WO2018074451A1 - 癌治療剤 - Google Patents

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WO2018074451A1
WO2018074451A1 PCT/JP2017/037473 JP2017037473W WO2018074451A1 WO 2018074451 A1 WO2018074451 A1 WO 2018074451A1 JP 2017037473 W JP2017037473 W JP 2017037473W WO 2018074451 A1 WO2018074451 A1 WO 2018074451A1
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WO
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cancer
cddp
cells
cafca
cisplatin
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Application number
PCT/JP2017/037473
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English (en)
French (fr)
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弘行 土屋
章彦 武内
健作 阿部
憲男 山本
克洋 林
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国立大学法人金沢大学
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Publication date
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a cancer therapeutic agent and a cancer treatment method characterized by combining caffeine citrate as an active ingredient with an anticancer agent as an active ingredient.
  • Osteosarcoma is the most common primary malignant bone tumor that occurs mainly in young people in their 10s, but the cause is unknown. The incidence in Japan is said to be 1 per 1 million (130 to 260 per year). In the days when amputation was the only treatment option, osteosarcoma had a 2-year survival rate of 15-20%, a disease with a very poor prognosis. However, with the introduction / advancement of chemotherapy and the development of diagnostic imaging and surgical therapy, the 5-year survival rate has improved to 70% or more (Non-patent Document 1). The inventors have disclosed “caffeine combination chemotherapy”.
  • Non-patent literature 2 In patients with relapse or metastasis from the first visit, the 5-year survival rate was 10-30%, which has not improved significantly over the past 40 years. I think that the improvement of an effect is required (nonpatent literature 3).
  • Soft tissue sarcoma Soft tissue sarcomas have various classifications such as leiomyosarcoma, fibrosarcoma, liposarcoma, rhabdomyosarcoma, and the like. Each has a different nature, and the rarity is very high. In non-small round cell sarcomas excluding extraosseous Ewing sarcoma and rhabdomyosarcoma, the 10-year survival rate of surgery alone has been reported to be around 35% when the extremity is limited to stage III. Reference 4).
  • An object of the present invention is to provide a cancer therapeutic agent and a cancer treatment method having a stronger therapeutic effect than conventional chemotherapy in various cancer types.
  • the present inventors have intensively studied a drug that can enhance the therapeutic effect of an anticancer agent by combining it with an anticancer agent, and as a result, “the combination of caffeine citrate and an anticancer agent has a therapeutic effect of the anticancer agent.
  • the present invention has been completed by finding “enhancing synergistically”.
  • this invention consists of the following.
  • a cancer therapeutic agent comprising a combination of an active ingredient caffeine citrate and an anticancer agent as an active ingredient.
  • the cancer therapeutic agent according to 1 above wherein the cancer is primary malignant bone tumor, soft tissue sarcoma, lung cancer, stomach cancer, breast cancer, uterine cancer, colon cancer, skin cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer or hepatocellular carcinoma. .
  • the cancer therapeutic agent according to any one of items 1 to 3, wherein the cancer is soft tissue sarcoma. 6). 4. The cancer therapeutic agent according to any one of items 1 to 3, wherein the cancer is lung cancer. 7). 4. The cancer therapeutic agent according to any one of items 1 to 3, wherein the cancer is pancreatic cancer. 8). 4. The cancer therapeutic agent according to any one of items 1 to 3, wherein the cancer is gastric cancer. 9. 4. The cancer therapeutic agent according to any one of items 1 to 3, wherein the cancer is hepatocellular carcinoma. 10. 4. The cancer therapeutic agent according to any one of items 1 to 3, wherein the cancer is uterine cancer. 11. 4. The cancer therapeutic agent according to any one of items 1 to 3, wherein the cancer is breast cancer. 12 4.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention has a synergistic effect that can synergistically enhance the therapeutic effect of the anticancer agent by combining at least caffeine citrate with the anticancer agent.
  • the vertical axis represents cell viability, and the horizontal axis represents cisplatin concentration (CDDP concentration).
  • Diamond ( ⁇ ) is cisplatin (CDDP) alone, black square ( ⁇ ) is cisplatin + anhydrous caffeine (CDDP + caf), gray square is cisplatin + citric acid (CDDP + CA), circle is cisplatin + caffeine citrate (CDDP + cafCA) ).
  • the CDDP + cafCA group was significantly different from all other groups at each cisplatin concentration (p ⁇ 0.01).
  • the vertical axis represents cell viability, and the horizontal axis represents cisplatin concentration.
  • a diamond ( ⁇ ) indicates CDDP alone, a black square ( ⁇ ) indicates CDDP + caf, a gray square indicates CDDP + CA, and a circle indicates CDDP + cafCA.
  • the CDDP + cafCA group was significantly different from all other groups at each cisplatin concentration (p ⁇ 0.01).
  • the vertical axis represents cell viability, and the horizontal axis represents cisplatin concentration.
  • a diamond ( ⁇ ) indicates CDDP alone, a black square ( ⁇ ) indicates CDDP + caf, a gray square indicates CDDP + CA, and a circle indicates CDDP + cafCA.
  • the CDDP + cafCA group was significantly different from all other groups at each cisplatin concentration (p ⁇ 0.01).
  • the vertical axis represents cell viability, and the horizontal axis represents cisplatin concentration.
  • a diamond ( ⁇ ) indicates CDDP alone, a black square ( ⁇ ) indicates CDDP + caf, a gray square indicates CDDP + CA, and a circle indicates CDDP + cafCA.
  • the CDDP + cafCA group was significantly different from all other groups at each cisplatin concentration (p ⁇ 0.01).
  • the vertical axis represents the CDDP concentration of CDDP + caf ( ⁇ M)
  • the horizontal axis represents the CDDP concentration of CDDP + CA ( ⁇ M).
  • X indicates Effective Dose 50 (ED50)
  • + indicates Effective Dose 75 (ED75)
  • ⁇ indicates Effective Dose 90 (ED90).
  • X, +, and ⁇ on the vertical axis indicate each effective dose of CDDP + caf
  • x, +, and ⁇ on the horizontal axis indicate each effective dose of CDDP + CA
  • X, +, and ⁇ surrounded by a circular broken line are , Each effective dose of CDDP + cafCA is shown.
  • the circular broken line Effective Dose of CDDP + cafCA
  • CI Combination Index
  • CDDP + caf each Effective Dose of CDDP + CA
  • CDCD + c + c each Effective Dose of CDDP + cafF and CDCD + c + c
  • a synergistic effect is observed when CI ⁇ 1.0.
  • the vertical axis represents the CDDP concentration of CDDP + caf ( ⁇ M)
  • the horizontal axis represents the CDDP concentration of CDDP + CA ( ⁇ M).
  • X represents ED50, + represents ED75, and ⁇ represents ED90.
  • X, +, and ⁇ on the vertical axis indicate each effective dose of CDDP + caf, and x, +, and ⁇ on the horizontal axis indicate each effective dose of CDDP + CA, and X, +, and ⁇ surrounded by a circular broken line are , Each effective dose of CDDP + cafCA is shown.
  • a synergistic effect is recognized when the circular broken line (Effective Dose of CDDP + cafCA) is located at the lower left of the curve connecting the Effective Dose.
  • the CI is calculated by calculating CDDP + ca as a combination of CDDP + caf and CDDP + CA by using each effective dose of CDDP + caf, each effective dose of CDDP + CA and each effective dose of CDDP + cafCA shown in the above graph.
  • a synergistic effect is observed when CI ⁇ 1.0.
  • the vertical axis represents the CDDP concentration of CDDP + caf ( ⁇ M)
  • the horizontal axis represents the CDDP concentration of CDDP + CA ( ⁇ M).
  • X represents ED50, + represents ED75, and ⁇ represents ED90.
  • X, +, and ⁇ on the vertical axis indicate each effective dose of CDDP + caf, and x, +, and ⁇ on the horizontal axis indicate each effective dose of CDDP + CA, and X, +, and ⁇ surrounded by a circular broken line are , Each effective dose of CDDP + cafCA is shown.
  • a synergistic effect is recognized when the circular broken line (Effective Dose of CDDP + cafCA) is located at the lower left of the curve connecting the Effective Dose.
  • the CI is calculated by calculating CDDP + ca as a combination of CDDP + caf and CDDP + CA by using each effective dose of CDDP + caf, each effective dose of CDDP + CA and each effective dose of CDDP + cafCA shown in the above graph.
  • a synergistic effect is observed when CI ⁇ 1.0.
  • the vertical axis represents the CDDP concentration of CDDP + caf ( ⁇ M)
  • the horizontal axis represents the CDDP concentration of CDDP + CA ( ⁇ M).
  • X represents ED50, + represents ED75, and ⁇ represents ED90.
  • X, +, and ⁇ on the vertical axis indicate each effective dose of CDDP + caf, and x, +, and ⁇ on the horizontal axis indicate each effective dose of CDDP + CA, and X, +, and ⁇ surrounded by a circular broken line are , Each effective dose of CDDP + cafCA is shown.
  • a synergistic effect is recognized when the circular broken line (Effective Dose of CDDP + cafCA) is located at the lower left of the curve connecting the Effective Dose.
  • the CI is calculated by calculating CDDP + ca as a combination of CDDP + caf and CDDP + CA by using each effective dose of CDDP + caf, each effective dose of CDDP + CA and each effective dose of CDDP + cafCA shown in the above graph.
  • a synergistic effect is observed when CI ⁇ 1.0.
  • the results of WST-8 assay for osteosarcoma cell line (HOS), soft tissue sarcoma cell line (HT1080), lung cancer cell line (RERF-LC-AI) and gastric cancer cell line (MKN45) in Example 1 were compared with the median effect method and Isobologram. The figure which summarized the result analyzed by the method.
  • the way of viewing the graph is the same as in FIG.
  • FIG. The result of having analyzed the result of the WST-8 assay using the breast cancer cell line (MCF7) in Example 2 by the Isobologram method.
  • the way of viewing the graph and table is the same as in FIG.
  • the way of viewing the graph is the same as in FIG.
  • Diamonds ( ⁇ ) are adriamycin (ADM) alone, black squares ( ⁇ ) are adriamycin + anhydrous caffeine (ADM + caf), gray squares are adriamycin + citric acid (ADM + CA), circles are adriamycin + caffeine citrate (ADM + cafCA) ).
  • the ADM + cafCA group was significantly different from all other groups at each adriamycin concentration (p ⁇ 0.01).
  • HOS osteosarcoma cell line
  • X, +, and ⁇ on the vertical axis indicate each effective dose of ADM + caf
  • x, +, and ⁇ on the horizontal axis indicate each effective dose of ADM + CA
  • x, +, and ⁇ surrounded by a circular broken line are Each effective dose of ADM + cafCA is shown.
  • a synergistic effect is recognized when the circular broken line (each effective dose of ADM + cafCA) is located in the lower left of the curve connecting ADM + caf and each effective dose of ADM + CA.
  • CI Combination Index
  • ADM + c was calculated as ADM + cafCA.
  • a synergistic effect is observed when CI ⁇ 1.0.
  • the way of viewing the graph is the same as in FIG.
  • the result of having analyzed the result of the WST-8 assay using the osteosarcoma cell line (HOS) in Example 3 by the Isobologram method The way of viewing the graph and the table is the same as in FIG.
  • the way of viewing the graph is the same as in FIG.
  • the result of having analyzed the result of the WST-8 assay using the gastric cancer cell line (MKN45) in Example 3 by the Isobologram method The way of viewing the graph and the table is the same as in FIG.
  • the way of viewing the graph is the same as in FIG.
  • FIG. The result of having analyzed the result of the WST-8 assay using the uterine cancer cell line (Hela) in Example 3 by the Isobologram method.
  • the way of viewing the graph and the table is the same as in FIG.
  • the vertical axis represents cell viability, and the horizontal axis represents gemcitabine concentration (GEM concentration).
  • Diamond ( ⁇ ) is gemcitabine (GEM) alone, black square ( ⁇ ) is gemcitabine + anhydrous caffeine (GEM + caf), gray square is gemcitabine + citric acid (GEM + CA), circle is gemcitabine + caffeine citrate (GEM + cafCA) ).
  • the GEM + cafCA group was significantly different from all other groups at each gemcitabine concentration (p ⁇ 0.01).
  • the vertical axis indicates the GEM + caf GEM concentration (nM), and the horizontal axis indicates the GEM + CA GEM concentration (nM).
  • X indicates Effective Dose 50 (ED50), + indicates Effective Dose 75 (ED75), and ⁇ indicates Effective Dose 90 (ED90).
  • X, +, and ⁇ on the vertical axis indicate GEM + caf Effective Dose
  • x, +, and ⁇ on the horizontal axis indicate GEM + CA Effective Dose
  • X, +, and ⁇ surrounded by a circular broken line are , GEM + cafCA Each Effective Dose is shown.
  • the way of viewing the graph is the same as in FIG.
  • the way of viewing the graph and table is the same as in FIG.
  • the way of viewing the graph is the same as in FIG.
  • the result of taking a photograph for a representative fixed point visual field of each group is shown.
  • Hoechst is a photographed result of Hoechst detection
  • Hoechst + TMRE is an image obtained by combining the photographed results of Hoechst detection and TMRE detection
  • TMRE is a photographed result of TMRE detection.
  • the result of taking a photograph for a representative fixed point visual field of each group is shown.
  • Hoechst is a photographed result of Hoechst detection
  • Hoechst + TMRE is an image obtained by combining the photographed results of Hoechst detection and TMRE detection
  • TMRE is a photographed result of TMRE detection.
  • the vertical axis shows the ratio of TMRE luminance per cell. * Indicates p ⁇ 0.05, and ** indicates p ⁇ 0.01.
  • the vertical axis represents cell viability, and the horizontal axis represents cisplatin concentration (CDDP concentration).
  • Diamonds ( ⁇ ) indicate cisplatin (CDDP) alone, triangles ( ⁇ ) indicate cisplatin + anhydrous caffeine (CDDP + caf), squares indicate cisplatin + citric acid (CDDP + CA), and circles indicate cisplatin + caffeine citrate (CDDP + cafCA).
  • the CDDP + cafCA group was significantly different from all other groups at each cisplatin concentration (p ⁇ 0.01).
  • the vertical axis represents cell viability, and the horizontal axis represents cisplatin concentration (CDDP concentration).
  • Diamonds ( ⁇ ) indicate cisplatin (CDDP) alone, triangles ( ⁇ ) indicate cisplatin + anhydrous caffeine (CDDP + caf), squares indicate cisplatin + citric acid (CDDP + CA), and circles indicate cisplatin + caffeine citrate (CDDP + cafCA).
  • the CDDP + cafCA group was significantly different from all other groups at each cisplatin concentration (p ⁇ 0.01).
  • the vertical axis represents cell viability, and the horizontal axis represents cisplatin concentration (CDDP concentration).
  • Diamonds ( ⁇ ) indicate cisplatin (CDDP) alone, triangles ( ⁇ ) indicate cisplatin + anhydrous caffeine (CDDP + caf), squares indicate cisplatin + citric acid (CDDP + CA), and circles indicate cisplatin + caffeine citrate (CDDP + cafCA).
  • the CDDP + cafCA group was significantly different from all other groups at each cisplatin concentration (p ⁇ 0.01).
  • the GEM + cafCA group was significantly different from all other groups at each gemcitabine concentration (p ⁇ 0.01).
  • the vertical axis represents cell viability, and the horizontal axis represents gemcitabine concentration (GEM concentration).
  • Diamonds ( ⁇ ) indicate gemcitabine (GEM) alone, triangles ( ⁇ ) indicate gemcitabine + anhydrous caffeine (GEM + caf), squares indicate gemcitabine + citric acid (GEM + CA), and circles indicate gemcitabine + caffeine citrate (GEM + cafCA).
  • the vertical axis represents cell viability, and the horizontal axis represents gemcitabine concentration (GEM concentration).
  • Diamonds ( ⁇ ) indicate gemcitabine (GEM) alone, triangles ( ⁇ ) indicate gemcitabine + anhydrous caffeine (GEM + caf), squares indicate gemcitabine + citric acid (GEM + CA), and circles indicate gemcitabine + caffeine citrate (GEM + cafCA).
  • the GEM + cafCA group was significantly different from all other groups at each gemcitabine concentration (p ⁇ 0.01).
  • the vertical axis represents cell viability, and the horizontal axis represents gemcitabine concentration (GEM concentration).
  • Diamonds ( ⁇ ) indicate gemcitabine (GEM) alone, triangles ( ⁇ ) indicate gemcitabine + anhydrous caffeine (GEM + caf), squares indicate gemcitabine + citric acid (GEM + CA), and circles indicate gemcitabine + caffeine citrate (GEM + cafCA).
  • the GEM + cafCA group was significantly different from all other groups at each gemcitabine concentration (p ⁇ 0.01). Administration schedule in Example 9.
  • the measurement date of the upper left graph is the first day (before drug administration), and the measurement date of the upper right graph is the 22nd day (after the end of the third course).
  • the upper row shows the results of using CDDP as an anticancer agent, and the lower row shows the results of using ADM as an anticancer agent.
  • the present invention relates to "a cancer therapeutic agent characterized by combining caffeine citrate as an active ingredient with an anticancer agent as an active ingredient” and "an anticancer agent as an active ingredient and caffeine citrate as an active ingredient” Is a method for treating cancer, comprising administering to a cancer patient.
  • caffeine citrate is an anhydrous caffeine represented by the following formula (1) and citric acid (2) and / or citric acid (2 ′). Containing citric acid hydrate).
  • citric acid represented by formula (2) and formula (2 ′) means a mixture of citric acid represented by formula (2) and citric acid represented by formula (2 ′).
  • a commercially available caffeine citrate may be used.
  • caffeine anhydrous caffeine analog
  • caffeine hydrate sodium benzoate caffeine (so-called Annaka) and the like
  • caffeine is a xanthine derivative
  • xanthines Xanthine-based nerve center stimulants (phenethylin, proventferrin), xanthine-based vasodilators (pentoxyferrin, naxiferin, xanthinol nicotinate, pentifylline, lorophilin, tonapoferrin), xanthine diuretics (theobromine, pamaprom), etc.
  • a compound similar to citric acid citric acid analog
  • potassium citrate, lithium citrate, copper citrate, ammonium iron citrate, and hydrates thereof can also be used. Therefore, a combination of a compound similar to anhydrous caffeine and a compound similar to citric acid can be used as a drug similar to caffeine citrate.
  • caffeine citrate Although caffeine citrate has not been reported on effects on cancer types and combined use with anticancer agents, it is used as a therapeutic agent for premature infant apnea attacks. That is, caffeine citrate is a therapeutic agent that is already used in other diseases and its safety is well established. Thus, caffeine citrate is an agent that has already been prescribed in insurance practice, and is therefore advantageous in early clinical applications compared to new agents.
