CN102212495B - 一株嗜酸乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株嗜酸乳杆菌及其应用。该嗜酸乳杆菌为Lactobacillus acidophilus，2011年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4649。本发明的嗜酸乳杆菌及其嗜酸乳杆菌制剂主要作为动物的饲料添加剂，其可以用于调节动物肠内微生态平衡，从而具有增强非特异性免疫功能来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、促进动物生长和提高饲料转化率。同时通过配方的筛选，使得本发明制剂成本低，产品质量稳定。

Description

一株嗜酸乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株嗜酸乳杆菌及其应用，特别涉及含有该嗜酸乳杆菌的嗜酸乳杆菌制剂、饲料、其制备方法及其用途，属于生物技术领域。
背景技术
饲料中添加抗生素促进动物生长已有50多年的历史，对集约化畜牧业的发展做出了重大贡献。随着人们生活水平的提高和对健康的重视程度不断加强，人们开始发现抗生素饲料添加剂在带来巨大经济效益的背后所隐藏的日益突出的负面效应，如抗生素引起的内源性感染和二重感染，耐药性的产生，肠道正常菌群的破坏和畜产品及环境中的残留等问题，这些都将对养殖业、饲料工业和动物带来严重威胁，进而通过食物链危及人类的健康。因此，禁止抗生素添加剂在畜牧业中使用的呼声越来越高，研究和开发新的抗生素替代品的工作迫在眉睫。
近年来，抗生素类替代品益生菌、酶制剂、酸制剂等的研究与开发成为近年来绿色饲料添加剂的热点，其中益生菌备受关注。何明清等对病、健仔猪肠道菌群的研究发现腹泻仔猪肠道中的乳酸杆菌(Lactobacillus)数量显著下降，大肠杆菌数显著上升。使用乳酸杆菌益生素可以调整胃肠道微生态平衡，所以乳酸杆菌是一种很有前途的益生素生产菌种。乳酸杆菌是一类能从可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的总称，其中乳酸杆菌属和双歧杆菌属是动物胃肠道中的优势菌群，这些菌属的益生素制剂应用历史最早，种类很多，其中包括乳酸菌发酵饲料、乳酸菌粉及乳酸菌提取物。能够作为饲料添加剂的乳酸杆菌有嗜酸乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌、短小乳酸杆菌、莱氏乳酸杆菌、植物乳酸杆菌及纤维二糖乳酸杆菌。现代科技发展，使人们对乳酸杆菌优良特征的认识更加深入，对其开发利用的热潮连绵不断。在畜牧业中，乳酸杆菌的开发利用也不断深化，结合乳酸杆菌的特征，开辟出各种应用途径。乳酸杆菌分布广，在动物消化道中含有大量的乳酸杆菌。研究表明，有些乳酸杆菌可以在动物的消化道内存活，对动物有益生作用。美国FDA和AAFCO在1989年公布的安全微生物品种共43种，其中乳酸杆菌占12种，中华人民共和国农业部1999年公布允许使用的12种饲用微生物中有3种是乳酸杆菌。在美国，益生素工业上应用的产品57％含有乳酸杆菌属。大连医学院康白等开发研制的乳酶生，是一种乳酸杆菌的干燥制剂，保存期间稳定性好，每克产品含活乳酸杆菌约107CFU，仔猪每日口服3-4克可以有效治疗腹泻。目前猪肠道的正常菌群的菌种有：嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)、罗伊氏乳酸杆菌(L.reuteri)、短乳酸杆菌(L.brevis)、纤维二糖乳酸杆菌(L.cellobiosus)、发酵乳酸杆菌(L.fermentum)、唾液乳酸杆菌(L.salivirius)，其中最主要的是嗜酸乳酸杆菌和罗伊氏乳酸杆菌。乳酸杆菌的数量、种类和位置对于预防和控制疾病具有重要的作用。乳酸杆菌能合成维生素，辅助食物消化，促进宿主代谢，克服腐败过程，降低宿主血胆固醇水平，增强宿主对乳糖的耐受力等生理意义，而且不具有病原性。乳酸杆菌能抑制肠道腐败菌活动，乳酸杆菌产生乳酸能够降低pH值，抑制其他微生物生长。
乳酸菌类产品的开发利用已成为饲料工业一个活跃领域，但也存在一些亟待解决的问题如产品质量不稳定、活菌数量不够、消化率低和成本高等。因此，培养繁殖力强、耐受能力强、产生较高消化酶的菌种以生产出产量高、质量稳定、在体温范围内具有较高活性的乳酸杆菌类产品，以提高其利用率，同时改进工艺、降低生产成本、提高产品的市场竞争力以及对于畜牧业的发展和人类的健康都非常有意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021及其应用。
