获得的同源重组片断，加入100微升的上述感受态细胞中，混匀。调节电穿孔仪，2.5千伏，电击；
B)加入900微升的LB培养基，37℃，100转/分钟培养1小时；
C)涂布氯霉素抗性平板培养，挑取重组子，以引物P3和P4进行PCR检测，得到ptsG缺陷型的大肠杆菌Q2。
其中，P3、P4引物序列为：
P3：5′-CCTGTACACGGCGAGGCTCT-3′
P4：5′-AATAACACCTGTAAAAAAGGCAGCC-3′
(b)PHB合成酶表达载体的构建
(I)将含有phbCAB基因簇的真养产碱杆菌Alcaligenes eutropha(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC)接种于LB培养基中，利用通用细菌基因组提取试剂盒提取基因组；
(II)根据Genbank公布的真养产碱杆菌的基因组序列，设计引物P5，P6；所述P5、P6引物序列为：
P5：5′-ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3′
P6：5′-ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC-3′
(III)克隆PHB合成酶基因
以含有phbCAB基因簇的真养产碱杆菌为模板，PCR扩增phbCAB基因簇。
PCR反应体系如下：(引物浓度为20微摩尔/升)
10×缓冲液 5微升；
25mmol/LMgCl2 4微升；
10mmol/L四种dNTP混合液 1微升；
上下游引物各 1微升；
TaqDNA聚合酶 0.5微升；
模板DNA1微升，加水补至 50微升；
PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60秒，58℃退火30秒，72℃延伸5.5分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。
(IV)PHB合成酶表达载体的构建
将pBluescript SK-和上述PCR产物(phbCAB基因簇)通过SmaI和EcoRI双酶切反应，利用PCR产物回收试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接，16℃反应16小时，获得PHB合成酶表达载体pBHR68。
(c)大肠杆菌感受态的制备；
(I)挑取LB平板中的大肠杆菌Q2，培养过夜；
(II)将培养过夜的大肠杆菌Q2按照1％的接种量转入装有50毫升LB的300毫升的三角瓶中培养，OD600至0.4左右。停止培养，置冰上20分钟，4℃，4000转/分钟，离心10分钟。弃上清，加入冰冷的CaCl2溶液悬浮，冰上静置30分钟。离心浓缩。获得感受态细胞。放于-70℃保存。
(d)PHB表达载体的转化
(I)将PHB表达载体pBHR68转入100微升的感受态细胞中，混匀；
(II)置冰上30分钟；
(III)42℃热激，冰上静置2分钟，加入900微升的LB培养基，37℃，100转/分钟，培养1小时。
(IV)涂布氨苄霉素抗性平板，培养过夜，挑取单菌落验证，筛选转化子得到含有PHB表达载体pBHR68的ptsG缺陷型大肠杆菌菌株(Escherichia coli)Q3。
所述的重组大肠杆菌(Escherichia coli)Q3外形呈杆状，大小为0.4～0.7微米×1～3微米，无芽胞。有普通菌毛与性菌毛，属于革兰氏阴性杆菌。此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。
所述大肠杆菌(Escherichia coli)Q3菌株已于2008年7月9日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO：M 208105。
实施例2.重组大肠杆菌Q3利用生物质原料发酵生产PHB，其中加入生物质原料水解液使培养基中总糖浓度为5克/升。
(1)菌种选择：大肠杆菌(Escherichia coli)Q3CCTCC NO：M 208105；
(2)平板培养：将菌种接种于含有质量百分比为1.6％的琼脂并加有终浓度为50微克/毫升的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，25℃条件下，静置培养8小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20mL并加有终浓度为50微克/毫升的氨苄青霉素的LB培养基中，25℃条件下，150转/分钟摇床振荡培养8小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以5％的体积比的接种量，将种子液接种于200毫升并加有终浓度为50微克/毫升的氨苄青霉素的LB培养基中，25℃条件下，150转/分钟振荡培养8小时，制得扩大培养液；