  • the anticancer agent as an active ingredient of the cancer therapeutic agent of the present invention is preferably cisplatin, adriamycin (doxorubicin), ifosfamide or gemcitabine.
  • Cisplatin is an anticancer agent that inhibits DNA replication by binding to the N-7 position of guanine and adenine in DNA and forming a bridge in the DNA strand.
  • cisplatin a commercially available product can be used. For example, it is marketed by Nippon Kayaku Co., Ltd. under the trade name “IA Coal”.
  • Adriamycin is an anticancer agent that suppresses both DNA and RNA biosynthesis by intercalating between DNA base pairs of tumor cells and inhibiting DNA synthase and RNA synthase.
  • Commercially available adriamycin can be used. For example, it is commercially available from Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.
  • Ifosfamide is an anticancer agent that inhibits DNA replication by alkylating guanine in DNA and forming a bridge between DNA double strands.
  • a commercially available product can be used as ifosfamide.
  • it is marketed by Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd. under the trade name “Ihomide”.
  • Gemcitabine is an anticancer agent that induces apoptosis in DNA synthesis of tumor cells by incorporating it into the DNA strand in the same manner as cytidine having a similar structure and stopping DNA strand elongation.
  • a commercially available gemcitabine can be used.
  • it is marketed by Eli Lilly Japan Co., Ltd. under the trade name “Gemzar”.
  • Cisplatin is a platinum preparation, and the same platinum preparation such as carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin and the like is expected to have the same effect.
  • Doxorubicin is an anticancer antibiotic, and the same anticancer antibiotics such as actinomycin D, pirarubicin, daunorubicin and the like are expected to have the same effect.
  • Ifosfamide is an alkylating agent, and the same alkylating agent such as cyclophosphamide, busulfan, dacarbazine and the like is expected to have the same effect.
  • Gemcitabine is an antimetabolite and the same antimetabolite is expected to have the same effect. In addition to the above, similar effects are expected in all types of drugs that inhibit DNA synthesis including plant alkaloids such as vincristine and etoposide.
  • the target cancer types of the cancer therapeutic agent and cancer treatment method of the present invention are primary malignant bone tumor, soft tissue sarcoma, lung cancer, stomach cancer, breast cancer, uterine cancer, colon cancer, skin cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer or liver Examples include cell cancer.
  • the primary malignant bone tumor is not particularly limited, and examples thereof include osteosarcoma, chondrosarcoma, Ewing sarcoma, and bone undifferentiated pleomorphic sarcoma.
  • the soft tissue sarcoma is not particularly limited, and examples thereof include fibrosarcoma, synovial sarcoma, leiomyosarcoma, liposarcoma, rhabdomyosarcoma, undifferentiated pleomorphic sarcoma, extraosseous osteosarcoma, extraosseous Ewing sarcoma, and the like. Can be mentioned. Although it does not specifically limit as lung cancer, For example, non-small cell lung cancer, such as adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, and large cell cancer, small cell lung cancer, etc. are mentioned.
  • Uterine cancer is not particularly limited, and examples thereof include cervical cancer and endometrial cancer.
  • cancer Although it does not specifically limit as skin cancer, For example, malignant melanoma, basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma etc. are mentioned.
  • the cancer types mentioned in this specification also include all squamous cell carcinomas in organs and organs in which those cancers occur.
  • gastric cancer includes squamous cell carcinoma in the stomach.
  • the administration method of the cancer therapeutic agent of the present invention or the dosage and administration schedule in the cancer treatment method can be adjusted depending on the required amount for each individual treatment target, the treatment method, the disease or the degree of necessity.
  • the dosage can be determined according to age, weight, general health condition, sex, diet, administration time, administration method, excretion rate, combination of drugs, patient condition, etc. It may be determined in consideration of these factors. Although the following can be illustrated, it is not specifically limited.
  • (1) Single dose Caffeine citrate (total of administration for 3 days): 0.1 to 10000 mg / m 2 body surface area, preferably 1 to 10000 mg / m 2 body surface area, more preferably 50 to 9000 mg / m 2 body surface area
  • Anticancer agent Cisplatin (administered for 1 day) is 0.1 to 150 mg / m 2 body surface area, preferably 10 to 150 mg / m 2 body surface area, more preferably 60 to 120 mg / m.
  • Doxorubicin (total for 2 days administration) is 0.1 to 120 mg / m 2 body surface area, preferably 10 to 90 mg / m 2 body surface area, more preferably 30 to 60 mg / m 2 body surface area.
  • Ifosfamide (total for 3-5 days administration) is 0.1-30 mg / m 2 body surface area, preferably 1-20 mg / m 2 body surface area, more preferably 4.5-15 mg / m 2 body surface area.
  • Gemcitabine (administered one day) is, 0.1 ⁇ 1000 mg / m2 body surface area, preferably 10 ⁇ 900 mg / m 2 body surface area, more preferably 675 ⁇ 900 mg / m 2 body surface area.
  • (2) Administration interval Caffeine citrate: administration 1 to 70 times for 10 weeks, preferably 1 to 2 times for 2 days, more preferably once a day.
  • the composition is administered 1 to 10 times per day for 1 to 30 consecutive days with 1 course of 1 to 10 weeks, preferably 1 to 3 times daily for 1 to 15 days with 1 course of 1 to 6 weeks, More preferably, it is administered once a day for 3 to 7 consecutive days with 1 to 2 weeks as one course.
  • Anticancer agent administered once a week for 1 to 10 weeks, preferably administered once a week for 2 to 8 weeks, more preferably administered once a week for 3 to 6 weeks.
  • Concomitant administration Caffeine citrate and anticancer agent are administered simultaneously, administered several hours apart, administered one day apart, administered several days apart, several weeks apart Either administration after an interval or administration after an interval of several months may be used.
  • the caffeine citrate and the anticancer agent may be mixed with a physiologically acceptable solvent, carrier, excipient, binder, etc. to form a pharmaceutical composition, and then the composition may be administered to the patient.
  • the caffeine citrate and / or the anticancer agent in the present invention also includes prodrugs or pharmacologically acceptable salts thereof.
  • a solvent For example, water, alcohol, physiological saline, etc. are mentioned.
  • carrier For example, an acid, a base, a buffer solution, a stabilizer, an isotonizing agent, a preservative, etc. are mentioned.
  • filler For example, a filler, a coagulant, a slipping agent, a disintegrating agent, a pigment
  • the binder is not particularly limited. For example, water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl starch, methyl cellulose, ethyl cellulose, shellac, calcium phosphate, polyvinyl Examples include pyrrolidone and the like.
  • the separately formulated product may be mixed with a diluent at the time of use to make a mixture, and then the mixture may be administered to the patient.
  • a cancer therapeutic agent or the method for treating cancer according to the present invention it can be administered orally or parenterally.
  • known dosage forms for administration such as tablets, capsules, coated tablets, troches, solutions such as solutions or suspensions can be used.
  • Parenteral administration includes intravenous, intramuscular, or subcutaneous administration by injection, transmucosal administration such as nasal cavity or oral cavity using spray or aerosol, rectal administration using suppositories, patches or liniments. And transdermal administration using gel and gel.
  • Preferred examples include oral administration, nasal administration, and intravenous administration by injection.
  • ⁇ Material> -Cell line Human-derived HOS cells obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) were used as osteosarcoma.
  • human-derived HT1080 cells obtained from ATCC
  • human-derived RERF-LC-AI cells obtained from the National Institute for Science and Technology Bioresource Center (RIKEN BRC) via the National Bioresource Project of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology
  • RIKEN BRC National Institute for Science and Technology Bioresource Center
  • gastric cancer human-derived MKN45 cells (obtained from RIKEN BRC through the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's National BioResource Project) were used.
  • Cisplatin obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hereinafter sometimes referred to as CDDP
  • CDDP Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hereinafter sometimes referred to as CDDP
  • Concomitant drugs Caffeine citrate (Caffeine citrate, Nobel Pharma Co., Ltd., trade name: Respia (registered trademark), hereinafter may be referred to as cafCA)
  • cafCA Caffeine citrate
  • Caffeine citrate anhydrous caffeine
  • CA citric acid
  • HOS cells, RERF-LC-AI cells, and MKN45 cells are Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium
  • HT1080 cells are Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM).
  • the cells were cultured in a 96-well culture plate at a concentration of 3000 to 5000 cells / 100 ⁇ L, respectively, at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • the CDDP concentration of the drug added to each group is 0.125, 0.00 by dissolving a CDDP powder in water (sterilized and purified water) to prepare a high concentration, and then diluting with a culture solution according to the cells. Prepared to 25, 0.5, 1.0, 2.0 ⁇ M.
  • the concentrations of caf and CA, which are concomitant drugs in each group, were uniformly adjusted to 0.5 mM by dissolving powders in water and preparing high concentrations, respectively, and then diluting with a culture solution according to the cells. Since the product was a liquid, the concentration of cafCA was diluted as it was with a culture solution according to the cells and adjusted to 0.5 mM, which was the same as for caf and CA.
  • CDDP has the same amount and the same concentration before and after the combination.
  • CDDP when the CDDP concentration is 1.0 ⁇ M, the combination of CDDP (1.0 ⁇ M) + caf (0.5 ⁇ M) and CDDP (1.0 ⁇ M) + CA (0.5 ⁇ M) is CDDP (1.0 ⁇ M). ⁇ M) + cafCA (0.5 ⁇ M).
  • the CI by the Median Effect method is based on the “CDDP concentration (ED50) considered necessary for 50% cell survival” derived from the cell viability at each concentration, and the concentrations of caf, CA and cafCA. It is a numerical value calculated for the cell viability at that time.
  • the CI by the Isobologram method is a numerical value calculated using “Effective doses (ED50, ED75, ED90)” of CDDP + caf, CDDP + CA and CDDP + cafCA derived from the cell viability by each CDDP concentration.
  • CI ⁇ 1 the synergistic effect was determined.
  • CI 1, it is determined as an additive effect, and when CI> 1, it is determined as an antagonistic effect.
  • FIG. 1 shows the cell viability based on the 450 nm absorbance of four groups in HOS cells.
  • the CDDP + cafCA group had the lowest cell viability compared to the other groups at all CDDP concentrations.
  • the CDDP + cafCA group was significantly different from all other groups at each cisplatin concentration (p ⁇ 0.01). Therefore, it was confirmed that caffeine citrate enhances the anticancer drug effect of cisplatin when added in combination with cisplatin at all cisplatin concentrations of 0.125 to 2.0 ⁇ M.
  • Table 1 shows the analysis result of the synergistic effect in HOS cells by the Median Effect method.
  • CI which is an index of synergistic effect, was calculated based on the cell viability for each CDDP concentration in FIG. 1 as a combination of CDDP + caf and CDDP + CA as CDDP + cafCA.
  • a synergistic effect is observed when CI ⁇ 1.0.
  • the CDDP + cafCA group had a CI ⁇ 1.0 at all cisplatin concentrations of 0.125 to 2.0 ⁇ M, and a synergistic effect was observed for CDDP + caf and CDDP + CA.
  • FIG. 5 shows the analysis result of the synergistic effect in HOS cells by the Isobologram method.
  • FIGS. 5 to 8 if a circular broken line indicating each effective dose of CDDP + cafCA is on a curve connecting each effective dose of CDDP + caf and each effective dose of CDDP + CA An additive effect is shown, and if it is in the lower left of the curve, it shows a synergistic effect, and if it is in the upper right of the curve, it shows an antagonistic effect.
  • ED90 means the CDDP concentration required to reduce the cells by 90% (to bring the cell viability to 10%).
  • the circular broken lines indicating the effective doses of CDDP + cafCA are located at the lower left of the curves connecting the effective doses of CDDP + caf and CDDP + CA, a synergistic effect was recognized.
  • the CDDP + cafCA group had a CI ⁇ 1.0 at all effective doses of 50 to 90%, and a synergistic effect was observed for CDDP + caf and CDDP + CA.
  • Table 1 shows the analysis result of the synergistic effect in HT1080 cells by the Median Effect method.
  • CI which is an index of the synergistic effect, was calculated as a combination of CDDP + caf and CDDP + CA as CDDP + cafCA based on the cell viability for each CDDP concentration in FIG.
  • the CDDP + cafCA group had a CI ⁇ 1.0 at all cisplatin concentrations of 0.125 to 2.0 ⁇ M, and a synergistic effect was observed for CDDP + caf and CDDP + CA.
  • FIG. 6 shows the analysis result of the synergistic effect in HT1080 cells by the Isobologram method.
  • the circular broken lines indicating the effective doses of CDDP + cafCA are located at the lower left of the curves connecting the effective doses of CDDP + caf and CDDP + CA, a synergistic effect was recognized.
  • CI was less than 1 at all effective doses of 50 to 90%, and a synergistic effect was observed for CDDP + caf and CDDP + CA.
  • Table 1 shows the analysis results of the synergistic effect in RERF-LC-AI cells by the Median Effect method.
  • CI which is an index of synergistic effect, was calculated based on the cell viability for each CDDP concentration in FIG. 3 as a combination of CDDP + caf and CDDP + CA as CDDP + cafCA.
  • the CDDP + cafCA group had a CI ⁇ 1.0 at all cisplatin concentrations of 0.125 to 2.0 ⁇ M, and a synergistic effect was observed for CDDP + caf and CDDP + CA.
  • FIG. 7 shows the analysis result of the synergistic effect in RERF-LC-AI cells by the Isobologram method.
  • the circular broken lines indicating the effective doses of CDDP + cafCA are located at the lower left of the curves connecting the effective doses of CDDP + caf and CDDP + CA, a synergistic effect was recognized.
  • the CDDP + cafCA group had CI ⁇ 1 at all effective doses of 50 to 90%, and a synergistic effect was observed for CDDP + caf and CDDP + CA.
  • Table 1 shows the analysis results of the synergistic effect in MKN45 cells by the Median Effect method.
  • CI which is an index of synergistic effect, was calculated based on the cell viability for each CDDP concentration in FIG. 4 as the combination of CDDP + caf and CDDP + CA as CDDP + cafCA.
  • the CDDP + cafCA group had a CI ⁇ 1.0 at all cisplatin concentrations of 0.125 to 2.0 ⁇ M, and a synergistic effect was observed for CDDP + caf and CDDP + CA.
  • FIG. 8 shows the analysis result of the synergistic effect in MKN45 cells by the Isobologram method.
  • a circular broken line indicating each effective dose of CDDP + cafCA is located at the lower left of the curve connecting each effective dose of CDDP + caf and CDDP + CA, and thus a synergistic effect was recognized.
  • the CDDP + cafCA group had CI ⁇ 1 at all effective doses of 50 to 90%, and a synergistic effect was observed for CDDP + caf and CDDP + CA.
  • the combination of cisplatin and caffeine citrate is significantly more significant than cisplatin alone, cisplatin and anhydrous caffeine, and cisplatin and citric acid.
  • the anticancer agent enhancing effect of caffeine citrate is not just an additive effect of the anticancer agent enhancing effect of anhydrous caffeine and the anticancer agent enhancing effect of citric acid, It became clear that it was a synergistic effect.
  • ⁇ Material> -Cell line As hepatocellular carcinoma, human-derived HepG2 cells (obtained from RIKEN BRC through the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's National BioResource Project) were used. As uterine cancer, human-derived Hela cells (obtained from RIKEN BRC through the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's National BioResource Project) were used. As breast cancer, human-derived MCF7 cells (obtained from RIKEN BRC through the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's National BioResource Project) were used.
  • human-derived OVCAR-3 cells obtained from RIKEN BRC through the National BioResource Project of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology
  • medium The RPMI1640 medium was used for HepG2 cells, Hela cells, MCF7 cells, and OVCAR-3 cells for each of the above cancer type cultured cells.
  • FIGS. 11, 14, 17 and 20 show the analysis results of the synergistic effect in HepG2 cells, Hela cells, MCF7 cells and OVCAR-3 cells by the median effect method.
  • FIG. CI which is an index of synergistic effect, was calculated as a combination of CDDP + caf and CDDP + CA as CDDP + cafCA based on the cell viability for each CDDP concentration in FIG. 11, FIG. 14, FIG. 17 and FIG.
  • a synergistic effect is observed when CI ⁇ 1.0.
  • the CDDP + cafCA group has a CI ⁇ 1.0 at all cisplatin concentrations of 0.125 to 2.0 ⁇ M, with respect to CDDP + caf and CDDP + CA. A synergistic effect was observed.
  • ⁇ Material> Cell line Human-derived HOS cells (obtained from ATCC) were used as osteosarcoma.
  • human-derived HT1080 cells (obtained from ATCC) were used.
  • human-derived MKN45 cells (obtained from RIKEN BRC through the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's National BioResource Project) were used.
  • human-derived Hela cells (obtained from RIKEN BRC through the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's National BioResource Project) were used.
  • Anticancer agent Adriamycin (obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hereinafter sometimes referred to as ADM) was used.
  • RPMI1640 medium was used for HOS cell, MKN45 cell, and Hela cell.
  • DMEM was used for HT1080 cells.
  • ⁇ WST-8 assay> A test was performed according to the method of Example 1 except that the step (2) was changed as follows. (2) After culturing, each cancer type cultured cell was divided into four groups, and 100 ⁇ L of a drug (ADM, ADM + caf, ADM + CA, ADM + cafCA) was added. The ADM concentration of the drug added to each group is 12.5, 25, by dissolving the powder of ADM in water (sterilized purified water) to make a high concentration, and then diluting with a culture solution according to the cells. Prepared to 50, 100, 200 nM.
  • the concentrations of caf and CA which are concomitant drugs in each group, were uniformly adjusted to 0.5 mM by dissolving powders in water and preparing high concentrations, respectively, and then diluting with a culture solution according to the cells. Since the product was a liquid, the concentration of cafCA was diluted as it was with a culture solution according to the cells and adjusted to 0.5 mM, which was the same as for caf and CA. As a control, no drug was added to some wells (ADM concentration 0 ⁇ M).
  • FIGS. 22, 25, 28 and 31 show cell survival based on absorbance at 450 nm of four groups (ADM, ADM + caf, ADM + CA, ADM + cafCA) in HOS cells, HT1080 cells, MKN45 cells and Hela cells, respectively. Indicates the rate.
  • ADM + cafCA group is all The cell viability was lowest at the ADM concentration compared to the other groups.
  • the ADM + cafCA group was significantly different from all other groups in each adriamycin concentration (p ⁇ 0.01). Therefore, it was confirmed that caffeine citrate enhances the anticancer drug effect of adriamycin when added in combination with adriamycin at all adriamycin concentrations of 12.5 to 200 nM.
  • FIG. 23, FIG. 26, FIG. 29, and FIG. 32 show the analysis results of the synergistic effect in HOS cells, HT1080 cells, MKN45 cells, and Hela cells by the Median Effect method.
  • CI which is an index of synergistic effect, was calculated as a combination of ADM + caf and ADM + CA as ADM + cafCA based on the cell viability for each ADM concentration in FIGS. 23, 26, 29, and 32.