本发明所提供的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.4649。该嗜酸乳杆菌抗逆性强、抗杂菌能力强、具有益生特性。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021具有以下特性：
(1)、在pH2.0处理6小时之后的存活率为69.3％；
(2)、在75℃水浴中15min中存活率为62.7％；
(3)、在室温下放置1个月后存活率分别为60％
(4)、接种肉汤培养基在37℃，5％CO2培养箱中培养后24小时达到最高生长浓度为1011cfu/ml(图1)。
本发明的另一个目的是提供一种嗜酸乳杆菌制剂。该制剂能够替代现有的饲用抗生素，并具有抗病、促生长的作用。
本发明所提供的嗜酸乳杆菌制剂，它的活性成分为所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021。
所述制剂具有下述至少一种用途：
1)制备调解动物肠内微生态平衡的产品；
2)制备增强非特异性免疫的产品；
3)提高动物饲料转化效率；
4)促进动物对营养物质的消化和吸收；
5)制备降低动物腹泻发病率的产品；
6)制备提高动物生产性能的产品。
上述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021或制剂可用于制备大肠杆菌抑制剂。
所述大肠杆菌抑制剂中的大肠杆菌具体可为大肠杆菌K88、大肠杆菌K99或大肠杆菌987P。
所述提高动物生产性能可为提高断奶仔猪的生产性能，具体体现为提高仔猪平均日增重和/或仔猪平均日采食量。
所述降低动物腹泻发病率具体可体现为降低大肠杆菌感染仔猪腹泻率；所述降低腹泻指数具体可体现为降低大肠杆菌感染仔猪腹泻指数。
所述制剂具体可由所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和载体组成；所述载体具体可为磷酸钙、稻壳粉、麸皮、米糠、脱脂奶粉、麦芽糊精、蔗糖、甘油和淀粉中的至少一种。
所述制剂中，所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和所述载体的配比可为：(107-1010)cfu∶(0.3-5)克载体。
所述载体可经过微粉化处理。经过微粉化处理后，90％的粉体粒度小于100μm，平均粒径小于50μm，所述平均粒径为50％粉体粒径。
所述制剂具体可为下述任一种：
A)由所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和磷酸钙组成的嗜酸乳杆菌制剂A，所述嗜酸乳杆菌制剂A中，二者的配比为5克磷酸钙：(107-1010)cfu所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；
B)由所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和稻壳粉组成的嗜酸乳杆菌制剂B，所述嗜酸乳杆菌制剂B中，二者的配比为0.5克稻壳粉：(107-1010)cfu所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；
C)由所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和所述载体组成的嗜酸乳杆菌制剂C，所述嗜酸乳杆菌制剂C中，二者的配比为0.3克所述载体：(107-1010)cfu所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；所述载体由稻壳粉和脱脂奶粉组成，所述稻壳粉和脱脂奶粉的质量比为2∶1；
D)由所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和所述载体组成的嗜酸乳杆菌制剂D，所述嗜酸乳杆菌制剂D中，二者的配比为0.3克所述载体：(107-1010)cfu所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉和麦芽糊精组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉和麦芽糊精的质量比为1∶1∶1；
