CN102231984A - 使用选择性细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂对抗化疗化合物的造血防护 - Google Patents

使用选择性细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂对抗化疗化合物的造血防护 Download PDF

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Abstract

提供减轻或预防细胞毒性化合物对健康细胞的效应的方法。所述方法涉及使用选择性细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4/6抑制剂来诱导CDK4/6依赖性细胞例如造血干细胞和/或造血祖细胞中的暂时静止。还描述选择用于减轻或预防细胞毒性剂化合物在健康细胞中的效应的化合物的方法。

Description

使用选择性细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂对抗化疗化合物的造血防护
相关申请
本发明公开的主题基于于2008年10月1日提交的美国临时申请61/101,841并要求其权利；其公开以其整体通过援引纳入本文。
政府权利
本发明公开的主题利用由National Institutes of Health经NationalInstitute on Aging和National Cancer Institute拨款的Grant Nos.RO1AG024379-01和K08 CA90679美国政府资助得以完成。因此，美国政府享有本发明公开的主题的某些权利。
技术领域
本发明公开的主题涉及保护健康细胞免受因细胞毒性化合物如DNA损伤性化合物导致的损伤的方法。具体地，本发明公开的主题涉及向已暴露于、正在或将暴露于、或者有风险暴露于细胞毒性化合物的对象给药的细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)抑制剂的保护作用。
缩写
Figure BPA00001380823800011
Figure BPA00001380823800021
Figure BPA00001380823800031
背景技术
化疗是指为了消除癌细胞和肿瘤而使用细胞毒性(例如DNA损伤性)药物，例如，但不限于白消安、环磷酰胺、多柔比星、柔红霉素、长春碱、长春新碱、博来霉素、依托泊苷、托泊替康、伊立替康、泰索帝、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、吉西他滨、顺铂、卡铂或苯丁酸氮芥。化疗化合物对正常的、快速***的细胞往往是非特异性的，并且具有毒性，特别是在高剂量下。这通常在进行化疗的患者中产生各种副作用。
骨髓抑制(骨髓中血细胞生成严重降低)是此类副作用之一。它的特征是骨髓抑制(贫血、中性白细胞减少症、粒细胞缺乏症和血小板减少)和淋巴细胞减少。中性白细胞减少症的特征是循环嗜中性粒细胞数的选择性降低和对细菌感染的易感性提高。在美国，贫血(红细胞或红血球数、血红蛋白量或红细胞压积(通过测定血细胞比容表征)降低)影响约67％的接受化疗的癌症患者。参见BioWorld Today，第4页，2002年7月23日。化学治疗剂的细胞毒性限制可用药的剂量，影响治疗周期并且严重危及癌症患者的生活质量。血小板减少症是血小板数降低伴有出血易感性增高。淋巴细胞减少症是化疗的常见副作用，其特征是循环淋巴细胞(也称为T-细胞和B-细胞)数量降低。淋巴细胞减少症患者易受到多种感染。
小分子已用来减轻某些化疗化合物的一些副作用。例如，亚叶酸已用来缓解甲氨蝶呤对骨髓细胞和对胃肠道粘膜细胞的效应。氨磷汀已用来减轻接受烷基化的或含铂的化疗剂的患者的中性白细胞减少症相关的发热和粘膜炎的发病。此外，右雷佐生已用来提供对于蒽环类抗癌化合物的心脏保护。不幸的是，许多化疗保护剂例如右雷佐生和氨磷汀在相伴给药时存在可能降低化疗效力的问题。
其它化疗保护治疗，特别是化疗相关的贫血和中性白细胞减少症的化疗保护治疗，包括使用生长因子。造血生长因子可在市场上以重组蛋白的形式得到。这些蛋白包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及它们用于治疗中性白细胞减少症的衍生物，以及红细胞生成素(EPO)及其用于治疗贫血的衍生物。但是，这些重组蛋白费用昂贵。此外，EPO在癌症患者中具有显著的毒性，在几个大型随机试验中，致使血栓形成、复发和死亡增加。G-CSF和GM-CSF可以增大继发性骨髓病症例如白血病和脊髓发育不良的后期(在治疗后＞2年)风险。因此，它们的使用受限，并且不是所有有需要的患者易得的。另外，虽然生长因子可以加速一些血液细胞系的恢复，但是不存在治疗对血小板、巨噬细胞、T-细胞或B-细胞的抑制的疗法。
已证明非选择性激酶抑制剂星形孢菌素在一些培养的细胞类型中预防DNA损伤剂。参见Chen等人，J.Natl.Cancer Inst.，92，1999-2008(2000)；和Ojeda等人，Int.J.Radiat.Biol.，61，663-667(1992)。星形孢菌素是天然产物，并且是高亲合性地结合大多数哺乳动物激酶的非选择性激酶抑制剂。参见Karaman等人，Nat.Biotechnol.，26，127-132(2008)。取决于细胞类型、药物浓度和暴露时间长度，星形孢菌素治疗可以引发一系列细胞反应，包括细胞凋亡、细胞周期停滞和细胞周期关卡破坏(compromise)。例如，已证明星形孢菌素通过几种报道的机制(包括消除G2关卡反应)使细胞对DNA损伤剂例如电离辐射和化疗敏感(参见Bernhard等人，Int.J.Radiat.Biol.，69，575-584(1996)；Teyssier等人，Bull.Cancer，86，345-357(1999)；Hallahan等人，Radiat.Res.，129，345-350(1992)；Zhang等人，J.Neurooncol.，15，1-7(1993)；Guo等人，Int.J.Radiat.Biol.，82，97-109(2006)；Bucher和 Britten，Br.J.Cancer，98，523-528(2008)；Laredo等人，Blood，84，229-237(1994)；Luo等人，Neoplasia，3，411-419(2001)；Wang等人，Yao XueXue Bao，31，411-415(1996)；Chen 等人，J.Natl.Cancer Inst.，92，1999-2008(2000)；和Hirose等人，Cancer Res.，61，5843-5849(2001))。尚不清楚星形孢菌素治疗借以在一些培养的细胞类型中预防DNA损伤剂的机制，所提出的几种可能的机制包括抑制蛋白激酶C或降低CDK4蛋白水平。参见Chen等人，J.Natl.Cancer Inst.，92，1999-2008(2000)；和Ojeda等人，Int.J.Radiat.Biol.，61，663-667(1992)。已证明星形孢菌素对造血祖细胞无效应，已证明恰在暴露于DNA损伤剂之后使用星形孢菌素不能提供保护。在向哺乳动物体内给药后，星形孢菌素的非选择性激酶抑制产生与其对细胞周期的效应无关的显著毒性(例如高血糖)，并且这些毒性已阻止其临床使用。
考虑到上述方法的这些缺陷，仍然需要实用的方法来保护正接受或预定接受化疗暴露的对象。特别需要保护化疗患者免于骨髓抑制和淋巴细胞减少。此外，需要不降低化疗对癌细胞的效力的化学保护策略。
发明概述
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供降低或预防细胞毒性化合物对已暴露于、将暴露于或有风险遭受暴露于细胞毒性化合物的对象中的健康细胞的效应的方法，其中所述健康细胞是造血干细胞或造血祖细胞，所述方法包括向所述对象给药有效量的抑制剂化合物或其药学可接受的形式，其中所述抑制剂化合物选择性地抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)。
在一些实施方案中，所述抑制剂化合物选择性地抑制CDK4和CDK6。在一些实施方案中，所述抑制剂化合物是非天然的化合物。
在一些实施方案中，所述抑制剂化合物基本上没有脱靶效应。在一些实施方案中，所述脱靶效应是长期毒性、抗氧化效应、***效应、酪氨酸激酶抑制、抑制除CDK4/6之外的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、和非CDK4/6依赖性细胞中的细胞周期停滞中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述抑制剂化合物选择性地诱导CDK4/6依赖性细胞中的G1停滞。在一些实施方案中，所述抑制剂化合物在CDK4/6依赖性细胞中诱导基本上纯粹的G1停滞。
在一些实施方案中，所述抑制剂化合物选自吡啶并[2，3-d]嘧啶、三氨基嘧啶、芳基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑、含氮的杂芳基取代的脲、5-嘧啶基-2-氨基噻唑、苯并噻二嗪和吖啶硫酮。
在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶是吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮或2-氨基-6-氰基吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-酮。在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮是2-(2’-吡啶基)氨基吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮。在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮是6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮。
在一些实施方案中，所述芳基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑选自萘基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑、吲哚并[a]吡咯并[3，4-c]咔唑、喹啉基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑和异喹啉基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑。在一些实施方案中，所述芳基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑是2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮。
在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物。在一些实施方案中，所述抑制剂化合物通过口服给药、局部给药、鼻内给药、吸入和静脉内给药之一向所述对象给药。
在一些实施方案中，在暴露于所述细胞毒性化合物之前、在暴露于所述细胞毒性化合物期间、在暴露于所述细胞毒性化合物之后或其任何组合向所述对象给药所述抑制剂化合物。在一些实施方案中，向所述对象给药所述抑制剂化合物，24小时或更短时间之后暴露于所述细胞毒性化合物。在一些实施方案中，在暴露于所述细胞毒性化合物之后24小时或更长时间向所述对象给药所述抑制剂化合物。
在一些实施方案中，所述细胞毒性化合物是DNA损伤性化合物。
在一些实施方案中，所述健康细胞选自长期造血干细胞(LT-HSC)、短期造血干细胞(ST-HSC)、多能祖细胞(MPP)、髓共同祖细胞(CMP)、淋巴共同祖细胞(CLPs)、粒细胞-单核细胞系祖细胞(GMP)和巨核细胞-红细胞系祖细胞(MEP)。在一些实施方案中，给药所述抑制剂化合物产生造血干细胞和造血祖细胞的暂时药理性静止。
在一些实施方案中，所述对象已接受、正接受或预定要接受用细胞毒性化合物的医学治疗以治疗疾病。在一些实施方案中，给药所述抑制剂化合物不影响患病细胞的生长。
在一些实施方案中，所述疾病是癌症。在一些实施方案中，所述癌症的特征在于一个或多个以下方面：细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)活性增高、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)活性增高、丧失或缺乏视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB)、高水平的MYC表达、细胞周期蛋白E增多和细胞周期蛋白A增多。
在一些实施方案中，与在不给药所述抑制剂化合物的情况下会使用的剂量相比，给药所述抑制剂化合物允许使用更高剂量的所述细胞毒性化合物来治疗所述疾病。
在一些实施方案中，所述对象已意外地暴露于所述细胞毒性化合物或者过量的所述细胞毒性化合物。
在一些实施方案中，所述方法没有长期的血液毒性。在一些实施方案中，与在不给药所述抑制剂化合物的情况下暴露于所述细胞毒性化合物后预期的状况相比，给药所述抑制剂化合物致使贫血减轻、淋巴细胞减少减轻、血小板减少减轻或中性白细胞减少症减轻。
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供筛选用于预防细胞毒性剂在健康细胞中的效应的化合物的方法，所述方法包括：使CDK4/6依赖性细胞群与测试化合物接触一段时间；进行所述细胞群的细胞周期分析；和选择选择性地诱导所述细胞群中的G1停滞的测试化合物。
在一些实施方案中，所述CDK4/6依赖性细胞群包括调聚的人类二倍体成纤维细胞或缺少INK4a/ARF的黑素瘤细胞。在一些实施方案中，使用选自流式细胞术、荧光测定法、细胞成像和荧光光谱法的一种或多种技术进行所述细胞周期分析。在一些实施方案中，所述细胞周期分析包括用选自5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)和碘化丙锭(PI)的一种或多种标记剂标记所述细胞群。
在一些实施方案中，所述方法还包括：使另一种细胞群与选择性地诱导CDK4/6依赖性细胞中的G1停滞的测试化合物接触一段时间，其中所述另一种细胞群包括非CDK4/6依赖性细胞；进行所述另一种细胞群的细胞周期分析；和选择没有选择性地诱导所述另一种细胞群中的G1停滞的测试化合物。
在一些实施方案中，所述另一种细胞群是癌细胞系。在一些实施方案中，所述另一种细胞群是RB无效的。
在一些实施方案中，所述方法还包括通过评价所述测试化合物在与细胞毒性剂接触的离体细胞群中减轻DNA损伤的能力、维持细胞活力的能力或此二者证实所述化合物的预防能力。在一些实施方案中，通过进行γ-H2AX测定评价所述细胞群中的DNA损伤。在一些实施方案中，通过进行细胞增殖测定评价细胞活力。
在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是DNA损伤性化合物。在一些实施方案中，所述DNA损伤性化合物选自多柔比星、依托泊苷和卡铂。
本发明公开的主题的目的是提供通过向对象给药有效量的选择性CDK4/6抑制剂化合物来保护所述对象中的健康细胞免受DNA损伤性化合物的效应的方法。
结合下文充分描述的附图，随着进一步描述，上文已述并通过本发明公开的主题全部或部分地实现的本发明公开的主题的目的，以及其它目的会变得显而易见。
附图简述
图1是关于血细胞生成、造血干细胞(HSC)和祖细胞的分级增殖伴有在增殖后分化增加的示意图。
图2A是经(由上至下)0nM、15nM、30nM、89nM或270nM的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)治疗24小时的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞；WM2664)的细胞周期分析的一系列代表性柱状图。利用Mod-FitTM软件(Varity Software House，Topsham，Maine，United States of America)拟合数据。
图2B是经(由上至下)0nM、122nM、370nM、1.1μM或3.3μM的2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)治疗24小时的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞；WM2664)的细胞周期分析的一系列代表性柱状图。利用Mod-FitTM软件(Varity Software House，Topsham，Maine，United States ofAmerica)拟合数据。
图2C是表示按照所述经0nM、15nM、30nM、89nM或270nM的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)或者经0nM、122nM、370nM、1.1μM或3.3μM的2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)治疗24小时后处于细胞周期G1期的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞；WM2664)的百分比(％)的图。
图2D是表示按照所述经0nM、15nM、30nM、89nM或270nM的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)或者经0nM、122nM、370nM、1.1μM或3.3μM的2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)治疗24小时后处于细胞周期G2/M期的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞；WM2664)的百分比(％)的图。
图2E是表示按照所述经0nM、15nM、30nM、89nM或270nM的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)或经0nM、122nM、370nM、1.1μM或3.3μM的2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)治疗24小时后处于细胞周期S期的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞；WM2664)的百分比(％)的图。
图3A是表示2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞免受卡铂诱导的DNA损伤的能力的棒图。缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664)被2BrIC预治疗16小时，然后被卡铂预治疗8小时。按照本文所述，利用γ-H2AX测定评价DNA损伤。示出关于仅被卡铂治疗或者被0.122、0.37、1.1或3.3μM的2BrIC预治疗后用卡铂治疗的WM2664的γ-H2AX阳性细胞的百分比(％)。
图3B是表示2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞免受依托泊苷诱导的DNA损伤的能力的棒图。缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664)被2BrIC预治疗16小时，然后被依托泊苷预治疗8小时。按照本文所述，利用γ-H2AX测定评价DNA损伤。示出关于仅被依托泊苷治疗或者被0.122、0.37、1.1或3.3μM的2BrIC预治疗后用依托泊苷治疗的WM2664的γ-H2AX阳性细胞的百分比(％)。