  • a synergistic effect is observed when CI ⁇ 1.0. As is apparent from FIGS.
  • the ADM + cafCA group has a CI ⁇ 1.0 at all adriamycin concentrations of 12.5 to 200 nM, and has a synergistic effect on ADM + caf and ADM + CA. was recognized.
  • FIGS. 24, 27, 30 and 33 show analysis results of synergistic effects in HOS cells, HT1080 cells, MKN45 cells and Hela cells by the Isobologram method.
  • the circular broken lines indicating the effective doses of ADM + cafCA are located on the lower left side of the curves connecting the effective doses of ADM + caf and ADM + CA, respectively. Therefore, a synergistic effect was recognized.
  • the ADM + cafCA group has a CI ⁇ 1.0 at all effective doses of 50 to 90%, and has a synergistic effect on ADM + caf and ADM + CA. was recognized.
  • the combination of adriamycin and caffeine citrate is significantly more significant than the combination of adriamycin alone, the combination of adriamycin and anhydrous caffeine, and the combination of adriamycin and citric acid.
  • the anticancer drug potentiating effect of caffeine citrate is not just an additive effect of the anticancer drug potentiating effect of anhydrous caffeine and the anticancer drug potentiating effect of citric acid, It became clear that it was a synergistic effect.
  • ⁇ Material> Cell line Human-derived HOS cells (obtained from ATCC) were used as osteosarcoma.
  • human-derived MKN45 cells (obtained from RIKEN BRC through the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's National BioResource Project) were used.
  • human-derived OVCAR-3 cells (obtained from RIKEN BRC through the National BioResource Project of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology) were used.
  • Anticancer agent Gemcitabine (obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hereinafter sometimes referred to as GEM) was used.
  • GEM Anticancer agent Gemcitabine
  • ⁇ WST-8 assay> A test was performed according to the method of Example 1 except that the step (2) was changed as follows. (2) After the culture, each cancer type cultured cell was divided into four groups, and 100 ⁇ L of a drug (GEM, GEM + caf, GEM + CA, GEM + cafCA) was added. The GEM concentration of the drug added to each group is 0.5, 1 by dissolving the GEM powder in water (sterilized purified water) to make a high concentration, and then diluting with a culture solution according to the cells. Prepared to 2, 4, 8 nM.
  • a drug GEM, GEM + caf, GEM + CA, GEM + cafCA
  • the concentrations of caf and CA which are concomitant drugs in each group, were uniformly adjusted to 0.5 mM by dissolving powders in water and preparing high concentrations, respectively, and then diluting with a culture solution according to the cells. Since the product was a liquid, the concentration of cafCA was diluted as it was with a culture solution according to the cells and adjusted to 0.5 mM, which was the same as for caf and CA. As a control, no drug was added to some wells (GEM concentration 0 ⁇ M).
  • FIG. 34, FIG. 37 and FIG. 40 show the cell viability based on the absorbance at 450 nm of the four groups (GEM, GEM + caf, GEM + CA, GEM + cafCA) in HOS cells, MKN45 cells and OVCAR-3 cells, respectively.
  • GEM GEM + caf
  • GEM + CA GEM + cafCA
  • MKN45 cells gastric cancer
  • OVCAR-3 cells ovarian cancer
  • FIG. 35, FIG. 38 and FIG. 41 show the analysis results of synergistic effects in HOS cells, MKN45 cells and OVCAR-3 by the Median Effect method.
  • CI which is an index of the synergistic effect, was calculated as a combination of GEM + caf and GEM + CA as GEM + cafCA based on the cell viability for each GEM concentration in FIG. 35, FIG. 38 and FIG.
  • a synergistic effect is observed when CI ⁇ 1.0.
  • the GEM + cafCA group has a CI ⁇ 1.0 at all gemcitabine concentrations from 0.5 to 8.0 nM, and has a synergistic effect on GEM + caf and GEM + CA. Admitted.
  • the combination of gemcitabine and caffeine citrate is significantly more significant than the combination of gemcitabine alone, the combination of gemcitabine and anhydrous caffeine, or the combination of gemcitabine and citric acid.
  • the anticancer agent enhancing effect of caffeine citrate is not just an additive effect of the anticancer agent enhancing effect of anhydrous caffeine and the anticancer agent enhancing effect of citric acid, It became clear that it was a synergistic effect.
  • ⁇ Material> Cell line Human-derived HOS cells (obtained from ATCC) were used as osteosarcoma. As the soft tissue sarcoma, human-derived HT1080 cells (obtained from ATCC) were used. -The anticancer agent cisplatin (available from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. -Concomitant drugs Caffeine citrate (cafCA, citrate caffeine, obtained from Nobel Pharma Co., Ltd.), anhydrous caffeine (caf, obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or citric acid (CA, Wako Pure Chemical Industries Ltd.) Obtained from the company). -Medium HMI cells used RPMI1640 medium, and HT1080 cells used DMEM.
  • EdU Cell proliferation (EdU) assay>
  • EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) is a nucleoside analog (analog) of thymidine that is incorporated into DNA during active DNA synthesis. That is, by detecting EdU, proliferating cells in which active DNA synthesis is occurring can be detected. Therefore, in this experiment, by detecting EdU according to the following procedure, the change in cell growth ability due to drug administration was confirmed, and the enhancement of the cell growth inhibitory effect by CDDP + cafCA was examined.
  • each cancer type cultured cell was divided into five groups (Non-drug, CDDP, CDDP + caf, CDDP + CA, CDDP + cafCA), and the culture solution was replaced. Add 0.5 mL of culture solution to the non-drug group, and add 0.5 mL of culture solution adjusted so that CDDP is 0.25 ⁇ M, caf, CA, and cafCA are 0.5 mM for the drug administration group.
  • the CDDP concentration of the drug to be added to each group is adjusted to 0.25 ⁇ M by dissolving CDDP powder in water (sterilized purified water) to make a high concentration, and then diluting with a culture solution suitable for the cells. did.
  • the concentrations of caf and CA, which are concomitant drugs in each group were uniformly adjusted to 0.5 mM by dissolving powders in water and preparing high concentrations, respectively, and then diluting with a culture solution according to the cells. Since the product was a liquid, the concentration of cafCA was diluted as it was with a culture solution according to the cells and adjusted to 0.5 mM, which was the same as for caf and CA.
  • the filter for illuminating Hoechst was DAPI (excitation wavelength: 360 ⁇ 40 nm, dichroic mirror wavelength: 400 nm, absorption wavelength: 460 ⁇ 50 nm), EdU TRITC (excitation wavelength: 540 ⁇ 25 nm, dichroic mirror wavelength: 565 nm, absorption wavelength: 605 ⁇ 55 nm) was used as a filter for illuminating, and five fixed points of each field were photographed. Hoechst and EdU were detected. It can be said that as the EdU detection signal is smaller (weaker) compared to Non-drug, cell proliferation is suppressed.
  • EdU color development rate DNA synthetic cell number (EdU detected cell number) / cell total number (Hoechst detected cell number). Calculate the average value of the EdU color development rate for each group of 5 fields of view, and use the statcel 3 (OMS Publishing Co., Ltd.) to calculate the difference in the EdU color development rate for each group from the ratio where the non-drug average value is 1. analyzed.
  • HOS cells and HT1080 cells are shown in FIGS. 43 and 44, respectively.
  • the CDDP + cafCA group had the smallest ratio of the EdU detected cells to the Hoechst detected cells compared to the other groups. That is, in the CDDP + cafCA group, cell growth of HOS cells (osteosarcoma) was most suppressed as compared with other groups.
  • the CDDP + cafCA group had the lowest ratio of the EdU detection signal to the Hoechst detection signal compared to the other groups.
  • the CDDP + cafCA group most suppressed the cell growth of HT1080 cells (soft tissue sarcoma) as compared with the other groups.
  • the analysis result of the significant difference of the EdU coloring rate of each group in HOS cell and HT1080 cell is shown in FIG.
  • the CDDP + cafCA group was significantly different from all other groups in HOS cells and HT1080 cells (p ⁇ 0.01).
  • the EdU color development rate of the CDDP + cafCA group was about 51% compared to the Non-Drug group, about 58% compared to the CDDP group, about 66% compared to the CDDP + caf group, and compared to the CDDP + CA group. About 61%.
  • the EdU color development rate of the CDDP + cafCA group is about 51% compared to the Non-Drug group, about 56% compared to the CDDP group, about 72% compared to the CDDP + caf group, and compared to the CDDP + CA group. It was about 57%, which was greatly reduced. Therefore, it was confirmed that caffeine citrate enhances the cell growth inhibitory effect of cisplatin when added in combination with cisplatin in osteosarcoma and soft tissue sarcoma.
  • the combination of cisplatin and caffeine citrate is cisplatin alone, cisplatin and anhydrous caffeine, cisplatin and citric acid in osteosarcoma and soft tissue sarcoma. Compared with the combination, it was found that the cell growth inhibitory effect of cisplatin was significantly enhanced.
  • ⁇ Material> Cell line Human-derived HOS cells (obtained from ATCC) were used as osteosarcoma. As the soft tissue sarcoma, human-derived HT1080 cells (obtained from ATCC) were used. -The anticancer agent cisplatin (available from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. -Concomitant drugs Caffeine citrate (cafCA, citrate caffeine, obtained from Nobel Pharma Co., Ltd.), anhydrous caffeine (caf, obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or citric acid (CA, Wako Pure Chemical Industries Ltd.) Obtained from the company). -Medium HMI cells used RPMI1640 medium, and HT1080 cells used DMEM.
  • TMRE mitochondrial membrane potential change
  • each cancer type cultured cell was divided into five groups (Non-drug, CDDP, CDDP + caf, CDDP + CA, CDDP + cafCA), and the culture solution was replaced. Add 0.5 mL of culture solution to the non-drug group, and add 0.5 mL of culture solution adjusted so that CDDP is 0.25 ⁇ M, caf, CA, and cafCA are 0.5 mM for the drug administration group.
  • the CDDP concentration of the drug to be added to each group is adjusted to 0.25 ⁇ M by dissolving CDDP powder in water (sterilized purified water) to make a high concentration, and then diluting with a culture solution suitable for the cells. did.
  • the concentrations of caf and CA, which are concomitant drugs in each group were uniformly adjusted to 0.5 mM by dissolving powders in water and preparing high concentrations, respectively, and then diluting with a culture solution according to the cells. Since the product was a liquid, the concentration of cafCA was diluted as it was with a culture solution according to the cells and adjusted to 0.5 mM, which was the same as for caf and CA.
  • a filter for illuminating Hoechst with a fluorescence microscope (BIOREVO: BZ-9000, KEYENCE) emits TMRE with DAPI (excitation wavelength: 360 ⁇ 40 nm, dichroic mirror wavelength: 400 nm, absorption wavelength: 460 ⁇ 50 nm).
  • DAPI excitation wavelength: 360 ⁇ 40 nm, dichroic mirror wavelength: 400 nm, absorption wavelength: 460 ⁇ 50 nm.
  • TRITC excitation wavelength: 540 ⁇ 25 nm, dichroic mirror wavelength: 565 nm, absorption wavelength: 605 ⁇ 55 nm
  • Detection of Hoechst and TMRE was performed. It can be said that apoptosis is induced as the TMRE detection signal becomes weaker compared to Non-drug.
  • TMRE luminance per cell TMRE luminance (detection signal intensity) sum / cell total number (Hoechst detection cell number).
  • TMRE luminance per cell TMRE luminance (detection signal intensity) sum / cell total number (Hoechst detection cell number).
  • the average value of TMRE luminance per cell in each group of 5 visual fields was calculated, and the TMRE per cell of each group was calculated using Statcel 3 (OMS Publishing) from the ratio where the average value of Non-drug was 1. Analysis of variance was performed for significant differences in luminance.
  • the CDDP + cafCA group had the weakest TMRE detection signal intensity with respect to the number of Hoechst detected cells as compared with the other groups. That is, the CDDP + cafCA group was confirmed to be most likely to induce apoptosis of HT1080 cells (soft tissue sarcoma) compared to other groups.
  • luminance per cell of each group in HOS cell and HT1080 cell is shown in FIG. As is clear from FIG. 48, the CDDP + cafCA group was significantly different from all other groups in HOS cells and HT1080 cells (p ⁇ 0.05 or p ⁇ 0.01).
  • the TMRE luminance per cell of the CDDP + cafCA group is about 51% compared to the Non-Drug group, about 65% compared to the CDDP group, about 77% compared to the CDDP + caf group, CDDP + CA Compared with the group, it was about 71%, which was greatly reduced.
  • the TMRE brightness per cell in the CDDP + cafCA group is about 35% compared to the Non-Drug group, about 38% compared to the CDDP group, about 57% compared to the CDDP + caf group, and the CDDP + CA group Compared to about 52%, it was greatly reduced.
  • caffeine citrate was added in combination with cisplatin in osteosarcoma and soft tissue sarcoma, whereby the mitochondrial membrane potential was attenuated / disappeared and the apoptosis-inducing effect of cisplatin could be enhanced.
  • the combination of cisplatin and caffeine folate is cisplatin alone, cisplatin and anhydrous caffeine, cisplatin and citric acid in osteosarcoma and soft tissue sarcoma. Compared with the combination, the possibility of significantly enhancing the apoptosis-inducing effect of cisplatin was confirmed.
  • ⁇ Material> -Cell line Human skin A375 cells (obtained from DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) were used as skin cancer.
  • human-derived PANC-1 cells obtained from RIKEN BRC through the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's National BioResource Project
  • human-derived TFK-1 cells obtained from RIKEN BRC through the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's National BioResource Project
  • Medium The RPMI1640 medium was used for all A375 cells, PANC-1 cells, and TFK-1 cells for each of the above cancer type cultured cells.
  • FIG. 49, FIG. 50 and FIG. 51 show the cell viability based on the absorbance at 450 nm of four groups (CDDP, CDDP + caf, CDDP + CA, CDDP + cafCA) in A375 cells, PANC-1 cells and TFK-1 cells, respectively. Show. As is clear from FIG. 49, FIG. 50 and FIG. 51, in A375 cells (skin cancer), PANC-1 cells (pancreatic cancer) and TFK-1 cells (bile duct cancer), the CDDP + cafCA group is the other at all CDDP concentrations. The cell viability was the lowest as compared with the group.
  • Isobologram method The synergistic effect in A375 cells, PANC-1 cells and TFK-1 cells was analyzed by the Isobologram method (not shown). Similar to Example 1, since the circular broken lines indicating the effective doses of CDDP + cafCA are located at the lower left of the curves connecting the effective doses of CDDP + caf and CDDP + CA, a synergistic effect was recognized. In the CDDP + cafCA group, CI was less than 1.0 at all effective doses of 50 to 90%, and a synergistic effect was observed for CDDP + caf and CDDP + CA.
  • ⁇ Material> -Cell line As soft tissue sarcoma, human-derived HT1080 cells (obtained from ATCC) were used. As skin cancer, human-derived A375 cells (obtained from DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) were used. As pancreatic cancer, human-derived PANC-1 cells (obtained from RIKEN BRC through the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's National BioResource Project) were used. As bile duct cancer, human-derived TFK-1 cells (obtained from RIKEN BRC through the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's National BioResource Project) were used. -Medium For each of the above cancer type cultured cells, DMEM was used for HT1080 cells, and RPMI1640 medium was used for all A375 cells, PANC-1 cells, and TFK-1 cells.
  • FIGS. 52, 53, 54 and 55 show the absorbance at 450 nm of four groups (GEM, GEM + caf, GEM + CA, GEM + cafCA) in HT1080 cells, A375 cells, PANC-1 cells and TFK-1 cells, respectively. The cell viability based on is shown. As is apparent from FIGS. 52, 53, 54 and 55, HT1080 cells (soft tissue sarcoma (fibrosarcoma)), A375 cells (skin cancer), PANC-1 cells (pancreatic cancer) and TFK-1 cells (bile duct cancer) ), The GEM + cafCA group had the lowest cell viability compared to the other groups at all gemcitabine concentrations. As a result of analysis of variance, the GEM + cafCA group was significantly different from all other groups (p ⁇ 0.01). Therefore, it was confirmed that caffeine citrate enhances the anticancer drug effect of gemcitabine when added in combination with gemcitabine.
  • CI which is an index of the synergistic effect
  • GEM + cafCA based on the cell viability for each GEM concentration as in Example 1, based on the combination of GEM + caf and GEM + CA.
  • a synergistic effect is observed when CI ⁇ 1.0.
  • CI ⁇ 1.0 at all gemcitabine concentrations from 0.125 to 2.0 ⁇ M and a synergistic effect was observed for GEM + caf and GEM + CA.
  • Isobologram method The synergistic effect in HT1080 cells, A375 cells, PANC-1 cells and TFK-1 cells was analyzed by the Isobologram method (not shown). As in Example 1, a circular broken line indicating each GEM + cafCA Effective Dose is located at the lower left of the curve connecting each GEM + caf and GEM + CA Effective Dose, and thus a synergistic effect was recognized. In the GEM + cafCA group, CI ⁇ 1.0 was obtained at all effective doses of 50 to 90%, and a synergistic effect was observed for GEM + caf and GEM + CA.
  • Caffeine citrate (cafCA, citrate caffeine, obtained from Nobel Pharma Co., Ltd.), anhydrous caffeine (caf, obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or citric acid (CA, Wako Pure Chemical Industries Ltd.) Obtained from the company).
  • -Medium LM8 cells used RPMI1640 medium, and HT1080 cells used DMEM.
  • ⁇ Evaluation method (1) Evaluation system in nude mice transplanted subcutaneously on the back of mice with LM8 cells (5 ⁇ 10 5 cells) derived from mice According to the schedule shown in Table 2 and FIG. The anticancer drug efficacy enhancement of was evaluated. (2) Evaluation system in nude mice transplanted with human-derived HT1080 cells (5 ⁇ 10 5 cells) subcutaneously on the back caffeine citrate in mice carrying cancer cells according to the schedule shown in Table 2 below and FIG. The anticancer drug efficacy enhancement of was evaluated. (3) Evaluation system in nude mice in which LM8 cells (5 ⁇ 10 5 cells) derived from mice characterized by low doses of caffeine citrate were subcutaneously implanted in the back, according to the schedule in Table 3 below and FIG.
  • FIGS. 57 and 58 show the results of an evaluation system using nude mice transplanted with mouse-derived LM8 cells subcutaneously on the back.
  • the results of the evaluation system in nude mice transplanted with human-derived HT1080 cells subcutaneously in the back are shown in FIG. 59 and FIG. 61 and 62 show the results of the evaluation system in nude mice in which LM8 cells derived from mice characterized by low doses of caffeine citrate are transplanted subcutaneously in the back.
