CN101293098A - 一种重组牛o型***病毒融合蛋白疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了根据O型***病毒设计的一种重组***病毒融合蛋白疫苗。实验证明，应用基因工程技术生产的本发明中的疫苗具有良好的防治***感染的功效。本发明提供了重组***病毒蛋白疫苗氨基酸序列及其核苷酸序列及预防***病毒感染方面的研究。

Description

一种重组牛O型***病毒融合蛋白疫苗

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及基因工程重组蛋白疫苗，特别是涉及一种预防动物***病毒感染的重组***病毒融合蛋白疫苗及其制备方法。

背景技术

***(Foot and mouth disease，FMD)是一种主要发生于野生和家养的牛，羊，猪等偶蹄类动物的急性全身性的高度传染性的疾病，***病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)是引起该病的病原体。FMDV传播方式主要包括消化道、呼吸道、皮肤和粘膜。动物的感染率几乎达100％，动物感染后体温升高到40～41℃，状态低迷。1～2天后，口腔出现水泡，同时或稍后，趾间、蹄冠的柔软皮肤上也发生水泡。动物在患病期间肉和奶的生产停止、病后肉和奶产量长期减少以及种用价值丧失也可造成较大的损失。由于FMDV对相关农、畜牧业有较大的经济影响，预防和治疗***一直是全球关注的问题。

***病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口疮病毒属(Aphthovirus)，是偶蹄类动物高度传染性疾病***的病原体。***病毒包括七个血清型：A型、O型、C型、Asia 1、SAT1、SAT2、SAT3，各血清型之间基因组高度变异并且无交叉反应(Margarita Sáiz，et al.2002)。

FMDV感染动物后，主要激发特异性的体液免疫应答。体液免疫保护机体免于同类抗原的再感染(J.S.Sallt，1993)。血清中中和抗体的水平与保护作用密切相关。感染或免疫FMDV后很快就可以检测出血清中的中和抗体。感染初期(3-4天)IgM首先提高，随后IgG开始提高，是感染后2周内主要的中和抗体(MargaritaSáiz，et al.2002)。FMDV的感染或免疫也可以激发T细胞的免疫反应。猪和牛的体内实验都证明：B细胞激活和抗体的产生常常伴随着CD4+T细胞介导的淋巴增生，这些辅助性的T细胞可以识别FMDV结构蛋白或非结构蛋白上的免疫表位，也是针对FMDV的保护性免疫必不可少的成分，起到促进中和抗体的分泌、调整免疫反应微环境的作用。同时，FMDV的感染也介导了感染细胞表面MHCI类分子的表达，影响FMDV感染细胞表面病毒抗原肽向CTLs的提呈，从而使病毒逃脱宿主的CTL细胞杀伤(F.Sobrino，2001)。

目前应用的FMDV疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗。弱毒疫苗采用弱化病毒的方式，将母毒通过在豚鼠，鸡胚或者细胞种经过多代的培养弱化，使病毒逐渐发生基因突变，产生弱毒毒株。弱毒毒株在组织培养物中经过大量扩增后，加入佐剂等制成疫苗。FMD弱毒疫苗在进行免疫预防的过程中，能产生一定水平的保护，对FMD的流行有一定的控制作用。但是由于弱毒疫苗是活病毒，在预防接种的过程中可能造成动物携带病毒的状态，在易感动物体内长期存活的过程中，弱毒的FMDV毒株很有可能恢复减弱了的毒力。同时，弱毒病毒在易感动物体内的增殖也会对产生的保护免疫有抑制的作用，不能达到最佳的免疫效果。因此，弱毒疫苗的应用受到了限制。灭活疫苗是大量扩增病毒后，经过化学灭活处理，添加佐剂后制备的疫苗产品。FMDV灭活疫苗的免疫原性较好，由于制备过程中强毒的使用和病毒灭活不完全的可能性，潜在的不安全性影响其使用。所以，为了克服弱毒疫苗和灭活疫苗在安全上的隐患，迫切寻找一种安全有效的新的FMDV疫苗。

重组***病毒蛋白疫苗是采用基因克隆的手段将***病毒的抗原编码基因进行克隆、重组、表达制备出的重组蛋白。由于重组蛋白疫苗只含有病原体的一部分，不会引起动物发病，在安全性方面有很大提高。另外，可以根据需要制备同一病毒多个成分或多价病毒疫苗。因此，重组***病毒蛋白疫苗有广阔的应用前景。

发明内容

本发明提供的应用基因工程技术在大肠杆菌中生产的一种重组***病毒融合蛋白疫苗，对O型***病毒感染有防治作用。

本发明中，应用重组***病毒融合蛋白疫苗免疫豚鼠和牛，免疫后获得的血清在乳鼠中和实验中，具有良好的中和O型***病毒的作用。

本发明提供的重组***病毒融合蛋白疫苗在生产方式上区别于传统灭活***病毒疫苗，且在安全性上具有传统灭活***病毒疫苗无法比拟的优势。

本发明还涉及该重组***病毒融合蛋白疫苗在制备用于防治动物***病毒感染的生物制品中的用途以及含有该基因工程重组蛋白的疫苗制品。

本发明还涉及该重组***病毒融合蛋白疫苗的施用对象、施用方法、药物学载体和施用剂量。

本发明中术语的含义

在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。特别地，下列术语具有如下的含义：

***病毒感染引起的相关疾病：是由***病毒引起的偶蹄类动物共患的接触性传染病。***病毒是一种RNA病毒，其基因组约包含75008000个碱基。***病毒主要以唾液的方式传播，传播的速度很快，易引发大面积的流行。牛、猪、羊、鹿等均为***病毒的感染动物。