图3C是表示2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞免受多柔比星诱导的DNA损伤的能力的棒图。缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664)被2BrIC预治疗16小时，然后被多柔比星预治疗8小时。按照本文所述，利用γ-H2AX测定评价DNA损伤。示出关于仅被多柔比星治疗或者被0.122、0.37、1.1或3.3μM的2BrIC预治疗后用多柔比星治疗的WM2664的γ-H2AX阳性细胞的百分比(％)。
图4是表示2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞免受多柔比星、卡铂或依托泊苷诱导的DNA损伤(通过评价γ-H2AX水平测定)的能力的棒图。示出关于未治疗的调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68)；被122nM、370nM、1.1μM或3.3μM的2BrIC治疗16小时的HS68细胞；仅被卡铂(Carbo)、依托泊苷(Etop)或多柔比星(Dox)治疗8小时的HS68细胞；以及被122nM、370nM、1.1μM或3.3μM的2BrIC预治疗16小时后被Carbo、Etop或Dox治疗8小时的HS68细胞的γ-H2AX阳性细胞的百分比(％)。
图5是表示2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)没有保护非细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(人类RB无效的黑素瘤细胞(A2058))免受多柔比星、卡铂或依托泊苷诱导的DNA损伤(通过评价γ-H2AX水平测定)的能力的棒图。示出关于未治疗的A2058细胞；被122nM、370nM、1.1μM或3.3μM的2BrIC治疗16小时的A2058细胞；仅被卡铂(Carbo)、依托泊苷(Etop)或多柔比星(Dox)治疗8小时的A2058细胞；以及被122nM、370nM、1.1μM或3.3μM的2BrIC预治疗16小时后被Carbo、Etop或Dox治疗8小时的A2058细胞的γ-H2AX阳性细胞的百分比(％)。
图6A是表示6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞免受卡铂诱导的DNA损伤的能力的棒图。缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664)被PD 0332991预治疗16小时，然后被卡铂预治疗8小时。按照本文所述，利用γ-H2AX测定评价DNA损伤。示出关于仅被卡铂治疗的或者被15nM、30nM、89nM或270nM的PD0332991预治疗后用卡铂治疗的WM2664的γ-H2AX阳性细胞的百分比(％)。
图6B是表示6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞免受依托泊苷诱导的DNA损伤的能力的棒图。缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664)被PD 0332991预治疗16小时，然后被依托泊苷预治疗8小时。按照本文所述，利用γ-H2AX测定评价DNA损伤。示出关于仅被依托泊苷治疗的或者被15nM、30nM、89nM或270nM的PD 0332991预治疗后用依托泊苷治疗的WM2664的γ-H2AX阳性细胞的百分比(％)。
图6C是表示6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞免受多柔比星诱导的DNA损伤的能力的棒图。缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664)被PD 0332991预治疗16小时，然后用多柔比星预治疗8小时。按照本文所述，利用γ-H2AX测定评价DNA损伤。示出关于仅被多柔比星治疗的或者被15nM、30nM、89nM或270nM的PD 0332991预治疗后用多柔比星治疗的WM2664的γ-H2AX阳性细胞的百分比(％)。
图7是表示6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞免受多柔比星、卡铂或依托泊苷诱导的DNA损伤(通过评价γ-H2AX水平测定)的能力的棒图。示出关于未治疗的调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68)；被15nM、30nM、89nM或270nM的PD 0332991治疗16小时的HS68细胞；仅被卡铂(Carbo)、依托泊苷(Etop)或多柔比星(Dox)治疗8小时的HS68细胞；以及被15nM、30nM、89nM或270nM的PD 0332991预治疗16小时后被Carbo、Etop或Dox治疗8小时的HS68细胞的γ-H2AX阳性细胞的百分比(％)。
图8是表示6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)没有保护非细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(人类RB无效的黑素瘤细胞(A2058))免受多柔比星、卡铂或依托泊苷诱导的DNA损伤(通过评价γ-H2AX水平测定)的能力的棒图。示出关于未治疗的A2058细胞；被15nM、30nM、89nM或270nM的PD0332991治疗16小时的A2058细胞；仅被卡铂(Carbo)、依托泊苷(Etop)或多柔比星(Dox)治疗8小时的A2058细胞；以及被15nM、30nM、89nM或270nM的PD 0332991预治疗16小时后被Carbo、Etop或Dox治疗8小时的A2058细胞的γ-H2AX阳性细胞的百分比(％)。
图9是表示2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)保护缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664)免受多柔比星诱导的细胞毒性(通过利用WST-1测定评价细胞活力来测定)的能力的棒图。通过监测(follow)在450nm的吸光度测定相对细胞数。示出关于仅用2BrIC(条纹棒；在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)；用2BrIC(在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)和多柔比星(DOX；实心棒)；或者仅用DOX(空心棒)治疗的细胞的结果。
图10是表示6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)保护缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664)免受多柔比星诱导的细胞毒性(通过利用WST-1测定评价细胞活力来测定)的能力的棒图。通过监测在450nm的吸光度测定相对细胞数。示出关于仅用PD 0332991(条纹棒；在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)；用PD 0332991(在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)和多柔比星(DOX；实心棒)；或者仅用DOX(空心棒)治疗的细胞的结果。
图11是表示2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)保护调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68)免受多柔比星诱导的细胞毒性(通过利用WST-1测定评价细胞活力来测定)的能力的棒图。通过监测在450nm的吸光度测定相对细胞数。示出关于仅用2BrIC(条纹棒；在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)；用2BrIC(在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)和多柔比星(DOX；实心棒)；或者仅用DOX(空心棒)治疗的细胞的结果。
图12是表示6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)保护调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68)免受多柔比星诱导的细胞毒性(通过利用WST-1测定评价细胞活力来测定)的能力的棒图。通过监测在450nm的吸光度测定相对细胞数。示出关于仅用PD 0332991(条纹棒；在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)；用PD 0332991(在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)和多柔比星(DOX；实心棒)；或者仅用DOX(空心棒)治疗的细胞的结果。
图13是表示2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)没有保护人类RB无效的黑素瘤细胞(A2058)免受多柔比星诱导的细胞毒性(通过利用WST-1测定评价细胞活力来测定)的能力的棒图。通过监测在450nm的吸光度测定相对细胞数。示出关于仅用2BrIC(条纹棒；在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)；用2BrIC(在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)和多柔比星(DOX；实心棒)；或者仅用多柔比星(空心棒)治疗的细胞的结果。
图14是表示6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)保护人类RB无效的黑素瘤细胞(A2058)免受多柔比星诱导的细胞毒性(通过利用WST-1测定评价细胞活力来测定)的能力的棒图。通过监测在450nm的吸光度测定相对细胞数。示出关于仅用PD 0332991(条纹棒；在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)；用PD 0332991(在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)和多柔比星(DOX；实心棒)；或者仅用DOX(空心棒)治疗的细胞的结果。
图15A是未治疗的多能祖细胞(MPP)细胞(上)和2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)治疗的MPP细胞(下)利用细胞表面抗原的流式细胞术门控示意图。除了经或未经2BrIC的治疗24小时之外，细胞还处于存在5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)的条件下。
图15B是表示5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)阳性细胞在Lin-Kit+Sca-1阳性的未治疗的和2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC)治疗的细胞群(来自图15A)中的百分比的棒图。BrdU掺入(incorporation)是G1至S-期细胞周期转变(traversal)的量度，体内2BrIC治疗明显降低MPP的增殖。
图16A是造血干细胞(HSC)和多能祖细胞(MPP)细胞(上)及髓样祖细胞(下)利用细胞表面抗原的流式细胞术门控示意图。
图16B是未经治疗(N＝6)或经6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)治疗48小时和24小时的BrdU暴露后的造血干细胞群和造血祖细胞(HSPC)群增殖的代表性的等值线图，由5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)掺入和Ki67表达来表示。等值线表示5％密度。作为G1至S-期细胞周期转变的量度的BrdU掺入和Ki67表达是周期中的细胞(cycling cell)的标记。在这些早期的HSPC中，PD0332991治疗明显地降低增殖。
图16C是表示量化在未治疗的(空心棒)和治疗的(阴影棒)细胞群中5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)和Ki67数据(来自图16B)的一系列棒图。*p，0.05；**p＜0.01，***p＜0.001。误差棒表示平均值的标准误差。
图16D是表示在48小时的治疗和24小时的5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)暴露之后未治疗的(空心棒)和治疗的(阴影棒)细胞群中Lin-、HSC、MPP或Lin-cKit+Sca1-群的相对频度的一系列棒图。*p，0.05；**p＜0.01，***p＜0.001。误差棒表示平均值的标准误差。随着细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂治疗发生HSC和MPP的相对富集，这是因为在CDK4/6抑制剂存在下，更为富集得多的、更分化的髓样细胞继续***和分化。
图17是表示2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮(2BrIC；150mg/kg通过口腔管饲)在小鼠中体内保护红细胞和血红蛋白免受卡铂(Carbo；100mg/kg，i.p.)的效应的一系列棒图。小鼠被2BrIC治疗1小时，然后注射Carbo。在Carbo注射后第6天采集血液，并测定全血细胞计数。无阴影棒代表来自被Carbo和2BrIC治疗的动物的数据，而阴影棒代表来自仅被Carbo治疗的动物的数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图18是表示6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991；150mg/kg通过口腔管饲)在小鼠中体内保护四种细胞系免受多柔比星(DOX；10mg/kg，i.p.)的效应的一系列棒图。小鼠被PD 0332991治疗1小时，然后注射DOX。7天后，重复DOX注射。在初次DOX注射后第14天采集血液并测定全血细胞计数。较浅的阴影棒代表来自被DOX和PD 0332991治疗的动物的数据，而较深的阴影棒代表来自仅被DOX治疗的动物的数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图19是表示6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991；150mg/kg通过口腔管饲)在小鼠中体内保护四种细胞系免受卡铂(Carbo；100mg/kg；i.p.)的效应的一系列棒图。小鼠被PD 0332991治疗1小时，然后注射Carbo。以7天为间隔采集血液并测定全血细胞计数。较浅的阴影棒代表来自被Carbo和PD0332991治疗的动物的数据，而较深的阴影棒代表来自仅被Carbo治疗的动物的数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图20A是被夫拉平度(flavopiridol)和5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)治疗的各种细胞类型的流式细胞术门控示意图，表明夫拉平度不诱导细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中的G1停滞。顶部的示意图对应于缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664)；中间的示意图对应于调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68)；底部的示意图对应于人类RB无效的黑素瘤细胞(A2058)。
图20B是表示夫拉平度在细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中没有化学保护效应的棒图。提供关于未治疗的缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664；细胞)；被900、300、100或30nM的夫拉平度治疗(16小时)的WM2664细胞；被多柔比星(DOX；122nM；8小时)治疗的WM2664细胞；以及被900、300、100或30nM的夫拉平度治疗16小时后用DOX(122nM)治疗8小时的WM2664细胞的数据。替换治疗介质，7天后利用CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800161
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，United Statesof America)测定细胞活力，并以相对光单位(RLU)表示数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图20C是表示夫拉平度在细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中没有化学保护效应的棒图。提供关于未治疗的调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68；细胞)；被900、300、100或30nM的夫拉平度治疗(16小时)的HS68细胞；被多柔比星(DOX；370nM；8小时)治疗的HS68细胞；以及被900、300、100或30nM的夫拉平度治疗16小时后用DOX(370nM)治疗8小时的HS68细胞的数据。替换治疗介质，7天后利用CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800162
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，United States ofAmerica)测定细胞活力，并以相对光单位(RLU)表示数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图20D是表示夫拉平度在非细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中没有化学保护效应的棒图。提供关于未治疗的人类视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB)无效的黑素瘤细胞(A2058；细胞)；被900、300、100或30nM的夫拉平度治疗(16小时)的A2058细胞；被多柔比星(DOX；370nM；8小时)治疗的A2058细胞；以及被900、300、100或30nM的夫拉平度治疗16小时后用DOX(370nM)治疗8小时的A2058细胞的数据。替换治疗介质，7天后利用CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800163
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，United States of America)测定细胞活力，并以相对光单位(RLU)表示数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图21A表示被化合物7(R547)和5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)治疗的各种细胞类型的流式细胞术门控示意图，表明化合物7不诱导细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中的G1停滞。顶部的示意图对应于缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664)；中间的示意图对应于调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68)；底部的示意图对应于人类视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB)无效的黑素瘤细胞(A2058)。