  • FIG. 63 and FIG. 64 show the results of the evaluation system in nude mice in which LM8 cells derived from mice characterized by low doses of anticancer agents were transplanted subcutaneously in the back.
  • the CDDP + cafCA group suppressed tumor growth (volume and weight) very strongly compared to the other groups.
  • the CDDP + cafCA group suppressed tumor growth (volume and weight) very strongly compared to the other groups. From the above results, it was confirmed that the anticancer agent (caffeine citrate) and the treatment method of the present invention have an anticancer agent enhancing effect even in an in vitro evaluation system.
  • ADM can cause adverse events of myocardial injury. Therefore, the damage of cardiomyocytes caused by the cancer therapeutic agent containing the ADM of the present invention was evaluated by an in vitro WST-8 assay. In this Example, the decrease in the number of viable cells of cardiomyocytes was equivalent to ADM + caf, ADM + CA, and ADM + cafCA, respectively, with ADM alone.
  • the cancer therapeutic agent and cancer treatment method of the present invention have the following advantageous effects.
  • the anticancer agent enhancement effect of caffeine citrate is not a mere additive effect of the anticancer agent enhancement effect of anhydrous caffeine and the anticancer agent enhancement effect of citric acid, but a synergistic effect.
  • the combination of adriamycin and caffeine citrate significantly enhances the anticancer drug effect of adriamycin, compared to adriamycin alone, a combination of adriamycin and anhydrous caffeine, and a combination of adriamycin and citric acid.
  • the anticancer agent enhancement effect of caffeine citrate is not a mere additive effect of the anticancer agent enhancement effect of anhydrous caffeine and the anticancer agent enhancement effect of citric acid, but a synergistic effect.
  • the combination of gemcitabine and caffeine citrate significantly enhances the anticancer drug effect of gemcitabine compared to gemcitabine alone, a combination of gemcitabine and anhydrous caffeine, or a combination of gemcitabine and citric acid .
  • the anticancer agent enhancement effect of caffeine citrate is not a mere additive effect of the anticancer agent enhancement effect of anhydrous caffeine and the anticancer agent enhancement effect of citric acid, but a synergistic effect.
  • the combination of cisplatin and caffeine citrate is significantly more effective in osteosarcoma and soft tissue sarcoma than cisplatin alone, cisplatin and anhydrous caffeine, and cisplatin and citric acid. To further enhance the cell growth inhibitory effect.

Abstract

本発明は、有効成分であるカフェインクエン酸塩を、有効成分である抗癌剤と組み合わせたことを特徴とする癌治療剤を提供することを目的とする。特に、抗癌剤として、シスプラチン、ゲムシタビン又はアドリアマイシンを有効成分とする癌治療剤が提供される。

Description

癌治療剤
　本発明は、有効成分であるカフェインクエン酸塩を、有効成分である抗癌剤と組み合わせたことを特徴とする癌治療剤及び癌治療方法に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本特願2016-203793号及び日本特願2017-061056号の優先権を請求する。
（骨肉腫）
　骨肉腫は、主に10歳代若年者に好発する原発生悪性骨腫瘍として最も頻度の高いものであるが、発生原因は不明である。日本における発生頻度は100万人に対して1人の発生率（1年間に130人から260人）といわれている。かつて切断術が唯一の治療選択肢であった時代、骨肉腫の2年生存率は15～20%であり、非常に予後の悪い疾患であった。
　しかし、化学療法の導入・進歩や画像診断及び手術療法の発達に伴い、現在では5年生存率が70%以上に向上している（非特許文献１）。本発明者らは、「カフェイン併用化学療法」を開示している。この療法により、初診時に転移のない治療完遂例では、5年生存率は89%と飛躍的に向上したが、依然として予後の改善が不十分であるため、更なる治療効果の向上が必要である（非特許文献２）。また、再発例や初診時より転移を認めている例では、5年生存率は10～30％であり、これは過去40年間、顕著な改善はされておらず、この点においても更なる治療効果の向上が必要であると考える（非特許文献３）。
（軟部肉腫）
　軟部肉腫は、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫等の様々な分類がある。それぞれが違う性質を有しており、希少性は非常に高い。骨外性Ewing肉腫、横紋筋肉腫を除いた非小円形細胞肉腫において、四肢発生で病期IIIに限ると、手術単独での10年生存率が35%程度と報告されている（非特許文献４）。さらに、高悪性度軟部肉腫進行例に対する化学療法の効果に関しては、奏効率で30～40%と報告されており、軟部肉腫は骨肉腫と比較して、さらに予後の改善に難渋する疾患である（非特許文献５～７）。
　軟部肉腫の現在の標準的治療方法は、悪性度、腫瘍の種類及び患者の状態にもよるが、術前化学療法と手術（広範切除術）と術後化学療法との組合せを基本とする。前記の化学療法とは、シスプラチン及びドキソルビシン等を使用した多剤併用化学療法である。
　先に述べた通り、当該治療方法は、治療効果が十分なものとは言えないが、軟部肉腫の希少性の高さゆえ、新規薬剤の開発が進みにくいといった問題点がある。
　以上の通り、様々な癌種に効果を発揮し、従来の化学療法よりも強力な治療効果を有する新たな治療剤が望まれていた。
N Engl J Med 1986; 314: 1600-6. Anticancer Res 1999; 18(1B): 657-66. Cancer Treat Rev 2014; 40: 523-32. Semin Radiat Oncol 1999; 9: 349-51. Am J Clin Oncol 1988; 11: 39-45. Eur J Cancer Clin Oncol 1987; 23: 311-21. Hematol Oncol Clin North Am 1995; 9: 765-85.
　本発明は、様々な癌種において、従来の化学療法よりも強力な治療効果を有する癌治療剤及び癌治療方法を提供することを課題とする。
　本発明者等は、上記課題を解決すべく、抗癌剤と組み合わせることで抗癌剤の治療効果を増強できる薬剤を鋭意検討した結果、「カフェインクエン酸塩と抗癌剤との組み合わせが、抗癌剤の治療効果を相乗的に高めること」を見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下からなる。
　１．有効成分であるカフェインクエン酸塩を、有効成分である抗癌剤と組み合わせたことを特徴とする癌治療剤。
　２．前記癌は、原発生悪性骨腫瘍、軟部肉腫、肺癌、胃癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、皮膚癌、卵巣癌、膵癌、胆管癌又は肝細胞癌である、前項１に記載の癌治療剤。
　３．前記抗癌剤が、シスプラチン、ゲムシタビン又はアドリアマイシンである前項１又は前項２に記載の癌治療剤。
　４．前記癌は、骨肉腫である、前項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
　５．前記癌は、軟部肉腫である、前項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
　６．前記癌は、肺癌である、前項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
　７．前記癌は、膵癌である、前項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
　８．前記癌は、胃癌である、前項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
　９．前記癌は、肝細胞癌である、前項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
　１０．前記癌は、子宮癌である、前項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
　１１．前記癌は、乳癌である、前項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
　１２．前記癌は、卵巣癌である、前項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
　１３．前記癌は、皮膚癌である、前項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
　１４．前記癌は、胆管癌である、前項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
　１５．有効成分であるカフェインクエン酸塩と有効成分である抗癌剤を癌患者に投与することを特徴とする癌治療方法。
　１６．前記癌患者は、原発生悪性骨腫瘍、軟部肉腫、肺癌、胃癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、皮膚癌、卵巣癌、膵癌、胆管癌又は肝細胞癌患者である、前項１５に記載の癌治療方法。
　１７．前記抗癌剤が、シスプラチン、アドリアマイシン又はゲムシタビンである前項１５又は前項１６に記載の癌治療方法。
　本発明の癌治療剤は、少なくとも、カフェインクエン酸塩を、抗癌剤と組み合わせることにより、抗癌剤の治療効果を相乗的に増強できる相乗効果を有する。
実施例１における骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。縦軸は細胞生存率（ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、横軸はシスプラチン濃度（ＣＤＤＰ濃度）を示す。菱形（◆）はシスプラチン（ＣＤＤＰ）単独、黒の正方形（■）はシスプラチン＋無水カフェイン（ＣＤＤＰ＋ｃａｆ）、灰色の正方形はシスプラチン＋クエン酸（ＣＤＤＰ＋ＣＡ）、丸はシスプラチン＋カフェインクエン酸塩（ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ）を示す。ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、各シスプラチン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。 実施例１における軟部肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。縦軸は細胞生存率、横軸はシスプラチン濃度を示す。菱形（◆）はＣＤＤＰ単独、黒の正方形（■）はＣＤＤＰ＋ｃａｆ、灰色の正方形はＣＤＤＰ＋ＣＡ、丸はＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡを示す。ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、各シスプラチン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。 実施例１における肺癌細胞株（ＲＥＲＦ－ＬＣ－ＡＩ）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。縦軸は細胞生存率、横軸はシスプラチン濃度を示す。菱形（◆）はＣＤＤＰ単独、黒の正方形（■）はＣＤＤＰ＋ｃａｆ、灰色の正方形はＣＤＤＰ＋ＣＡ、丸はＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡを示す。ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、各シスプラチン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。 実施例１における胃癌細胞株（ＭＫＮ４５）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。縦軸は細胞生存率、横軸はシスプラチン濃度を示す。菱形（◆）はＣＤＤＰ単独、黒の正方形（■）はＣＤＤＰ＋ｃａｆ、灰色の正方形はＣＤＤＰ＋ＣＡ、丸はＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡを示す。ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、各シスプラチン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。 実施例１における骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。図中のグラフにおいて、縦軸はＣＤＤＰ＋ｃａｆのＣＤＤＰ濃度（μＭ）を示し、横軸はＣＤＤＰ＋ＣＡのＣＤＤＰ濃度（μＭ）を示す。×は、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ５０（ＥＤ５０）を示し、＋は、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ７５（ＥＤ７５）を示し、●は、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ９０（ＥＤ９０）を示す。縦軸上の×、＋及び●は、ＣＤＤＰ＋ｃａｆの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを、横軸上の×、＋及び●は、ＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示し、円形の破線に囲まれた×、＋及び●は、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す。当該円形の破線（ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ）が、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置する場合は、相乗効果が認められる。図中の表において、相乗効果の指標であるＣＩ（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ）は、前述のグラフに示されたＣＤＤＰ＋ｃａｆの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ、ＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ及びＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを用いて、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡのコンビネーションをＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡとして算出した。ＣＩ＜１．０のとき、相乗効果が認められる。 実施例１における軟部肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。図中のグラフにおいて、縦軸はＣＤＤＰ＋ｃａｆのＣＤＤＰ濃度（μＭ）を示し、横軸はＣＤＤＰ＋ＣＡのＣＤＤＰ濃度（μＭ）を示す。×はＥＤ５０を示し、＋はＥＤ７５を示し、●はＥＤ９０を示す。縦軸上の×、＋及び●は、ＣＤＤＰ＋ｃａｆの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを、横軸上の×、＋及び●は、ＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示し、円形の破線に囲まれた×、＋及び●は、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す。当該円形の破線（ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ）が、各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置する場合は、相乗効果が認められる。図中の表において、ＣＩは、前述のグラフに示されたＣＤＤＰ＋ｃａｆの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ、ＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ及びＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを用いて、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡのコンビネーションをＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡとして算出した。ＣＩ＜１．０のとき、相乗効果が認められる。 実施例１における肺癌細胞株（ＲＥＲＦ－ＬＣ－ＡＩ）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。図中のグラフにおいて、縦軸はＣＤＤＰ＋ｃａｆのＣＤＤＰ濃度（μＭ）を示し、横軸はＣＤＤＰ＋ＣＡのＣＤＤＰ濃度（μＭ）を示す。×はＥＤ５０を示し、＋はＥＤ７５を示し、●はＥＤ９０を示す。縦軸上の×、＋及び●は、ＣＤＤＰ＋ｃａｆの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを、横軸上の×、＋及び●は、ＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示し、円形の破線に囲まれた×、＋及び●は、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す。当該円形の破線（ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ）が、各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置する場合は、相乗効果が認められる。図中の表において、ＣＩは、前述のグラフに示されたＣＤＤＰ＋ｃａｆの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ、ＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ及びＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを用いて、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡのコンビネーションをＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡとして算出した。ＣＩ＜１．０のとき、相乗効果が認められる。 実施例１における胃癌細胞株（ＭＫＮ４５）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。図中のグラフにおいて、縦軸はＣＤＤＰ＋ｃａｆのＣＤＤＰ濃度（μＭ）を示し、横軸はＣＤＤＰ＋ＣＡのＣＤＤＰ濃度（μＭ）を示す。×はＥＤ５０を示し、＋はＥＤ７５を示し、●はＥＤ９０を示す。縦軸上の×、＋及び●は、ＣＤＤＰ＋ｃａｆの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを、横軸上の×、＋及び●は、ＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示し、円形の破線に囲まれた×、＋及び●は、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す。当該円形の破線（ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ）が、各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置する場合は、相乗効果が認められる。図中の表において、ＣＩは、前述のグラフに示されたＣＤＤＰ＋ｃａｆの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ、ＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ及びＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを用いて、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡのコンビネーションをＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡとして算出した。ＣＩ＜１．０のとき、相乗効果が認められる。 実施例１における骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）、軟部肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）、肺癌細胞株（ＲＥＲＦ－ＬＣ－ＡＩ）及び胃癌細胞株（ＭＫＮ４５）のＷＳＴ－８アッセイの結果をＭｅｄｉａｎ　ｅｆｆｅｃｔ法及びＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果をまとめた図。図中に示した通り、ＣＩ（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ）＜１．０のとき相乗効果、ＣＩ＝１．０のとき相加効果、ＣＩ＞１．０のとき拮抗作用であることを示す。図中、各系列において、バーは、左からＨＯＳ、ＨＴ１０８０、ＲＥＲＦ－ＬＣ－ＡＩ、ＭＫＮ４５の順で示している。 実施例２における肝細胞癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。グラフの見方は図１と同様である。 実施例２におけるＭｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法による肝細胞癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いた相乗効果の解析結果。 実施例２における肝細胞癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。グラフ及び表の見方は図５と同様である。 実施例２における子宮癌細胞株（Ｈｅｌａ）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。グラフの見方は図１と同様である。 実施例２におけるＭｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法による子宮癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いた相乗効果の解析結果。 実施例２における子宮癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。グラフ及び表の見方は図５と同様である。 実施例２における乳癌細胞株（ＭＣＦ７）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。グラフの見方は図１と同様である。 実施例２におけるＭｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法による乳癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いた相乗効果の解析結果。 