重组蛋白疫苗：是利用分子克隆技术，将编码具有免疫原性的蛋白或多肽的基因克隆到原核或真核细胞的表达载体上，用此载体在细菌或真核细胞(酵母细胞或哺乳动物细胞)生产的具有免疫原性的蛋白质或多肽，这种蛋白质或多肽在应用于机体后可刺激机体(人或动物)发生特异性的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。若将病毒如***病毒基因编码的具有免疫原性的蛋白或多肽的基因克隆到原核或真核细胞的表达载体上，用其在细菌或真核细胞(酵母细胞或哺乳动物细胞)生产的由病毒基因编码的蛋白质或多肽是具有抗病毒作用的重组蛋白疫苗。这种疫苗在应用于机体(人或动物)后可诱导机体发生特异性的体液免疫应答和/或细胞免疫应答，防止病毒如***病毒引起的感染。

核酸疫苗：也称为DNA疫苗，是携带能引起保护性免疫反应的抗原基因的真核细胞表达质粒。注射后，DNA疫苗可被肌肉细胞和树突状细胞摄取，以染色体外DNA的形式在细胞内停留较长的时间，并表达出相应的蛋白质，后者刺激机体的免疫***发生免疫应答。

佐剂：佐剂(adjuvant)是和抗原一起应用后能够增强抗原免疫原性的物质。包括但不限于：铝佐剂、油佐剂、胶体颗粒佐剂、多种细菌或细菌细胞壁的成分(杀死的百日咳毒杆菌、分枝杆菌的胞壁酰二肽、细菌脂多糖)、福氏完全佐剂、细菌的热休克蛋白、细菌的DNA、人工合成的含CpG的寡核苷酸、Toll样受体的激活剂。

非特异性免疫增强剂：是指能非特异增强个体免疫反应的制剂，这些制剂包括但不限于卡介苗(Bacillis Calmette-Gruen，BCG)，短小棒状杆菌(Corynabacterium parvum，金黄色葡萄球菌，CD40配体，细菌核糖体提取物(Ribosomal fractions)，细菌膜提取物(membranar bacterial fractions)，细菌膜proteoglycanes，polyarginine，HSP-60，HSP-70，HSP-90和CTLA-4抑制剂等。

病原体载体疫苗：是将编码某一蛋白抗原的基因转入减毒的病毒或细菌而制成的疫苗。病原体载体疫苗在应用于人体后，会在体内增殖并将蛋白抗原的基因表达成相应的蛋白质，后者刺激人体发生免疫应答。可将一种病原体的两个或多个蛋白抗原的编码基因、两种或多个病原体的蛋白抗原编码基因种转入同一种病原体制成病原体载体疫苗。痘苗病毒(vacciniavirus)是常用的载体，已被用于甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒等重组载体疫苗的研制。另外，腺病毒、金丝雀痘病毒(canarypox virus)，减毒的脊髓灰质炎病毒、减毒伤寒杆菌、卡介苗也可作为病原体载体疫苗的载体。有些病原体载体疫苗，如采用减毒伤寒杆菌为载体的霍乱和痢疾口服疫苗可经天然的病原体感染途径接种，并能诱导分泌型IgA，表现出明显的优点。

药物学可接受的载体：药物学可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)是指一种或多种固体或液体的填充剂、稀释剂或包封物质，此载体适合将本发明提供的重组***病毒融合蛋白疫苗应用于个体。该载体可以是有机的、无机的、天然的或合成的。该载体包括各种溶液、稀释剂、溶剂、分散剂、脂质体、乳化剂、抗菌剂、抗真菌剂、等渗的和延缓吸收的试剂、和其他的适合本发明中的重组***病毒融合蛋白疫苗应用的载体。药物学可接受的载体的选择决定于本发明中本发明提供的重组***病毒融合蛋白疫苗的应用方式。可注射用的载体包括水、生理盐水、PBS缓冲液(phosphate buffered saline solution)、平衡盐溶液、葡萄糖溶液、甘油和乳化剂和湿化剂等。乳化剂可包括水包油乳化剂(oil/wateremulsion)和油包水乳化剂(o water/oil emulsion)。

治疗有效剂量：是指在应用后个体产生理想中和抗体效价的重组***病毒融合蛋白疫苗的剂量。这个“剂量”的多少决定于本领域技术熟练人员应知的标准技术，还要参考其他因素，包括并不限于个体的大小，健康情况和疾病的严重程度等。为了加强效果，可在第一次免疫后14或21天进行1次加强免疫。本领域技术熟练人员可以对剂量作10倍到1000倍的调整。

给药途径：在应用时，本发明中的重组***病毒融合蛋白疫苗可以经由各种合适的给药途径(Route)来达到理想的效果。本发明中的重组***病毒融合蛋白疫苗可经肠外给药途径施用，这些途径包括皮下，肌肉、腹腔、鞘内、皮内和***内注射。