图21B是表示化合物7(R547)在细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中没有化学保护效应的棒图。提供关于未治疗的缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664；细胞)；被900、300、100或30nM的化合物7治疗(16小时)的WM2664细胞；被多柔比星(DOX；122nM；8小时)治疗的WM2664细胞；以及被900、300、100或30nM的化合物7预治疗16小时后用DOX(122nM)治疗8小时的WM2664细胞的数据。替换治疗介质，7天后利用CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800171
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，United States of America)测定细胞活力，并以相对光单位(RLU)表示数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图21C是表示化合物7(R547)在细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中没有化学保护效应的棒图。提供关于未治疗的调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68；细胞)；被900、300、100或30nM的化合物7治疗(16小时)的HS68细胞；被多柔比星(DOX；370nM；8小时)治疗的HS68细胞；以及被900、300、100或30nM的化合物7预治疗16小时后用DOX(370nM)治疗8小时的HS68细胞的数据。替换治疗介质，7天后利用CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800172
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，United Statesof America)测定细胞活力，并以相对光单位(RLU)表示数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图21D是表示化合物7(R547)在非细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中没有化学保护效应的棒图。提供关于未治疗的人类视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB)无效的黑素瘤细胞(A2058；细胞)；被900、300、100或30nM的化合物7治疗(16小时)的A2058细胞；被多柔比星(DOX；370nM；8小时)治疗的A2058细胞；以及被900、300、100或30nM的化合物7预治疗16小时后用DOX(370nM)治疗8小时的A2058细胞的数据。替换治疗介质，7天后利用CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800181
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，United States of America)测定细胞活力，并以相对光单位(RLU)表示数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图22A表示被Roscovitine和5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)治疗的各种细胞类型的流式细胞术门控示意图，表明Roscovitine不诱导细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中的G1停滞。顶部的示意图对应于缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664)；中间的示意图对应于调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68)；底部的示意图对应于人类视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB)无效的黑素瘤细胞(A2058)。
图22B是表示Roscovitine在细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中没有化学保护效应的棒图。提供关于未治疗的缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664；细胞)；被900、300、100或30nM的Roscovitine治疗(16小时)的WM2664细胞；被多柔比星(DOX；122nM；8小时)治疗的WM2664细胞；以及被900、300、100或30nM的Roscovitine预治疗16小时后用DOX(122nM)治疗8小时的WM2664细胞的数据。替换治疗介质，7天后利用CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800182
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，United States of America)测定细胞活力，并以相对光单位(RLU)表示数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图22C是表示Roscovitine在细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中没有化学保护效应的棒图。提供关于未治疗的调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68；细胞)；被900、300、100或30nM的Roscovitine治疗(16小时)的HS68细胞；被多柔比星(DOX；370nM；8小时)治疗的HS68细胞；以及被900、300、100或30nM的Roscovitine预治疗16小时后用DOX(370nM)治疗8小时的HS68细胞的数据。替换治疗介质，7天后利用CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800183
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，UnitedStates of America)测定细胞活力，并以相对光单位(RLU)表示数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图22D是表示Roscovitine在非细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中没有化学保护效应的棒图。提供关于未治疗的人类视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB)无效的黑素瘤细胞(A2058；细胞)；被900、300、100或30nM的Roscovitine治疗(16小时)的A2058细胞；被多柔比星(DOX；370nM；8小时)治疗的A2058细胞；以及被900、300、100或30nM的Roscovitine预治疗16小时后用DOX(370nM)治疗8小时的A2058细胞的数据。替换治疗介质，7天后利用CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800191
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，United States of America)测定细胞活力，并以相对光单位(RLU)表示数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图23A是表示染料木黄酮在细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中没有化学保护效应的棒图。提供关于未治疗的缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664；细胞)；被100、30、10或3μM的染料木黄酮治疗(16小时)的WM2664细胞；被多柔比星(DOX；122nM；8小时)治疗的WM2664细胞；以及被100、30、10或3μM的染料木黄酮预治疗16小时后用DOX(122nM)治疗8小时的WM2664细胞的数据。替换治疗介质，7天后利用CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800192
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，UnitedStates of America)测定细胞活力，并以相对光单位(RLU)表示数据。
图23B是表示染料木黄酮在细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中没有化学保护效应的棒图。提供关于未治疗的调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68；细胞)；被300、100、30或3μM的染料木黄酮治疗(16小时)的HS68细胞；被多柔比星(DOX；370nM；8小时)治疗的HS68细胞；以及被300、100、30或3μM的染料木黄酮预治疗16小时后用DOX(370nM)治疗8小时的HS68细胞的数据。替换治疗介质，7天后利用CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800193
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，United Statesof America)测定细胞活力，并以相对光单位(RLU)表示数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图23C是表示染料木黄酮在非细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中没有化学保护效应的棒图。提供关于未治疗的人类视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB)无效的黑素瘤细胞(A2058；细胞)；被100、30、10或3μM的染料木黄酮治疗(16小时)的A2058细胞；被多柔比星(DOX；370nM；8小时)治疗的A2058细胞；以及被100、30、10或3μM的染料木黄酮预治疗16小时后用DOX(370nM)治疗8小时的A2058细胞的数据。替换治疗介质，7天后利用CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800201
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，United States of America)测定细胞活力，并以相对光单位(RLU)表示数据。误差棒表示平均值的标准误差。
图24A是表示用1.1或3.3μM的非-CDK4/6选择性化合物8、9、11、14、10、13或12治疗后处于G1期的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞的百分比(％)的棒图。为了比较，还给出未治疗的细胞群(对照1-4)的数据。
图24B是表示用1.1或3.3μM的化合物8、9、11、14、10、13或12治疗后处于G2/M期的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞的百分比(％)的棒图。为了比较，还给出未治疗的细胞群(对照1-4)的数据。
图24C是表示用1.1或3.3μM的化合物8、9、11、14、10、13或12治疗后处于S期的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞的百分比(％)的棒图。为了比较，还给出未治疗的细胞群(对照1-4)的数据。
图24D是表示化合物8没有保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664))免受多柔比星诱导的细胞毒性(在细胞治疗后7天通过利用WST-1测定评价细胞活力来测定)的能力的棒图。通过监测在450nm的吸光度测定细胞数。示出关于仅用化合物8(条纹棒；在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)治疗16小时的细胞；用化合物8(在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)治疗16小时然后用多柔比星(DOX；实心棒)治疗8小时的细胞；或者仅用DOX(122nM；8小时；空心棒)治疗的细胞的结果。误差棒表示平均值的标准误差。
图24E是表示化合物9没有保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664))免受多柔比星诱导的细胞毒性(在细胞治疗后7天通过利用WST-1测定评价细胞活力来测定)的能力的棒图。通过监测在450nm的吸光度测定细胞数。示出关于仅用化合物9(条纹棒；在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)治疗16小时的细胞；用化合物9(在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)治疗16小时然后用多柔比星(DOX；122nM；实心棒)治疗8小时的细胞；或者仅用DOX(122nM；空心棒)治疗8小时的细胞的结果。误差棒表示平均值的标准误差。
图24F是表示化合物11没有保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664))免受多柔比星诱导的细胞毒性(在细胞治疗后7天通过利用WST-1测定评价细胞活力来测定)的能力的棒图。通过监测在450nm的吸光度测定细胞数。示出关于仅用化合物11(条纹棒；在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)治疗16小时的细胞；用化合物11(在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)治疗16小时然后用多柔比星(DOX；122nM；实心棒)治疗8小时的细胞；或者仅用DOX(122nM；空心棒)治疗8小时的细胞的结果。误差棒表示平均值的标准误差。
图24G是表示化合物8没有保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68))免受多柔比星诱导的细胞毒性(在细胞治疗后7天通过利用WST-1测定评价细胞活力来测定)的能力的棒图。通过监测在450nm的吸光度测定细胞数。示出关于仅用化合物8(条纹棒；在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)治疗16小时的细胞；用化合物8(在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)治疗16小时然后用多柔比星(DOX；370nM；实心棒)治疗8小时的细胞；或者仅用DOX(370nM；空心棒)治疗8小时的细胞的结果。误差棒表示平均值的标准误差。
图24H是表示化合物9没有保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68))免受多柔比星-诱导的细胞毒性(在细胞治疗后7天通过利用WST-1测定评价细胞活力来测定)的能力的棒图。通过监测在450nm的吸光度测定细胞数。示出关于仅用化合物9(条纹棒；在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)治疗16小时的细胞；用化合物9(在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)治疗16小时然后用多柔比星(DOX；370nM；实心棒)治疗8小时的细胞；或者仅用DOX(370nM；空心棒)治疗8小时的细胞的结果。误差棒表示平均值的标准误差。
图24I是表示化合物11没有保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68))免受多柔比星诱导的细胞毒性(在细胞治疗后7天通过利用WST-1测定评价细胞活力来测定)的能力的棒图。通过监测在450nm的吸光度测定细胞数。示出关于仅用化合物11(条纹棒；在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)治疗16小时的细胞；用化合物11(在0.0μM、0.120μM、0.370μM、1.1μM或3.3μM下)治疗16小时然后用多柔比星(DOX；370nM；实心棒)治疗8小时的细胞；或者仅用DOX(370nM；空心棒)治疗8小时的细胞的结果。误差棒表示平均值的标准误差。
图25A是表示6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)以细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性的方式抑制化疗诱导的细胞毒性的棒图。提供关于未治疗的缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664；细胞)；与15nM、30nM、89nM或270nM的PD0332991一起孵育16小时的WM2664细胞；用卡铂(Carbo；50μM)、多柔比星(DOX；122nM)或依托泊苷(Etop；2.5μM)治疗8小时的WM2664细胞；以及用15nM、30nM、89nM或270nM的PD0332991治疗16小时后用DOX(122nM)、Carbo(50μM)或Etop(2.5μM)治疗8小时的WM2664细胞的结果。孵育后，取出等分量的培养基，然后通过量化腺苷酸激酶的量来评价细胞毒性。以相对光单位(RLU)表示数据。
图25B是表示6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)以细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性的方式抑制化疗诱导的细胞毒性的棒图。提供关于HS68细胞(细胞)；与15nM、30nM、89nM或270nM的PD0332991一起孵育16小时的HS68细胞；用卡铂(Carbo；50μM)、多柔比星(DOX；122nM)或依托泊苷(Etop；2.5μM)治疗8小时的HS68细胞；以及用15nM、30nM、89nM或270nM的PD0332991治疗16小时后用DOX(122nM)、Carbo(50μM)或Etop(2.5μM)治疗8小时的HS68细胞的结果。孵育后，取出等分量的培养基，然后通过量化腺苷酸激酶的量来评价细胞毒性。以相对光单位(RLU)表示数据。