E)由所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和所述载体组成的嗜酸乳杆菌制剂E，所述嗜酸乳杆菌制剂E中，二者的配比为0.3克所述载体：(107-1010)cfu所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；所述载体由脱脂奶粉和麸皮组成，所述脱脂奶粉和麸皮的质量比为1∶1；
F)由所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和所述载体组成的嗜酸乳杆菌制剂F，所述嗜酸乳杆菌制剂F中，二者的配比为0.4克所述载体：(107-1010)cfu所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉和麸皮的质量比为2∶1∶1。
本发明所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021或所述制剂的动物饲料可以作为添加剂用于制备动物饲料，其中的动物包括但不限于猪、牛、羊、鸡等各种动物。该饲料具有与抗生素饲料类似的功能，但无抗生素饲料的副作用。
所述动物饲料中，每克所述动物饲料中具体可含有107CFU以上的所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021。
本发明的嗜酸乳杆菌及其嗜酸乳杆菌制剂主要作为动物的饲料添加剂，其可以替代现有动物日粮中的抗生素，调节动物肠内微生态平衡，从而具有增强非特异性免疫功能来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、降低腹泻、促进动物生长和提高饲料转化率、提高断奶仔猪的生产性能。
本发明的嗜酸乳杆菌及其嗜酸乳杆菌制剂对防治动物消化***疾病起到保健作用，同时对幼年动物可刺激其胃肠道发育，所以将之作为饲料添加剂应用在饲料中能起到抗病促生长的作用。同时，本发明的嗜酸乳杆菌及其嗜酸乳杆菌制剂无耐药性和药物在动物产品中残留从而对人类的健康产生潜在的危害的可能，是一种有前途的绿色饲料添加剂。
下面结合具体实施例详细描述本发明，所述实施利用于理解而不是限制本发明。
保藏说明
菌种名称：嗜酸乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus acidophilus
菌株编号：AI2021
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2011年3月11日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4649
附图说明
图1为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021的发酵生长曲线；
图2为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021抑制大肠杆菌实验的平板示意图
具体实施方式
本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021，可先接种于Rogosa SL琼脂的Hungates滚管培养基中进行培养，得到的种子培养物再接种于Rogosa SL肉汤厌氧培养基里进行培养。
其中的所述的琼脂培养基为适合嗜酸乳杆菌培养的任何培养基，本领域技术人员都知晓何种培养基适合嗜酸乳杆菌培养。具体可选用Rogosa SL琼脂的Hungates滚管培养基，这里所述的Rogosa SL琼脂的Hungates滚管培养基理解为在Rogosa SL完全选择性培养基的基础上，适当修改的适合嗜酸乳杆菌培养的培养基。所述适合嗜酸乳杆菌培养的培养基可以为现有技术任何适合嗜酸乳杆菌培养的培养基，这为本领域技术人员所知晓，具体可为：胰蛋白胨1-20g，牛肉膏1-20g，酵母浸粉1-15g，葡萄糖1-20g，***糖1-15g，蔗糖1-15g，醋酸钠5-25g，枸橼酸钠1-10g，磷酸二氢钾1-15g，七水硫酸镁0.1-1.5g，四水硫酸锰0.1-1.5g，硫酸亚铁0.01-0.10g，吐温-800.1-2.0mL，琼脂5-20g，蒸馏水100-2500mL；优选为胰蛋白胨5-15g，牛肉膏5-15g，酵母浸粉3-10g，葡萄糖5-15g，***糖3-10g，蔗糖3-10g，醋酸钠10-20g，枸橼酸钠1-5g，磷酸二氢钾1-10g，七水硫酸镁0.1-1g，四水硫酸锰0.1-1g，硫酸亚铁0.01-0.05g，吐温-800.5-1.5mL，琼脂10-15g，蒸馏水500-2000mL；更优选为胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，***糖5g，蔗糖5g，醋酸钠15g，枸橼酸钠2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，硫酸亚铁0.03g，吐温-80 1mL，琼脂13g，蒸馏水1000mL。