上镍亲和柱前样品：本发明中的“上镍亲和柱前样品”是指实施例3的含有重组O型***病毒融合蛋白疫苗原核表达载体的细菌裂解上清。

流穿样品：本发明中的“流穿样品”是指在实施例3中，含有重组O型***病毒融合蛋白疫苗原核表达载体的细菌裂解上清加样到镍金属螯合柱时，从加样开始到加样结束收集的流经镍金属螯和柱的样品。

洗涤液洗柱样品：本发明中的“洗涤液洗柱样品”是指在实施例3中用洗涤缓冲液洗镍金属螯和柱时，收集的流经镍金属螯和柱的洗涤缓冲液。

洗脱样品(含目的蛋白)：本发明中的“洗脱样品(含目的蛋白)”是指在实施例3中，洗脱缓冲液流经洗涤液洗涤后的镍金属螯和柱时，收集的样品(含目的蛋白)。

除盐后样品1、2(含目的蛋白)：本发明中的“除盐后样品1、2(含目的蛋白)”是指实施例3中，在用装填有Sephadex G25介质的除盐柱除盐过程中，镍金属螯和柱洗脱缓冲液在流经洗涤液洗涤后的镍金属螯和柱时，收集的洗脱样品(含目的蛋白)上除盐柱后，分段收集的用10mM PBS，pH7.2洗脱的蛋白(含目的蛋白)。

附图说明

附图1说明：重组O型***病毒融合蛋白A片段编码基因电泳图

泳道一：约189bp处可见目的DNA片段

泳道二：DNA Marker 2000

附图2说明：重组O型***病毒融合蛋白N片段编码基因电泳图

泳道一：约174bp处可见目的DNA片段

泳道二：DNA Marker 2000

附图3说明：重组O型***病毒融合蛋白A片段编码基因二聚体电泳图

泳道一：DNA Marker 2000

泳道二：约348bp处可见目的DNA片段

附图4说明：重组O型***病毒融合蛋白A片段编码基因二聚体(AA)和N片段编码基因的融合基因电泳图

泳道一：DNA Marker 2000

泳道二：约504bp处可见目的DNA片段

附图5说明：重组O型***病毒融合蛋白编码基因电泳图

泳道一：DNA Marker 2000

泳道二：约1002bp处可见目的DNA片段

附图6说明：重组O型***病毒融合蛋白编码基因亚克隆入表达载体酶切电泳图

泳道一：DNA Marker 2000

泳道二：约1014bp处可见酶切片段

附图7说明：含重组pET-28a(+)质粒大肠杆菌表达的重组O型***病毒融合蛋白SDS-PAGE电泳图

泳道一：蛋白Marker

泳道二：诱导前

泳道三：IPTG诱导3h。在41KD处为目的蛋白

附图8说明：抗His tag抗体对重组O型***病毒融合蛋白进行鉴定的Western杂交

泳道一：蛋白Marker

泳道二：诱导前

泳道三：IPTG诱导3h。Western杂交可见阳性杂交条带。

附图9说明：重组***病毒融合蛋白纯化鉴定的SDS-PAGE电泳

泳道一：蛋白Marker

泳道二：上镍亲和柱前样品

泳道三：流穿样品

泳道四：洗涤液洗柱样品

泳道五：洗脱样品(含目的蛋白)

泳道六：除盐后样品1(含目的蛋白)

泳道七：除盐后样品2(含目的蛋白)

附图10说明：豚鼠免疫血清***病毒特异性抗体的ELISA检测

横坐标表示免疫后的时间，纵坐标表示ELISA检测中显色反应的OD值。

图中曲折线1、2、3、4代表4只豚鼠免疫后不同时间ELISA检测中显色反应的OD值，

曲折线M代表平均值。PBS代表该豚鼠作为阴性对照单纯注射PBS。

下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

具体实施方式

在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例如Molecular Cloning一书(J.Sambrook，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecularcloning，1989)所述的方法。

本发明实施例中所用试剂、菌种、病毒、动物的来源：

核酸内切酶EcoRI、HindIII、BglII、BamHI和T4DNA连接酶、碱性磷酸酶购自大连TAKARA生物工程公司；DNA回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司；IPTG、抗组氨酸单克隆抗体购自Sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗豚鼠抗体购自于北京鼎国生物技术有限公司；硝酸纤维素膜(NC)购自美国Schleicher&Schuell公司；卡那霉素、氨苄青霉素购于北京华美生物工程公司。金属整合层析介质(Sepharose-6B)、排阻层析介质(葡聚糖凝胶Sephadex-G-25)等均购自Pharmacia公司。

pMD-18T质粒购于大连TAKARA生物工程公司；PET28a质粒购于Novagen公司。

豚鼠：购自长春高新实验动物中心的洁净实验动物。

实验用乳鼠、牛由内蒙古金宇生物公司实验中心提供。

牛亚洲I型、O型***病毒二价灭活苗、O型***病毒(佳木斯毒株)由内蒙古金宇生物公司实验中心提供。

实施例1 重组O型***病毒融合蛋白疫苗编码基因的构建

1.1  重组O型***病毒融合蛋白疫苗A片段编码基因的构建

采用二轮PCR方法合成重组O型***病毒融合蛋白疫苗编码基因DNA片段A。设计并合成了具有下述序列的PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)：