图25C是表示6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD 0332991)以细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性的方式抑制化疗诱导的细胞毒性的棒图。提供关于未治疗的视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB无效的)人类黑素瘤细胞(A2058；细胞)；与15nM、30nM、89nM或270nM的PD0332991一起孵育16小时的A2058细胞；用卡铂(Carbo；50μM)、多柔比星(DOX；122nM)或依托泊苷(Etop；2.5μM)治疗8小时的A2058细胞；以及用15nM、30nM、89nM或270nM的PD0332991治疗16小时后用DOX(122nM)、Carbo(50μM)或Etop(2.5μM)治疗8小时的A2058细胞的结果。孵育后，取出等分量的培养基，然后通过量化腺苷酸激酶的量来评价细胞毒性。以相对光单位(RLU)表示数据。
图25D是表示星形孢菌素以非细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性的方式提高化疗诱导的细胞毒性的棒图。提供关于未治疗的缺少INK4a/ARF的人类黑素瘤细胞(WM2664；细胞)；与160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素一起孵育16小时的WM2664细胞；用卡铂(Carbo；50μM)、多柔比星(DOX；122nM)或依托泊苷(Etop；2.5μM)治疗8小时的WM2664细胞；以及用160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素治疗16小时后用DOX(122nM)、Carbo(50μM)或Etop(2.5μM)治疗8小时的WM2664细胞的数据。孵育后，取出等分量的培养基，然后通过量化腺苷酸激酶的量来评价细胞毒性。以相对光单位(RLU)表示数据。
图25E是表示星形孢菌素以非细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性的方式提高化疗诱导的细胞毒性的棒图。提供关于HS68细胞；与160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素一起孵育16小时的HS68细胞；用卡铂(Carbo；50μM)、多柔比星(DOX；122nM)或依托泊苷(Etop；2.5μM)治疗8小时的HS68细胞；以及用160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素治疗16小时后用DOX(122nM)、Carbo(50μM)或Etop(2.5μM)治疗8小时的HS68细胞的数据。孵育后，取出等分量的培养基，然后通过量化腺苷酸激酶的量来评价细胞毒性。以相对光单位(RLU)表示数据。
图25F是表示星形孢菌素以非细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性的方式提高化疗诱导的细胞毒性的棒图。提供关于未治疗的视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB无效的)人类黑素瘤细胞(A2058；细胞)；与160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素一起孵育16小时的A2058细胞；用卡铂(Carbo；50μM)、多柔比星(DOX；122nM)或依托泊苷(Etop；2.5μM)治疗8小时的A2058细胞；以及用160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素治疗16小时后用DOX(122nM)、Carbo(50μM)或Etop(2.5μM)治疗8小时的A2058细胞的数据。孵育后，取出等分量的培养基，然后通过量化腺苷酸激酶的量来评价细胞毒性。以相对光单位(RLU)表示数据。
图26A是表示用160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素治疗24小时后处于G1期(浅阴影棒)、G2/M期(深阴影棒)和S期(无阴影棒)的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞的百分比(％)的棒图。星形孢菌素似乎诱导HS68细胞中的G1细胞周期停滞。
图26B是表示星形孢菌素在细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞中没有化学保护效应的棒图。提供关于未治疗的HS68细胞；被160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素治疗(16小时)的HS68细胞；用多柔比星(DOX；122nM；8小时)治疗的HS68细胞；以及被160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素预治疗16小时后用DOX(122nM)治疗8小时的HS68细胞；用卡铂(Carbo；50μM；8小时)治疗的HS68细胞；以及被160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素预治疗16小时后用Carbo(50μM)治疗8小时的HS68细胞；用依托泊苷(Etop；2.5μM；8小时)治疗的HS68细胞；以及被160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素预治疗16小时后用Etop(2.5μM)治疗8小时的HS68细胞的数据。替换治疗介质，7天后利用CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800241
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，United States of America)测定细胞活力，并以相对光单位(RLU)表示数据。星形孢菌素似乎不保护HS68细胞免受化疗诱导的细胞毒性。
图27A是表示星形孢菌素没有保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(人类INKa/ARF黑素瘤细胞(WM2664))免受多柔比星、卡铂或依托泊苷诱导的DNA损伤(通过评价γ-H2AX水平测定)的能力的棒图。示出关于未治疗的WM2664细胞；用160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素治疗16小时的WM2664细胞；仅用卡铂(Carbo，50μM)、依托泊苷(Etop，2.5μM)或多柔比星(Dox，122nM)治疗8小时的A2058细胞；以及用160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素预治疗16小时后用Carbo(50μM)、Etop(2.5μM)或Dox(122nM)治疗8小时的WM2664细胞的γ-H2AX阳性细胞的百分比(％)。星形孢菌素似乎不保护WM2664细胞免受化疗诱导的DNA损伤。
图27B是表示星形孢菌素没有保护细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(人类调聚的成纤维细胞(HS68))免受多柔比星、卡铂或依托泊苷诱导的DNA损伤(通过评价γ-H2AX水平测定)的能力的棒图。示出关于未治疗的HS68细胞；160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素治疗16小时的HS68细胞；仅用卡铂(Carbo，50μM)、依托泊苷(Etop，2.5μM)或多柔比星(Dox，122nM)治疗8小时的HS68细胞；以及用160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素预治疗16小时后用Carbo(50μM)、Etop(2.5μM)或Dox(122nM)治疗8小时的HS68细胞的γ-H2AX阳性细胞的百分比(％)。星形孢菌素似乎不保护HS68细胞免受化疗诱导的DNA损伤。
图27C是表示星形孢菌素没有保护非细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)依赖性细胞(人类RB无效的黑素瘤细胞(A2058))免受多柔比星、卡铂或依托泊苷诱导的DNA损伤(通过评价γ-H2AX水平测定)的能力的棒图。示出关于未治疗的A2058细胞；用160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素治疗16小时的A2058细胞；仅用卡铂(Carbo，50μM)、依托泊苷(Etop，2.5μM)或多柔比星(Dox，122nM)治疗8小时的A2058细胞；以及用160pM、500pM、1.5nM或4.5nM的星形孢菌素预治疗16小时后用Carbo(50μM)、Etop(2.5μM)或Dox(122nM)治疗8小时的A2058细胞的γ-H2AX阳性细胞的百分比(％)。星形孢菌素似乎不保护A2058细胞免受化疗诱导的DNA损伤。
发明详述
参考随附的实施例(其中给出代表性的实施方案)，在下文中更充分地描述本发明公开的主题。但是，本发明公开的主题可以以不同的形式体现，而不应解释为受限于本文列举的实施方案。更确切地，提供这些实施方案以使本公开充分且完整，并且这些实施方案会向本领域技术人员充分传达本发明的实施方案的范围。
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的技术人员的通常理解相同的含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其它文献以其整体通过援引纳入本文。
在整个说明书和权利要求书中，特定的化学式或化学名应包括所有活性的旋光异构体和立体异构体，以及外消旋混合物(若存在此类异构体和混合物)。
I.定义
虽然我们认为本领域技术人员完全理解以下术语，但是为了便于说明本发明公开的主题解释以下定义。
遵循长期的专利法常规，英文词“a”、“an”和“the”在本申请包括权利要求书中使用时是指“一个(种)或多个(种)”。因此，例如，提及“化合物”或“细胞”包括多个这样的化合物或细胞等。
术语“和/或”，当用于描述两种项目或情况，例如CDK4和/或CDK6时，是指两种项目或情况均存在或均适用的情况，以及仅所述项目或情况之一存在或适用的情况。因此，CDK4和/或CDK6抑制剂可以是抑制CDK4和CDK6的化合物、仅抑制CDK4的化合物或者仅抑制CDK6的化合物。
“健康细胞”或“正常细胞”是指对象中的不表现出疾病(例如癌症或其它增殖性疾病)的症状或标志的任何细胞。在一些实施方案中，所述健康细胞是干细胞。在一些实施方案中，所述健康细胞是造血干细胞或造血祖细胞。祖细胞包括但不限于长期造血干细胞(LT-HSC)、短期造血干细胞(ST-HSC)、多能祖细胞(MPP)、髓共同祖细胞(CMP)、淋巴共同祖细胞(CLP)、粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)以及巨核细胞-红细胞系祖细胞(MEP)。
在本文中使用时，术语“癌症”是指由不受控制的细胞***和细胞转移或者在其他部位形成新生物(new growth)的能力导致的疾病。术语“恶性瘤”、“瘤”、“肿瘤”及其变体是指癌细胞或癌细胞组。
癌症的具体类型包括但不限于皮肤癌、***癌、脂肪癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、***、子宫癌、肛殖癌(anogenital cancer)、肾癌、膀胱癌、结肠癌、***癌、头颈癌、脑癌、中枢神经***(CNS)癌、视网膜癌、血癌和淋巴癌。
在本文使用时，术语“化疗”是指用细胞毒性化合物(例如DNA损伤性化合物)来减低或消除不期望的细胞(例如但不限于癌细胞)的生长或增殖的治疗。因此，在本文使用时，“化疗化合物”是指用于治疗癌症的细胞毒性化合物。化合物的细胞毒性效应可以是以下的一种或多种效应的结果：核酸嵌入或结合、DNA或RNA烷基化、抑制RNA或DNA合成、抑制另一种核酸相关的活性(例如蛋白质合成)或任何其它细胞毒性效应。
因此，“细胞毒性化合物”可以是也称为“抗肿瘤”剂或“化疗剂”的化合物中的任一种或任何组合。此类化合物包括但不限于DNA损伤性化合物和可杀死细胞的其它化学物质。“DNA损伤性化合物”包括但不限于烷化剂、DNA嵌入剂、蛋白质合成抑制剂、DNA或RNA合成抑制剂、DNA碱基类似物、拓扑异构酶抑制剂和端粒酶抑制剂或结合端粒DNA的化合物。例如，烷化剂包括烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如benzodizepa、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺类，例如六甲蜜胺、三亚乙基密胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲嘧胺；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新恩比兴、胆固醇苯乙酸氮芥、泼尼莫司汀、曲磷胺和乌拉莫司汀；以及亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀。
用于治疗癌症的抗生素包括：放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、硫酸博来霉素、丝裂霉素C、普卡霉素和链佐星。化疗抗代谢药包括：巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷、阿糖胞苷、喷司他丁、甲氨蝶呤和硫唑嘌呤、阿昔洛韦、腺嘌呤β-1-D-***糖苷、甲氨喋呤、氨甲蝶呤、2-氨基嘌呤、阿非科林、8-氮鸟嘌呤、偶氮丝氨酸、6-氮尿嘧啶、2′-叠氮-2′-脱氧核苷、5-溴脱氧胞苷、胞嘧啶β-1-D-***糖苷、重氮氧正亮氨酸(diazooxynorleucine)、双脱氧核苷类、5-氟脱氧胞苷、5-氟脱氧尿苷和羟基脲。
化疗蛋白质合成抑制剂包括：相思豆毒蛋白、金精三羧酸、氯霉素、大肠杆菌素E3、环己酰亚胺、白喉毒素、伊短菌素A、依米丁、红霉素、乙硫氨酸、氟化物、5-氟色氨酸、夫西地酸、鸟苷酰亚甲基二磷酸(guanylylmethylene diphosphonate)和鸟苷酰亚胺二磷酸(guanylyl imidodiphosphate)、卡那霉素、春雷霉素、黄色霉素和O-甲基苏氨酸。其它蛋白质合成抑制剂包括：蒴莲根毒蛋白、新霉素、正缬氨酸、密旋霉素、巴龙霉素、嘌罗霉素、蓖麻毒蛋白、志贺毒素、焦土霉素、司帕霉素、大观霉素、链霉素、四环素、硫链丝菌肽和甲氧苄啶。DNA合成抑制剂包括：烷基化剂，例如硫酸二甲酯、丝裂霉素C、氮芥和硫芥；嵌入剂，例如吖啶染料、放线菌素类、阿霉素、蒽类、苯并芘、溴乙啶、二碘化丙啶-缠绕剂(propidiumdiiodide-intertwining)；及其它药剂，例如偏端霉素和纺锤菌素。拓扑异构酶抑制剂(例如香豆霉素、萘啶酸、新生霉素和奥索利酸)；细胞***抑制剂(包括秋水仙酰胺、秋水仙碱、长春碱和长春新碱)；以及RNA合成抑制剂(包括放线菌素D、α-鹅膏蕈碱及其它真菌鹅膏蕈毒素、蛹虫草菌素(3′-脱氧腺苷)、二氯呋喃核糖基苯并咪唑、利福平、曲张链菌素和利迪链菌素)还可以用作DNA损伤性化合物。
因此，其毒性效应可被本发明公开的选择性CDK4/6抑制剂缓解的现有化疗化合物包括：阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、依托泊苷、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素、顺铂、过氧化氢、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素、他莫昔芬、紫杉醇、反铂、长春碱和甲氨蝶呤等。
“有风险遭受暴露于细胞毒性化合物”是指预定(例如按照预定的化学治疗时间)在将来暴露于细胞毒性(例如DNA损伤性)药剂的对象，或者有机会在将来无意地暴露于细胞毒性化合物的对象。无意的暴露包括意外的或无计划的环境或职业暴露，或者作为医学治疗的部分而导致的过量服用细胞毒性化合物。
“抑制剂化合物的有效量”是指有效减小或消除所述对象的健康的HSPC中的与化疗或对细胞毒性化合物的其它暴露相关的毒性的量。在一些实施方案中，所述有效量是暂时(例如，数小时或数天)抑制对象中的造血干细胞增殖(即诱导造血干细胞中的静态)所需的量。
“长期血液毒性”是指在给药所述细胞毒性化合物之后影响对象持续一周或多周、一月或多月或者一年或多年的时间的血液毒性。长期血液毒性可以导致骨髓病症，其可致使无效地产生血细胞(即脊髓发育不良)和/或淋巴细胞。血液毒性可以表现为例如贫血、血小板计数降低(即血小板减少)或白细胞计数降低(即中性白细胞减少症)。在一些情况中，脊髓发育不良可以导致白血病的发病。与化疗相关的长期毒性还可能损伤对象中的除血细胞之外的其它自我更新的细胞。因此，长期毒性还可能导致白发(graying)和虚弱。
“没有”是指按照本发明公开的方法用选择性CDK4/6抑制剂治疗的对象不显示出任何可检测到的长期血液毒性的症状或体征，或者，与用所述细胞毒性化合物治疗而未接受一次或多次给药CDK4/6抑制剂的对象会显示出的体征/症状相比，显示出显著减轻的长期血液毒性的体征或症状(例如，减轻10倍，或者减轻100倍或更多倍)。
“没有”还可指选择性CDK4/6抑制剂化合物不具有不期望的或脱靶效应，特别是当其被体内使用或者通过基于细胞的测定进行评价时。因此，“没有”可指选择性CDK4/6抑制剂不具有脱靶效应，例如但不限于长期毒性、抗氧化效应、***效应、酪氨酸激酶抑制效应、对除CDK4/6之外的CDK的抑制效应；以及非CDK4/6依赖性细胞中的细胞周期停滞。
“基本上没有”脱靶效应的CDK4/6抑制剂是CDK4/6抑制剂，其可能具有一些不严重的脱靶效应，所述脱靶效应不干扰所述抑制剂提供对抗CDK4/6依赖性细胞中的细胞毒性化合物的保护作用的能力。例如，“基本上没有”脱靶效应的CDK4/6抑制剂可能对其它CDK具有小的抑制效应(例如，对CDK1或CDK2的IC50＞0.5μM；＞1.0μM或者＞5.0μM)，只要所述抑制剂提供CDK4/6依赖性细胞中的选择性G1停滞。
“减轻”和“预防”或其语法变体分别是指，减小医学治疗的不期望的副作用，或者预防所述不期望的副作用完全发生。
在一些实施方案中，本发明公开的主题中被治疗的对象适当地是人类对象，但是应理解本文所述的方法对所有脊椎动物物种有效，术语“对象”旨在包括所有脊椎动物物种。
更具体地，本文提供哺乳动物的治疗，例如，人类，以及因濒危而具有重要性的那些哺乳动物(例如西伯利亚虎)、对人类具有经济重要性(为了供人类食用而在农场饲养的动物)和/或社会重要性(作为宠物饲养或在动物园中饲养的动物)的那些哺乳动物，例如，除了人类之外的食肉动物(例如猫和狗)、猪类(猪、肉猪和野猪)、反刍动物(例如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)和马。因此，本文所述的方法的实施方案包括家畜包括但不限于家养猪(猪和肉猪)、反刍动物、马、家禽等的治疗。
在本文中使用时，术语“烷基”是指C1-20(含端值)、线性的(即直链的)、支链的、或环状的、饱和的、或者至少部分不饱和的以及在一些情况中完全不饱和的(即烯基和炔基)烃链，包括例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、丁二烯基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基和丙二烯基基团。“支链的”是指其中低级烷基基团例如甲基、乙基或丙基与直链烷基链相连的烷基基团。“低级烷基”是指含有1-约8个碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的烷基基团(即C1-8烷基)。“高级烷基”是指含有约10-约20个碳原子，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的烷基基团。在某些实施方案中，“烷基”特指C1-8直链烷基。在其它实施方案中，“烷基”特指C1-8支链烷基。