其中的液体培养基为适合嗜酸乳杆菌培养的任何培养基，本领域技术人员也知晓这种液体培养基，其中可优选肉汤厌氧培养基，这里所述的肉汤厌氧培养基理解为在普通肉汤厌氧培养基的基础上，适当修改的培养基，所述适当修改的培养基可以为现有技术任何适合嗜酸乳杆菌培养的培养基，这为本领域技术人员所知晓，优选RogosaSL肉汤厌氧培养基，其中培养基的配方为：胰蛋白胨5-15g，酵母浸粉3-10g，葡萄糖5-15g，***糖3-10g，蔗糖3-10g，醋酸钠10-20g，枸橼酸钠1-5g，磷酸二氢钾1-10g，七水硫酸镁0.1-1g，四水硫酸锰0.1-1g，硫酸亚铁0.01-0.05g，吐温-80 0.5-1.5mL，蒸馏水500-2000mL；优选为胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，***糖5g，蔗糖5g，醋酸钠15g，枸橼酸钠2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，硫酸亚铁0.03g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL。
应用上述培养基，本领域技术人员一般都知晓具体培养过程，这里优选为上述Rogosa SL琼脂培养基的Hungates滚管中培养，优选在培养箱中，37℃下，培养15-72小时；其中的嗜酸乳杆菌扩大培养优选在Rogosa SL肉汤厌氧培养基中，37℃下培养15-80小时。上述培养基的pH值可为6-7。
所述的嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649菌种液为经过一次发酵、二次发酵或三次发酵所得的菌种液。其中所述的一次发酵、二次发酵或三次发酵的培养基中碳氮磷比为100∶5～10∶0.5～5；优选100∶10∶2.8。
所述的嗜酸乳杆菌制剂培养基，为任何适合制作嗜酸乳杆菌制剂的培养基，其培养基成分优选为：糖蜜、蔗糖、葡萄糖，三者的重量比为20-50份∶10-70份∶10-30份。
所述的嗜酸乳杆菌制剂培养基，为任何适合制作嗜酸乳杆菌制剂的培养基，其培养基成分在上述培养基的基础上还包括蛋白胨，其与糖蜜的重量比为10-25份∶15-55份。
所述的嗜酸乳杆菌制剂培养基，为任何适合制作嗜酸乳杆菌制剂的培养基，其培养基成分在上述培养基的基础上还包括磷酸和/或可溶性磷酸盐，其与糖蜜的重量比为10-25∶15-55。
所述的后处理为将嗜酸乳杆菌菌液经过一次、二次、三次发酵扩繁，将发酵菌液加入磷酸盐缓冲液中，喷雾干燥即可，所述的磷酸盐缓冲液的pH为6.5～6.7。
本发明的动物饲料包括：常用动物饲料和本发明的嗜酸乳杆菌制剂制剂。其中嗜酸乳杆菌制剂的含量至少为0.001％，优选为0.001-3％，更优选0.01％-2％，最优选0.05％-0.2％。本发明的嗜酸乳杆菌制剂可以同目前市面上任何常用动物饲料进行配合，即本发明所述动物饲料保护范围不为配合的常用动物饲料种类所限制。
然而其中的常用动物饲料可优选为日粮，进一步优选为猪用日粮、鸡用日粮、反刍动物用日粮和水产动物用日粮。对于不同的动物，其日粮的配方各不相同，但是，现有技术中公开的任何日粮都可以作为本发明的动物饲料，其配方都是该领域的公知常识。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021的分离和鉴定
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021是从猪胃肠道粘膜中提取、分离、筛选、纯化得到的。
1.1试验材料
取健康仔猪胃肠道粘膜5cm2(胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠)，在灭菌杯中，用无菌生理盐水冲洗粘膜上的食糜，将粘膜浸入装有15mL HEPES缓冲液的烧杯中，用镊子来回摇动粘膜5min后，得到上清液。
1.2培养基
1.2.1Rogosa SL琼脂的培养基
胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，***糖5g，蔗糖5g，醋酸钠15g，枸橼酸钠2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，硫酸亚铁0.03g，吐温-80 1mL，琼脂13g，用蒸馏水定容至1000mL。