引物1：5′TCTTCAGGTTCTGGCTCAGAAAGCTGCTCGTACTCTGCCAGGTGGCGAAGAAAACTACGGTGGT 3′

引物2：5′GAAGGATACGTCGGTGTGCTGACGACGCTGAACCTGAGCTTCACCACCGTAGTTTTCTT 3′

引物3：5′GAATTCAGATCTGGTGGCCCGGTAACCAACGTTCGTGGTGATCTTCAGGTTCTGGCTC 3′

引物4：5′AAGCTTGGATCCCGGAGTTACTTTAACGAAACGGTCCAGGATGAAGGATACGTCGGTGT 3′

将引物1、引物2互为模板做第一轮PCR。第一轮PCR反应条件：94℃，45s；58℃，30S；74℃，10min。

将得到的PCR产物作为模板，引物3、引物4为引物，做第二轮PCR。

第二轮PCR反应条件：94℃，45s；58℃，30S；74℃，1min；25个循环，25个循环后72℃延伸10min。

将第二轮PCR产物做2％琼脂糖凝胶电泳(图1)，目的片段长度为189bp。采用北京鼎国公司的DNA回收试剂盒回收用PCR合成的重组***病毒融合蛋白编码基因DNA片段A，并将其克隆入pMD18-T Vect质粒(TakaRa公司)。将克隆有重组***病毒融合蛋白编码基DNA片段A的pMD18-T Vect质粒转化入大肠杆菌JM109(Novagen公司)。挑选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定方向，测定***片段的DNA序列(上海生工生物工程有限公司)，测序结果正确。

1.2重组O型***病毒融合蛋白疫苗N片段编码基因的构建

采用二轮PCR方法合成重组O型***病毒融合蛋白疫苗编码基因DNA片段N。设计并合成了具有下述序列的PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)：

引物1：5′GTTACTAACGTTCGTGGCGATCTGCAGGTTCTGGCTCAGAAGGCAGCACGTACTCTG 3′

引物2：5′TTTCTGTTTATGACGAGCTTCAGACGGTTCACCACCCGGCAGAGTACGTGCTGCCTT 3′

引物3：5′GAATTCAGATCTGGTTCCTCTAAATACGGCGAGTCTCCGGTTACTAACGTTCGTGGC 3′

引物4：5′AAGCTTGGATCCCAGCAGTTGCTTAACTGGAGCAACGATTTTCTGTTTATGACGAGC 3′

将引物1、引物2互为模板做第一轮PCR。第一轮PCR反应条件：94℃，45s；60℃，30S；74℃，10min。

将得到的PCR产物作为模板，引物3、引物4为引物，做第二轮PCR。

第二轮PCR反应条件：94℃，45s；55℃，30S；74℃，1min；25个循环，25个循环后72℃延伸10min。

将第二轮PCR产物做2％琼脂糖凝胶电泳(图2)，目的片段长度为174bp。采用北京鼎国公司的DNA回收试剂盒回收用PCR合成的重组***病毒融合蛋白编码基因DNA片段N，并将其克隆入pMD18-T Vect质粒(TakaRa公司)。将克隆有重组***病毒融合蛋白编码基DNA片段N的pMD18-T Vect质粒转化入大肠杆菌JM109(Novagen公司)。挑选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定方向，测定***片段的DNA序列(上海生工生物工程有限公司)，测序结果正确。

1.3重组O型***病毒融合蛋白疫苗A片段编码基因二聚体(命名为AA)的构建

将载有A片段编码基因的pMD18-T载体用BglII、BamHI双酶切，得到A片段的编码基因；将载有A片段编码基因的pMD18-T载体用BglII单酶切，得到含A片段编码基因的pMD18-T线性载体；然后将上述的含A片段编码基因的pMD18-T线性载体和A片段用T4DNA连接酶连接，既获得含AA片段编码基因的pMD18-T载体。转入宿主细胞扩增，提取质粒后BglII、BamHI双酶切鉴定，目的片段长度为348bp(图3)。

1.4重组O型***病毒融合蛋白疫苗A片段编码基因二聚体和N片段编码基因的融合基因(命名为AAN)的构建

将载有AA片段编码基因的pMD18-T载体用BglII、BamHI双酶切，得到AA片段的编码基因；将载有N片段编码基因的pMD18-T载体用BglII单酶切，得到含N片段编码基因的pMD18-T线性载体；然后将上述的含N片段编码基因的pMD18-T线性载体和AA片段用T4DNA连接酶连接，既获得***AAN片段编码基因的pMD18-T载体。转入宿主细胞扩增，提取质粒后BglII、BamHI双酶切鉴定，目的片段长度应为504bp(图4)。

1.5重组O型***病毒融合蛋白疫苗编码基因(AAN的二聚体)的构建

将载有AAN片段编码基因的pMD18-T载体用BglII、BamHI双酶切，得到AAN片段的编码基因；将载有AAN片段编码基因的pMD18-T载体用BglII单酶切，得到含AAN片段编码基因的pMD18-T线性载体；然后将上述的含AAN片段编码基因的pMD18-T线性载体和AAN片段用T4DNA连接酶连接，既获得含AAN二聚体编码基因的pMD18-T载体。转入宿主细胞扩增，提取质粒后BglII、BamHI双酶切鉴定，目的片段长度应为1002bp(图5)。