烷基基团可以任选地被一个或多个烷基基团的取代基取代(“取代的烷基”)，所述取代基可以相同或不同。术语“烷基基团的取代基”包括但不限于烷基、取代的烷基、卤素、芳基氨基、酰基、羟基、芳氧基、烷氧基、烷硫基、芳硫基、芳烷基氧基、芳烷基硫基、羧基、烷氧基羰基、氧代和环烷基。可以沿着所述烷基链任选地***一个或多个氧原子、硫原子或者取代的或未取代的氮原子，其中氮的取代基是氢、低级烷基(本文也称为“烷基氨基烷基”)或芳基。
因此，在本文使用时，术语“取代的烷基”包括本文定义的烷基基团，其中所述烷基基团的一个或多个原子或官能团被另外的原子或官能团(包括例如烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸酯和巯基)替代。
本文使用的术语“芳基”是指芳香族部分，其可以是单个芳香环，或者稠合的、共价连接的或连接至共有基团(例如但不限于亚甲基或亚乙基部分)的多个芳香环。所述共有的连接基团还可以是羰基(如在二苯甲酮中)、氧(如在二苯醚中)或氮(如在二苯胺中)。术语“芳基”具体地包括杂环芳香化合物。所述芳香环可以包括苯基、萘基、联苯基、二苯基醚、二苯胺和二苯甲酮等。在特定的实施方案中，术语“芳基”是指含有约5-约10个碳原子(例如5、6、7、8、9或10个碳原子)并且包含5元-和6-元烃和杂环芳香环的环状芳香基团。
所述芳基基团可以任选地被一个或多个芳基基团的取代基取代(“取代的芳基”)，所述取代基可以相同或不同，其中“芳基基团的取代基”包括烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷基氧基、羧基、羰基、酰基、卤代、硝基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、芳烷氧基羰基、酰氧基、酰基氨基、芳酰基氨基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、芳硫基、烷硫基、亚烷基和-NR′R″(其中R′和R″可以各自独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和芳烷基)。
因此，在本文使用时，术语“取代的芳基”包括本文定义的芳基基团，其中所述芳基基团的一个或多个原子或官能团被另外的原子或官能团(包括例如烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸酯和巯基)替代。
芳基基团的具体实例包括但不限于环戊二烯基、苯基、呋喃、噻吩、吡咯、吡喃、吡啶、咪唑、苯并咪唑、异噻唑、异噁唑、吡唑、吡嗪、三嗪、嘧啶、喹啉、异喹啉、吲哚、咔唑等。
术语“杂芳基”是指其中一个或多个芳香环骨架中的至少一个原子是除碳以外的原子的芳基基团。因此，杂芳基基团含有一个或多个选自包括但不限于氮、氧和硫的非碳的原子。
在本文使用时，术语“酰基”是指其中羧基基团的-OH已被另一个取代基替代的有机羧酸基团(即由RCO-表示，其中R是本文定义的烷基或芳基基团)。因此，术语“酰基”具体地包括芳基酰基基团例如乙酰基呋喃和苯酰基基团。酰基基团的具体实例包括乙酰基和苯甲酰基。
“环状的”和“环烷基”是指含有约3-约10个碳原子(例如3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)的非芳香性的单环或多环***。所述环烷基基团任选地可以是部分不饱和的。所述环烷基基团还可以任选地被本文定义的烷基基团取代基、氧代和/或亚烷基取代。沿着所述环烷基链可以任选地***一个或多个氧原子、硫原子或者取代的或未取代的氮原子，其中氮的取代基是氢、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基，由此得到杂环基团。代表性的单环环烷基环包括环戊基、环己基和环庚基。多环的环烷基环包括金刚烷基、八氢萘基、萘烷、樟脑、莰烷和降金刚烷基(noradamantyl)。
术语“杂环”或“杂环的”是指其中环状环的骨架碳原子中的一个或多个被杂原子(例如氮、硫或氧)替代的环烷基基团(即上文所述的非芳香性的环状基团)。杂环的实例包括但不限于四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉、二氧杂环己烷、哌啶、哌嗪和吡咯烷。
“烷氧基(alkoxyl)”或“烷氧基(alkoxy)”是指烷基-O-基团，其中烷基如上所述。在本文中使用时，术语“烷氧基”可以指例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基和戊氧基。术语“氧基烷基”可以与“烷氧基”互换使用。
“芳氧基(aryloxyl)”或“芳氧基(aryloxy)”是指芳基-O-基团，其中芳基基团如上所述，包括取代的芳基。在本文中使用时，术语”芳氧基”可指苯氧基或己氧基，以及被烷基、取代的烷基、卤代或烷氧基取代的苯氧基或己氧基。
“芳烷基”是指芳基-烷基-基团，其中芳基和烷基如上所述并且包括取代的芳基和取代的烷基。示例性的芳烷基基团包括苄基、苯乙基和萘甲基。
“芳烷基氧基(aralkyloxyl)”或“芳烷基氧基(aralkyloxy)”是指芳烷基-O-基团，其中所述芳烷基基团如上所述。示例性的芳烷基氧基基团是苄氧基。
术语“氨基”是指-NR’R”基团，其中R’和R”各自独立地选自H以及取代的和未取代的烷基、环烷基、杂环、芳烷基、芳基和杂芳基。在一些实施方案中，所述氨基基团是-NH2。“氨基烷基”和“氨基芳基”是指-NR’R”基团，其中分别地，R’如上文关于氨基所定义的，R”是取代的或未取代的烷基或芳基。
“酰氨基″是指酰基-NH-基团，其中酰基如上所述。
术语“羰基”是指-(C＝O)-，或者与上文命名的母体基团的碳原子连接的成双键的氧取代基。
术语“羧基”是指-COOH基团。
在本文中使用时，术语“卤代”、“卤化物”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘基团。
术语“羟基(hydroxyl)”和“羟基(hydroxy)”是指-OH基团。
术语“氧代”是指其中碳原子被氧原子替代的上文已述的化合物。
术语“氰基”是指-CN基团。
术语“硝基”是指-NO2基团。
术语“硫代”是指其中碳或氧原子被硫原子替代的上文已述的化合物。
II.造血干细胞和造血祖细胞及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂
组织特异性干细胞能够自我更新，意指它们能够在整个成年哺乳动物寿命中通过被调节的复制进行自我更新。此外，干细胞不对称地***产生“子代”细胞或“祖”细胞，其继而产生特定器官的各种组分。例如，在造血***中，造血干细胞产生祖细胞，其继而产生血液的所有分化的组分(例如，白细胞、红细胞、淋巴细胞和血小板)。参见图1。
本发明公开的主题涉及在成年哺乳动物中早期的造血干细胞/祖细胞(HSPC)的具体生化需要。具体地，已发现，为了细胞复制，这些细胞需要增殖性激酶细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)的酶活性。不同的是，成年哺乳动物中的绝大多数增殖细胞不需要CDK4和/或CDK6(即CDK4/6)的活性。这些分化的细胞可以通过利用其它增殖性激酶例如细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)或细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)在不存在CDK4/6活性的情况下增殖。因此我们认为用选择性CDK4/6抑制剂治疗哺乳动物可以导致抑制非常有限的干细胞区室(compartment)和祖细胞区室中的增殖(即药理性静止(PQ))。
化疗的许多最急性和严重的毒性是通过对干细胞和祖细胞的效应。因此，使HSPC具有化疗抗性可以保护整个生物体免受化疗的急性和慢性毒性。本发明公开的主题涉及通过给药选择性CDK4/6抑制剂保护对象中的HSPC免受细胞毒性(例如DNA损伤性)化合物的毒性的方法。不拘于任何一种理论，预期此类抑制剂的给药迫使所述对象中的干细胞和祖细胞进入PQ，以致所述HSPC比增殖细胞对化疗化合物的细胞毒性效应更具抗性。
因此，在一些实施方案中，本发明公开的主题提供通过用无毒性的选择性CDK4/6抑制剂(例如口服给药可利用的无毒性CDK4/6抑制剂)短期(例如小于48、24、20、16、12、10、8、6、4、2或1小时的时间)治疗迫使造血干细胞和造血祖细胞(HSPC)进入静止态来保护哺乳动物免受化疗化合物的急性和慢性的毒性效应的方法。在静止期中，所述对象的HSPC对所述化疗化合物的某些效应更具抗性。在使用所述抑制剂的治疗停止之后，所述HSPC从此暂时静止期中恢复，然后正常发挥功能。因此，用选择性CDK4/6抑制剂化学保护可以提供显著的骨髓保护，并且可以使化疗后的外周血细胞计数(血细胞比容、血小板、淋巴细胞和髓样细胞)更快速地恢复。
授予Davis等人的美国专利6,369,086(下称“‘086专利”)似乎描述：选择性CDK抑制剂可以用于限制细胞毒性剂的毒性并且可以用来预防化疗诱导的脱发。具体地，‘086专利描述作为特异性CDK2抑制剂的羟吲哚化合物。相关的期刊文献(参见Davis等人，Science，291，134-137(2001))似乎描述：CDK2的抑制产生细胞周期停滞，降低上皮细胞对细胞周期活性的抗肿瘤药的敏感性，并且可以预防化疗诱导的脱发。但是，该期刊文献由于不可再现结果而后被撤回。不同于这些标榜的选择性CDK2抑制剂的保护效应(通过撤回所述期刊文章而对其质疑)，本发明公开的主题涉及保护HSPC和预防血液毒性。
保护干细胞/祖细胞的能力在癌症治疗中和在缓解意外接触或过量服用细胞毒性化学物质的效应中均是期望的。所述选择性CDK4/6抑制剂的保护效应可以通过用所述抑制剂预治疗(即预先用CDK4/6抑制剂治疗预定接受细胞毒性化合物治疗或有风险接触细胞毒性化合物的对象)，用所述CDK4/6抑制剂与细胞毒性化合物同时治疗，或者用所述CDK4/6抑制剂后治疗(即接触所述细胞毒性化合物后用所述CDK4/6抑制剂治疗)，向所述对象提供。因此，在一些实施方案中，本发明公开的方法涉及选择性CDK4/6抑制剂化合物向正接受或将接受化疗化合物治疗的对象提供化学保护的用途，以及保护对象免受对细胞毒性化合物的其它暴露的用途。
在本文中使用时，术语“选择性CDK4/6抑制剂化合物”是指这样的化合物，其选择性地抑制CDK4和CDK6中的至少一种，或者其主要的作用模式是通过抑制CDK4和/或CDK6。因此，选择性CDK4/6抑制剂是这样的化合物，其对CDK4和/或CDK6的50％抑制浓度(IC50)比对其它激酶更低。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂对其它CDK(例如CDK1和CDK2)的IC50可以是所述化合物对CDK4或CDK6的IC50的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂对其它CDK的IC50可以是所述化合物对CDK4或CDK6的IC50的至少20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂其它CDK的IC50可以是所述化合物对CDK4或CDK6的IC50的100倍以上或1000倍以上。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物是选择性抑制CDK4和CDK6的化合物。
在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物是选择性诱导CDK4/6依赖性细胞中的G1细胞周期停滞的化合物。因此，当按照本发明公开的方法用所述选择性CDK4/6抑制剂化合物治疗时，处于G1期的CDK4/6依赖性细胞的百分比增高，而处于G2/M期和S期的CDK4/6依赖性细胞的百分比降低。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂是这样的化合物，其诱导所述CDK4/6依赖性细胞中的基本上纯粹的(pure)(即“完全的(clean)”)G1细胞周期停滞(例如，其中采用所述选择性CDK4/6抑制剂治疗诱导细胞周期停滞，以致按照标准方法(例如碘化丙锭染色等)测定，大多数的细胞停滞于G1，处于G2/M和S期的细胞的总数合计为总细胞数的20％、15％、12％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少)。
虽然已报告非特异性的激酶抑制剂星形孢菌素在一些细胞类型中间接地诱导G1停滞(参见Chen等人，J.Nat.Cancer Inst.，92，1999-2008(2000))，但是本发明公开的选择性CDK4/6抑制剂直接且选择性地诱导细胞(例如特定部分的HSPC)中的G1细胞周期停滞的用途可以提供化学防护，具有减低的长期毒性，并且不需要在暴露于DNA损伤性化合物之前用所述抑制剂长时(例如48小时或更长)治疗。具体地，虽然一些非选择性激酶抑制剂可以通过降低CDK4蛋白水平引起一些细胞类型中的G1停滞，但是，不拘于任何一种理论，我们认为本发明公开的方法的益处至少部分地归因于选择性CDK4/6抑制剂能够直接地抑制HSPC中的CDK4/6的激酶活性而不降低它们的细胞浓度。
在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物是基本上没有脱靶效应(特别是与抑制除CDK4和/或CDK6之外的激酶相关)的化合物。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物对除CDK4/6之外的CDK(如CDK1和CDK2)的抑制性差(例如，＞1μM IC50)。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物不诱导非CDK4/6依赖性细胞中的细胞周期停滞。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物对酪氨酸激酶的抑制性差(例如，＞1μMIC50)。其它的不期望的脱靶效应包括但不限于长期毒性、抗氧化效应和***效应。
抗氧化效应可以通过本领域已知的标准测定进行测定。例如，无显著抗氧化效应的化合物是不显著地清除自由基例如氧自由基的化合物。可以将化合物的抗氧化效应与抗氧化活性已知的化合物例如染料木黄酮比较。因此，无显著的抗氧化活性的化合物可以是抗氧化活性为染料木黄酮的抗氧化活性的约1/2、1/3、1/5、1/10、1/30或1/100的化合物。***活性也可以通过已知的测定进行测定。例如，非***化合物是不显著地结合和激活***受体的化合物。基本上没有***效应的化合物可以是***活性为具有***活性的化合物(例如，染料木黄酮)的约1/2、1/3、1/5、1/10、1/20或1/100的化合物。
可按照本发明公开的方法使用的选择性CDK4/6抑制剂包括任何已知的小分子(例如，＜1000Da，＜750Da，或者＜500Da)选择性CDK4/6抑制剂，或其药学可接受的盐。在一些实施方案中，所述抑制剂是非天然的化合物(即自然界中未发现的化合物)。已报告几类化合物具有CDK4/6抑制能力(例如，在非细胞测定中)。用于本发明公开的方法的选择性CDK4/6抑制剂可以包括但不限于，吡啶并[2，3-d]嘧啶(例如，吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮和2-氨基-6-氰基吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-酮)、三氨基嘧啶、芳基[a]吡咯并[3，4-d]咔唑、含氮的杂芳基取代的脲、5-嘧啶基-2-氨基噻唑、苯并噻二嗪、吖啶硫酮和异喹啉酮。
在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶是吡啶并[2，3-d]嘧啶酮。在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶酮是吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮。在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮被氨基芳基或氨基杂芳基基团取代。在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮被氨基吡啶基团取代。在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮是2-(2-吡啶基)氨基吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮。例如，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮化合物可以具有Barvian等人的美国专利公布2007/0179118中所述的式(II)的结构，该专利公布以其整体通过援引纳入本文。在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶化合物是6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(即PD 0332991)或其药学可接受的盐。参见Toogood 等人，J.Med.Chem.，2005，48，2388-2406。
在一些实施方案中，所述吡啶并[2，3-d]嘧啶酮是2-氨基-6-氰基吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-酮。例如，Tu等人描述了包括2-氨基-6-氰基吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-酮在内的选择性CDK4/6抑制剂。参见Tu等人，Bioorg.Med.Chem，Lett.，2006，16，3578-3581。
在本文使用时，“三氨基嘧啶”是其中嘧啶环中的至少三个碳原子被具有式-NR1R2的基团取代的嘧啶化合物，其中R1和R2独立地选自H、烷基、芳烷基、环烷基、杂环、芳基和杂芳基。各R1和R2的烷基、芳烷基、环烷基、杂环、芳基和杂芳基基团可以进一步被一个或多个羟基、卤素、氨基、烷基、芳烷基、环烷基、杂环、芳基或杂芳基基团取代。在一些实施方案中，所述氨基基团中的至少一个是具有-NHR结构的烷基氨基基团，其中R是C1-C6烷基。在一些实施方案中，至少一个氨基基团是环烷基氨基基团或羟基取代的环烷基氨基基团，具有式-NHR，其中R是被或不被羟基基团取代的C3-C7环烷基。在一些实施方案中，至少一个氨基基团是杂芳基取代的氨基烷基基团，其中所述杂芳基基团可以进一步被芳基基团取代基取代。
芳基[a]吡咯并[3，4-d]咔唑包括但不限于萘基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑、吲哚并[a]吡咯并[3，4-c]咔唑、喹啉基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑和异喹啉基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑。参见例如，Engler等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，2003，13，2261-2267；sanchez-Martinez等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，2003，13，3835-3839；Sanchez-Martinez等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，2003，13，3841-3846；Zhu等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，2003，13，1231-1235；和Zhu 等人，J.Med.Chem.，2003，46，2027-2030。适合的芳基[a]吡咯并[3，4-d]咔唑还公开于美国专利公布2003/0229026和2004/0048915中。