1.2.2Rogosa SL肉汤厌氧培养基
胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，牛肉膏10g，葡萄糖10g，***糖5g，蔗糖5g，醋酸钠15g，枸橼酸钠2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，硫酸亚铁0.03g，吐温-80 1mL，用蒸馏水1000mL。
1.3革兰氏染色
用无菌注射器吸取少量Rogosa SL肉汤培养物，滴在载玻片上，在酒精灯火焰上轻轻烘干固定。滴加结晶紫染色液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液媒染，作用1min，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮∶95％乙醇＝3∶7)脱色30s，水洗；滴加沙黄染色液复染1min，水洗，待干，在普通光学显微镜上观察，菌体成红色为阴性，紫色的为阳性。呈革兰氏阳性形态一致的杆菌，进一步进行接触酶试验。
1.4接触酶试验
作Rogosa SL斜面培养基，取培养物约0.2m L注入装有Rogosa SL培养基斜面，5％CO2培养箱，37℃培养24h，长出菌落后，将3％过氧化氢溶液滴加到菌落上，若没有气泡产生说明是阴性，若有气泡产生说明是阳性。通过Rogosa SL上厌氧培养的培养物经革兰氏染色阳性和接触酶试验阴性可初步认为是乳酸杆菌属。
1.5耐酸性能选育
制备含pH2.0和pH2.5、pH3.0、pH3.5的Rogosa SL肉汤培养基，分别接种已培养24h的菌种，接种量1％，于37℃培养24h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐酸。从接种开始和第8h用无菌注射器取出1mL进行梯度稀释至10-5后，取0.3mL稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，平皿放置在37℃，5％CO2培养箱中，培养24h，计算存活率。然后镜检看是否染菌。能够生长的嗜酸乳杆菌的最初分离样品保存在-80℃冰箱备用。
1.6耐胆盐性能选育
制备含猪胆盐0.3％的麦芽汁培养基，接种已培养24h的菌种，接种量1％，于28℃培养24h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐胆盐。然后镜检看是否染菌。能够生长的菌株的最初分离样品保存在-80℃冰箱备用。
1.7耐高铜性能选育
制备含有0.1％五水硫酸铜的肉汤培养基，接种已培养24h的菌株培养物，接种量1％，于28℃培养12-72h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐高铜。然后镜检看是否染菌。能够生长的嗜酸乳杆菌的最初分离样品保存在-80℃冰箱备用。
1.8耐高锌性能选育
制备含有1％氧化锌的肉汤厌氧培养基，接种已培养24h的乳酸杆菌培养物，接种量1％，于28℃培养12-72h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐高锌。然后镜检看是否染菌。能够生长的嗜酸乳杆菌的最初分离样品保存在-80℃冰箱备用。
2.结果与讨论
2.1嗜酸乳杆菌的分离与鉴定
本试验从健康仔猪胃肠道粘膜中利用经过盐酸校正后Rogosa SL完全选择性培养基筛选出7009株乳酸杆菌株。将仔猪胃肠道粘膜在HEPES缓冲液中摇动5min，用无菌注射器吸取0.2mL上清液装入含Rogosa SL琼脂的滚管中培养24h，再挑去白色菌落在厌氧无菌Rogosa SL肉汤里进行培养。经过革兰氏染色和接触酶试验，证明乳酸杆菌是健康仔猪胃肠道的优势菌群，说明经盐酸校正的Rogosa SL培养基适合分离胃肠道粘膜乳酸杆菌。
菌种的筛选是及其烦琐的过程。大多数乳酸菌的选育过程是从消化道上皮分离益生菌，这样便可已获得具有良好定植效果的菌种。
2.2耐酸性能选育
通过耐酸性能选育，有573株乳酸杆菌可以在pH2.0的Rogosa SL培养基中生长繁殖，淘汰率为30％。这说明胃肠道的大多数嗜酸乳杆菌耐酸性能较好，有70％可以在仔猪的胃肠道中进行繁殖。乳酸杆菌一般通过定植在消化道上皮发生益生特性。因此，如果菌种对胃酸没有耐受性很难对动物的生产性能产生良好的作用。
2.3耐胆盐性能选育