实施例2  重组O型***病毒融合蛋白疫苗编码基因亚克隆入表达载体

将***AAN二聚体编码基因的pMD18-T载体用EcoR I，HindIII双酶切，获得AAN二聚体的编码基因；将pET28a质粒用EcoR I，HindIII双酶切，既获得pET28a线性载体。将上述两个步骤获得的片段和载体用T4DNA酶连接，既获得含AAN二聚体编码基因的pET28a载体[命名为pET28a-(AAN)2]。转入宿主细胞扩增，提取质粒后EcoRI、HindIII双酶切酶切鉴定，目的片段长度应为1014bp(图6)。

实施例3  重组O型***病毒融合蛋白疫苗的表达、鉴定和纯化

将pET28a-(AAN)2重组表达质粒转入BL21受体菌中，经克隆筛选、鉴定后，用IPTG诱导蛋白J8有较高水平的表达。(图7)

质粒pET28a在***目的片段的后端、终止密码前端有一段组氨酸尾(His tag)，选择抗His tag抗体对相应蛋白进行鉴定。结果表明，表达蛋白可以被抗His tag抗体识别，说明我们所诱导并成功表达的蛋白是相应的目的蛋白(图8)。

His tag能与金属离子镍特异性结合，所以选择金属离子Ni2+鳌合亲和层析的方法纯化目的蛋白。用磷酸盐缓冲液装柱(20mM phosphate，pH 7.2  1M NaCl)，层析介质为Sepharose4B-Ni2+(Pharmacia)并平衡。将含有重组***病毒融合蛋白疫苗J8原核表达载体的细菌裂解上清加到镍金属螯合柱中，并收集流穿样品。用洗涤缓冲液(20mM Tris，pH 7.9，0.5M NaCl，20mM咪唑，3M尿素洗柱，收集洗柱后的洗涤缓冲液。用洗脱缓冲液(20mM Tris，pH7.9，0.5M NaCl，1M咪唑，2M尿素)洗脱，收集洗脱的蛋白。直到吸收值不再下降为止，用容器接取不同时段的流出液。

除盐

用Sephadex 625(Pharmacia)装柱并用2个柱床体积的双蒸水洗柱。

用2个柱床体积的10mM PBS，pH7.2洗柱后，将镍亲和柱洗脱的蛋白上柱后，再用10mM PBS，pH7.2上柱，分段收集洗脱的蛋白，分装后于-70℃冻干保存。

用SDS-PAGE电泳对纯化的重组O型***病毒融合蛋白进行鉴定，其中含有所示核苷酸序列的原核表达载体表达的蛋白纯化后，其纯度达95％(图9)。

实施例4  豚鼠血清O型***病毒特异性抗体的ELISA检测

以PBS溶解重组O型***病毒融合蛋白疫苗，浓度为800μg/mL，与等体积油佐剂(MONTANIDE ISA 206油佐剂，Seppic，France)均匀混合。取5只体重250g左右的健康雄性豚鼠，股内侧肌肉注射，其中4只豚鼠免疫重组O型***病毒融合蛋白疫苗，剂量为200μg/500μL/只，1只注射等体积PBS作为阴性对照。分别在免疫后的第3天，7天、14天、21天、29天、36天、43天、71天、85天采集豚鼠血清样品。

以灭活的佳木斯株***病毒包被的间接ELISA方法检测血清中O型***病毒特异性抗体的水平。方法如下：用包被液(PBS：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，3.58g/L Na2HPO4·12H2O，0.24g/L KH2PO4；0.8％戊二醛)稀释灭活的佳木斯株***病毒液(1∶4稀释)，100μL/孔加入酶标板，密封平板，4℃包被14-16小时；洗涤液(PBS；0.05％Tween-20)洗涤平板三次，300μL/孔，3分钟/次；加入封闭液(PBS；5％FBS)，200μL/孔，37℃放置2h；再次洗涤平板；用样品稀释液(PBS；5％FBS)稀释动物血清，加入稀释后血清100μL/孔，37℃放置1h；再次洗涤平板后用样品稀释液稀释辣根过氧化酶标记的兔抗豚鼠二抗(1∶5000稀释)，100μL/孔。避光37℃放置1h；洗涤平板后，加入现配的底物液(10ml中柠檬酸0.01M，Na2HPO40.02M，超纯水9ml，30％H2O2 15μL，OPD4mg)100μL/孔每孔，室温避光20min；每孔加入50μL终止液(20％硫酸)。立刻检测OD值(A492)。

间接ELISA结果显示：重组O型***病毒融合蛋白疫苗免疫豚鼠的血清含有针对O型***病毒特异性的抗体(图10)。

实施例5  重组O型***病毒融合蛋白疫苗在豚鼠体内诱生O型***病毒特异性中和抗体对乳鼠的保护作用

为检测重组O型***病毒融合蛋白疫苗免疫豚鼠的血清在O型***病毒攻击的条件下对动物的保护作用，进行了乳鼠病毒中和试验。

将一免21天豚鼠血清和二免21天豚鼠血清进行系列稀释并加热灭活补体后，与等体积O型***病毒(200 ID50)混合，进行1h的中和反应后，注入乳鼠体内，观察24小时、48小时、72小时乳鼠存活情况，以PBS免疫的豚鼠血清为阴性对照，以O型***病毒灭活苗2次免疫21天的豚鼠血清为阳性对照(表1)。表1中，1-A表为一免21天豚鼠血清乳鼠中和实验的结果；1-B表为二免21天豚鼠血清乳鼠中和实验的结果。