実施例２における乳癌細胞株（ＭＣＦ７）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。グラフ及び表の見方は図５と同様である。 実施例２における卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ－３）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。グラフの見方は図１と同様である。 実施例２におけるＭｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法による卵巣癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いた相乗効果の解析結果。 実施例２における卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ－３）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。グラフ及び表の見方は図５と同様である。 実施例３における骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。縦軸は細胞生存率（ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、横軸はアドリアマイシン濃度（ＡＤＭ濃度）を示す。菱形（◆）はアドリアマイシン（ＡＤＭ）単独、黒の正方形（■）はアドリアマイシン＋無水カフェイン（ＡＤＭ＋ｃａｆ）、灰色の正方形はアドリアマイシン＋クエン酸（ＡＤＭ＋ＣＡ）、丸はアドリアマイシン＋カフェインクエン酸塩（ＡＤＭ＋ｃａｆＣＡ）を示す。ＡＤＭ＋ｃａｆＣＡ群は、各アドリアマイシン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。 実施例３におけるＭｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法による骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）を用いた相乗効果の解析結果。 実施例３における骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。図中のグラフにおいて、縦軸はＡＤＭ＋ｃａｆのＡＤＭ濃度（ｎＭ）を示し、横軸はＡＤＭ＋ＣＡのＡＤＭ濃度（ｎＭ）を示す。×は、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ５０（ＥＤ５０）を示し、＋は、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ７５（ＥＤ７５）を示し、●は、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ９０（ＥＤ９０）を示す。縦軸上の×、＋及び●は、ＡＤＭ＋ｃａｆの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを、横軸上の×、＋及び●は、ＡＤＭ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示し、円形の破線に囲まれた×、＋及び●は、ＡＤＭ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す。当該円形の破線（ＡＤＭ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ）が、ＡＤＭ＋ｃａｆとＡＤＭ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置する場合は、相乗効果が認められる。図中の表において、相乗効果の指標であるＣＩ（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ）は、前述のグラフに示されたＡＤＭ＋ｃａｆの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ、ＡＤＭ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ及びＡＤＭ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを用いて、ＡＤＭ＋ｃａｆとＡＤＭ＋ＣＡのコンビネーションをＡＤＭ＋ｃａｆＣＡとして算出した。ＣＩ＜１．０のとき、相乗効果が認められる。 実施例３における軟部肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。グラフの見方は図２２と同様である。 実施例３におけるＭｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法による軟部肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）を用いた相乗効果の解析結果。 実施例３における骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。グラフ及び表の見方は図２４と同様である。 実施例３における胃癌細胞株（ＭＫＮ４５）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。グラフの見方は図２２と同様である。 実施例３におけるＭｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法による胃癌細胞株（ＭＫＮ４５）を用いた相乗効果の解析結果。 実施例３における胃癌細胞株（ＭＫＮ４５）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。グラフ及び表の見方は図２４と同様である。 実施例３における子宮癌細胞株（Ｈｅｌａ）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。グラフの見方は図２２と同様である。 実施例３におけるＭｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法による子宮癌細胞株（Ｈｅｌａ）を用いた相乗効果の解析結果。 実施例３における子宮癌細胞株（Ｈｅｌａ）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。グラフ及び表の見方は図２４と同様である。 実施例４における骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。縦軸は細胞生存率（ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、横軸はゲムシタビン濃度（ＧＥＭ濃度）を示す。菱形（◆）はゲムシタビン（ＧＥＭ）単独、黒の正方形（■）はゲムシタビン＋無水カフェイン（ＧＥＭ＋ｃａｆ）、灰色の正方形はゲムシタビン＋クエン酸（ＧＥＭ＋ＣＡ）、丸はゲムシタビン＋カフェインクエン酸塩（ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ）を示す。ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ群は、各ゲムシタビン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。 実施例４におけるＭｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法による骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）を用いた相乗効果の解析結果。 実施例４における骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。図中のグラフにおいて、縦軸はＧＥＭ＋ｃａｆのＧＥＭ濃度（ｎＭ）を示し、横軸はＧＥＭ＋ＣＡのＧＥＭ濃度（ｎＭ）を示す。×は、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ５０（ＥＤ５０）を示し、＋は、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ７５（ＥＤ７５）を示し、●は、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ９０（ＥＤ９０）を示す。縦軸上の×、＋及び●は、ＧＥＭ＋ｃａｆの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを、横軸上の×、＋及び●は、ＧＥＭ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示し、円形の破線に囲まれた×、＋及び●は、ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す。当該円形の破線（ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ）が、ＧＥＭ＋ｃａｆとＧＥＭ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置する場合は、相乗効果が認められる。図中の表において、相乗効果の指標であるＣＩ（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ）は、前述のグラフに示されたＧＥＭ＋ｃａｆの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ、ＧＥＭ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ及びＧＥＭ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを用いて、ＧＥＭ＋ｃａｆとＧＥＭ＋ＣＡのコンビネーションをＧＥＭ＋ｃａｆＣＡとして算出した。ＣＩ＜１．０のとき、相乗効果が認められる。 実施例４における胃癌細胞株（ＭＫＮ４５）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。グラフの見方は図３４と同様である。 実施例４におけるＭｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法による胃癌細胞株（ＭＫＮ４５）を用いた相乗効果の解析結果。 実施例４における胃癌細胞株（ＭＫＮ４５）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。グラフ及び表の見方は図３６と同様である。 実施例４における卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ－３）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。グラフの見方は図３４と同様である。 実施例４におけるＭｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法による卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ－３）を用いた相乗効果の解析結果。 実施例４における卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ－３）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果をＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法により解析した結果。表の見方は図３６と同様である。 実施例５における骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）を用いた細胞増殖（ＥｄＵ）アッセイの結果。各群の代表的な定点１視野について、写真撮影した結果を示す。ＨｏｅｃｈｓｔはＨｏｅｃｈｓｔ検出の写真撮影結果、Ｈｏｅｃｈｓｔ＋ＥｄＵはＨｏｅｃｈｓｔ検出及びＥｄＵ検出の写真撮影結果を合わせた画像、ＥｄＵはＥｄＵ検出の写真撮影結果を示す。 実施例５における軟部肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）を用いた細胞増殖（ＥｄＵ）アッセイの結果。各群の代表的な定点１視野について、写真撮影した結果を示す。ＨｏｅｃｈｓｔはＨｏｅｃｈｓｔ検出の写真撮影結果、Ｈｏｅｃｈｓｔ＋ＥｄＵはＨｏｅｃｈｓｔ検出及びＥｄＵ検出の写真撮影結果を合わせた画像、ＥｄＵはＥｄＵ検出の写真撮影結果を示す。 実施例５における骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）及び軟部肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）を用いた細胞増殖（ＥｄＵ）アッセイでのＥｄＵ発色率の有意差の解析結果。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。 実施例６における骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）を用いたミトコンドリア膜電位変化（ＴＭＲＥ）アッセイの結果。各群の代表的な定点１視野について、写真撮影した結果を示す。ＨｏｅｃｈｓｔはＨｏｅｃｈｓｔ検出の写真撮影結果、Ｈｏｅｃｈｓｔ＋ＴＭＲＥはＨｏｅｃｈｓｔ検出及びＴＭＲＥ検出の写真撮影結果を合わせた画像、ＴＭＲＥはＴＭＲＥ検出の写真撮影結果を示す。 実施例６における軟部肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）を用いたミトコンドリア膜電位変化（ＴＭＲＥ）アッセイの結果。各群の代表的な定点１視野について、写真撮影した結果を示す。ＨｏｅｃｈｓｔはＨｏｅｃｈｓｔ検出の写真撮影結果、Ｈｏｅｃｈｓｔ＋ＴＭＲＥはＨｏｅｃｈｓｔ検出及びＴＭＲＥ検出の写真撮影結果を合わせた画像、ＴＭＲＥはＴＭＲＥ検出の写真撮影結果を示す。 実施例６における骨肉腫細胞株（ＨＯＳ）及び軟部肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）を用いたミトコンドリア膜電位変化（ＴＭＲＥ）アッセイでの１細胞あたりのＴＭＲＥ輝度の有意差の解析結果。縦軸は１細胞あたりのＴＭＲＥ輝度の比率を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。 実施例７における皮膚癌細胞株（Ａ３７５）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。縦軸は細胞生存率（ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、横軸はシスプラチン濃度（ＣＤＤＰ濃度）を示す。菱形（◆）はシスプラチン（ＣＤＤＰ）単独、三角形（▲）はシスプラチン＋無水カフェイン（ＣＤＤＰ＋ｃａｆ）、正方形はシスプラチン＋クエン酸（ＣＤＤＰ＋ＣＡ）、丸はシスプラチン＋カフェインクエン酸塩（ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ）を示す。ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、各シスプラチン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。 実施例７における膵癌細胞株（ＰＡＮＣ－１）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。縦軸は細胞生存率（ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、横軸はシスプラチン濃度（ＣＤＤＰ濃度）を示す。菱形（◆）はシスプラチン（ＣＤＤＰ）単独、三角形（▲）はシスプラチン＋無水カフェイン（ＣＤＤＰ＋ｃａｆ）、正方形はシスプラチン＋クエン酸（ＣＤＤＰ＋ＣＡ）、丸はシスプラチン＋カフェインクエン酸塩（ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ）を示す。ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、各シスプラチン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。 実施例７における担癌細胞株（ＴＦＫ－１）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。縦軸は細胞生存率（ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、横軸はシスプラチン濃度（ＣＤＤＰ濃度）を示す。菱形（◆）はシスプラチン（ＣＤＤＰ）単独、三角形（▲）はシスプラチン＋無水カフェイン（ＣＤＤＰ＋ｃａｆ）、正方形はシスプラチン＋クエン酸（ＣＤＤＰ＋ＣＡ）、丸はシスプラチン＋カフェインクエン酸塩（ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ）を示す。ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、各シスプラチン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。 実施例８における線維肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。縦軸は細胞生存率（ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、横軸はゲムシタビン濃度（ＧＥＭ濃度）を示す。菱形（◆）はゲムシタビン（ＧＥＭ）単独、三角形（▲）はゲムシタビン＋無水カフェイン（ＧＥＭ＋ｃａｆ）、正方形はゲムシタビン＋クエン酸（ＧＥＭ＋ＣＡ）、丸はゲムシタビン＋カフェインクエン酸塩（ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ）を示す。ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ群は、各ゲムシタビン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。 実施例８における皮膚癌細胞株（Ａ３７５）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。縦軸は細胞生存率（ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、横軸はゲムシタビン濃度（ＧＥＭ濃度）を示す。菱形（◆）はゲムシタビン（ＧＥＭ）単独、三角形（▲）はゲムシタビン＋無水カフェイン（ＧＥＭ＋ｃａｆ）、正方形はゲムシタビン＋クエン酸（ＧＥＭ＋ＣＡ）、丸はゲムシタビン＋カフェインクエン酸塩（ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ）を示す。 実施例８における膵癌細胞株（ＰＡＮＣ－１）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。縦軸は細胞生存率（ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、横軸はゲムシタビン濃度（ＧＥＭ濃度）を示す。菱形（◆）はゲムシタビン（ＧＥＭ）単独、三角形（▲）はゲムシタビン＋無水カフェイン（ＧＥＭ＋ｃａｆ）、正方形はゲムシタビン＋クエン酸（ＧＥＭ＋ＣＡ）、丸はゲムシタビン＋カフェインクエン酸塩（ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ）を示す。ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ群は、各ゲムシタビン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。 実施例８における担癌細胞株（ＴＦＫ－１）を用いたＷＳＴ－８アッセイの結果。縦軸は細胞生存率（ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、横軸はゲムシタビン濃度（ＧＥＭ濃度）を示す。菱形（◆）はゲムシタビン（ＧＥＭ）単独、三角形（▲）はゲムシタビン＋無水カフェイン（ＧＥＭ＋ｃａｆ）、正方形はゲムシタビン＋クエン酸（ＧＥＭ＋ＣＡ）、丸はゲムシタビン＋カフェインクエン酸塩（ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ）を示す。ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ群は、各ゲムシタビン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。 実施例９における投与スケジュール。 実施例９におけるマウス骨肉腫細胞株であるＬＭ８細胞を背部皮下に移植したヌードマウスの腫瘍体積の推移。 実施例９におけるマウス由来のＬＭ８細胞を背部皮下に移植したヌードマウスの１５日目の腫瘍の重さ。 実施例９におけるヒト由来のＨＴ１０８０細胞を背部皮下に移植したヌードマウスの腫瘍体積の推移。 実施例９におけるヒト由来のＨＴ１０８０細胞を背部皮下に移植したヌードマウスの１５日目の腫瘍の重さ。 実施例９におけるカフェインクエン酸塩低投与量を特徴とするマウス由来のＬＭ８細胞を背部皮下に移植したヌードマウスの腫瘍体積の推移。 実施例９におけるカフェインクエン酸塩低投与量を特徴とするマウス由来のＬＭ８細胞を背部皮下に移植したヌードマウスの１５日目の腫瘍の重さ。 実施例９における抗癌剤低投与量を特徴とするマウス由来のＬＭ８細胞を背部皮下に移植したヌードマウスの腫瘍体積の推移。 実施例９における抗癌剤低投与量を特徴とするマウス由来のＬＭ８細胞を背部皮下に移植したヌードマウスの１５日目の腫瘍の重さ。 実施例１０におけるヌードマウス（担癌マウスではない）の体重推移。左上下のグラフの測定日は、１日目（薬剤投与前）であり、右上下のグラフの測定日は、２２日目（３コース終了後）である。上段は抗癌剤としてＣＤＤＰを用いた結果であり、下段は抗癌剤としてＡＤＭを用いた結果である。
　本発明は、「有効成分であるカフェインクエン酸塩を、有効成分である抗癌剤と組み合わせたことを特徴とする癌治療剤」並びに「有効成分であるカフェインクエン酸塩と有効成分である抗癌剤を癌患者に投与することを特徴とする癌治療方法」である。
（カフェインクエン酸塩）
　本発明において、カフェインクエン酸塩（クエン酸カフェイン）は、以下の式（１）で表される無水カフェイン並びに式（２）及び／又は式（２'）で表されるクエン酸（クエン酸水和物を含む）を含有する薬剤である。ここで、式（２）及び式（２'）で表されるクエン酸とは、式（２）で表されるクエン酸と式（２'）で表されるクエン酸との混合物を意味する。
　カフェインクエン酸塩中の無水カフェイン及びクエン酸の比率はモル比で、無水カフェイン：クエン酸＝０．１：９．９～９．９：０．１、好ましくは１：９～９：１、より好ましくは１：１である。
　カフェインクエン酸塩としては、市販のカフェインクエン酸塩を使用してもよい。例えば、ノーベルファーマ株式会社により商品名「レスピア（登録商標）」が市販されている。
　また、無水カフェインに類似する化合物（無水カフェイン類似化合物）として、カフェイン水和物、安息香酸ナトリウムカフェイン（いわゆるアンナカ）等も使用できるほか、カフェインはキサンチン誘導体であるから、キサンチン類であるキサンチン系神経中枢刺激薬（フェネチリン、プロベントフェリン）、キサンチン系血管拡張薬（ペントキシフェリン、ナキシフェリン、ニコチン酸キサンチノール、ペンチフィリン、ロロフィリン、トナポフェリン）、キサンチン系利尿薬（テオブロミン、パマプロム）等も使用できる。
　クエン酸に類似する化合物（クエン酸類似化合物）として、クエン酸カリウム、クエン酸リチウム、クエン酸銅、クエン酸鉄アンモニウム、及びそれらの水和物等も使用できる。
　したがって、カフェインクエン酸塩に類似する薬剤として、上記の無水カフェインに類似する化合物及びクエン酸に類似する化合物の組合せも使用できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
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　カフェインクエン酸塩は、癌種に対する効果や抗癌剤との併用に関する報告はないが、未熟児無呼吸発作治療剤等として利用されている。すなわち、カフェインクエン酸塩は、他の疾患で既に使用され、その安全性が十分に確立されている治療薬である。
　このように、カフェインクエン酸塩は、すでに保険診療で処方されている薬剤であるため、早期臨床応用において、新規薬剤と比較すると有利である。
（抗癌剤）
　本発明の癌治療剤の有効成分としての抗癌剤は、シスプラチン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、イホスファミド又はゲムシタビンが好ましい。
（シスプラチン）
　シスプラチンは、ＤＮＡ中のグアニン、アデニンのＮ－７位に結合し、ＤＮＡ鎖内に架橋を形成することにより、ＤＮＡの複製を阻害する抗癌剤である。
　シスプラチンは、市販されているものを使用できる。例えば、日本化薬株式会社より商品名「アイエーコール」として市販されている。
（アドリアマイシン）
　アドリアマイシンは、腫瘍細胞のＤＮＡの塩基対間に挿入し、ＤＮＡ合成酵素及びＲＮＡ合成酵素を阻害することにより、ＤＮＡ、ＲＮＡ双方の生合成を抑制する抗癌剤である。
　アドリアマイシンは、市販されているものを使用できる。例えば、協和発酵キリン株式会社より商品名「アドリアシン」として市販されている。
（イホスファミド）
　イホスファミドは、ＤＮＡ中のグアニンをアルキル化し、ＤＮＡ二本鎖間に架橋を形成することにより、ＤＮＡの複製を阻害する抗癌剤である。
　イホスファミドは、市販されているものを使用できる。例えば、塩野義製薬株式会社より商品名「イホマイド」として市販されている。
（ゲムシタビン）
　ゲムシタビンは、腫瘍細胞のＤＮＡ合成において、構造の類似するシチジンと同様にＤＮＡ鎖に取り込まれ、ＤＮＡ鎖伸長を停止させることにより、アポトーシスを誘導する抗癌剤である。
　ゲムシタビンは、市販されているものを使用できる。例えば、日本イーライリリー株式会社より商品名「ジェムザール」として市販されている。
　シスプラチンは、プラチナ製剤であり、同じプラチナ製剤、例えば、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン等も同様の効果が期待される。
　ドキソルビシンは、抗癌抗生物質であり、同じ抗癌抗生物質、例えば、アクチノマイシンＤ、ピラルビシン、ダウノルビシン等も同様の効果が期待される。