将通过耐酸性能选育的573株乳酸杆菌进行耐胆盐性能选育，有95株乳酸杆菌可以在含胆盐0.3％的Rogosa SL培养基中生长繁殖，淘汰率为83％。研究表明，胆盐是肠乳酸杆菌在动物胃肠道内遇到的比胃酸更不利的因素。Chou和Weimer研究发现用胆盐选择性驯化乳酸杆菌对胆盐的耐受力是有效的，经过几代胆盐驯化之后得到的乳酸杆菌耐胆盐的能力比亲代乳酸杆菌强，乳酸杆菌容易对胆盐性能产生耐受性，且具有一定的遗传性，选育出耐胆盐的菌在生产中具有重要的意义。
2.4耐高铜性能选育
将通过耐胆盐性能选育的95株乳酸杆菌进行耐高铜性能选育，有79株乳酸杆菌可以在250mg/kg铜的Rogosa SL培养基中生长繁殖，淘汰率为17％。证明该乳酸杆菌具有较强的耐高铜特性。由于高铜日粮具有促生长的作用，是目前我国比较普遍使用的日粮，因此选择具有耐高铜的嗜酸乳杆菌是极其必要的。
2.5耐高锌性能选育
将通过耐高铜性能选育的79株乳酸杆菌进行耐高锌性能选育，有71株乳酸杆菌可以在含1％氧化锌的肉汤厌氧培养基中生长繁殖，淘汰率为10％。高锌具有防止腹泻、促进生长的作用，因此在我国利用氧化锌来配制仔猪饲料，尤其是断奶仔猪饲料的厂家很多。因此选育出耐高锌的乳酸杆菌菌株也是必要的。
3.小结
通过本试验获得71株来源于仔猪胃肠道粘膜，对消化道内环境有一定抵抗能力的嗜酸乳杆菌菌株，这为以后的选种工作打下了基础。
实施例2、发酵乳酸杆菌的生物学特性的研究
1.1生长曲线
MRS肉汤：蛋白胨，10g；牛肉浸膏，10g；酵母浸粉，5g；磷酸氢二钾，2g；枸椽酸二铵，2g；葡萄糖，20g；七水硫酸镁，0.58g；四水硫酸锰，0.25g；醋酸钠，5g；蒸馏水，1000mL，在500mL锥形瓶里装300mL MRS肉汤。按1％接种量接种乳酸杆菌培养物，在前24h每隔1h，24h之后在第28、32、36、40、44、48h取样，取1mL培养液进行梯度稀释后，在10-2～10-6稀释度取0.3mL稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，5％CO2的培养箱中，培养24h，取平皿中的菌落数50～150的稀释度作为计算用，每个梯度做3个平行样，以平均值表示结果。每毫升细菌浓度以对数值表示。
1.2耐酸存活率
MRS肉汤配方同实施例2中1.1，用冰醋酸调节pH至5.4，再用浓盐酸将pH调节至2.0。置于Hungates滚管中，每个管装20mL肉汤，制成厌氧无菌肉汤。凉下来后每管中加1mL乳酸杆菌16h的培养物，在开始时、2h、4h、6h和8h分别取样，测定存活率。用无菌注射器取出1mL进行梯度稀释后，在10-4～10-7稀释度取0.3mL稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，5％CO2的培养箱中，培养24h，取平皿中的菌落数50～150的平皿计数，以平均值表示结果。
存活率的计算公式为：
S酸＝nx/n0
S酸为经过pH2.0处理后不同时间的乳酸杆菌存活率；n0为pH2.0处理前每毫升活菌数；nx为pH2.0处理2、4、6、8h后每毫升活菌数。
1.3耐热存活率
MRS肉汤配方同步骤1.1，调节pH为6.7，置于Hungates滚管中，每个管装20mL肉汤，制成厌氧无菌肉汤。每管中加1mL乳酸杆菌培养16h后的培养物，放置在37℃培养箱中16h后，取样进行活菌计数培养，同时将Hungates管迅速放置在75℃水浴中加热15min，取样进行活菌计数。用无菌注射器取出1mL进行梯度稀释后，在10-4～10-7稀释度取0.3mL稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，5％CO2培养箱中，培养24h，取平皿中的菌落数为50～150的平皿计数，以平均值表示结果。
存活率的计算公式为：
S热＝n1/n0；
S热为经过75℃处理后的乳酸杆菌存活率；n0为加热处理前每毫升活菌数；n1为加热处理15min后每毫升活菌数。
1.4贮藏存活率
MRS肉汤配方同步骤1.1，调节pH为6.7，置于Hungates滚管中，每个管放置20mL的MRS肉汤，制成厌氧无菌肉汤后，每管中加1mL乳酸杆菌培养16h的培养物，放置在37℃培养箱中16h后，取样1mL进行活菌计数。室温下放置1个月后，取样1mL进行活菌计数培养。计数方法用无菌注射器取出1mL进行梯度稀释后，在10-4～10-7稀释度取0.3mL稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，5％CO2的培养箱中，培养24h，取菌落数为50～150个的平皿计数，以平均值表示结果。