乳鼠中和实验结果表明：重组O型***病毒融合蛋白疫苗诱导豚鼠产生了特异性的针对O型***病毒抗体，可以中和O型***病毒，保护乳鼠免受O型***病毒的攻击。

表1：重组O型***病毒蛋白疫苗免疫的豚鼠血清对O型***病毒攻击的乳鼠的保护作用

1-A

表中：OJ3-1、OJ3-2、OJ3-3、OJ3-4代表经重组O型***病毒蛋白疫苗一次免疫21天的4只豚鼠；PBS-1、PBS-2代表用等体积PBS免疫作为阴性对照的2只豚鼠。灭活苗-4代表O型***病毒灭活苗2次免疫21天的豚鼠。

1--B

表中：OJ3-1、OJ3-2、OJ3-3、OJ3-4代表经重组O型***病毒蛋白疫苗二次免疫21天的4只豚鼠；灭活苗-4代表O型***病毒灭活苗2次免疫21天的豚鼠。

实施例6  重组O型***病毒融合蛋白疫苗免疫牛产生O型***病毒特异性抗体的ELISA检测

以PBS溶解重组O型***病毒融合蛋白疫苗，使之浓度为1.6mg/0.92ml，取5.52ml与油佐剂(MONTANIDE ISA 206油佐剂，Seppic，France)6.48ml均匀混合。取5头纯牧区健康8个月大小抗FMDV抗体阴性的幼牛，臀部肌肉注射的方式免疫，每只牛免疫抗原溶液的剂量为1.6mg/2mL/头。牛Asia I/O FMDV二价灭活疫苗作阳性对照。取稀释用0.04M PBS缓冲溶液，用206佐剂进行乳化作溶媒对照。分别在0天和28天免疫2次。在二免后14天采集幼牛血清样品。颈静脉采血，采集的血液置于37℃放置15min，4℃放置2h，充分析出血清；4000r/min离心10min，11000r/min离心4min，小心吸出血清，-70℃保存备用。

以灭活的佳木斯株O型***病毒包被的间接ELISA方法检测血清中O型***病毒特异性抗体水平(具体方法参照实施例4)。间接ELISA结果显示：重组O型***病毒融合蛋白疫苗免疫幼牛的血清中产生了高滴度的针对O型***病毒特异性的抗体。(表2)。

表2：重组O型***病毒融合蛋白疫苗免疫牛产生O型***病毒特异性抗体的ELISA检测

表中：OJ3代表重组O型***病毒融合蛋白疫苗；灭活苗代表牛Asia I/O FMDV二价灭活疫苗。牛号栏中的每一个数字代表一头牛。

实施例7  重组O型***病毒融合蛋白疫苗在牛体内诱生牛O型***病毒特异性中和抗体对乳鼠的保护作用

为检测重组O型***病毒融合蛋白疫苗免疫幼牛的血清在同型O型***病毒攻击的条件下对动物的保护作用，进行了乳鼠病毒中和试验。分别将重组O型***病毒融合蛋白疫苗和灭活苗第一次免疫后21天和第二次免疫后14天幼牛(6-18个月)血清加热灭活补体，进行系列稀释，与等体积O型***病毒(200 ID₅₀)混合，进行1h的中和反应后，注入乳鼠体内，进行72h的培养和观察(表3)。乳鼠中和实验结果表明：重组O型***病毒融合蛋白疫苗免疫幼牛的血清中产生了针对O型***病毒特异性的抗体。

表3：重组O型***病毒融合蛋白疫苗免疫的牛血清对***病毒攻击的乳鼠的保护作用

A

B

表中：OJ3代表重组O型***病毒融合蛋白疫苗；灭活苗代表牛Asia I/O FMDV二价灭活疫苗。牛号栏中的每一个数字代表一头牛。PBS代表用等体积PBS免疫作为阴性对照的组别。血清对照组别的乳鼠是只注射相关血清未给予病毒的乳鼠。健康对照组别乳鼠是未给予任何实验处理，饲养条件和实验组相同的乳鼠。

实施例8  重组O型***病毒融合蛋白疫苗免疫牛预防牛O型***病毒感染的研究

实验动物

相同品种、来源的6-18月健康牛，经检验血清中亚洲I型、O型***病毒抗体均为阴性。

实验分组

重组O型***病毒融合蛋白疫苗组：经PBS溶解的重组O型***病毒融合蛋白疫苗与206佐剂混合，水相∶油相＝46∶54，重组O型***病毒融合蛋白疫苗终浓度为800微克/毫升。2毫升/只/次，臀部肌肉注射。

牛***二价灭活苗阳性对照组：商品化牛亚洲I型、O型***病毒二价灭活苗，2毫升/只/次，臀部肌肉注射。

PBS阴性对照组：PBS，2毫升/只/次，臀部肌肉注射。

攻毒实验

于各组免疫后的第28天，在牛舌面皮下注射O型***病毒佳木斯毒株，10000ID50/0.2ml。于注射病毒后第10天判断发病情况。除注射病毒的舌面外，牙龈、口腔、四蹄任何部位出现水泡，即可判断为发病。阴性对照组的牛至少三个蹄子出现水泡，方可判定攻毒实验成立。结果见表4。实验结果表明，重组O型***病毒融合蛋白疫苗免疫牛后具有预防牛O型***病毒感染的作用，其预防效果与商品化牛亚洲I型、O型***病毒二价灭活苗相当。