　イホスファミドは、アルキル化薬であり、同じアルキル化薬、例えば、シクロホスファミド、ブスルファン、ダカルバジン等も同様の効果が期待される。
　ゲムシタビンは、代謝拮抗薬であり、同じ代謝拮抗薬も同様の効果が期待される。
　上記以外にも、ビンクリスチンやエトポシドのような植物アルカロイド等を含めたＤＮＡの合成を阻害するタイプの薬剤全てにおいて、同様の効果が期待される。
（癌種）
　本発明の癌治療剤及び癌治療方法の対象の癌種は、原発生悪性骨腫瘍、軟部肉腫、肺癌、胃癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、皮膚癌、卵巣癌、膵癌、胆管癌又は肝細胞癌等が挙げられる。
　原発生悪性骨腫瘍としては、特に限定されないが、例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング（Ｅｗｉｎｇ）肉腫、骨未分化多形肉腫等が挙げられる。
　軟部肉腫としては、特に限定されないが、例えば、線維肉腫、滑膜肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、未分化多形肉腫、骨外性骨肉腫、骨外性Ｅｗｉｎｇ肉腫等が挙げられる。
　肺癌としては、特に限定されないが、例えば、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌等の非小細胞肺癌、小細胞肺癌等が挙げられる。
　子宮癌としては、特に限定されないが、例えば、子宮頸癌、子宮体癌等が挙げられる。
　皮膚癌としては、特に限定されないが、例えば、悪性黒色腫、基底細胞癌、有棘細胞癌等が挙げられる。
　なお、本明細書において挙げた癌種は、それらの癌が生じる臓器、器官における全ての扁平上皮癌も対象となる。例えば、胃癌には、胃における扁平上皮癌が含まれる。
（本発明の癌治療剤の投与方法又は癌治療方法）
　本発明の癌治療剤の投与方法又は癌治療方法における投与量および投与計画は、個々の治療対象毎の所要量、治療方法、疾病または必要性の程度などに依存して調整できる。投与量は、具体的には年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、***速度、薬物の組合せ、および患者の病状などに応じて決めることができ、さらに、その他の要因を考慮して決定してもよい。
以下を例示することができるが特に限定されない。
（１）１回の投与量
　カフェインクエン酸塩（３日間投与の合計）：０．１～１００００ ｍｇ／ｍ２体表面積、好ましくは１～１００００ ｍｇ／ｍ２体表面積、より好ましくは５０～９０００ ｍｇ／ｍ２体表面積
　抗癌剤：シスプラチン（１日間投与）は、０．１～１５０ ｍｇ／ｍ２体表面積、好ましくは１０～１５０ ｍｇ／ｍ２体表面積、より好ましくは６０～１２０ ｍｇ／ｍ２体表面積。ドキソルビシン（２日間投与の合計）は、０．１～１２０ ｍｇ／ｍ２体表面積、好ましくは１０～９０ ｍｇ／ｍ２体表面積、より好ましくは３０～６０ ｍｇ／ｍ２体表面積。イホスファミド（３～５日間投与の合計）は、０．１～３０ ｍｇ／ｍ２体表面積、好ましくは１～２０ ｍｇ／ｍ２体表面積、より好ましくは４．５～１５ ｍｇ／ｍ２体表面積。ゲムシタビン（１日間投与）は、０．１～１０００ ｍｇ／ｍ２体表面積、好ましくは１０～９００ ｍｇ／ｍ２体表面積、より好ましくは６７５～９００ ｍｇ／ｍ２体表面積。
（２）投与間隔
　カフェインクエン酸塩：１０週間１～７０回投与、好ましくは２日１～２回投与、より好ましくは１日１回投与。詳しくは、１日～１０週間を１クールとして１～３０日間連続で１日１～１０回投与、好ましくは１～６週間を１クールとして１～１５日間連続で１日１～３回投与、より好ましくは２～３週間を１クールとして３～７日間連続で１日１回投与。
　抗癌剤：１～１０週間１回投与、好ましくは２～８週間１回投与、より好ましくは３～６週間１回投与。
（３）併用投与
　カフェインクエン酸塩と抗癌剤は同時投与、数時間の間隔を空けての投与、１日の間隔を空けての投与、数日の間隔を空けての投与、数週間の間隔を空けての投与、数か月の間隔を空けての投与のいずれでも良い。
　また、カフェインクエン酸塩及び抗癌剤を、生理学的に許容されうる溶媒、担体、賦形剤、結合剤等と混合し、医薬組成物にした後に、該組成物を患者に投与してもよい。なお、本発明におけるカフェインクエン酸塩及び／又は抗癌剤は、プロドラッグ、またはそれらの薬理学的に許容される塩も対象とする。
　溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水、アルコール、生理食塩水等が挙げられる。
　担体としては、特に限定されないが、例えば、酸、塩基、緩衝液、安定化剤、等張化剤、保存剤等が挙げられる。
　賦形剤としては、特に限定されないが、例えば、充填剤、凝固剤、滑たく剤、崩壊剤、色素、甘味料、香料、コーティング剤等が挙げられる。
　結合剤としては、特に限定されないが、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
　さらに、カフェインクエン酸塩及び抗癌剤を別々に製剤化した場合において、別々に製剤化したものを使用時に希釈剤等を用いて混合して混合物にして後に、該混合物を患者に投与してもよい。
　本発明の癌治療剤の投与方法又は癌治療方法では、経口的または非経口的に投与することができる。経口投与には、錠剤、カプセル、コーティング錠、トローチ、溶液または懸濁液などの液剤といった既知の投与用剤形を用いることができる。また、非経口投与は、注射による静脈内、筋肉内、または皮下への投与、スプレーやエアロゾルなどを用いた経鼻腔や口腔などの経粘膜投与、坐剤などを用いた直腸投与、パッチやリニメントやゲルなどを用いた経皮投与などを挙げることができる。好ましくは経口投与、経鼻腔投与、または注射による静脈内投与を挙げることができる。
　以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［骨肉腫、軟部肉腫、肺癌及び胃癌培養細胞におけるカフェインクエン酸塩のシスプラチン効果増強の評価］
　以下の方法により、骨肉腫、軟部肉腫、肺癌、胃癌に対するカフェインクエン酸塩の抗癌剤効果増強を評価した。
＜材料＞
・細胞株
　骨肉腫としては、ヒト由来のＨＯＳ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手）を用いた。
　軟部肉腫としては、ヒト由来のＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
　肺癌としては、ヒト由来のＲＥＲＦ－ＬＣ－ＡＩ細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、国立研究開発法人理科学研究所バイオリソースセンター（理研ＢＲＣ）より入手）を用いた。
　胃癌としては、ヒト由来のＭＫＮ４５細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
・抗癌剤
　シスプラチン（和光純薬工業株式会社より入手、以下、ＣＤＤＰと称する場合がある）を用いた。
・併用薬
　カフェインクエン酸塩（クエン酸カフェイン、ノーベルファーマ株式会社、商品名：レスピア（登録商標）、以下、ｃａｆＣＡと称する場合がある）、無水カフェイン（和光純薬工業株式会社、以下、ｃａｆと称する場合がある）又はクエン酸（和光純薬工業株式会社、以下、ＣＡと称する場合がある）を用いた。
＜ＷＳＴ－８アッセイ＞
（１）上記の各癌種培養細胞について、ＨＯＳ細胞、ＲＥＲＦ－ＬＣ－ＡＩ細胞、及びＭＫＮ４５細胞は、Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地を、ＨＴ１０８０細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、それぞれ３０００～５０００個／１００ μＬの濃度で、３７℃、ＣＯ２　５％の条件で、２４時間、９６ｗｅｌｌの培養プレートで培養した。
（２）培養後、各癌種培養細胞について、４つの群に分け、薬剤（ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ、ＣＤＤＰ＋ＣＡ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ）を１００ μＬ添加した。各群に添加する薬剤のＣＤＤＰ濃度は、水（滅菌精製水）にＣＤＤＰの粉末を溶かして高濃度のものを作成し、その後細胞に応じた培養液で希釈することで０．１２５、０．２５、０．５、１．０、２．０ μＭに調製した。各群の併用薬であるｃａｆ及びＣＡの濃度は、水に粉末を溶かしてそれぞれ高濃度のものを作成し、その後細胞に応じた培養液で希釈することで一律０．５ ｍＭに調製した。ｃａｆＣＡの濃度は、製品が液体であるので、そのまま細胞に応じた培養液で希釈し、ｃａｆ、ＣＡと同様の０．５ ｍＭに調製した。対照として、一部のウェルには薬剤を添加しなかった（ＣＤＤＰ濃度０ μＭ）。
（３）薬剤投与後７２時間後に、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８）（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）で発色し、２～４時間後に４５０ ｎｍの吸光度を測定した。対照の吸光度を１として、吸光度の比率から細胞生存率を決定した。
（４）（３）の結果について、Ｓｔａｔｃｅｌ　３（オーエムエス出版）で分散分析を行い、各ＣＤＤＰ濃度における４つの群間の細胞生存率の有意差を解析し、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの効果を検討した。
（５）ＣａｌｃｕＳｙｎ　ｖｅｒ．２（ＢＩＯＳＯＦＴ）にてｃａｆＣＡのもたらす抗癌剤増強効果と、ｃａｆ／ＣＡのもたらす抗癌剤増強効果の相乗効果について解析した。解析には、Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法及びＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法を用いた（参照：Ting-Chao Chou, Cancer Res 2010; 70: 440-6.；　Tallarida RJ, et al., Life Sci 1989; 45: 947-61.；　Roering SC et al., J Pharmacol Exp Ther 1988; 247: 603-8.；　Tallarida RJ, Chapman & Hall/CRC, Florida, USA, 2000.）。
　０．１２５、０．２５、０．５、１．０、２．０ μＭの各ＣＤＤＰ濃度において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆにおけるｃａｆ濃度と、ＣＤＤＰ＋ＣＡにおけるＣＡ濃度とのコンビネーションを、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡにおけるｃａｆＣＡ濃度として、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）を求めた。
　ここで、ＣＤＤＰは、前記コンビネーションの前後で、同量・同濃度である。例えば、ＣＤＤＰ濃度１．０ μＭの場合、ＣＤＤＰ（１．０ μＭ）＋ｃａｆ（０．５ μＭ）とＣＤＤＰ（１．０ μＭ）＋ＣＡ（０．５ μＭ）とのコンビネーションは、ＣＤＤＰ（１．０ μＭ）＋ｃａｆＣＡ（０．５ μＭ）である。
　Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法によるＣＩは、各濃度による細胞生存率から導かれた「細胞が５０％生存するために必要と考えられるＣＤＤＰ濃度（ＥＤ５０）」を基準に、ｃａｆ、ＣＡ、ｃａｆＣＡの各々の濃度およびその際の細胞生存率を対象として算出した数値である。
　Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法によるＣＩは、各ＣＤＤＰ濃度による細胞生存率から導かれた、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ、ＣＤＤＰ＋ＣＡ及びＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの「各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｄｏｓｅ（ＥＤ５０、ＥＤ７５、ＥＤ９０）」を用いて算出した数値である。
　ＣＩ＜１のとき、相乗効果と判定した。なお、ＣＩ＝１のときは、相加効果と判定し、ＣＩ＞１のときは、拮抗効果と判定する。
＜骨肉腫の結果＞
１．細胞生存率
　図１に、ＨＯＳ細胞における４つの群の４５０ ｎｍの吸光度に基づく細胞生存率を示す。図１から明らかなように、ＨＯＳ細胞（骨肉腫）において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、全てのＣＤＤＰ濃度で、他の群と比較して、最も細胞生存率が低かった。
　また、分散分析の結果、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、各シスプラチン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。
　よって、カフェインクエン酸塩は、シスプラチンと組み合わせて添加することにより、シスプラチンの抗癌剤効果を増強することが、０．１２５～２．０ μＭの全てのシスプラチン濃度において確認できた。
２．Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法
　次に、Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法によるＨＯＳ細胞における相乗効果の解析結果を、表１に示す。相乗効果の指標であるＣＩは、図１におけるＣＤＤＰ濃度毎の細胞生存率に基づき、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡのコンビネーションをＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡとして算出した。ＣＩ＜１．０のとき、相乗効果が認められる。
　表１から明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、０．１２５～２．０ μＭの全てのシスプラチン濃度で、ＣＩ＜１．０となり、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
３．Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法
　Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法によるＨＯＳ細胞における相乗効果の解析結果を図５に示す。
　図５～図８のＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法の解析結果のグラフにおいて、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す円形の破線が、それぞれ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅと、ＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅとを結んだ曲線上にあれば、相加効果を示し、曲線より左下にあれば、相乗効果を示し、曲線より右上にあれば、拮抗効果を示す。例えば、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡのＥＤ５０を示す円形の破線が、ＣＤＤＰ＋ｃａｆのＥＤ５０と、ＣＤＤＰ＋ＣＡのＥＤ５０とを結んだ曲線上にあれば、相加効果を示し、曲線より左下にあれば、相乗効果を示し、曲線より右上にあれば、拮抗効果を示す。ＥＤ７５、ＥＤ９０についても同様である。
　本解析における「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅ」とは、各癌腫培養細胞を減少させるために必要なＣＤＤＰ濃度を示しており、ＣＤＤＰ濃度毎の細胞生存率から導かれる。例えば、ＥＤ５０であれば、細胞をベースから５０％減少させる（細胞生存率を５０％にする）ために必要なＣＤＤＰ濃度を意味し、ＥＤ７５であれば、細胞を７５％減少させる（細胞生存率を２５％にする）ために必要なＣＤＤＰ濃度、ＥＤ９０であれば、細胞を９０％減少させる（細胞生存率を１０％にする）ために必要なＣＤＤＰ濃度を意味する。
　図５のグラフから明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す円形の破線が、それぞれ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置することから、相乗効果が認められた。
　図５の表から明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、５０～９０％の全てのＥｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅで、ＣＩ＜１．０となり、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
＜軟部肉腫の結果＞
１．細胞生存率
　ＨＴ１０８０細胞における４つの群の４５０ ｎｍの吸光度に基づく細胞生存率を図２に示す。図２から明らかなように、ＨＴ１０８０細胞（軟部肉腫）において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、全てのＣＤＤＰ濃度で、他の群と比較して、最も細胞生存率が低かった。
　また、分散分析の結果、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、各シスプラチン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。
　よって、カフェインクエン酸塩は、シスプラチンと組み合わせて添加することにより、シスプラチンの抗癌剤効果を増強することが、０．１２５～２．０ μＭの全てのシスプラチン濃度において確認できた。
２．Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法
　Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法によるＨＴ１０８０細胞における相乗効果の解析結果を、表１に示す。相乗効果の指標であるＣＩは、図２におけるＣＤＤＰ濃度毎の細胞生存率に基づき、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡのコンビネーションをＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡとして算出した。
　表１から明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、０．１２５～２．０ μＭの全てのシスプラチン濃度で、ＣＩ＜１．０となり、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
３．Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法
　Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法によるＨＴ１０８０細胞における相乗効果の解析結果を図６に示す。
　図６のグラフから明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す円形の破線が、それぞれ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置することから、相乗効果が認められた。
　図６の表から明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、５０～９０％の全てのＥｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅで、ＣＩ＜１となり、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
＜肺癌の結果＞
１．細胞生存率
　ＲＥＲＦ－ＬＣ－ＡＩ細胞における４つの群の４５０ ｎｍの吸光度に基づく細胞生存率を図３に示す。図３から明らかなように、ＲＥＲＦ－ＬＣ－ＡＩ細胞（肺癌）において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、全てのＣＤＤＰ濃度で、他の群と比較して、最も細胞生存率が低かった。
　また、分散分析の結果、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、各シスプラチン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。
　よって、カフェインクエン酸塩は、シスプラチンと組み合わせて添加することにより、シスプラチンの抗癌剤効果を増強することが、０．１２５～２．０ μＭの全てのシスプラチン濃度において確認できた。
２．Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法
　Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法によるＲＥＲＦ－ＬＣ－ＡＩ細胞における相乗効果の解析結果を、表１に示す。相乗効果の指標であるＣＩは、図３におけるＣＤＤＰ濃度毎の細胞生存率に基づき、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡのコンビネーションをＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡとして算出した。
　表１から明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、０．１２５～２．０ μＭの全てのシスプラチン濃度で、ＣＩ＜１．０となり、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
３．Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法
　Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法によるＲＥＲＦ－ＬＣ－ＡＩ細胞における相乗効果の解析結果を図７に示す。
　図７のグラフから明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す円形の破線が、それぞれ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置することから、相乗効果が認められた。
　図７の表から明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、５０～９０％の全てのＥｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅで、ＣＩ＜１となり、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
＜胃癌の結果＞
１．細胞生存率
　ＭＫＮ４５細胞における４つの群の４５０ ｎｍの吸光度に基づく細胞生存率を図４に示す。図４から明らかなように、ＭＫＮ４５細胞（胃癌）において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、全てのＣＤＤＰ濃度で、他の群と比較して、最も細胞生存率が低かった。
　また、分散分析の結果、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、各シスプラチン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。
　よって、カフェインクエン酸塩は、シスプラチンと組み合わせて添加することにより、シスプラチンの抗癌剤効果を増強することが、０．１２５～２．０ μＭの全てのシスプラチン濃度において確認できた。
２．Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法
　Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法によるＭＫＮ４５細胞における相乗効果の解析結果を、表１に示す。相乗効果の指標であるＣＩは、図４におけるＣＤＤＰ濃度毎の細胞生存率に基づき、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡのコンビネーションをＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡとして算出した。
　表１から明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、０．１２５～２．０ μＭの全てのシスプラチン濃度で、ＣＩ＜１．０となり、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
３．Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法
　Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法によるＭＫＮ４５細胞における相乗効果の解析結果を図８に示す。
　図８のグラフから明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す円形の破線が、それぞれ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置することから、相乗効果が認められた。
　図８の表から明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、５０～９０％の全てのＥｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅで、ＣＩ＜１となり、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
＜総合評価＞
　以上の４種類の細胞株におけるＭｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法及びＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法の実験結果をまとめると、図９の通りである。
　図９から明らかなように、本発明の癌治療剤は、実験した全ての癌種において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法及びＩｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法の双方の解析により、ＣＩ＜１．０となり、相乗効果を有することが確認された。