含氮的杂芳基取代的脲是包含脲部分的化合物，其中脲氮原子之一被含氮的杂芳基基团取代。含氮的杂芳基基团包括但不限于包含至少一个氮原子的5-10元芳基基团。因此，含氮的杂芳基基团包括例如吡啶、吡咯、吲哚、咔唑、咪唑、噻唑、异噁唑、吡唑、异噻唑、吡嗪、***、四唑、嘧啶、哒嗪、嘌呤、喹啉、异喹啉、喹喔啉、噌啉、喹唑啉、苯并咪唑、苯邻二甲酰亚胺等。在一些实施方案中，所述含氮的杂芳基基团可以被一个或多个烷基、环烷基、杂环基、芳烷基、芳基、杂芳基、羟基、卤代、羰基、羧基、硝基、氰基、烷氧基或氨基基团取代。在一些实施方案中，所述含氮的杂芳基取代的脲是吡唑-3-基脲。所述吡唑可以进一步被环烷基或杂环基取代。在一些实施方案中，所述吡唑-3-基脲是：
Figure BPA00001380823800381
参见Ikuta，等人，J.Biol.Chem.，2001，276，27548-27554。可按照本发明公开的主题使用的其它脲包括美国专利公布2007/0027147中所述的式(I)的二芳基脲化合物。也参见，Honma等人，J.Med.Chem.，2001，44，4615-4627；和Honma等人，J.Med.Chem.，2001，44，4628-4640。
Shimamura等人描述了适合的5-嘧啶基-2-氨基噻唑CDK4/6抑制剂。参见Shimamura等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，2006，16，3751-3754。在一些实施方案中，所述5-嘧啶基-2-氨基噻唑具有结构：
Figure BPA00001380823800382
有用的苯并噻二嗪和吖啶硫酮化合物包括例如Kubo等人公开的那些(参见Kubo等人，Clin.Cancer Res.1999，5，4279-4286)和美国专利公布2004/0006074中的公开的那些，这些文献以其整体通过援引纳入本文。在一些实施方案中，所述苯并噻二嗪被一个或多个卤代、卤代芳基或烷基基团取代。在一些实施方案中，所述苯并噻二嗪选自4-(4-氟苄基氨基)-1，2，3-苯并噻二嗪-1，1-二氧化物、3-氯-4-甲基-4H-苯并[e][1，2，4]噻二嗪-1，1-二氧化物和3-氯-4-乙基-4H-苯并[e][1，2，4]噻二嗪-1，1-二氧化物。在一些实施方案中，所述吖啶硫酮被一个或多个氨基或烷氧基基团取代。在一些实施方案中，所述吖啶硫酮选自3-氨基-10H-吖啶酮-9-硫酮(3ATA)、9(10H)-吖啶硫酮、1，4-二甲氧基-10H-吖啶-9-硫酮和2，2’-二苯基二胺-二[N，N’-[3-氨基-N-甲基氨基)-10H-吖啶-9-硫酮]]。
在一些实施方案中，本发明公开的方法的对象是在进行增殖性病症治疗时已暴露于、正在暴露于、或者预定暴露于化疗化合物的对象。此类病症包括癌性的和非癌性的增殖性疾病。例如，我们认为本发明公开的化合物在化疗治疗广泛的肿瘤类型(包括但不限以下：乳腺癌、***癌、卵巢癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、脑癌(即神经胶质瘤)和肾癌)的过程中有效地保护健康的HSPC。
理想地，正接受化疗化合物治疗的癌的生长应该不受所述选择性CDK4/6抑制剂影响，因为优选所述选择性CDK4/6抑制剂不损及所述化疗化合物自身阻止癌细胞生长的效力。大多数癌症的增殖似乎不依赖于CDK4/6的活性，因为它们可以非选择性地(promiscuously)利用增殖性激酶(例如可以利用CDK 1/2/4/6)，或者缺失视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB，其被CDK灭活)的功能。因此，孤立地抑制CDK4/6应该不影响大多数癌症中的疗响应答。本领域技术人员理解，根据肿瘤类型和分子遗传学可以推断某些肿瘤对CDK4/6抑制的可能的敏感性。预期不受CDK4/6抑制影响的癌症是特征可以在于包括但不限于以下方面中的一个或多个方面的那些癌症：CDK1或CDK2活性增高、视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB)丧失或缺乏、高水平的MYC表达、细胞周期蛋白E增多和细胞周期蛋白A增多。此类癌症可以包括但不限于小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤、HPV阳性恶性瘤如***和某些头颈癌、MYC扩增的肿瘤例如Burkitts淋巴瘤、和三阴性乳腺癌；某些种类的肉瘤、某些种类的非小细胞肺癌、某些种类的黑素瘤、某些种类的胰腺癌、某些种类的白血病、某些种类的淋巴瘤、某些种类的脑癌、某些种类的结肠癌、某些种类的***癌、某些种类的卵巢癌、某些种类的子宫癌、某些种类的甲状腺癌及其它内分泌组织癌、某些种类的唾液腺癌、某些种类的胸腺癌、某些种类的肾癌、某些种类的膀胱癌和某些种类的睾丸癌。
例如，在一些实施方案中，所述癌症选自小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤和三阴性乳腺癌(ER/PR/Her2阴性)或“基底样”乳腺癌。小细胞肺癌和视网膜母细胞瘤几乎总是灭活视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB)，因此不需要CDK4/6活性来增殖。因此，CDK4/6抑制剂治疗会影响骨髓及其它正常宿主细胞中的PQ，但不影响肿瘤中的PQ。三阴性(基底样)乳腺癌也几乎总是RB无效的。此外，某些病毒诱导的癌症(如***和头颈癌的亚类)表达灭活RB的病毒蛋白(E7)，使这些肿瘤在功能上是RB无效的。一些肺癌也被认为是由HPV引起的。本领域技术人员会理解，预期不受CDK4/6抑制剂影响的癌症(例如，RB无效的、表达病毒蛋白E7的或者过度表达MYC的那些癌症)可以通过包括但不限于DNA分析、免疫染色、蛋白质印迹分析和基因表达图谱的方法来确定。
在一定程度上，预期用选择性CDK4/6抑制剂的化学保护治疗的效力相当于使用外源性生长因子(例如GCSF和红细胞生成素)所观察到的效力。但是，选择性CDK4/6抑制剂化合物治疗应具有许多优点，因为它可改善血小板和淋巴细胞计数的抑制(已报告的疗法都不能有效地做到)。因此，本发明公开的方法可以用来缓解化疗诱导的血小板减少和淋巴细胞减少。
此外，选择性CDK4/6抑制剂治疗不会迫使干细胞更快速地增殖。这是令人期望的，因为强迫性增殖可能增大在意欲缓解DNA损伤效应而进行生长因子支持后在人类和小鼠中观察到的后期和长期骨髓毒性。参见Herodin等人，Blood，2003，101，2609-2616；Hershman等人，J.Natl.CancerInst.，2007，99，196-205；and Le Deley等人，J.Clin.Oncol.，2007，25，292-300。数个小组已报告，使用G-CSF可以在幸存的癌症患者中显著地增大后期(化疗后＞3年)骨髓毒性(例如脊髓发育不良)的发生率。数个小组也已报告，EPO和相关的刺激红细胞增多的化合物似乎增大癌症相关的死亡率(当采用化疗时)。参见Khuri，N.Engl.J.Med.，2007，356，2445-2448。虽然不确定这是否表示EPO能够刺激肿瘤生长或肿瘤血管形成，但是这些发现表明在肿瘤学领域使用EPO的主要不利因素。预期PQ不会刺激肿瘤生长并且在禁忌使用EPO的情况中可以安全地用于治疗以增加红细胞计数。
涉及选择性CDK4/6抑制剂的化学保护方法可以产生若干其它优点。预期所述选择性CDK4/6抑制剂产生的对健康细胞的化学毒性减轻不会影响化疗化合物降低癌细胞的生长和增殖的效力。此外，预期化学毒性降低允许增大剂量(例如在特定的时期或较短的时期内更高的剂量和/或更多给药)，这意味着更好的效力。因此，本发明公开的方法可以产生毒性更小并且更有效的化疗方案。
也不同于用外源生物生长因子保护性治疗，选择性CDK4/6抑制剂包括许多较不昂贵的、口服可利用的小分子，所述小分子可以被配制以通过许多不同途径给药。适当时，此类小分子可以被配制用于口服给药、局部给药、鼻内给药、吸入、静脉内给药或任何其它给药形式。此外，不同于生物药剂，稳定的小分子可更容易地大量储备和储藏。因此，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物更容易且廉价地便利贮存在意外地化学暴露于细胞毒性(例如DNA损伤性)化合物的对象可报到的急诊室，或者化学暴露特别可能发生的场所，包括化学品或药物生产场所和化学研究实验室。
选择性CDK4/6抑制剂还可在化学治疗非癌性增殖疾病中的异常组织的过程中用于保护健康的HSPC，所述非癌性增殖疾病包括但不限于以下：婴儿血管瘤病、继发性进行性多发性硬化、慢性进行性骨髓变性病、神经纤维瘤病、神经节瘤、瘢痕疙瘩形成、骨的佩吉特病、乳腺纤维囊性病、Peronies & Duputren纤维化、再狭窄和肝硬化。此外，如果发生意外的化学接触或用药过量(例如甲氨蝶呤用药过量)，选择性CDK4/6抑制剂可以用来缓和DNA损伤性(例如嵌入或烷基化)化合物的效应。因此，本发明公开的方法可以用来保护化工厂工人、化学研究者和急诊应答者免受职业性暴露，例如如果发生化学泄漏。
根据本发明公开的主题，可以符合处方的疗程的任何时间表和任何剂量向对象施用化疗，只要在给药化疗剂之前、之中或之后给药化学保护化合物。通常，在从暴露于化疗化合物之前24小时至暴露之后24小时的时间段中向所述对象给药所述化学保护化合物。但是，此时间段可以扩展至早于暴露于所述化疗剂前24小时的时间(例如，根据所述化合物达到适合的血浆浓度所需的时间和/或所述化合物的血浆半衰期)。此外，所述时间段可以扩展长于暴露于所述化疗化合物或其他DNA损伤性化合物后的24小时，只要较晚给药所述CDK4/6抑制剂至少产生一些保护作用。这样的暴露后治疗在意外暴露或用药过量的情况下可能特别有用。
在一些实施方案中，可以在给药所述化疗剂之前的时间段向所述对象给药所述选择性CDK4/6抑制剂，以致所述选择性CDK4/6抑制剂的血浆水平在给药所述化疗化合物之时达到峰值。若方便的话，所述选择性CDK4/6抑制剂可以与所述化疗剂同时给药以简化治疗方案。在一些实施方案中，所述化学保护化合物和化疗化合物可以单一制剂的形式提供。
若期望，可以向所述对象给药多个剂量的所述化学保护化合物。或者，可以向所述对象给药单剂量的所述选择性CDK4/6抑制剂。化疗和化学保护治疗的疗程可随对象而变，本领域技术人员可以容易地确定在特定临床情况下的化疗和相关的化学保护治疗的适当剂量和时间表。
III、活性化合物、盐和制剂
在本文使用时，术语“活性化合物”是指选择性CDK 4/6抑制剂化合物或其药学可接受的盐。所述活性化合物可以通过任何适合的方法向所述对象给药。当然，给药的活性化合物的量和时机取决于受治疗的对象、所述对象已暴露于、正暴露于或者预定要暴露于的DNA损伤性化合物的剂量、取决于给药形式、所述活性化合物的药代动力学性质，以及处方医师的判断。因此，由于对象的差异性，下述剂量仅作参考，并且医师可以逐步增加(titrate)所述化合物的剂量以实现医师认为适合于所述对象的治疗。在考虑期望的治疗程度时，医师可以权衡各种因素如所述对象的年龄和重量、先前存在的疾病的存在、以及其它疾病的存在。可以配制药物制剂用于任何期望的给药途径，包括但不限于口服给药、静脉内给药或气雾剂给药，这会下文中更详细地讨论。
任何特定活性化合物的治疗有效量(其用途在本文所述的实施方案的范围内)可以随化合物和对象稍微改变，并且取决于所述对象的状况和递送途径。作为一般性的提议，约0.1-约200mg/kg的剂量可以具有疗效，其中所有重量是基于所述活性化合物的重量计算的，包括使用盐的情况在内。在一些实施方案中，所述剂量可以是提供达到约1-5μM或更高的所述活性化合物的血清浓度所需的化合物的量。在较高水平时的毒性问题可能将静脉给药剂量限制至较低水平，例如达到约10mg/kg，其中所有重量是基于所述活性碱的重量计算的，包括使用盐的情况在内。约10mg/kg-约50mg/kg的剂量可以用于口服给药。典型地，约0.5mg/kg-5mg/kg的剂量可以用于肌肉内注射。在一些实施方案中，对于静脉内或口服给药，剂量可以是约1μmol/kg-约50μmol/kg，或者，任选地，约22μmol/kg-约33μmol/kg的所述化合物。
根据本发明公开的方法，本文所述的药学活性化合物可以以固体或液体形式口服给药，或者，可以以溶液剂、混悬剂或乳剂的形式肌肉内给药、静脉内给药或者经吸入给药。在一些实施方案中，所述化合物或盐还可以以脂质体混悬剂的形式经吸入给药、静脉内给药或肌肉内给药。若通过吸入给药，所述活性化合物或盐可以是粒度为约0.5-约5微米任选地为约1-约2微米的多个固体颗粒或液滴的形式。
所述药物制剂可以包含本文所述的活性化合物或其药学可接受的盐和任何药学可接受的载体。若期望溶液剂，对于水溶性化合物或盐，水是可选的媒介物(vehicle)。对于水溶性化合物或盐，适合的可以是有机媒介物，例如甘油、丙二醇、聚乙二醇或其混合物。在后一情况中，所述有机媒介物可以包含大量的水。然后，可以本领域技术人员已知的适合的方式，典型地通过0.22微米过滤器过滤，来灭菌处理在两种情况的任一种中的溶液剂。灭菌之后，可以将所述溶液剂分配入适当的容器中，例如去热原的玻璃小瓶。任选地，通过无菌的方法进行此分配过程。然后可以对小瓶进行灭菌密闭，并且，如果需要，可以冻干小瓶的内容物。
除了所述活性化合物或其盐之外，所述药物制剂还可包含其它添加剂，例如pH-调节添加剂。具体地，有用的pH-调节剂包括酸如盐酸、碱或缓冲剂，例如乳酸钠、乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或葡萄糖酸钠。此外，所述制剂可以包含抗菌防腐剂。有用的抗菌防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和苄醇。当所述制剂被置于设计用于多次给药用途的小瓶中时，一般使用抗菌防腐剂。可以利用本领域公知的技术冻干本文所述的药物制剂。
为了口服给药，药物组合物可以采用溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂等形式。包含各种赋形剂(例如柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸钙)的片剂与各种崩解剂(例如淀粉(例如马铃薯淀粉或木薯淀粉)和某些复杂的硅酸盐)及粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和***树胶)一起使用。此外，对于压片用途，润滑剂例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石通常很有用。相似类型的固体组分还用作软-和硬-填充明胶胶囊中的填充剂。此方面的材料还包括乳糖和高分子量的聚乙二醇。当期望含水的混悬剂和/或酏剂用于口服给药时，本发明公开的主题的化合物可以与各种甜味剂、调味剂、着色剂、乳化剂和/或助悬剂，以及稀释剂(如水、乙醇、丙二醇、甘油)及其各种组合混合。
在本文所述的主题的又一个实施方案中，提供在密封容器中的单位剂型形式的、可注射的、稳定的无菌制剂，其包含本文所述的活性化合物或其盐。所述化合物或盐以冻干物的形式提供，所述冻干物能够用适当的药学可接受的载体复原(reconstitute)形成适合注射入对象的液体制剂。当所述化合物或盐基本上不溶于水时，可以足量的生理学可接受的乳化剂以乳化含水载体中的所述化合物或盐。特别有用的乳化剂包括磷脂酰胆碱和卵磷脂。
本文提供的其它实施方案包括本文公开的活性化合物的脂质体制剂。配制脂质体混悬剂的技术是本领域公知的。当所述化合物是水溶性盐时，利用常规的脂质体技术，可以将所述化合物掺入脂质囊泡中。在此情况中，由于所述活性化合物的水溶性，所述活性化合物可以大量包含在所述脂质体的亲水性中心或核内。使用的脂质层可以具有任何常规组成，并且可以包含胆固醇，或者可以不含胆固醇。当感兴趣的活性化合物是水不溶性的时，再利用常规的脂质体制剂技术，所述盐可以大量包含在形成所述脂质体的结构的疏水性脂质双层内。在两种情况的任一种中，通过使用标准的超声和均质化技术，可以降低制得的脂质体的大小。可以冻干包含本文公开的活性化合物的脂质体制剂以制备冻干物，所述冻干物可以用药学可接受的载体例如水复原以再产生脂质体混悬剂。
还提供药物制剂，其适合作为气雾剂通过吸入给药。这些制剂包含期望的本文所述化合物或其盐的溶液剂或混悬剂，或者所述化合物或盐的多个固体颗粒。可以将期望的制剂置于小室中并雾化。雾化可以通过压缩空气或通过超声能量形成包含所述化合物或盐的多个液滴或固体颗粒来完成。所述液滴或固体颗粒的粒度应为约0.5-约10微米，任选地是约0.5-约5微米。所述固体颗粒可以通过以本领域已知的任何适当的方式，例如通过微粉化处理固体化合物或其盐来获得。任选地，所述固体颗粒或液滴的粒度可以是约1-约2微米。在此方面，商品雾化器可用于实现此目的。所述化合物可以美国专利5,628,984中所述的方式，通过可呼吸颗粒的气雾悬浮剂给药，该专利整个公开通过援引纳入本文。
当适合以气雾剂形式给药的药物制剂是液体形式时，所述制剂可以包含在含水载体中的水溶性活性化合物。可以存在表面活性剂，其使所述制剂的表面张力降低以致足以在接受雾化时形成期望粒度范围内的液滴。
如本文所示，本发明提供水溶性和水不溶性的活性化合物。在本文使用时，术语“水溶性的”意在限定以约50mg/mL或更大的量溶于水的任何组分。此外，在本文使用时，术语“水不溶性的”意在限定在水中的溶解度小于约20mg/mL的任何组分。在一些实施方案中，水溶性化合物或盐可以是令人期望的，而在其它实施方案中，水不溶性化合物或盐也可以是令人期望的。
在本文中使用时，术语“药学可接受的盐”是指在正确的医学判断范围内，适合于与对象(例如，人类对象)接触使用而不具有不适合的毒性、刺激、变应性反应等，与适当的益处/风险比相称，并且对其预期用途有效的本发明公开的主题的化合物的那些盐，以及两性离子形式(如果可能的话)。
因此，术语“盐“是指本发明公开的主题的化合物的相对无毒性的无机酸和有机酸加成盐。这些盐可以在最终分离和纯化所述化合物的过程中原位制备，或者通过分开地使游离碱形式的被纯化的化合物与适合的有机或无机酸反应并且分离由此形成的盐进行制备。就本发明公开的主题的化合物是碱性化合物而言，它们均能够与各种无机酸和有机酸形成很多种不同的盐。虽然这些盐必须是药学可接受的以向动物给药，但实际上，通常期望首先从反应混合物中分离药学不可接受的盐形式的碱性化合物，然后通过用碱性试剂处理简单地转化成游离碱化合物，其后将所述游离碱转化成药学可接受的酸加成盐。所述碱性化合物的酸加成盐通过以常规方式使所述游离碱形式与足量的期望的酸接触产生所述盐进行制备。所述游离碱形式可以通过以常规方式使所述盐形式与碱接触并分离所述游离碱而再生。所述游离碱形式与其各种盐形式在某些物理性质方面(例如在极性溶剂中的溶解度)略微不同，但在其它方面，对于本发明公开的主题的目的而言，所述盐相当于其各自的游离碱。
药学可接受的碱加成盐是与金属或胺例如碱金属和碱土金属的氢氧化物或者有机胺形成的。用作阳离子的金属的实例包括但不限于钠、钾、镁、钙等。适合的胺的实例包括但不限于N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。
酸性化合物的碱加成盐通过以常规方式使游离酸形式与足量的期望的碱接触产生所述盐进行制备。所述游离酸形式可以通过以常规方式使所述盐形式与酸接触并分离所述游离酸而再生。所述游离酸形式与其各自的盐形式在某些物理性质方面例如在极性溶剂中的溶解度)略微不同，但在其它方面，对于本发明公开的主题的目的而言，所述盐相当于其各自的游离酸。
盐可以从无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等制备，盐的实例是硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐(naphthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐、月桂基磺酸盐和羟乙基磺酸盐等。盐还可以从有机酸例如脂族一元羧酸和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基烷酸、链烷双酸、芳族酸、脂族和芳族的磺酸等。代表性的盐包括乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。药学可接受的盐可以包含基于碱金属和碱土金属(例如钠、锂、钾、钙、镁等)的阳离子，以及无毒性的铵、季铵和胺的阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。还包括氨基酸的盐，例如精氨酸盐、葡糖酸盐、半乳糖醛酸盐等。参见例如Berge 人，J.Pharm.Sci.，1977，66，1-19，其通过援引纳入本文。