表4：重组O型***病毒融合蛋白疫苗免疫牛预防牛O型***病毒感染

实验分组	未发病牛(只)	发病牛(只)	保护率
				重组O型***病毒融合蛋白疫苗组	4	1	80％
商品化牛亚洲I型、O型***病毒二价灭活苗阳性对照组	4	1	80％
				PBS阴性对照组	0	3	0

序列表

<110>北京迪威华宇生物技术有限公司

<120>一种重组牛O型***病毒融合蛋白疫苗

<160>2

<210>1

<211>1152

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ATGGGCAGCA GCCATCATCA TCATCATCAC AGCAGCGGCC TGGTGCCGCG CGGCAGCCAT     60

ATGGCTAGCA TGACTGGTGG ACAGCAAATG GGTCGCGGAT CCGAATTCAG ATCTGGTGGC    120

CCGGTAACCA ACGTTCGTGG TGATCTTCAG GTTCTGGCTC AGAAAGCTGC TCGTACTCTG    180

CCAGGTGGCG AAGAAAACTA CGGTGGTGAA GCTCAGGTTC AGCGTCGTCA GCACACCGAC    240

GTATCCTTCA TCCTGGACCG TTTCGTTAAA GTAACTCCGG GATCTGGTGG CCCGGTAACC    300

AACGTTCGTG GTGATCTTCA GGTTCTGGCT CAGAAAGCTG CTCGTACTCT GCCAGGTGGC    360

GAAGAAAACT ACGGTGGTGA AGCTCAGGTT CAGCGTCGTC AGCACACCGA CGTATCCTTC    420

ATCCTGGACC GTTTCGTTAA AGTAACTCCG GGATCTGGTT CCTCTAAATA CGGCGAGTCT    480

CCGGTTACTA ACGTTCGTGG CGATCTGCAG GTTCTGGCTC AGAAGGCAGC ACGTACTCTG    540

CCGGGTGGTG AACCGTCTGA AGCTCGTCAT AAACAGAAAA TCGTTGCTCC AGTTAAGCAA    600

CTGCTGGGAT CTGGTGGCCC GGTAACCAAC GTTCGTGGTG ATCTTCAGGT TCTGGCTCAG    660

AAAGCTGCTC GTACTCTGCC AGGTGGCGAA GAAAACTACG GTGGTGAAGC TCAGGTTCAG    720

CGTCGTCAGC ACACCGACGT ATCCTTCATC CTGGACCGTT TCGTTAAAGT AACTCCGGGA    780

TCTGGTGGCC CGGTAACCAA CGTTCGTGGT GATCTTCAGG TTCTGGCTCA GAAAGCTGCT    840

CGTACTCTGC CAGGTGGCGA AGAAAACTAC GGTGGTGAAG CTCAGGTTCA GCGTCGTCAG    900

CACACCGACG TATCCTTCAT CCTGGACCGT TTCGTTAAAG TAACTCCGGG ATCTGGTTCC    960

TCTAAATACG GCGAGTCTCC GGTTACTAAC GTTCGTGGCG ATCTGCAGGT TCTGGCTCAG   1020

AAGGCAGCAC GTACTCTGCC GGGTGGTGAA CCGTCTGAAG CTCGTCATAA ACAGAAAATC   1080

GTTGCTCCAG TTAAGCAACT GCTGGGATCC AAGCTTGCGG CCGCACTCGA GCACCACCAC   1140

CACCACCACT GA                                                       1152

<210>2

<211>383

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Met Gly Ser Ser His  His His His His His  Ser Ser Gly Leu Val     15