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　以上の結果より、本発明の癌治療剤において、シスプラチンとカフェインクエン酸塩との組合せは、シスプラチン単独、シスプラチンと無水カフェインとの組合せ、シスプラチンとクエン酸との組合せと比較して、有意にシスプラチンの抗癌剤効果をより増強すること、カフェインクエン酸塩の有する抗癌剤増強効果は、無水カフェインの有する抗癌剤増強効果と、クエン酸の有する抗癌剤増強効果との、単なる相加効果ではなく、相乗効果であることが明らかになった。
［肝細胞癌、子宮癌、乳癌及び卵巣癌培養細胞におけるカフェインクエン酸塩のシスプラチン効果増強の評価］
　肝細胞癌、子宮癌、乳癌及び卵巣癌に対するカフェインクエン酸塩の抗癌剤（シスプラチン）効果増強を評価した。以下の細胞株及び培地を用いた他は、実施例１と同様の材料及び方法により試験を行った。
＜材料＞
・細胞株
　肝細胞癌としては、ヒト由来のＨｅｐＧ２細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
　子宮癌としては、ヒト由来のＨｅｌａ細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
　乳癌としては、ヒト由来のＭＣＦ７細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
　卵巣癌としては、ヒト由来のＯＶＣＡＲ－３細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
・培地
　上記の各癌種培養細胞について、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＭＣＦ７細胞及びＯＶＣＡＲ－３細胞は、いずれもＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
＜結果＞
１．細胞生存率
　図１０、図１３、図１６及び図１９に、それぞれＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＭＣＦ７細胞及びＯＶＣＡＲ－３細胞における４つの群（ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ、ＣＤＤＰ＋ＣＡ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ）の４５０ ｎｍの吸光度に基づく細胞生存率を示す。図１０、図１３、図１６及び図１９から明らかなように、ＨｅｐＧ２細胞（肝細胞癌）、Ｈｅｌａ細胞（子宮癌）、ＭＣＦ７細胞（乳癌）及びＯＶＣＡＲ－３細胞（卵巣癌）において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、全てのＣＤＤＰ濃度で、他の群と比較して、最も細胞生存率が低かった。
　また、分散分析の結果、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、各シスプラチン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。
　よって、カフェインクエン酸塩は、シスプラチンと組み合わせて添加することにより、シスプラチンの抗癌剤効果を増強することが、０．１２５～２．０ μＭの全てのシスプラチン濃度において確認できた。
２．Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法
　次に、Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法によるＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＭＣＦ７細胞及びＯＶＣＡＲ－３細胞における相乗効果の解析結果を、図１１、図１４、図１７及び図２０に示す。相乗効果の指標であるＣＩは、図１１、図１４、図１７及び図２０におけるＣＤＤＰ濃度毎の細胞生存率に基づき、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡのコンビネーションをＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡとして算出した。ＣＩ＜１．０のとき、相乗効果が認められる。
　図１１、図１４、図１７及び図２０から明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、０．１２５～２．０ μＭの全てのシスプラチン濃度で、ＣＩ＜１．０となり、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
３．Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法
　Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法によるＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＭＣＦ７細胞及びＯＶＣＡＲ－３細胞における相乗効果の解析結果を図１２、図１５、図１８及び図２１に示す。
　図１２、図１５、図１８及び図２１のグラフから明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す円形の破線が、それぞれ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置することから、相乗効果が認められた。
　図１２、図１５、図１８及び図２１の表から明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、５０～９０％の全てのＥｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅで、ＣＩ＜１．０となり、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
［骨肉腫、軟部肉腫、胃癌及び子宮癌培養細胞におけるカフェインクエン酸塩のアドリアマイシン効果増強の評価］
　骨肉腫、軟部肉腫、胃癌及び子宮癌に対するカフェインクエン酸塩の抗癌剤（アドリアマイシン）効果増強を評価した。以下の細胞株、抗癌剤及び培地を用いた他は、実施例１と同様の材料により試験を行った。
＜材料＞
・細胞株
　骨肉腫としては、ヒト由来のＨＯＳ細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
　軟部肉腫としては、ヒト由来のＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
　胃癌としては、ヒト由来のＭＫＮ４５細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
　子宮癌としては、ヒト由来のＨｅｌａ細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
・抗癌剤
　アドリアマイシン（和光純薬工業株式会社より入手、以下、ＡＤＭと称する場合がある）を用いた。
・培地
　上記の各癌種培養細胞について、ＨＯＳ細胞、ＭＫＮ４５細胞及びＨｅｌａ細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。ＨＴ１０８０細胞は、ＤＭＥＭを用いた。
＜ＷＳＴ－８アッセイ＞
　工程（２）を下記の通りに変更した他は、実施例１の方法に準じて試験を行った。
（２）培養後、各癌種培養細胞について、４つの群に分け、薬剤（ＡＤＭ、ＡＤＭ＋ｃａｆ、ＡＤＭ＋ＣＡ、ＡＤＭ＋ｃａｆＣＡ）を１００ μＬ添加した。各群に添加する薬剤のＡＤＭ濃度は、水（滅菌精製水）にＡＤＭの粉末を溶かして高濃度のものを作成し、その後細胞に応じた培養液で希釈することで１２．５、２５、５０、１００、２００ ｎＭに調製した。各群の併用薬であるｃａｆ及びＣＡの濃度は、水に粉末を溶かしてそれぞれ高濃度のものを作成し、その後細胞に応じた培養液で希釈することで一律０．５ ｍＭに調製した。ｃａｆＣＡの濃度は、製品が液体であるので、そのまま細胞に応じた培養液で希釈し、ｃａｆ、ＣＡと同様の０．５ ｍＭに調製した。対照として、一部のウェルには薬剤を添加しなかった（ＡＤＭ濃度０ μＭ）。
＜結果＞
１．細胞生存率
　図２２、図２５、図２８及び図３１に、それぞれＨＯＳ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＭＫＮ４５細胞及びＨｅｌａ細胞における４つの群（ＡＤＭ、ＡＤＭ＋ｃａｆ、ＡＤＭ＋ＣＡ、ＡＤＭ＋ｃａｆＣＡ）の４５０ ｎｍの吸光度に基づく細胞生存率を示す。図２２、図２５、図２８及び図３１から明らかなように、ＨＯＳ細胞（骨肉腫）、ＨＴ１０８０細胞（軟部肉腫）、ＭＫＮ４５細胞（胃癌）及びＨｅｌａ細胞（子宮癌）において、ＡＤＭ＋ｃａｆＣＡ群は、全てのＡＤＭ濃度で、他の群と比較して、最も細胞生存率が低かった。
　また、分散分析の結果、ＡＤＭ＋ｃａｆＣＡ群は、各アドリアマイシン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。
　よって、カフェインクエン酸塩は、アドリアマイシンと組み合わせて添加することにより、アドリアマイシンの抗癌剤効果を増強することが、１２．５～２００ ｎＭの全てのアドリアマイシン濃度において確認できた。
２．Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法
　次に、Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法によるＨＯＳ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＭＫＮ４５細胞及びＨｅｌａ細胞における相乗効果の解析結果を、図２３、図２６、図２９及び図３２に示す。相乗効果の指標であるＣＩは、図２３、図２６、図２９及び図３２におけるＡＤＭ濃度毎の細胞生存率に基づき、ＡＤＭ＋ｃａｆとＡＤＭ＋ＣＡのコンビネーションをＡＤＭ＋ｃａｆＣＡとして算出した。ＣＩ＜１．０のとき、相乗効果が認められる。
　図２３、図２６、図２９及び図３２から明らかなように、ＡＤＭ＋ｃａｆＣＡ群は、１２．５～２００ ｎＭの全てのアドリアマイシン濃度で、ＣＩ＜１．０となり、ＡＤＭ＋ｃａｆ及びＡＤＭ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
３．Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法
　Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法によるＨＯＳ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＭＫＮ４５細胞及びＨｅｌａ細胞における相乗効果の解析結果を図２４、図２７、図３０及び図３３に示す。
　図２４、図２７、図３０及び図３３のグラフから明らかなように、ＡＤＭ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す円形の破線が、それぞれ、ＡＤＭ＋ｃａｆ及びＡＤＭ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置することから、相乗効果が認められた。
　図２４、図２７、図３０及び図３３の表から明らかなように、ＡＤＭ＋ｃａｆＣＡ群は、５０～９０％の全てのＥｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅで、ＣＩ＜１．０となり、ＡＤＭ＋ｃａｆ及びＡＤＭ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
　以上の結果より、本発明の癌治療剤において、アドリアマイシンとカフェインクエン酸塩との組合せは、アドリアマイシン単独、アドリアマイシンと無水カフェインとの組合せ、アドリアマイシンとクエン酸との組合せと比較して、有意にアドリアマイシンの抗癌剤効果をより増強すること、カフェインクエン酸塩の有する抗癌剤増強効果は、無水カフェインの有する抗癌剤増強効果と、クエン酸の有する抗癌剤増強効果との、単なる相加効果ではなく、相乗効果であることが明らかになった。
［骨肉腫、胃癌及び卵巣癌培養細胞におけるカフェインクエン酸塩のゲムシタビン効果増強の評価］
　骨肉腫、胃癌及び卵巣癌に対するカフェインクエン酸塩の抗癌剤（ゲムシタビン）効果増強を評価した。以下の細胞株、抗癌剤及び培地を用いた他は、実施例１と同様の材料により試験を行った。
＜材料＞
・細胞株
　骨肉腫としては、ヒト由来のＨＯＳ細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
　胃癌としては、ヒト由来のＭＫＮ４５細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
　卵巣癌としては、ヒト由来のＯＶＣＡＲ－３細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
・抗癌剤
　ゲムシタビン（和光純薬工業株式会社より入手、以下、ＧＥＭと称する場合がある）を用いた。
・培地
　上記の各癌種培養細胞について、ＨＯＳ細胞、ＭＫＮ４５細胞及びＯＶＣＡＲ－３細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
＜ＷＳＴ－８アッセイ＞
　工程（２）を下記の通りに変更した他は、実施例１の方法に準じて試験を行った。
（２）培養後、各癌種培養細胞について、４つの群に分け、薬剤（ＧＥＭ、ＧＥＭ＋ｃａｆ、ＧＥＭ＋ＣＡ、ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ）を１００ μＬ添加した。各群に添加する薬剤のＧＥＭ濃度は、水（滅菌精製水）にＧＥＭの粉末を溶かして高濃度のものを作成し、その後細胞に応じた培養液で希釈することで０．５、１、２、４、８ ｎＭに調製した。各群の併用薬であるｃａｆ及びＣＡの濃度は、水に粉末を溶かしてそれぞれ高濃度のものを作成し、その後細胞に応じた培養液で希釈することで一律０．５ ｍＭに調製した。ｃａｆＣＡの濃度は、製品が液体であるので、そのまま細胞に応じた培養液で希釈し、ｃａｆ、ＣＡと同様の０．５ ｍＭに調製した。対照として、一部のウェルには薬剤を添加しなかった（ＧＥＭ濃度０ μＭ）。
＜結果＞
１．細胞生存率
　図３４、図３７及び図４０に、それぞれＨＯＳ細胞、ＭＫＮ４５細胞及びＯＶＣＡＲ－３細胞における４つの群（ＧＥＭ、ＧＥＭ＋ｃａｆ、ＧＥＭ＋ＣＡ、ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ）の４５０ ｎｍの吸光度に基づく細胞生存率を示す。図３４、図３７及び図４０から明らかなように、ＨＯＳ細胞（骨肉腫）、ＭＫＮ４５細胞（胃癌）及びＯＶＣＡＲ－３細胞（卵巣癌）において、ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ群は、全てのＧＥＭ濃度で、他の群と比較して、最も細胞生存率が低かった。
　また、分散分析の結果、ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ群は、各ゲムシタビン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。
　よって、カフェインクエン酸塩は、ゲムシタビンと組み合わせて添加することにより、ゲムシタビンの抗癌剤効果を増強することが、０．５～８．０ ｎＭの全てのゲムシタビン濃度において確認できた。
２．Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法
　次に、Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法によるＨＯＳ細胞、ＭＫＮ４５細胞及びＯＶＣＡＲ－３における相乗効果の解析結果を、図３５、図３８及び図４１に示す。相乗効果の指標であるＣＩは、図３５、図３８及び図４１におけるＧＥＭ濃度毎の細胞生存率に基づき、ＧＥＭ＋ｃａｆとＧＥＭ＋ＣＡのコンビネーションをＧＥＭ＋ｃａｆＣＡとして算出した。ＣＩ＜１．０のとき、相乗効果が認められる。
　図３５、図３８及び図４１から明らかなように、ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ群は、０．５～８．０ ｎＭの全てのゲムシタビン濃度で、ＣＩ＜１．０となり、ＧＥＭ＋ｃａｆ及びＧＥＭ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
３．Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法
　Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法によるＨＯＳ細胞、ＭＫＮ４５細胞及びＯＶＣＡＲ－３における相乗効果の解析結果を図３６、図３９及び図４２に示す。
　図３６及び図３９のグラフから明らかなように、ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す円形の破線が、それぞれ、ＧＥＭ＋ｃａｆ及びＧＥＭ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置することから、相乗効果が認められた。
　図３６、図３９及び図４２の表から明らかなように、ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ群は、５０～９０％の全てのＥｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅで、ＣＩ＜１．０となり、ＧＥＭ＋ｃａｆ及びＧＥＭ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
　以上の結果より、本発明の癌治療剤において、ゲムシタビンとカフェインクエン酸塩との組合せは、ゲムシタビン単独、ゲムシタビンと無水カフェインとの組合せ、ゲムシタビンとクエン酸との組合せと比較して、有意にゲムシタビンの抗癌剤効果をより増強すること、カフェインクエン酸塩の有する抗癌剤増強効果は、無水カフェインの有する抗癌剤増強効果と、クエン酸の有する抗癌剤増強効果との、単なる相加効果ではなく、相乗効果であることが明らかになった。
［骨肉腫及び軟部肉腫培養細胞におけるカフェインクエン酸塩の抗癌剤による細胞増殖抑制効果の増強の評価］
　以下の方法により、骨肉腫及び軟部肉腫に対するカフェインクエン酸塩の抗癌剤による細胞増殖抑制効果の増強を評価した。
＜材料＞
・細胞株
　骨肉腫としては、ヒト由来のＨＯＳ細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
　軟部肉腫としては、ヒト由来のＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
・抗癌剤
　シスプラチン（和光純薬工業株式会社より入手）を用いた。
・併用薬
　カフェインクエン酸塩（ｃａｆＣＡ、クエン酸カフェイン、ノーベルファーマ株式会社より入手）、無水カフェイン（ｃａｆ、和光純薬工業株式会社より入手）又はクエン酸（ＣＡ、和光純薬工業株式会社より入手）を用いた。
・培地
　ＨＯＳ細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地を用い、ＨＴ１０８０細胞は、ＤＭＥＭを用いた。
＜細胞増殖（ＥｄＵ）アッセイ＞
　ＥｄＵ（５－エチニル－２'－デオキシウリジン）とは、チミジンのヌクレオシド類似体（アナログ）であり、活発なＤＮＡ合成の間にＤＮＡに取り込まれる。すなわち、ＥｄＵを検出することで、活発なＤＮＡ合成が起こっている増殖細胞を検出できる。
　そこで、本実験は、以下の手順で、ＥｄＵを検出することにより、薬剤投与による細胞増殖能の変化を確認し、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡによる細胞増殖抑制効果の増強を調べた。
（１）上記の各癌種培養細胞について、それぞれ３０００～５０００個／１００ μＬの濃度で、上記の培地、３７℃、ＣＯ２　５％の条件で、２４時間、チャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｃ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｆｉｓｈｅｒ）で培養した。
（２）培養後、各癌種培養細胞について、５つの群（Ｎｏｎ－ｄｒｕｇ、ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ、ＣＤＤＰ＋ＣＡ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ）に分け、培養液を入れ替えた。Ｎｏｎ－ｄｒｕｇ群は０．５ ｍＬの培養液を、薬剤投与群はＣＤＤＰが０．２５ μＭ、ｃａｆ、ＣＡ及びｃａｆＣＡがそれぞれ０．５ ｍＭとなるように調整した培養液を０．５ ｍＬ添加した。各群に添加する薬剤のＣＤＤＰ濃度は、水（滅菌精製水）にＣＤＤＰの粉末を溶かして高濃度のものを作成し、その後細胞に応じた培養液で希釈することで０．２５ μＭに調製した。各群の併用薬であるｃａｆ及びＣＡの濃度は、水に粉末を溶かしてそれぞれ高濃度のものを作成し、その後細胞に応じた培養液で希釈することで一律０．５ ｍＭに調製した。ｃａｆＣＡの濃度は、製品が液体であるので、そのまま細胞に応じた培養液で希釈し、ｃａｆ、ＣＡと同様の０．５ ｍＭに調製した。対照として、一部のウェルには薬剤を添加しなかった（Ｎｏｎ－ｄｒｕｇ：０ μＭ）。
（３）薬剤添加後２４時間後に、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ（登録商標）　Ｐｌｕｓ　ＥｄＵ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、並びにＮｕｃＢｌｕｅ（商標）　Ｌｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ　ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（商標）　ｒｅａｇｅｎｔ　（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｂｅｓ　ｂｙ　ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、メーカーのマニュアルに従い、ＤＮＡ合成を行っている細胞の核を染色した（Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）：核を検出、ＥｄＵ検出試薬（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５）：ＤＮＡ合成中の核を検出）。蛍光顕微鏡（ＢＩＯＲＥＶＯ：ＢＺ－９０００、ＫＥＹＥＮＣＥ社）により、Ｈｏｅｃｈｓｔを光らせるためのフィルターはＤＡＰＩ（励起波長：３６０±４０ ｎｍ、ダイクロイックミラー波長：４００ ｎｍ、吸収波長：４６０±５０ ｎｍ）を、ＥｄＵを光らせるためのフィルターはＴＲＩＴＣ（励起波長：５４０±２５ ｎｍ、ダイクロイックミラー波長：５６５ ｎｍ、吸収波長：６０５±５５ ｎｍ）を用い、各群の定点５視野を写真撮影した。Ｈｏｅｃｈｓｔ及びＥｄＵの検出を行った。Ｎｏｎ－ｄｒｕｇと比較して、ＥｄＵ検出シグナルが少なく（弱く）なるほど、細胞増殖を抑制しているといえる。
（４）（３）の写真の画面中の細胞をカウントした。なお、ＥｄＵ発色率は以下の通りに算出した。ＥｄＵ発色率＝ＤＮＡ合成細胞数（ＥｄＵ検出細胞数）／細胞総数（Ｈｏｅｃｈｓｔ検出細胞数）。各群５視野のＥｄＵ発色率の平均値を算出し、Ｎｏｎ－ｄｒｕｇの平均値を１とした比率から、Ｓｔａｔｃｅｌ　３（オーエムエス出版）を用いて、各群のＥｄＵ発色率の有意差について分散分析した。
＜結果＞
　ＨＯＳ細胞及びＨＴ１０８０細胞における結果を、それぞれ図４３及び図４４に示す。
　図４３から明らかなように、ＨＯＳ細胞（骨肉腫）において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、他の群と比較して、最もＨｏｅｃｈｓｔ検出細胞数に対するＥｄＵ検出細胞数の割合が少なかった。すなわち、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、他の群と比較して、最もＨＯＳ細胞（骨肉腫）の細胞増殖を抑制した。
　図４４から明らかなように、ＨＴ１０８０細胞（軟部肉腫）において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、他の群と比較して、最もＨｏｅｃｈｓｔ検出シグナルに対するＥｄＵ検出シグナルの割合が少なかった。すなわち、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、他の群と比較して、最もＨＴ１０８０細胞（軟部肉腫）の細胞増殖を抑制した。
　ＨＯＳ細胞及びＨＴ１０８０細胞における各群のＥｄＵ発色率の有意差の解析結果を図４５に示す。
　図４５から明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、ＨＯＳ細胞及びＨＴ１０８０細胞において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。また、ＨＯＳ細胞において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群のＥｄＵ発色率は、Ｎｏｎ－Ｄｒｕｇ群と比較して約５１％、ＣＤＤＰ群と比較して約５８％、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ群と比較して約６６％、ＣＤＤＰ＋ＣＡ群と比較して約６１％であり、大きく低下した。ＨＴ１０８０細胞において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群のＥｄＵ発色率は、Ｎｏｎ－Ｄｒｕｇ群と比較して約５１％、ＣＤＤＰ群と比較して約５６％、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ群と比較して約７２％、ＣＤＤＰ＋ＣＡ群と比較して約５７％であり、大きく低下した。
　よって、カフェインクエン酸塩は、骨肉腫及び軟部肉腫において、シスプラチンと組み合わせて添加することにより、シスプラチンの細胞増殖抑制効果を増強することが確認できた。
　以上の結果より、本発明の癌治療剤において、シスプラチンとカフェインクエン酸塩との組合せは、骨肉腫及び軟部肉腫において、シスプラチン単独、シスプラチンと無水カフェインとの組合せ、シスプラチンとクエン酸との組合せと比較して、有意にシスプラチンの細胞増殖抑制効果をより増強することが明らかとなった。