IV.筛选化学保护活性的化合物的方法
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供选择化学保护化合物的方法。具体地，本发明公开的主题提供选择化学保护化合物的方法，所述化学保护化合物可以引起健康细胞中的短暂PQ，使得能够用细胞毒性(例如DNA损伤性)化合物或其它药剂(例如电离辐射)***，但不产生长期(或其它不期望的)毒性，并且在长时预治疗期的情况下提供化学保护。在一些实施方案中，期望通过进行一种或多种基于细胞的测定来筛选测试化合物。使用基于细胞的测定可以证实在非基于细胞的测定中具有CDK4/6抑制性的化合物的效力，并且有助于排除具有不期望的脱靶效应的化合物。已证明本文所述的基于细胞测定的筛选方法可预测化合物的体内化学保护能力。
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供筛选用于预防细胞毒性剂在健康细胞中的效应的化合物的方法，所述方法包括：使细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)依赖性细胞群和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)依赖性细胞群与测试化合物接触一段时间；进行所述细胞群的细胞周期分析；和选择选择性地诱导所述细胞群中的G1停滞的测试化合物。
在一些实施方案中，所述选择包括选择诱导基本上纯粹的G1停滞(即，基本上没有G2/M或S期停滞或者小于20％、15％、12％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的G2/M和/或S期停滞)的测试化合物。
适合的测试化合物包括各种不同的化合物。例如，所述测试化合物可以是已知或疑似具有CDK4/6抑制效应的化合物。测试化合物可以包括具有已知的CDK4/6抑制效应(通过非细胞测定)的那些。在一些实施方案中，所述测试化合物可以选自包括但不限于吡啶并[2，3-d]嘧啶(例如吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮和2-氨基-6-氰基吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-酮)、三氨基嘧啶、芳基[a]吡咯并[3，4-d]咔唑、含氮的杂芳基取代的脲、5-嘧啶基-2-氨基噻唑、苯并噻二嗪、吖啶硫酮和异喹啉酮，例如上文所述的化合物。
适合按照本发明公开的方法使用的细胞群包括但不限于调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)或CDK4/6依赖性癌细胞系。在一些实施方案中，所述CDK4/6依赖性癌细胞系是缺少INK4a/ARF的癌细胞系。在一些实施方案中，所述细胞群可以与所述测试化合物接触24小时或更短(例如24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小时)，然后进行所述细胞群的细胞周期分析。可以使用任何适量的测试化合物接触所述细胞群。例如，用来接触所述细胞群的测试化合物的量可以与所述化合物相关的已知数据(例如通过非细胞激酶抑制研究测得的已知的IC50)为依据。筛选还可包括用测试化合物治疗多个细胞群，其中用不同量的特定测试化合物治疗所述多个细胞群中的每个细胞群，以测定剂量依赖性效应。
在所述细胞群已与所述测试化合物接触期望的时间段后，进行细胞周期分析以确定处于一个或多个特定细胞期(例如G1、G2/M、S)的细胞的百分比(％)。为了比较，还可在未经所述测试化合物治疗的细胞群中进行细胞周期分析。
评价细胞群的细胞期的方法是本领域已知的，并且在例如美国专利申请公布2002/0224522中有述。可以用各种方法评价细胞期，包括细胞计数分析、显微分析、梯度离心、淘析和荧光技术包括免疫荧光法(其可与例如任何前述技术组合使用)。细胞计数技术包括将细胞暴露于标记剂或染色剂例如DNA-结合染料，例如碘化丙锭(PI)，并通过流式细胞术分析细胞的DNA含量。免疫荧光技术包括用荧光抗体检测特异性细胞周期标志例如胸苷类似物(例如，5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)或碘代脱氧尿苷)。
在一种使用流式细胞术的细胞期分析的方法中，可以高速地定量测定作为细胞周期各期的标志的细胞核DNA含量。DNA含量是细胞期的标志，因为细胞的DNA含量在细胞周期的几个时期之间有变化。设定处于G0/1期的细胞所具有的DNA含量等于1单位的DNA；处于S期的细胞复制DNA，其含量与S的进程成比例地增长；并且当进入G2期和然后进入M期后，细胞具有两倍于G0/1期的DNA含量(即，2单位的DNA)。因此，S期细胞的DNA含量介于处于G1的细胞和处于G2/M的细胞(其DNA是处于G1的细胞的DNA的2倍)的DNA含量之间。细胞DNA含量的单变量分析能够辨别G0/1、S和G2/M期的细胞。
细胞DNA含量的流式细胞术测定典型地包括将按化学计量与DNA结合的染料加入渗透化的细胞或核的悬浮液中。通常，用例如洗涤剂固定或渗透化细胞，然后用DNA结合染料染色。此类染料的实例包括但不限于核酸特异性的荧光染料、碘化丙锭(PI)或4′，6′-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。除DNA外，PI还染色RNA；因此，为了避免在细胞DNA含量测定中包含RNA导致的荧光测量值，期望通过与RNA酶孵育除去RNA。已结合DNA的PI在被蓝光(488nm)激发时发射出红色荧光。此DAPI-DNA复合物可以被紫外线(UV)(360nm)激发并发射出蓝色荧光。DNA还可在活细胞中用UV光-可激发的荧光染料Hoeschst 33242(其也发射蓝色荧光)染色。其它DNA结合染料包括但不限于Hoechst 33258、7-AAD、LDS 751和SYTO 16(参见例如Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals，Haugland，第6版，具体参见第8和16章)。通常，DNA-结合染料被细胞被动吸收并且通过嵌入结合DNA，但是一些DNA-结合染料是结合大沟或小沟的化合物。
被染色的材料掺入与DNA量成比例的量的染料。然后在流式细胞仪中测定所述被染色的材料，并且发射出的荧光信号产生高度(振幅)与来自细胞的总荧光发射成比例的电子脉冲。荧光测定结果还可以显示为细胞DNA含量频数直方图，所述直方图显示处于细胞周期中不同期的细胞的比例(依据荧光强度的差异)。已开发了含有拟合单峰DNA直方图的数学模型的软件来计算处于细胞周期的不同期的细胞的百分比。数个生产商提供细胞周期分析的软件，包括例如CELLFITTM(Becton，Dickinson and Company，Franklin Lakes，New Jersey，United States of America)。
在细胞复制过程中各种核酸类似物可以被掺入DNA。例如，在暴露于所述类似物BrdU的细胞中，在复制过程中BrdU被掺入DNA。利用荧光素标记的抗-BrdU抗体通过免疫细胞化学法检测已掺入所述类似物的DNA。例如，可以通过用红色荧光嵌入性荧光染料例如PI或7-氨基放线菌素D(7-AAD)复染来评价DNA含量。DNA含量对比抗-BrdU抗体的免疫荧光的双变量分析将S期细胞与G1或G2/M细胞区分开，这是根据它们的DNA含量上的差异以及绿色的、发荧光的抗-BrdU抗体的掺入。
离心和离心式淘析可以用来根据它们的大小分级(fractionate)细胞。因为不同期的细胞大小不同，这些方法还可用来根据细胞期分类细胞并由此评价细胞所处的期。例如，G1前期细胞约是有丝***细胞或G2后期细胞的大小的一半。
在细胞周期进程中，染色体进行形态学的、超微结构的和拓扑学上的改变。因此，处于细胞周期的不同期的细胞的染色体是特征性的。染色体的拓扑学在细胞周期的不同期有差异。间期染色体DNA以各种脱浓缩状态存在以促进基因表达。未被转录的染色体区的染色质主要以浓缩形式存在，而被转录区呈伸展形式。在S期内，染色体DNA随着其在复制过程中解链进一步分散。在S期结束时，发生内聚作用使伸展的姐妹染色单体紧密缔合。典型地，染色体在前期开始浓缩，进行由组蛋白及其它促进蛋白支配的数级超螺旋。染色体在中期是最浓缩的，并且在末期随着姐妹细胞分离并恢复正常转录水平开始去浓缩。因此，可以通过各种成像(例如显微镜)技术评价细胞期。
根据本发明公开的方法，细胞周期分析可以利用任何适合的技术进行，例如但不限于流式细胞术、荧光测定法、细胞成像和荧光光谱法或其组合。在一些实施方案中，所述细胞周期分析包括流式细胞术。在一些实施方案中，细胞周期分析包括用一种或多种标记剂(例如DNA-结合剂或细胞周期标志)标记所述细胞群(例如在与所述测试化合物接触一段时间之后)。在一些实施方案中，所述标记剂是BrdU、PI或其组合。
在一些实施方案中，所述选择化学保护化合物的方法还可包括一种或多种额外的验证性测定。例如，在一些实施方案中，所述方法还包括试验测试化合物诱导非CDK4/6依赖性细胞中的G1细胞周期停滞的能力。因此，在一些实施方案中，所述方法还包括：使另一种细胞群与选择性地诱导CDK4/6依赖性细胞中的G1停滞的测试化合物接触一段时间，其中所述另一种细胞群包括非CDK4和/或CDK6依赖性细胞；进行所述另一种细胞群中的细胞周期分析；和选择没有选择性地诱导所述另一种细胞群中的G1停滞的测试化合物。
在一些实施方案中，所述另一种细胞群是癌细胞系，例如与要用所述化学保护化合物治疗的对象中存在的癌症相关的癌细胞系。在一些实施方案中，所述另一种细胞群是视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB)无效的。在一些实施方案中，所述另一种细胞群是以CDK1或CDK2活性增高、高水平的MYC表达、细胞周期蛋白E增多或细胞周期蛋白A增多为特征的细胞群。
所述方法还可包括证实所选择的测试化合物在接触细胞毒性(例如DNA损伤性)化合物的细胞群中减轻DNA损伤和/或维持细胞活力。例如，可以在体内使用所述化疗保护剂之前，在离体细胞群(例如培养基中培养的细胞群)中评价DNA损伤的预防和/或细胞活力的维持。
因此，在一些实施方案中，所述验证性测定包括：使细胞群与测试化合物接触一段时间，或者使细胞群与作为在所述细胞群与细胞毒性化合物(例如化疗化合物)接触之前、同时或之后的时间点的单次给药的测试化合物接触。在一些实施方案中，所述细胞毒性化合物是DNA损伤性化合物。在一些实施方案中，用于本发明公开的方法的DNA损伤性化合物是多柔比星、依托泊苷、卡铂或其组合。
可以任何适合的方式评价在被细胞毒性化合物治疗的细胞中由所述测试化合物引起的DNA损伤减轻或由所述测试化合物实现的细胞活力维持。例如，细胞群中的DNA损伤可以通过下文进一步描述的γ-H2AX测定进行评价。哺乳动物细胞以组蛋白H2AX的立即且大量的磷酸化对诱导DNA双链断裂的药剂作出反应。因此，利用可商购的抗体检测磷酸化的H2AX(表述为γ-H2AX(γH2AX))可以用作细胞中DNA损伤的量度。
用来评价细胞活力的各种细胞增殖测定也是本领域已知的。在一些实施方案中，通过进行使用2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓单钠盐(WST-1)的测定来评价细胞活力，例如在下文进一步描述的那样。在WST-1测定中，WST-1被活细胞中存在的线粒体还原酶分解形成有色产物(即甲
Figure BPA00001380823800511
)，所述有色产物可通过测量在特定的波长(例如420-480nm)下的吸光度来检测。可用作比色法底物的其它四唑鎓盐包括WST-8、TTC、INT、MTS、MTT和XTT。CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800512
测定(CTG测定；Promega，Madison，Wisconsin，United States of America)通过测量细胞溶解物中ATP浓度来测定细胞活力。细胞活力还可通过测定DNA合成(例如通过掺入核酸类似物)及本领域已知的其它技术进行评价。
实施例
以下实施例提供示例性实施方案。由于本公开和本领域技术的一般水平，技术人员可以理解以下实施例仅是示例性意图，并且在不脱离本发明公开的主题的范围的情况下可以使用许多变化、修改和变型。
方法
化合物：用于以下研究的化合物在下表1中示出。除了夫拉平度之外，所述化合物通过已知的文献途径新近合成或者采购自商业来源。夫拉平度由Dr.Kwok-Kin Wong提供(Dana-Farber Cancer Institute，Harvard MedicalSchool，Boston，Massachusetts，United States of America)。Roscovitine和染料木黄酮购自LC Laboratories(Woburn，Massachusetts，United States ofAmerica)。2BrIC由OTAVA Chemicals(Kiev，Ukraine)新近合成用于本研究，但也可从例如OTAVA Chemicals(Kiev，Ukraine)和Alexis Biocemicals(EnzoLife Sciences，Inc.，Farmingdale，New York，United States of America)商购获得。2BrIC可以按照Zhu等人，J.Med.Chem.，46，2027-2030(2003)中所述的方法合成。PD 0332991按照以下实施例1中所述合成。所有化合物的结构和纯度均通过NMR和LC-MS证实。所有化合物的纯度均＞94％。
表1.选择性和非选择性CDK4/6抑制剂化合物
Figure BPA00001380823800531
Figure BPA00001380823800541
细胞系：在含有任何其它化合物的杜尔贝科改良的Eagle培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)中培养调聚的人类二倍体成纤维细胞(tHDF)细胞(HS68)。相同的条件用于A2058和WM2664、具有已知的RB-途径突变的人类黑素瘤细胞系：A2058是RB无效的，而WM2664缺少INK4a/ARF。因此，A2058细胞是非CDK4/6依赖性的，而WM2664细胞是CDK4/6依赖性的。在DMEM+10％FBS中培养细胞。
细胞周期分析：按照生产商的方案，使用BrdU和碘化丙锭(均来自BD Biosciences Pharmigen，San Jose，California，United States of America)进行细胞周期分析。以期望剂量的测试化合物处理细胞24小时，然后进行15分钟BrdU脉冲，细胞采集，固定，染色，然后通过流式细胞术分析。使用来自Verity Software House(Topsham，Maine，United States of America)的Mod-FitTM软件分析在HS68、WM2664和A2058细胞中PD332991和2BrIC的剂量-反应曲线的直方图。
γH2AX测定：为了γH2AX测定，用反应剂量的PD332991或2BrIC处理细胞24小时。固定细胞、渗透化，并通过γH2AX Flow Kit(Millipore，Billerica，Massachusetts，United States of America)用抗-γH2AX抗体染色。通过流式细胞术评价γH2AX水平。
细胞增殖测定：通过于96-孔组织培养板中的100μL培养基中接种1x103细胞/孔进行细胞增殖测定。按照所述用表1的化合物和多柔比星、依托泊苷或卡铂治疗细胞。治疗后，使细胞在正常培养基中恢复7天。在恢复期结束时，使用WST-1细胞增殖测定(TaKaRa Bio USA，Madison，Wisconsin，United States of America)或CellTiter-Glo
Figure BPA00001380823800561
测定(CTG；Promega，Madison，Wisconsin，United States of America)定量细胞数。对于WST测定，数据表示为在450nM的吸光度，或者对于CTG测定，数据表示为相对光单位(RLU)。
体内药效学测定(BrdU掺入)：
冶疗：
PD0332991：为了HSPC增殖实验，向小鼠每日接受口腔管饲PD0332991150mg/kg，持续2天，并且每6小时腹膜内注射(i.p.)1mg BrdU，持续24小时，然后杀死。
2BrIC：为了HSPC增殖实验，口腔管饲2剂2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4-c]咔唑-5，7(6H)-二酮(2BrIC)300mg/kg或媒介物对照治疗小鼠。使用来自Hot Rod制剂药盒(Pharmatek，Inc.San Diego，California，United States of America)的制剂#6溶解2BrIC用于口腔管饲。在给药BrdU之前2小时给药2BrIC，并在BrdU 1mg i.p.注射之时再次给药。在BrdU+/-2BrIC治疗指定时间后，杀死小鼠并采集骨髓用于免疫表型和BrdU分析。
通过流式细胞术分析BrdU掺入：
从小鼠的股骨采集骨髓(BM)，合并，然后离心纯化骨髓单核细胞(BM-MNC)。然后在ACK缓冲液中孵育细胞5分钟以溶解红细胞。除非另外说明，所有的抗体来自BD Pharmingen(San Jose，California，United Statesof America)。纯化的BM-MNC与小鼠细胞系混合物生物素缀合的抗体孵育，然后与链霉亲和素-FITC孵育。然后用Sca-1-PE-Cy7和c-kit-APC-alexa750抗体染色细胞。使用LIVE/DEAD Aqua Dead Cell Stain Kit(InvitrogenCorporation，Carlsbad，California，United States of America)评价细胞活力。为了BrdU掺入测定，固定细胞，渗透化，并按照生产商说明书用APC BrdUFlow Kit染色。在所有实验中，适当时，掺入PE-Cy7、FITC、APC-alexa750和Aqua Dead细胞染色同型对照。使用CyAn ADP(Dako，Glostrup，Denmark)进行流式细胞计数分析。对于每个样品，至少分析500,000个细胞，并用FlowJo软件(Tree Star，Ashland，Oregon，United States of America)分析数据。
骨髓抑制测定：每周全血细胞计数：
治疗：
PD0332991：在卡铂实验中，通过单剂的PD0332991 150mg/kg口腔管饲或媒介物对照，然后用卡铂100mg/kg IP注射治疗小鼠。在多柔比星实验中，在第0天，通过口腔管饲用PD0332991 150mg/kg或媒介物对照治疗小鼠，1小时后，通过IP注射多柔比星10mg/kg治疗小鼠，然后在第7天重复治疗小鼠。
2BrIC：通过IP注射单剂的卡铂100mg/kg和口腔管饲2剂2BrIC150mg/kg或媒介物对照来治疗小鼠。用2BrIC预治疗，2小时后给药卡铂，然后在注射卡铂时再给药另一剂2BrIC来治疗小鼠。
血液采集和血小板定量：
给药前，对亚组小鼠进行基线全血细胞计数(CBC)分析。给药后(化学疗+/-指定的CDK4/6抑制剂或对照)，通过CBC分析每周监测小鼠骨髓抑制的存在情况。使用含有K2E(K2EDTA)的BD Microtainer管进行CBC分析，通过尾静脉切口采集40μL血液。使用HESKA CBC-Diff VeterinaryHematology System分析血液。CBC分析包括测定白细胞、淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、血细胞比容、红细胞、血红蛋白、血小板及其它常用的血液参数。
TOXILIGHTTM测定：