Pro Arg Gly Ser His  Met Ala Ser Met Thr  Gly Gly Gln Gln Met     30

Gly Arg Gly Ser Glu  Phe Arg Ser Gly Gly  Pro Val Thr Asn Val     45

Arg Gly Asp Leu Gln  Val Leu Ala Gln Lys  Ala Ala Arg Thr Leu     60

Pro Gly Gly Glu Glu  Asn Tyr Gly Gly Glu  Ala Gln Val Gln Arg     75

Arg Gln His Thr Asp  Val Ser Phe Ile Leu  Asp Arg Phe Val Lys     90

Val Thr Pro Gly Ser  Gly Gly Pro Val Thr  Asn Val Arg Gly Asp    105

Leu Gln Val Leu Ala  Gln Lys Ala Ala Arg  Thr Leu Pro Gly Gly    120

Glu Glu Asn Tyr Gly  Gly Glu Ala Gln Val  Gln Arg Arg Gln His    135

Thr Asp Val Ser Phe  Ile Leu Asp Arg Phe  Val Lys Val Thr Pro    150

Gly Ser Gly Ser Ser  Lys Tyr Gly Glu Ser  Pro Val Thr Asn Val    165

Arg Gly Asp Leu Gln  Val Leu Ala Gln Lys  Ala Ala Arg Thr Leu    180

Pro Gly Gly Glu Pro  Ser Glu Ala Arg His  Lys Gln Lys Ile Val    195

Ala Pro Val Lys Gln  Leu Leu Gly Ser Gly  Gly Pro Val Thr Asn    210

Val Arg Gly Asp Leu  Gln Val Leu Ala Gln  Lys Ala Ala Arg Thr    225

Leu Pro Gly Gly Glu  Glu Asn Tyr Gly Gly  Glu Ala Gln Val Gln    240

Arg Arg Gln His Thr  Asp Val Ser Phe Ile  Leu Asp Arg Phe Val    255

Lys Val Thr Pro Gly  Ser Gly Gly Pro Val  Thr Asn Val Arg Gly    270

Asp Leu Gln Val Leu  Ala Gln Lys Ala Ala  Arg Thr Leu Pro Gly    285

Gly Glu Glu Asn Tyr  Gly Gly Glu Ala Gln  Val Gln Arg Arg Gln    300

His Thr Asp Val Ser  Phe Ile Leu Asp Arg  Phe Val Lys Val Thr    315

Pro Gly Ser Gly Ser  Ser Lys Tyr Gly Glu  Ser Pro Val Thr Asn    330

Val Arg Gly Asp Leu  Gln Val Leu Ala Gln  Lys Ala Ala Arg Thr    345

Leu Pro Gly Gly Glu  Pro Ser Glu Ala Arg  His Lys Gln Lys Ile    360

Val Ala Pro Val Lys  Gln Leu Leu Gly Ser  Lys Leu Ala Ala Ala    375

Leu Glu His His His  His His His                                 383

Claims (16)

1.一种应用基因工程方法生产的重组***病毒融合蛋白疫苗，编码该重组疫苗的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

2.以权利要求1所述的氨基酸序列为核心结构的蛋白类疫苗，这里的蛋白类疫苗是指采勇如下一种方法或几种方法联合生产的蛋白类疫苗：

a)参照权利要求1所述的氨基酸序列进行突变的重组蛋白疫苗。这里的突变是指在如权利要求1所述的重组蛋白疫苗的N末端、中间部位、C末端进行氨基酸的点突变或多个氨基酸的突变。

b)参照权利要求1所述重组***病毒融合蛋白疫苗的核苷酸序列进行修改而制备的重组蛋白疫苗。这里的“修改”是指在SEQ NO.1所示序列的核苷酸的5`端或/和3`端或/和中间部分的核苷酸的删除或/和添加其它序列的核苷酸，或/和对SEQNO.1所示序列的核苷酸进行单个或部分碱基所作的改变。

c)以权利要求1所述的氨基酸序列的重组蛋白疫苗或a)或b)中所述重组蛋白疫苗为核心结构，在其N末端或/和C末端添加或删除部分氨基酸序列所生产的重组蛋白疫苗。

d)将多个权利要求1所述的氨基酸序列的重组蛋白疫苗或a)或b)或c)中所述重组蛋白疫苗进行串联连接所生产的重组蛋白类疫苗。

3.含有权利要求1或权利要求2中任一所述重组蛋白疫苗的氨基酸序列对应的编码该蛋白质疫苗的核苷酸序列的核酸疫苗。

4.载有和权利要求1或权利要求2中任一所述重组蛋白疫苗的氨基酸序列对应的编码该蛋白质疫苗的核苷酸序列的病原体载体疫苗。

5.应用权利要求1、2、3、4中任一所述的疫苗在免疫后，可刺激豚鼠产生特异性抗O型***病毒抗体。

6.应用权利要求1、2、3、4中任一所述的疫苗在免疫后，可刺激牛产生特异性抗O型***病毒抗体。

7.权利要求5或权利要求6中所述的任一特异性抗***病毒抗体在***病毒的乳鼠中和试验中，可以中和O型***病毒，对乳鼠具有保护作用。

8.应用权利要求1、2、3、4中任一所述的疫苗在免疫牛后，可以保护牛免受O型***病毒的感染和攻击。

9.权利要求1、2、3、4中任一所述的疫苗用于制备用于防治O型***病毒或O型***病毒突变体感染引起的相关疾病的疫苗的用途。

10.权利要求9所述的用途中，O型***病毒感染的对象是牛，或者是羊，或者是猪，或者鹿，或是其他类型的偶蹄动物，或者是人。

11.按照权利要求9所述的用途，其中用于防治***病毒感染的疫苗在应用于权利要求10所述的对象时，其应用剂量是药物有效剂量。

12.按照权利要求9所述的用途，其中用于防治***病毒感染的疫苗在应用于权利要求10所述的对象时，可与药物学可接受的载体承载应用。

13.按照权利要求9所述的用途，其中用于防治***病毒感染的疫苗在应用于权利要求10所述的对象时，和佐剂或/和非特异性免疫增强剂联合应用。

14.按照权利要求9所述的用途，其中用于防治***病毒感染的疫苗在应用于权利要求10所述的对象时，和一种或多种其它***疫苗联合应用，这里的“其它***疫苗”包括但不限于针对亚洲一型***病毒及其变种的重组***病毒蛋白疫苗、核酸疫苗、病原体载体疫苗。

15.按照权利要求9所述的用途，其中用于防治***病毒感染的疫苗在应用于权利要求10所述的对象时，经肠外给药途径施用，这些途径包括皮下、皮内、肌肉、腹腔。

16.权利要求1、2、3、4中任一所述的疫苗用于制备用于防治和O型***病毒有交叉抗原的其它类型的***病毒感染引起的相关疾病的疫苗的用途。

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