［骨肉腫及び軟部肉腫培養細胞におけるカフェインクエン酸塩の抗癌剤によるアポトーシス（細胞死）誘導効果の増強の評価］
　以下の方法により、骨肉腫及び軟部肉腫に対するカフェインクエン酸塩の抗癌剤によるアポトーシス誘導効果の増強を評価した。
＜材料＞
・細胞株
　骨肉腫としては、ヒト由来のＨＯＳ細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
　軟部肉腫としては、ヒト由来のＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
・抗癌剤
　シスプラチン（和光純薬工業株式会社より入手）を用いた。
・併用薬
　カフェインクエン酸塩（ｃａｆＣＡ、クエン酸カフェイン、ノーベルファーマ株式会社より入手）、無水カフェイン（ｃａｆ、和光純薬工業株式会社より入手）又はクエン酸（ＣＡ、和光純薬工業株式会社より入手）を用いた。
・培地
　ＨＯＳ細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地を用い、ＨＴ１０８０細胞は、ＤＭＥＭを用いた。
＜ミトコンドリア膜電位変化（ＴＭＲＥ）アッセイ＞
　ＴＭＲＥ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ，ｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ）とは、膜電位の保たれているミトコンドリア内に蓄積される色素である。ミトコンドリア膜電位が消失すると、ＴＭＲＥは分散され、検出シグナル強度が弱くなる。アポトーシスでは、初期の段階として、ミトコンドリア外膜が破壊され、膜電位の消失が起こるため、ＴＭＲＥの蓄積は少なくなり、ＴＭＲＥ検出シグナル強度が弱くなる。
　そこで、本実験は、以下の手順で、ＴＭＲＥを検出することにより、薬剤投与による膜電位の変化を確認し、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡによるミトコンドリア膜電位の減弱・消失（アポトーシス誘導効果）の増強を調べた。
（１）上記の各癌種培養細胞について、それぞれ３０００～５０００個／１００ μＬの濃度で、上記の培地、３７℃、ＣＯ２　５％の条件で、２４時間、チャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｃ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｆｉｓｈｅｒ）で培養した。
（２）培養後、各癌種培養細胞について、５つの群（Ｎｏｎ－ｄｒｕｇ、ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ、ＣＤＤＰ＋ＣＡ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ）に分け、培養液を入れ替えた。Ｎｏｎ－ｄｒｕｇ群は０．５ ｍＬの培養液を、薬剤投与群はＣＤＤＰが０．２５ μＭ、ｃａｆ、ＣＡ及びｃａｆＣＡがそれぞれ０．５ ｍＭとなるように調整した培養液を０．５ ｍＬ添加した。各群に添加する薬剤のＣＤＤＰ濃度は、水（滅菌精製水）にＣＤＤＰの粉末を溶かして高濃度のものを作成し、その後細胞に応じた培養液で希釈することで０．２５ μＭに調製した。各群の併用薬であるｃａｆ及びＣＡの濃度は、水に粉末を溶かしてそれぞれ高濃度のものを作成し、その後細胞に応じた培養液で希釈することで一律０．５ ｍＭに調製した。ｃａｆＣＡの濃度は、製品が液体であるので、そのまま細胞に応じた培養液で希釈し、ｃａｆ、ＣＡと同様の０．５ ｍＭに調製した。対照として、一部のウェルには薬剤を添加しなかった（Ｎｏｎ－ｄｒｕｇ：０ μＭ）。
（３）薬剤添加後２４時間後に、ＴＭＲＥ－Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（アブカム社）を用いて、メーカーのマニュアルに従い、ＤＮＡ合成を行っている細胞の核を染色した（Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）：核を検出、ＴＭＲＥ：膜電位の保たれているミトコンドリアを検出）。蛍光顕微鏡（ＢＩＯＲＥＶＯ：ＢＺ－９０００、ＫＥＹＥＮＣＥ社）によりＨｏｅｃｈｓｔを光らせるためのフィルターはＤＡＰＩ（励起波長：３６０±４０ ｎｍ、ダイクロイックミラー波長：４００　ｎｍ、吸収波長：４６０±５０ ｎｍ）を、ＴＭＲＥを光らせるためのフィルターはＴＲＩＴＣ（励起波長：５４０±２５ ｎｍ、ダイクロイックミラー波長：５６５ ｎｍ、吸収波長：６０５±５５ ｎｍ）を用い、各群の定点５視野を写真撮影した。Ｈｏｅｃｈｓｔ及びＴＭＲＥの検出を行った。Ｎｏｎ－ｄｒｕｇと比較して、ＴＭＲＥ検出シグナルが弱くなるほど、アポトーシスを誘導しているといえる。
（４）（３）の写真の画面中の細胞をカウントした。なお、１細胞あたりのＴＭＲＥ輝度は以下の通りに算出した。１細胞あたりのＴＭＲＥ輝度＝ＴＭＲＥ輝度（検出シグナル強度）総和／細胞総数（Ｈｏｅｃｈｓｔ検出細胞数）。各群５視野の１細胞あたりのＴＭＲＥ輝度の平均値を算出し、Ｎｏｎ－ｄｒｕｇの平均値を１とした比率から、Ｓｔａｔｃｅｌ　３（オーエムエス出版）を用いて、各群の１細胞あたりのＴＭＲＥ輝度の有意差について分散分析した。
＜結果＞
　ＨＯＳ細胞及びＨＴ１０８０細胞における結果を、それぞれ図４６及び図４７に示す。
　図４６から明らかなように、ＨＯＳ細胞（骨肉腫）において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、他の群と比較して、最もＨｏｅｃｈｓｔ検出細胞数に対するＴＭＲＥ検出シグナル強度が弱かった。すなわち、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、他の群と比較して、最もＨＯＳ細胞（骨肉腫）のアポトーシスを誘導する可能性を確認した。
　図４７から明らかなように、ＨＴ１０８０細胞（軟部肉腫）において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、他の群と比較して、最もＨｏｅｃｈｓｔ検出細胞数に対するＴＭＲＥ検出シグナル強度が弱かった。すなわち、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、他の群と比較して、最もＨＴ１０８０細胞（軟部肉腫）のアポトーシスを誘導する可能性を確認した。
　ＨＯＳ細胞及びＨＴ１０８０細胞における各群の１細胞あたりのＴＭＲＥ輝度の有意差の解析結果を図４８に示す。
　図４８から明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、ＨＯＳ細胞及びＨＴ１０８０細胞において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０５又はｐ＜０．０１）。
　また、ＨＯＳ細胞において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群の１細胞あたりのＴＭＲＥ輝度は、Ｎｏｎ－Ｄｒｕｇ群と比較して約５１％、ＣＤＤＰ群と比較して約６５％、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ群と比較して約７７％、ＣＤＤＰ＋ＣＡ群と比較して約７１％であり、大きく低下した。ＨＴ１０８０細胞において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群の１細胞あたりのＴＭＲＥ輝度は、Ｎｏｎ－Ｄｒｕｇ群と比較して約３５％、ＣＤＤＰ群と比較して約３８％、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ群と比較して約５７％、ＣＤＤＰ＋ＣＡ群と比較して約５２％であり、大きく低下した。
　よって、カフェインクエン酸塩は、骨肉腫及び軟部肉腫において、シスプラチンと組み合わせて添加することにより、ミトコンドリア膜電位が減弱・消失し、シスプラチンのアポトーシス誘導効果を増強する可能性を確認した。
　以上の結果より、本発明の癌治療剤において、シスプラチンとカフェインクエン酸塩との組合せは、骨肉腫及び軟部肉腫において、シスプラチン単独、シスプラチンと無水カフェインとの組合せ、シスプラチンとクエン酸との組合せと比較して、有意にシスプラチンのアポトーシス誘導効果をより増強する可能性を確認した。
［皮膚癌、膵癌及び胆管癌培養細胞におけるカフェインクエン酸塩のシスプラチン効果増強の評価］
　皮膚癌、膵癌及び胆管癌に対するカフェインクエン酸塩の抗癌剤（シスプラチン）効果増強を評価した。以下の細胞株及び培地を用いた他は、実施例１と同様の材料及び方法により試験を行った。
＜材料＞
・細胞株
　皮膚癌としては、ヒト由来のＡ３７５細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社より入手）を用いた。
　膵癌としては、ヒト由来のＰＡＮＣ－１細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
　胆管癌としては、ヒト由来のＴＦＫ－１細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
・培地
　上記の各癌種培養細胞について、Ａ３７５細胞、ＰＡＮＣ－１細胞及びＴＦＫ－１細胞は、いずれもＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
＜結果＞
１．細胞生存率
　図４９、図５０及び図５１に、それぞれＡ３７５細胞、ＰＡＮＣ－１細胞及びＴＦＫ－１細胞における４つの群（ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ、ＣＤＤＰ＋ＣＡ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ）の４５０ ｎｍの吸光度に基づく細胞生存率を示す。図４９、図５０及び図５１から明らかなように、Ａ３７５細胞（皮膚癌）、ＰＡＮＣ－１細胞（膵癌）及びＴＦＫ－１細胞（胆管癌）において、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、全てのＣＤＤＰ濃度で、他の群と比較して、最も細胞生存率が低かった。
　また、分散分析の結果、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、各シスプラチン濃度において、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。
　よって、カフェインクエン酸塩は、シスプラチンと組み合わせて添加することにより、シスプラチンの抗癌剤効果を増強することが、０．１２５～２．０ μＭの全てのシスプラチン濃度において確認できた。
２．Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法
　Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法によるＡ３７５細胞、ＰＡＮＣ－１細胞及びＴＦＫ－１細胞における相乗効果の解析を行った（図省略）。相乗効果の指標であるＣＩは、実施例１と同様に、ＣＤＤＰ濃度毎の細胞生存率に基づき、ＣＤＤＰ＋ｃａｆとＣＤＤＰ＋ＣＡのコンビネーションをＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡとして算出した。ＣＩ＜１．０のとき、相乗効果が認められる。
　ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、０．１２５～２．０ μＭの全てのシスプラチン濃度で、ＣＩ＜１．０となり、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
３．Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法
　Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法によるＡ３７５細胞、ＰＡＮＣ－１細胞及びＴＦＫ－１細胞における相乗効果の解析を行った（図省略）。
　実施例１と同様に、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す円形の破線が、それぞれ、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置することから、相乗効果が認められた。
　ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、５０～９０％の全てのＥｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅで、ＣＩ＜１．０となり、ＣＤＤＰ＋ｃａｆ及びＣＤＤＰ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
［軟部肉腫、皮膚癌、膵癌及び胆管癌培養細胞におけるカフェインクエン酸塩のゲムシタビン効果増強の評価］
　軟部肉腫、皮膚癌、膵癌及び胆管癌に対するカフェインクエン酸塩の抗癌剤（ゲムシタビン）効果増強を評価した。以下の細胞株及び培地を用いた他は、実施例４と同様の材料及び方法により試験を行った。
＜材料＞
・細胞株
　軟部肉腫としては、ヒト由来のＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
　皮膚癌としては、ヒト由来のＡ３７５細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社より入手）を用いた。
　膵癌としては、ヒト由来のＰＡＮＣ－１細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
　胆管癌としては、ヒト由来のＴＦＫ－１細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
・培地
　上記の各癌種培養細胞について、ＨＴ１０８０細胞はＤＭＥＭを用い、Ａ３７５細胞、ＰＡＮＣ－１細胞及びＴＦＫ－１細胞は、いずれもＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
＜結果＞
１．細胞生存率
　図５２、図５３、図５４及び図５５に、それぞれＨＴ１０８０細胞、Ａ３７５細胞、ＰＡＮＣ－１細胞及びＴＦＫ－１細胞における４つの群（ＧＥＭ、ＧＥＭ＋ｃａｆ、ＧＥＭ＋ＣＡ、ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ）の４５０ ｎｍの吸光度に基づく細胞生存率を示す。図５２、図５３、図５４及び図５５から明らかなように、ＨＴ１０８０細胞（軟部肉腫（線維肉腫））、Ａ３７５細胞（皮膚癌）、ＰＡＮＣ－１細胞（膵癌）及びＴＦＫ－１細胞（胆管癌）において、ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ群は、全てのゲムシタビン濃度で、他の群と比較して、最も細胞生存率が低かった。
　また、分散分析の結果、ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ群は、他の全ての群との間で有意差があった（ｐ＜０．０１）。
　よって、カフェインクエン酸塩は、ゲムシタビンと組み合わせて添加することにより、ゲムシタビンの抗癌剤効果を増強することが確認できた。
２．Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法
　Ｍｅｄｉａｎ　Ｅｆｆｅｃｔ法によるＨＴ１０８０細胞、Ａ３７５細胞、ＰＡＮＣ－１細胞及びＴＦＫ－１細胞における相乗効果の解析を行った（図省略）。相乗効果の指標であるＣＩは、実施例１と同様に、ＧＥＭ濃度毎の細胞生存率に基づき、ＧＥＭ＋ｃａｆとＧＥＭ＋ＣＡのコンビネーションをＧＥＭ＋ｃａｆＣＡとして算出した。ＣＩ＜１．０のとき、相乗効果が認められる。
　ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ群は、０．１２５～２．０ μＭの全てのゲムシタビン濃度で、ＣＩ＜１．０となり、ＧＥＭ＋ｃａｆ及びＧＥＭ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
３．Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法
　Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ法によるＨＴ１０８０細胞、A３７５細胞、ＰＡＮＣ－１細胞及びＴＦＫ－１細胞における相乗効果の解析を行った（図省略）。
　実施例１と同様に、ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを示す円形の破線が、それぞれ、ＧＥＭ＋ｃａｆ及びＧＥＭ＋ＣＡの各Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅを結んだ曲線よりも左下に位置することから、相乗効果が認められた。
　ＧＥＭ＋ｃａｆＣＡ群は、５０～９０％の全てのＥｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅで、ＣＩ＜１．０となり、ＧＥＭ＋ｃａｆ及びＧＥＭ＋ＣＡに対して、相乗効果が認められた。
［癌細胞を担持したマウスにおけるカフェインクエン酸塩の抗癌剤効果増強の評価］
　以下の方法により、癌細胞を担持したマウスにおけるカフェインクエン酸塩の抗癌剤効果増強を評価した。さらに、カフェインクエン酸塩及び抗癌剤の濃度を変化させてカフェインクエン酸塩の抗癌剤効果増強を評価した。
＜材料＞
・マウスは、BALB/c-nu（日本チャールズリバー社より入手）を用いた。
・細胞株
　骨肉腫としては、マウス由来のＬＭ８細胞（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣより入手）を用いた。
　軟部肉腫としては、ヒト由来のＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
・抗癌剤
　シスプラチン（和光純薬工業株式会社より入手）を用いた。
・併用薬
　カフェインクエン酸塩（ｃａｆＣＡ、クエン酸カフェイン、ノーベルファーマ株式会社より入手）、無水カフェイン（ｃａｆ、和光純薬工業株式会社より入手）又はクエン酸（ＣＡ、和光純薬工業株式会社より入手）を用いた。
・培地
　ＬＭ８細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地を用い、ＨＴ１０８０細胞は、ＤＭＥＭを用いた。
＜評価方法＞
（１）マウス由来のＬＭ８細胞（５×１０５個）を背部皮下に移植したヌードマウスでの評価系
　下記の表２及び図５６のスケジュールに従い、癌細胞を担持したマウスにおけるカフェインクエン酸塩の抗癌剤効果増強を評価した。
（２）ヒト由来のＨＴ１０８０細胞（５×１０５個）を背部皮下に移植したヌードマウスでの評価系
　下記の表２及び図５６のスケジュールに従い、癌細胞を担持したマウスにおけるカフェインクエン酸塩の抗癌剤効果増強を評価した。
（３）カフェインクエン酸塩低投与量を特徴とするマウス由来のＬＭ８細胞（５×１０５個）を背部皮下に移植したヌードマウスでの評価系
　下記の表３及び図５６のスケジュールに従い、癌細胞を担持したマウスにおけるカフェインクエン酸塩の抗癌剤効果増強を評価した。
（４）抗癌剤低投与量を特徴とするマウス由来のＬＭ８細胞（５×１０５個）を背部皮下に移植したヌードマウスでの評価系
　下記の表４及び図５６のスケジュールに従い、癌細胞を担持したマウスにおけるカフェインクエン酸塩の抗癌剤効果増強を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜評価結果＞
　マウス由来のＬＭ８細胞を背部皮下に移植したヌードマウスでの評価系の結果を図５７及び図５８に示す。
　ヒト由来のＨＴ１０８０細胞を背部皮下に移植したヌードマウスでの評価系の結果を図５９及び図６０に示す。
　カフェインクエン酸塩低投与量を特徴とするマウス由来のＬＭ８細胞を背部皮下に移植したヌードマウスでの評価系の結果を図６１及び図６２に示す。
　抗癌剤低投与量を特徴とするマウス由来のＬＭ８細胞を背部皮下に移植したヌードマウスでの評価系の結果を図６３及び図６４に示す。
　図５７～６４から明らかなように、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、他の群と比較して、腫瘍の成長（体積及び重さ）を非常に強く抑制した。加えて、カフェインクエン酸塩及び抗癌剤の濃度を変化させても、ＣＤＤＰ＋ｃａｆＣＡ群は、他の群と比較して、腫瘍の成長（体積及び重さ）を非常に強く抑制した。
　以上の結果により、本発明の抗癌剤（カフェインクエン酸塩）及び治療方法は、In vitro評価系でも抗癌剤増強効果を有することを確認した。
［安全性の評価］
　以下の方法により、本発明の癌治療剤の安全性を評価した。
＜安全性評価方法＞
　以下の表５に従い、ヌードマウス（担癌マウスではない）の体重推移を評価した。
　外部委託して、前記ヌードマウスを採血、臓器摘出を行い、血液検査及び病理組織学的検査を実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　体重推移の評価を図６５に示す。各郡では体重増加に有意差がなかった。
　血液検査及び病理組織学的検査では、有害事象は認められなかった。
　以上により、本発明の癌治療剤及び癌治療方法は安全性に問題がないことを確認した。
［ＡＤＭによる心筋障害の評価］
　ＡＤＭは心筋障害の有害事象をきたすことがある。そこで、in vitroによるＷＳＴ－８アッセイにより、本発明のＡＤＭを含む癌治療剤による心筋細胞の障害を評価した。本実施例では、心筋細胞の生存細胞数の減少は、ＡＤＭ＋ｃａｆ、ＡＤＭ＋ＣＡ、ＡＤＭ＋ｃａｆＣＡそれぞれが、ＡＤＭ単独と同等であった。
＜総論＞
　以上の結果より、本発明の癌治療剤及び癌治療方法は、以下の有利な効果を有することが明らかになった。
　（１）シスプラチンとカフェインクエン酸塩との組合せは、シスプラチン単独、シスプラチンと無水カフェインとの組合せ、シスプラチンとクエン酸との組合せと比較して、有意にシスプラチンの抗癌剤効果をより増強すること。カフェインクエン酸塩の有する抗癌剤増強効果は、無水カフェインの有する抗癌剤増強効果と、クエン酸の有する抗癌剤増強効果との、単なる相加効果ではなく、相乗効果であること。
　（２）アドリアマイシンとカフェインクエン酸塩との組合せは、アドリアマイシン単独、アドリアマイシンと無水カフェインとの組合せ、アドリアマイシンとクエン酸との組合せと比較して、有意にアドリアマイシンの抗癌剤効果をより増強すること。カフェインクエン酸塩の有する抗癌剤増強効果は、無水カフェインの有する抗癌剤増強効果と、クエン酸の有する抗癌剤増強効果との、単なる相加効果ではなく、相乗効果であること。
　（３）ゲムシタビンとカフェインクエン酸塩との組合せは、ゲムシタビン単独、ゲムシタビンと無水カフェインとの組合せ、ゲムシタビンとクエン酸との組合せと比較して、有意にゲムシタビンの抗癌剤効果をより増強すること。カフェインクエン酸塩の有する抗癌剤増強効果は、無水カフェインの有する抗癌剤増強効果と、クエン酸の有する抗癌剤増強効果との、単なる相加効果ではなく、相乗効果であること。
　（４）シスプラチンとカフェインクエン酸塩との組合せは、骨肉腫及び軟部肉腫において、シスプラチン単独、シスプラチンと無水カフェインとの組合せ、シスプラチンとクエン酸との組合せと比較して、有意にシスプラチンの細胞増殖抑制効果をより増強すること。
　（５）シスプラチンとカフェインクエン酸塩との組合せは、骨肉腫及び軟部肉腫において、シスプラチン単独、シスプラチンと無水カフェインとの組合せ、シスプラチンとクエン酸との組合せと比較して、有意にシスプラチンのアポトーシス誘導効果をより増強する可能性がある。
　（６）安全性に問題がない。
　従来の化学療法よりも強力な治療効果を有する癌治療剤及び癌治療方法を提供する。

Claims (17)

  1. 　有効成分であるカフェインクエン酸塩を、有効成分である抗癌剤と組み合わせたことを特徴とする癌治療剤。
  2. 　前記癌は、原発生悪性骨腫瘍、軟部肉腫、肺癌、胃癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、皮膚癌、卵巣癌、膵癌、胆管癌又は肝細胞癌である、請求項１に記載の癌治療剤。
  3. 　前記抗癌剤が、シスプラチン、ゲムシタビン又はアドリアマイシンである請求項１又は請求項２に記載の癌治療剤。
  4. 　前記癌は、骨肉腫である、請求項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
  5. 　前記癌は、軟部肉腫である、請求項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
  6. 　前記癌は、肺癌である、請求項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
  7. 　前記癌は、膵癌である、請求項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
  8. 　前記癌は、胃癌である、請求項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
  9. 　前記癌は、肝細胞癌である、請求項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
  10. 　前記癌は、子宮癌である、請求項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
  11. 　前記癌は、乳癌である、請求項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
  12. 　前記癌は、卵巣癌である、請求項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
  13. 　前記癌は、皮膚癌である、請求項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
  14. 　前記癌は、胆管癌である、請求項１～３のいずれか１に記載の癌治療剤。
  15. 　有効成分であるカフェインクエン酸塩と有効成分である抗癌剤を癌患者に投与することを特徴とする癌治療方法。
  16. 　前記癌患者は、原発生悪性骨腫瘍、軟部肉腫、肺癌、胃癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、皮膚癌、卵巣癌、膵癌、胆管癌又は肝細胞癌患者である、請求項１５に記載の癌治療方法。
  17. 　前記抗癌剤が、シスプラチン、アドリアマイシン又はゲムシタビンである請求項１５又は請求項１６に記載の癌治療方法。
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