(5)发酵培养：以5％的体积比的接种量，将扩大培养液接种于工作体积为2.5升的5升发酵罐中，发酵培养基为加有终浓度为50微克/毫升的氨苄青霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并使其终浓度达到0.2毫摩尔/升；在25℃下诱导培养1小时使菌体OD600达到1，之后向菌液中加入生物质原料水解液，使菌液中的总糖含量达到5克/升，以氨水维持发酵液的pH值在5.5～7.5，搅拌转速为100转/分钟，25℃条件下，发酵培养24小时；
(6)收集细胞：取步骤(5)所得的发酵液5,000转/分钟离心10分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2次后，收集细胞；
(7)PHB提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中12小时，然后在冻干机中冻干。获得的干菌体经过丙酮50～60℃处理20～60分钟后，烘干；然后加入8～10倍体积量的氯仿，61℃提取1～3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得PHB样品；
(8)样品检测：取步骤(7)所得的PHB样品，加入100微升的浓硫酸，沸水浴中加热45分钟，然后利用10％的氨水调节pH至2～3，经微孔滤膜过滤后，HPLC检测PHB含量。
(9)结果分析：由步骤(7)、(8)中获得的数据知：在发酵开始后的28小时菌体达到最大浓度10.21克/升；在发酵开始后24小时PHB达到最大浓度7.11克/升，胞内PHB含量达到69.6％。
实施例3.重组大肠杆菌Q3利用生物质原料发酵生产PHB，其中加入生物质原料水解液使培养基中总糖浓度为20克/升。
(1)菌种选择：大肠杆菌(Escherichia coli)Q3 CCTCC NO：M 208105；
(2)平板培养：将菌种接种于含有质量百分比为1.6％的琼脂并加有终浓度为150微克/毫升的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，42℃条件下，静置培养16小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于100mL并加有终浓度为150微克/毫升的氨苄青霉素的LB培养基中，42℃条件下，250转/分钟摇床振荡培养16小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以15％的体积比的接种量，将种子液接种于1000mL并加有终浓度为150微克/毫升的氨苄青霉素的LB培养基中，42℃条件下，150～250转/分钟振荡培养16小时，制得扩大培养液；
(5)发酵培养：以15％的体积比的接种量，将扩大培养液接种于工作体积为3.5升的5升发酵罐中，发酵培养基为加有终浓度为150微克/毫升的氨苄青霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并使其终浓度达到0.6毫摩尔/升；在240℃下诱导培养3小时使菌体OD600达到2，之后向菌液中加入生物质原料水解液，使菌液中的总糖含量达到20克/升，以氨水维持发酵液的pH值在5.8～9.0，搅拌转速为450转/分钟，42℃条件下，发酵培养72小时；
(6)收集细胞：取步骤(5)所得的发酵液5,000转/分钟离心15分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2～3次后，收集细胞；
(7)PHB提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中30小时，然后在冻干机中冻干。获得的干菌体经过丙酮50～60℃处理20～60分钟后，烘干；然后加入8～10倍体积的氯仿，61℃提取1～3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得PHB样品；
(8)样品检测：取步骤(7)所得的PHB样品，加入200微升的浓硫酸沸水浴中加热90分钟，然后利用20％的氨水调节pH至2～3，经微孔滤膜过滤后，HPLC检测PHB含量。
(9)结果分析：由步骤(7)、(8)中获得的数据知：在发酵开始后的24小时菌体达到最大浓度7.59克/升；在发酵开始后24小时PHB达到最大浓度5.07克/升，胞内PHB含量达到66.8％。
实施例4.重组大肠杆菌Q3利用生物质原料发酵生产PHB，其中加入生物质原料水解液使培养基中总糖浓度为10克/升。
(1)菌种选择：大肠杆菌(Escherichia coli)Q3 CCTCC NO：M208105；
(2)平板培养：将菌种接种于含有质量百分比为1.6％的琼脂并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，37℃条件下，静置培养12小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于50mL并加有终浓度100微克/毫升的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃条件下，200转/分钟摇床振荡培养12小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以10％的体积比的接种量，将种子液接种于500mL并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃条件下，200转/分钟振荡培养12小时，制得扩大培养液；