使用TOXILIGHTTM Bioassay kit(Lonza，Basel，Switzerland)(其通过量化释放入培养基的腺苷酸激酶测定细胞溶解)评价细胞毒性。简言之，从用不同浓度的PD 0332991或星形孢菌素治疗的细胞的96孔板的各孔吸取20μL。加入100μL的TOXILIGHTTM试剂，并孵育5分钟，然后在发光计中以1秒/孔读数。
实施例1
合成PD
Figure BPA00001380823800581
路线1：合成PD
如以上路线1中所示合成PD。除了将化合物D转化成化合物E的反应以及将化合物F转化成化合物G的反应之外，路线1中所示的反应大体上按照之前报告的方法进行(参见VandelWel等人，J.Med Chem.，48，2371-2387(2005)；和Toogood等人，J.Med.Chem.，48，2388-2406(2005))。
化合物D转化成化合物E：
Figure BPA00001380823800591
在氮气下将化合物D(40g，169mmol)溶于无水THF(800mL)并在冰浴中冷却溶液，向其缓慢地加入MeMgBr(160mL，480mmol，3M在***中)并搅拌1h。用饱和NH4Cl水溶液终止反应，并在水和EtOAc之间分配。分离有机层，并用EtOAc萃取水层。合并的有机层用盐水洗涤，然后用MgSO4干燥。浓缩得到中间体产物(41.9g，98％)，其为油。
将上述中间体(40g，158mmol)溶于无水CHCl3(700mL)。加入MnO2(96g，1.11mol)，在搅拌下将混合物加热至回流，持续18h，再另外加入MnO2(34g，395mmol)，继续回流4h。通过硅藻土(Celite)垫过滤固体并用CHCl3洗涤。浓缩滤液得到黄色固体化合物E(35g，88％)，Mp：75.8-76.6℃。
化合物F转化成化合物G：
Figure BPA00001380823800592
将化合物F(5g，18.2mmol)溶于无水DMF(150mL)并加入NBS(11.3g，63.6mmol)。在r.t.下搅拌反应混合物3.5h，然后倒入H2O(500mL)中，过滤沉淀并用H2O洗涤。从EtOH中重结晶固体得到化合物G，为白色固体(5.42g，80.7％)，mp：210.6-211.3℃。
PD的表征数据：
LC-MS：448.5(ESI，M+H).纯度：～99％
1H NMR(300MHz，D2O)：9.00(s，1H)，8.12(dd，J＝9.3Hz，2.1Hz，1H)，7.81(d，J＝2.4Hz，1H)，7.46(d，J＝9.6Hz，1H)，5.80-5.74(m，1H)，3.57-3.48(m，8H)，2.48(s，3H)，2.37(s，3H)，2.13-1.94(m，6H)，1.73-1.71(m，2H)。
13C NMR(75MHz，D2O)：203.6，159.0，153.5，153.3，152.2，139.9，139.4，139.2，133.1，129.0，118.7，113.8，107.4，51.8，42.2，40.0，28.0，25.2，22.6，10.8。
实施例2
CDK4/6依赖性细胞系中的选择性G1停滞
使几种人类细胞系暴露于多种小分子激酶抑制剂。按照上文方法部分中所述进行细胞周期分析。
在暴露于有效的且选择性的Cdk4/6抑制剂PD0332991或2BrIC之后，CDK4/6依赖性细胞系(包括调聚的人类二倍体成纤维细胞(HS68)和人类黑素瘤细胞系WM2664)显示出显著的、纯粹的且可逆的G1-停滞。参见图2A-2E。另外靶向CDK1/2的选择性较小的CDK抑制剂(例如化合物1-6、夫拉平度(图20A)、化合物7(即R547；图21A)、Roscovitine(图22A)、染料木黄酮和化合物8-14(图24A-24C))在这些细胞型中不定地产生G2/M阻断、S内-停滞或细胞死亡(sub-G0)。相比之下，正如所料，RB无效的黑素瘤细胞系A2058对CDK4/6抑制不敏感，但是，在暴露于特异性较小的CDK抑制剂之后，相似地显示出G2/M或S-内停滞和/或细胞死亡。7种RB-缺陷人类小细胞肺癌细胞系的增殖也对CDK4/6抑制剂具有抗性。因此，数据表明，结构上不同的、有效的和选择性的Cdk4/6抑制剂在易感细胞系(CDK4/6依赖性细胞系)中实现基本上纯粹的(即“完全的”)G1-停滞，而更全面的和非特异性CDK抑制剂的细胞周期效应较难预测并且与细胞毒性有关。
实施例3
预防化疗剂治疗的细胞中的DNA损伤
在如上文方法部分中所述的基于细胞的测定中，测定选择性CDK4/6抑制剂减轻暴露于DNA损伤性化合物如卡铂、依托泊苷和多柔比星的细胞中的DNA损伤的能力。卡铂、依托泊苷和多柔比星引起广泛的DNA损伤，这通过CDK4/6依赖性细胞系和非CDK4/6依赖性细胞系中的γH2AX病灶形成测得。参见图3A-3C、4和5。用PD0332991(图6A-6C，7和8)或2BrIC(图3A-3C，4和5)治疗然后用卡铂、依托泊苷或多柔比星治疗减弱γH2AX染色，表明由PD0332991和2BrIC诱导的G1停滞保护细胞免受化疗诱导的DNA损伤。
实施例4
预防化疗剂治疗的细胞中的细胞毒性
在如上文方法部分中所述的基于细胞的细胞增殖测定中评价选择性CDK4/6抑制剂保护细胞免受化疗诱导的细胞毒性的能力。CDK4/6依赖性细胞系和非CDK4/6依赖性细胞系被PD332991和2BrIC预治疗，然后加入卡铂、依托泊苷或多柔比星。PD332991和2BrIC均显著地保护CDK4/6依赖性细胞，但不保护非CDK4/6依赖性细胞。参见图9-14和25A-25C。相比之下，另外靶向CDK1/2且在CDK4/6依赖性细胞或非CDK4/6依赖性细胞中不诱导完全的G1停滞的选择性较小的CDK抑制剂(例如夫拉平度(图20B-20D)、化合物7(即R547；图21B-21D)、Roscovitine(图22B-22D)、染料木黄酮(图23A-23C)和化合物8、9和11(图24D-24I))不能保护细胞免受化疗诱导的细胞毒性。所述选择性较小的抑制剂不能提供保护表明，停滞于除G1之外的细胞周期的某期(例如G2/M)不预防基因毒性暴露。
重要的是应注意，仅是有效的CDK4/6抑制剂并在一些CDK4/6敏感细胞系中产生G1停滞不足以最佳地预防细胞毒性化合物。在一些实施方案中，本文公开了CDK4/6抑制剂的用途，所述CDK4/6抑制剂对这些激酶不仅有效而且是高度选择性的，而对其它CDK或其它非-CDK激酶并非如此。例如，在图26A中，有效但非选择性的CDK4/6抑制剂星形孢菌素在一种CDK4/6依赖性细胞类型HS68中诱导基本上纯粹的G1停滞；但是此停滞不预防化疗毒性。参见图26B。在图25D-25F中表明星形孢菌素治疗提高在WM2664(CDK4/6依赖性)和A2058(非CDK4/6依赖性)细胞系中的细胞毒性。同样的，如H2AX病灶所测定的，星形孢菌素也不保护CDK4/6依赖性细胞或非CDK4/6依赖性细胞免受DNA损伤。参见图27A-27C。总之，这些结果表明此化合物的脱靶、非CDK4/6依赖性效应在一些情况中诱导细胞死亡，表明多能激酶抑制剂如星形孢菌素在化学保护方面的效力是可变的并且是细胞类型依赖性的：在一些细胞类型中在体外提供保护，其中这些药物的主要效应是在脱靶效应有害于细胞存活的细胞类型中直接或间接地诱导G1停滞(参见Chen等人，J.Natl.Cancer Inst.，92，1999-2008(2000))和细胞死亡或其它不期望的结果。在本发明公开的主题的一些实施方案中，可以进行多测定筛选(例如在第7天细胞周期停滞和H2AX保护和/或细胞生长)以确定体内有效的化疗保护剂。在此类筛选中，星形孢菌素由于这些脱靶效应和不一致的效应而没能通过筛选。
此外，当在体内使用时，这些脱靶效应产生毒性并且提高化疗敏感性，并且这些毒性可阻止多能激酶抑制剂的临床化学保护用途。根据本发明公开的主题的一些实施方案，本文公开出乎预料地发现，选择性CDK4/6抑制剂对部分增殖细胞(即早期HSPC)的高度特异性使得此类化合物可以用于临床化疗体内保护而不产生剂量-限制性毒性。
实施例5
体内化学保护
评价使用选择性CDK4/6抑制剂提供体内PQ的能力。通过口腔管饲向成年野生型C57Bl/6小鼠给药口服可生物利用的PD0332991。根据在24小时内Ki67表达和BrdU掺入测定，造血干细胞(HSC；Lin-Kit+Sca1+CD48-CD150+)增殖缓慢(参见图16A-16D)，相当于预估值。参见Passegue等人，2005；Wilson等人，2008；和Kiel等人，2007。48小时的PD0332991治疗显著地降低Ki67表达和BrdU双阳性的HSC的频度(图16B)，其中对Ki67表达具有更显著的效应。在更快速增殖的多能祖细胞区室(MPP；Lin-Kit+Sca1+CD48-CD150-)中观察到更显著的增殖抑制(图16B-16C)。寡能祖细胞(Lin-Kit+Sca1-)显示出中度的增殖抑制(图16C)，其中，相比于在更分化的粒细胞-单核细胞系祖细胞(GMP)和巨核细胞-红细胞系祖细胞(MEP；图16B-16C)中的较弱效应，在髓共同祖细胞(CMP)和淋巴共同祖细胞(CLP)中观察到最强的效应。不同于对早期HSPC的这些效应，在更完全地分化的Lin-Kit-Sca1-和Lin+细胞中未观察到增殖方面的变化，但是这些部分是异种基因的，并且对亚群的效应可能被隐藏。
溶解2BrIC，然后通过口腔管饲给药，2小时后注射BrdU，在BrdU注射之时给药额外一剂2BrIC。相对于单独用制剂治疗的小鼠，2BrIC抑制BrdU掺入Lin-Kit+Sca1+细胞。参见图15A-15B。
为了确定选择性CDK4/6抑制剂是否能够保护暴露于化疗剂的小鼠中的血细胞计数，在用PD332991治疗的小鼠中研究血细胞计数。在用PD332991预治疗后用多柔比星(参见图18)或卡铂(参见图19)治疗的小鼠中，四种细胞系(血小板、血红蛋白、淋巴细胞和粒细胞)均被保护。
在用PD0332991连续治疗的荷瘤小鼠(参见Ramsey等人，Cancer Res.，67，4732-4741(2007)；和Fry等人，Mol.Cancer Ther.，3，1427-1438(2004))和患有恶性瘤的人类患者(参见O’Dwyer等人，“A Phase I does escalation trialof a daily oral CDK4/6 inhibitor PD 0332991”in American Society of ClinicalOncology(ASCO，Chicago，Illinois，2007))中，已观察到，在给药PD0332991后，红细胞、血小板和髓样(单核细胞+粒细胞)细胞系减少，并且在停止PD0332991后这些细胞系增多。预期此显著的降低可能增大化疗中给药的细胞毒性化合物的副作用。但是如本文所示，出乎预料地，造血细胞被保护免受副作用。
应理解，在不背离本发明公开的主题的范围的情况下可以改变本发明公开的主题的各种细节。此外，前述说明仅是出于例证目的而非限制性目的。

Claims (41)

1.减轻或预防细胞毒性化合物对已暴露于、将暴露于或有风险遭受暴露于细胞毒性化合物的对象中的健康细胞的效应的方法，其中所述健康细胞是造血干细胞或造血祖细胞，所述方法包括向所述对象给药有效量的抑制剂化合物或其药学可接受的形式，其中所述抑制剂化合物选择性地抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)。
2.权利要求1的方法，其中所述抑制剂化合物选择性地抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)。
3.权利要求1的方法，其中所述抑制剂化合物是非天然的化合物。
4.权利要求1的方法，其中所述抑制剂化合物基本上没有脱靶效应。
5.权利要求4的方法，其中所述脱靶效应是长期毒性、抗氧化效应、***效应、酪氨酸激酶抑制、抑制除细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)之外的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、和非CDK4/6依赖性细胞中的细胞周期停滞中的一种或多种。
6.权利要求1的方法，其中所述抑制剂化合物选择性地诱导细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)依赖性细胞和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)依赖性细胞中的G1停滞。
7.权利要求6的方法，其中所述抑制剂化合物在细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)依赖性细胞和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)依赖性细胞中诱导基本上纯粹的G1停滞。
8.权利要求1的方法，其中所述抑制剂化合物选自吡啶并[2，3-d]嘧啶、三氨基嘧啶、芳基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑、含氮的杂芳基取代的脲、5-嘧啶基-2-氨基噻唑、苯并噻二嗪和吖啶硫酮。
9.权利要求8的方法，其中所述吡啶并[2，3-d]嘧啶是吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮或2-氨基-6-氰基吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-酮。
10.权利要求9的方法，其中所述吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮是2-(2’-吡啶基)氨基吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮。
11.权利要求10的方法，其中所述吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮是6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮。
12.权利要求8的方法，其中所述芳基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑选自萘基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑、吲哚并[a]吡咯并[3，4-c]咔唑、喹啉基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑和异喹啉基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑。
13.权利要求12的方法，其中所述芳基[a]吡咯并[3，4-c]咔唑是2-溴-12，13-二氢-5H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4]咔唑-5，6-二酮。
14.权利要求1的方法，其中所述对象是哺乳动物。
15.权利要求1的方法，其中所述抑制剂化合物通过口服给药、局部给药、鼻内给药、吸入和静脉内给药之一向所述对象给药。
16.权利要求1的方法，其中在暴露于所述细胞毒性化合物之前、在暴露于所述细胞毒性化合物期间、在暴露于所述细胞毒性化合物之后或其任何组合向所述对象给药所述抑制剂化合物。
17.权利要求16的方法，其中在暴露于所述细胞毒性化合物之前24小时或更短时间向所述对象给药所述抑制剂化合物。
18.权利要求16的方法，其中在暴露于所述细胞毒性化合物之后24小时或更长时间向所述对象给药所述抑制剂化合物。
19.权利要求1的方法，其中所述细胞毒性化合物是DNA损伤性化合物。
20.权利要求1的方法，其中所述健康细胞选自长期造血干细胞(LT-HSC)、短期造血干细胞(ST-HSC)、多能祖细胞(MPP)、髓共同祖细胞(CMP)、淋巴共同祖细胞(CLP)、粒细胞-单核细胞系祖细胞(GMP)和巨核细胞-红细胞系祖细胞(MEP)。
21.权利要求1的方法，其中给药所述抑制剂化合物产生造血干细胞和造血祖细胞的短暂药理性静止。
22.权利要求1的方法，其中所述对象已接受、正在接受或预定要接受用细胞毒性化合物的医学治疗以治疗疾病。
23.权利要求22的方法，其中给药所述抑制剂化合物不影响患病细胞的生长。
24.权利要求22的方法，其中所述疾病是癌症。
25.权利要求24的方法，其中所述癌症的特征在于以下一个或多个方面：细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)活性增高、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)活性增高、丧失或缺乏视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB)、高水平的MYC表达、细胞周期蛋白E增多和细胞周期蛋白A增多。
26.权利要求22的方法，其中与在不给药所述抑制剂化合物的情况下会使用的剂量相比，给药所述抑制剂化合物允许使用更高剂量的所述细胞毒性化合物来治疗所述疾病。
27.权利要求1的方法，其中所述对象已意外地暴露于所述细胞毒性化合物或者过量的所述细胞毒性化合物。
28.权利要求1的方法，其中所述方法没有长期的血液毒性。
29.权利要求1的方法，其中与在不给药所述抑制剂化合物的情况下暴露于所述细胞毒性化合物后预期的状况相比，给药所述抑制剂化合物致使贫血减轻、淋巴细胞减少减轻、血小板减少减轻或中性白细胞减少症减轻。
30.筛选用于预防细胞毒性剂在健康细胞中的效应的化合物的方法，所述方法包括：
使细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)依赖性细胞群和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)依赖性细胞群与测试化合物接触一段时间；
进行所述细胞群的细胞周期分析；和
选择选择性地诱导所述细胞群中的G1停滞的测试化合物。
31.权利要求30的方法，其中所述细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)依赖性细胞群和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)依赖性细胞群包括调聚的人类二倍体成纤维细胞或缺少INK4a/ARF的黑素瘤细胞。
32.权利要求30的方法，其中使用选自流式细胞术、荧光测定法、细胞成像和荧光光谱法的一种或多种技术进行所述细胞周期分析。
33.权利要求30的方法，其中所述细胞周期分析包括用选自5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)和碘化丙锭的一种或多种标记剂标记所述细胞群。
34.权利要求30的方法，其中所述方法还包括：
使另一种细胞群与选择性地诱导细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)依赖性细胞和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)依赖性细胞中的G1停滞的测试化合物接触一段时间，其中所述另一种细胞群包括非CDK4和/或CDK6依赖性细胞；
进行所述另一种细胞群的细胞周期分析；和
选择没有选择性地诱导所述另一种细胞群中的G1停滞的测试化合物。
35.权利要求34的方法，其中所述另一种细胞群是癌细胞系。
36.权利要求34的方法，其中所述另一种细胞群是视网膜母细胞瘤抑癌蛋白(RB)无效的。
37.权利要求30的方法，其中所述方法还包括通过评价所述测试化合物在与细胞毒性剂接触的离体细胞群中减轻DNA损伤的能力、维持细胞活力的能力或此二者来证实所述化合物的预防能力。
38.权利要求37的方法，其中通过进行γ-H2AX测定评价所述细胞群中的DNA损伤。
39.权利要求37的方法，其中通过进行细胞增殖测定评价细胞活力。
40.权利要求37的方法，其中所述细胞毒性剂是DNA损伤性化合物。
41.权利要求40的方法，其中所述DNA损伤性化合物选自多柔比星、依托泊苷和卡铂。
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