存活率的计算公式为：
S贮＝n1/n0
S贮为经过1个月贮藏后的乳酸杆菌存活率；n0为贮藏前每毫升活菌数；n1为贮藏1个月后每毫升活菌数。
2统计方法
采用中国均匀设计学会与香港浸会大学统计学研究和咨询中心共同开发的均匀设计软件4.0版，用二次回归和逐步回归的方法对各因素的解进行最优化。
3结果与讨论
3.1嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021生长曲线
生长曲线主要反映一种微生物的生长特性，微生物的生长一般经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段，这是一种典型的生长曲线模型。延迟期是微生物对新的生长环境的适应过程，在这一过程中，微生物表现为数量不变或下降，对其自身的大分子和小分子的组成进行调整，同时也会产生特定的物质如酶等来适应新的环境。对数生长期是微生物对新的环境适应之后，生长繁殖速度呈几何级数的阶段，是数量增长最快的一个阶段，表现为菌体数量和重量的增加。但是到了对数期的末期，由于菌体生长代谢对营养物质的消耗和有毒产物的积累，细菌的生长繁殖速率下降。稳定期是细菌生长速率与死亡速率趋于平衡的阶段。衰亡期细菌数量明显下降。测定生长曲线对于确定合适的发酵时间具有重要作用
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021的生长曲线如图1所示，从图1可见，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021的浓度在开始时缓慢上升，经过3h之后从105个数量级迅速上升，到第18h超过1011个数量级，到第32h，细菌的数量级开始缓慢下降到1011数量级以下，主要原因是培养基营养物质浓度下降和有害代谢产物增加引起菌体死亡增加，生长繁殖的菌体数量比死亡的菌体数量更多，导致总的活菌数量减少。从生长曲线可以看出，嗜酸乳杆菌的最佳收获期是在培养后18～23h，从图中可以看出活菌数维持在1011数量级达15h左右，而维持在1010数量级达26h左右。
3.2嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021耐酸存活率
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021经pH2.0处理不同时间的菌体浓度见表1。
从表1可见，在pH2.0处理的前6h，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021的数量下降缓慢，存活率从87.9下降到69.3％。嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)AI2021是一株分离自仔猪空肠粘膜的菌种，这个存活率对于其耐过胃酸的抑制作用或杀灭作用应是较为理想的，也表明该菌株可以有足够数量的活菌数到达空肠。
表1  pH2.0处理不同时间对嗜酸乳杆菌活菌浓度的影响(单位：CFU/ml)
Figure BDA0000055557630000111
3.3嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021耐热存活率
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021经过75℃处理15min之后的存活率达到62.7％。一般仔猪饲料的制粒温度为70℃～85℃之间，耐高温之后存活率低也是乳酸杆菌作为饲料添加剂的主要限制性因素之一，根据Fuller(1989)的研究，乳酸杆菌经过75℃处理10min之后基本上没有活菌。从耐热存活率看，本试验选育的发酵乳酸杆菌可以耐受制粒时的高温，作为饲料添加剂将会有较好的前途。
3.4嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021耐贮藏存活率
经过一个月的贮藏之后，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021的存活率为60％。
4小结
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021在发酵后18到23h是合适的菌体收获期。耐热存活率为62.7％，耐贮藏存活率为60％，耐酸存活率69.3％，综合抗逆存活率25.7％。
实施例3、乳酸杆菌抗大肠杆菌的选育
1.1乳酸杆菌代谢产物抑制大肠杆菌能力的选育