(5)发酵培养：以10％的体积比的接种量，将扩大培养液接种于工作体积为3升的5升发酵罐中，发酵培养基为加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并使其终浓度达到0.4毫摩尔/升；在37℃下诱导培养2小时使菌体OD600达到1.2～1.5，之后向菌液中加入玉米芯水解液，使菌液中的总糖含量达到10克/升，以氨水维持发酵液的pH值在6.8～7.5，搅拌转速为300转/分钟，37℃条件下，发酵培养48小时；
(6)收集细胞：取步骤(5)所得的发酵液5,000转/分钟离心10分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2次后，收集细胞；
(7)PHB提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中20小时，然后在冻干机中冻干。获得的干菌体经过丙酮50～60℃处理20～60分钟后，烘干；然后加入8～10倍体积的氯仿，61℃提取1～3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得PHB样品；
(8)样品检测：取步骤(7)所得的PHB样品，加入150微升的浓硫酸沸水浴中加热60分钟，然后利用15％的氨水调节pH至2～3，经微孔滤膜过滤后，HPLC检测PHB含量。
(9)结果分析：由步骤(7)、(8)中获得的数据知：在发酵开始后的24小时菌体达到最大浓度8.88克/升；在发酵开始后20小时PHB达到最大浓度6.42克/升，胞内PHB含量达到72.3％。
实施例5.重组大肠杆菌MG1655/pBHR68利用生物质原料发酵生产PHB，其中加入生物质原料水解液使培养基中总糖浓度为10克/升。
(1)菌种选择：重组大肠杆菌MG1655/pBHR68；
(2)平板培养：将菌种接种于含有质量百分比为1.6％的琼脂并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，37℃条件下，静置培养12小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于50mL并加有终浓度100微克/毫升的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃条件下，200转/分钟摇床振荡培养12小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以10％的体积比的接种量，将种子液接种于500mL并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃条件下，200转/分钟振荡培养12小时，制得扩大培养液；
(5)发酵培养：以10％的体积比的接种量，将扩大培养液接种于工作体积为3升的5升发酵罐中，发酵培养基为加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并使其终浓度达到0.4毫摩尔/升；在37℃下诱导培养2小时使菌体OD600达到1.2～1.5，之后向菌液中加入玉米芯水解液，使菌液中的总糖含量达到10克/升，以氨水维持发酵液的pH值在6.8～7.5，搅拌转速为300转/分钟，37℃条件下，发酵培养48小时；
(6)收集细胞：取步骤(5)所得的发酵液5,000转/分钟离心10分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2次后，收集细胞；
(7)PHB提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中20小时，然后在冻干机中冻干。获得的干菌体经过丙酮50～60℃处理20～60分钟后，烘干；然后加入8～10倍体积的氯仿，61℃提取1～3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得PHB样品；
(8)样品检测：取步骤(7)所得的PHB样品，加入150微升的浓硫酸沸水浴中加热60分钟，然后利用15％的氨水调节pH至2～3，经微孔滤膜过滤后，HPLC检测PHB含量。
(9)结果分析：由步骤(7)、(8)中获得的数据知：在发酵开始后的44小时菌体达到最大浓度9.32克/升；在发酵开始后36小时PHB达到最大浓度6.09克/升，胞内PHB含量达到65.4％。
其中，步骤(1)所述重组大肠杆菌MG1655/pBHR68与大肠杆菌Q3相比，不同之处在于重组大肠杆菌MG1655/pBHR68不是ptsG缺陷型菌株，其他方面都与大肠杆菌Q3相同。
实施例6.重组大肠杆菌MG1655/pBHR68利用葡萄糖发酵生产PHB，其中葡萄糖的终浓度为10克/升
(1)菌种选择：重组大肠杆菌MG1655/pBHR68
(2)平板培养：将菌种接种于含有质量百分比为1.6％的琼脂并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，37℃条件下，静置培养12小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于50mL并加有终浓度100微克/毫升的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃条件下，200转/分钟摇床振荡培养12小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以10％的体积比的接种量，将种子液接种于500mL并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃条件下，200转/分钟振荡培养12小时，制得扩大培养液；
(5)发酵培养：以10％的体积比的接种量，将扩大培养液接种于工作体积为3升的5升发酵罐中，发酵培养基为加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并使其终浓度达到0.4毫摩尔/升；在37℃下诱导培养2小时使菌体OD600达到1.2～1.5，之后向菌液中加入无菌的葡萄糖溶液，使菌液中的总糖含量达到10克/升，以氨水维持发酵液的pH值在6.8～7.5，搅拌转速为300转/分钟，37℃条件下，发酵培养48小时；
(6)收集细胞：取步骤(5)所得的发酵液5,000转/分钟离心10分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2次后，收集细胞；
(7)PHB提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中20小时，然后在冻干机中冻干。获得的干菌体经过丙酮50～60℃处理20～60分钟后，烘干；然后加入8～10倍体积的氯仿，61℃提取1～3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得PHB样品；
(8)样品检测：取步骤(7)所得的PHB样品，加入150微升的浓硫酸沸水浴中加热60分钟，然后利用15％的氨水调节pH至2～3，经微孔滤膜过滤后，HPLC检测PHB含量。
(9)结果分析：由步骤(7)、(8)中获得的数据知：在发酵开始后的32小时菌体达到最大浓度11.12克/升；在发酵开始后30小时PHB达到最大浓度8.18克/升，胞内PHB含量达到73.6％。
其中，步骤(1)所述重组大肠杆菌MG1655/pBHR68与大肠杆菌Q3相比，不同之处在于重组大肠杆菌MG1655/pBHR68不是ptsG缺陷型菌株，其他方面都与大肠杆菌Q3相同。
通过实施例4与实施例5的对比可以看出，以重组大肠杆菌MG1655/pBHR68利用生物质原料发酵生产PHB，菌体浓度和PHB浓度达到最大需要40小时左右，而以重组大肠杆菌Q3利用生物质原料发酵生产PHB，要达到相同浓度只需要20小时，缩短发酵时间近50％；
通过实施例4与实施例6的对比可以看出，以重组大肠杆菌Q3利用生物质原料发酵生产PHB，在相同的发酵条件下，可以达到与大肠杆菌MG1655/pBHR68利用葡萄糖生产PHB产量相当的水平，而其生产成本却比单纯利用葡萄糖大大降低。
因此，重组大肠杆菌Q3利用生物质原料发酵生产PHB的方法在实际应用中有较大的利用价值。
上述应用重组大肠杆菌以廉价农业生物质为原料生产PHB的方法中涉及的培养基及其配方是：
菌体培养使用的液体LB培养基配方为：
蛋白胨10克/升，酵母粉5克/升，氯化钠10克/升，pH7.0，121℃条件下灭菌20分钟。
菌体发酵使用的M9培养基的配方为：
Na2HPO4·12H2O 15.2克/升，KH2PO4 0.5克/升，NaCl 1克/升，NH4Cl 0.2克/升，酵母粉2克/升，MgSO40.12克/升，CaCl2 0.011克/升，pH7.0，121℃条件下灭菌20分钟。
固体平板LB培养基为液体LB培养基成分添加质量百分比浓度为1.6％的琼脂粉。
上述的生物质原料水解液的制备方法是：将生物质原料(农作物的秸秆、皮壳或/和芯)粉碎至粒径25～35目，按固液比即克∶毫升＝1∶10的量向生物质原料粉粒中加入1.0％的H2SO4，在110℃下水解3～5小时，然后抽滤除去固体残渣，水解液在50℃下真空浓缩至原体积的1/10～1/5，且水解液含糖量以重量比计不低于10％，浓缩水解液用石灰乳中和至pH10.0，抽滤除去CaSO4沉淀后，用85％的H3PO4回调pH至6.0，抽滤除去Ca3(PO4)2沉淀，所得水解液即生物质原料水解液，4℃冷藏备用。
Claims (10)
1.一株产PHB的重组大肠杆菌，其特征在于：该菌株名为大肠杆菌(Escherichia coli)Q3，该菌株已于2008年7月9日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCCNO:M208105。
2.应用权利要求1所述重组大肠杆菌以廉价农业生物质为原料生产PHB的方法，步骤如下：
(1)菌种选择：大肠杆菌(Escherichia coli)Q3CCTCC NO:M 208105；
(2)平板培养：将菌种接种于含有质量百分比为1.5～2.0％的琼脂并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，25～42℃条件下，静置培养8～16小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄青霉素的LB液体培养基中，25～42℃条件下，150～250转/分钟摇床振荡培养8～16小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以5～15％的体积比的接种量，将种子液接种于200～1000mL并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄青霉素的LB液体培养基中，25～42℃条件下，150～250转/分钟振荡培养8～16小时，制得扩大培养菌液；
(5)发酵培养：以5～15％的体积比的接种量，将步骤(4)所述扩大培养菌液接种于培养基工作体积为2.5～3.5升的5升发酵罐中，其中发酵培养基是加有终浓度为50～150微克/毫升氨苄青霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入IPTG并使其终浓度达到0.2～0.6毫摩尔/升；在25～40℃下诱导培养1～3小时使菌体OD600达到1～2，之后向菌液中加入生物质原料水解液，使菌液中的总糖含量达到5～20克/升，维持pH值在5.5～9.0，搅拌转速为100-500转/分钟，25～42℃条件下，发酵培养24～72小时；
(6)收集细胞：发酵结束后，将发酵液在5,000转/分钟的转速下离心10～30分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2～3次后，5,000转/分钟离心10-30分钟收集细胞，烘干后称其干重；
(7)PHB提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中12～30小时，然后在冻干机中冻干；向获得的干菌体中加入其8-10倍体积的丙酮，50～60℃处理20～60分钟后，过滤除去丙酮，烘干；然后加入干菌体8～10倍体积的氯仿，40～60℃浸提1～3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得PHB产物。
3.如权利要求1所述应用重组大肠杆菌以廉价农业生物质为原料生产PHB的方法，其特征在于：步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养温度是30～40℃；氨苄青霉素的终浓度是80～120微克/毫升。
4.如权利要求1所述应用重组大肠杆菌以廉价农业生物质为原料生产PHB的方法，其特征在于：步骤(2)、(3)、(4)中所述的菌体培养时间为10～14小时。
5.如权利要求1所述应用重组大肠杆菌以廉价农业生物质为原料生产PHB的方法，其特征在于：步骤(4)、(5)中所述的接种量为8～12％。
6.如权利要求1所述应用重组大肠杆菌以廉价农业生物质为原料生产PHB的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的加入的IPTG的终浓度为0.3～0.5毫摩尔/升，诱导时间为2～3小时。
7.如权利要求1所述应用重组大肠杆菌以廉价农业生物质为原料生产PHB的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的生物质原料水解液是农作物的秸秆、皮壳或/和芯的水解液。
8.如权利要求7所述应用重组大肠杆菌以廉价农业生物质为原料生产PHB的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的生物质原料水解液是玉米芯水解液。
9.如权利要求7所述应用重组大肠杆菌以廉价农业生物质为原料生产PHB的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的生物质原料水解液的制备方法是：将生物质原料粉碎至粒径25～35目，按固液比即克∶毫升＝1∶10的量向生物质原料粉粒中加入1.0％的H2SO4，在110℃下水解3～5小时，然后抽滤除去固体残渣，水解液在50℃下真空浓缩至原体积的1/10～1/5，且水解液含糖量以重量比计不低于10％，浓缩水解液用石灰乳中和至pH10.0，抽滤除去CaSO4沉淀后，用85％的H3PO4回调pH至6.0，抽滤除去Ca3(PO4)2沉淀，所得水解液即生物质原料水解液，4℃冷藏备用；
上述生物质原料是指农作物的秸秆、皮壳或/和芯。
10.如权利要求1所述应用重组大肠杆菌以廉价农业生物质为原料生产PHB的方法，其特征在于：步骤(5)中所述菌液中的总糖含量是7～12克/升。
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