大肠杆菌(K88、K99和987P)购自中国兽药监察所。K88在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为：CMCC44742，K99在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为：CMCC44820，987P在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为：CMCC44317。
乳酸杆菌：71株耐酸、耐高锌、耐高铜和胆盐的嗜酸乳杆菌。
培养基：麦康凯(MacConkay)培养基。
在Hungates管里加MRS肉汤约15mL，充二氧化碳，制成无菌厌氧MRS肉汤。每个管中分别接种从健康仔猪胃里分离到的71株耐酸、耐高锌耐高铜和胆盐的嗜酸乳杆菌，乳酸杆菌经18h培养后按1％接种于肉汤中，在37℃培养箱里培养24h后，置4℃冰箱保存备用。
抑制大肠杆菌试验：制作麦康凯培养基，加热溶解后在121℃高压灭菌15min后，无菌倾倒平皿。用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域，每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌培养液(4.0×108CFU/mL)于培养基表面，然后在距平皿中线约3em的地方挖一宽为0.5em的沟，沟与接种划线垂直，用热接种棒补底，如图2所示。分别用不同的乳酸杆菌培养物将沟填满(不能溢出)，置普通培养箱37℃培养18h后，观察出现大肠杆菌菌落的位置，大肠杆菌的菌落为红色，测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟的距离。每个乳酸杆菌作两个平行样，以平均值表示结果。
1.2乳酸杆菌与大肠杆菌混合培养抑制作用选育
大肠杆菌(K88、K99和987P)来源与1.1节同。
乳酸杆菌：71株肠代谢产物对大肠杆菌具有较强抑制作用的乳酸杆菌。
大肠杆菌的检测培养基：麦康凯(MacConkay)培养基与1.1同。
乳酸杆菌接种于厌氧无菌MRS肉汤中，37℃培养24h后，置4℃冰箱保存备用。
1.3不同浓度乳酸杆菌对大肠杆菌的抑制
随机选择一株乳酸杆菌，取5mL培养物(8.2×109CFU/mL)分别与5、10、15mL营养肉汤混合，制成3个含不同乳酸杆菌培养物浓度的营养肉汤，接种大肠杆菌，接种量为培养液的5％，置37℃，5％CO2培养箱培养4、8和18h后，分别用无菌注射器取出培养液，培养液经梯度稀释成10-2～10-5后，每个稀释度作4个平行样，取0.3mL稀释液，用“L”棒均匀涂布于麦康凯琼脂平板上，置于37℃，普通培养箱培养18h，取菌落数在50～150个的平皿计数，以平均值表示结果，计算每毫升培养液中大肠杆菌的数量。
2.3.2含1/4乳酸杆菌的营养肉汤中乳酸杆菌与大肠杆菌的数量关系
取5mL乳酸杆菌培养物(108CFU/mL)分别与15mL营养肉汤混合，接种24h大肠杆菌培养物，接种量分别为培养液的10％(107CFU/mL)，起始混合液中乳酸杆菌的数量为大肠杆菌的10倍，用0.1N NaOH溶液调节培养液的pH为7.0，置37℃培养箱培养24h后，分别用无菌注射器取出培养液，培养液经梯度稀释至10-5，10-6，10-7后，取0.3mL稀释液用“L”棒均匀涂布于MRS琼脂培养基上，每个梯度的培养液作3个平行样，MRS琼脂培养基(pH5.4)置37℃、5％CO2培养箱培养18h，取菌落数在50～150个的平皿计数，以平均值表示乳酸杆菌的数量，计算每毫升培养液中乳酸杆菌的数量。培养24h后直接用无菌注射器取1mL培养液经梯度稀释至10-2后，取0.3mL稀释液置于麦康凯琼脂上，用“L”棒均匀涂布，每个管做3个平行样，将平板置于37℃，普通培养箱培养18h，计算每个平板的大肠杆菌菌落数，以平均值表示结果。
2结果
2.1乳酸杆菌代谢产物抑制大肠杆菌的选育
乳酸杆菌代谢产物抑制大肠杆菌的效果以离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟的距离为指标，距离越大，说明抑菌效果越好。本试验所采用的平皿挖沟法是对经典的平皿挖孔法的改进，基本原理是放置在沟中的抗菌物质能渗透过琼脂来抑制大肠杆菌，随着离沟距离的增大，能渗透过去的抗菌物质的浓度就越小。大肠杆菌菌落与小沟的距离越大，说明乳酸杆菌代谢产物所含抗菌物质的抑菌能力越强。用平皿挖沟法在同一平皿可以同时测定乳酸杆菌代谢产物对3株大肠杆菌的抑制作用，而用平皿挖孔法在同一平皿只能测定对一株大肠杆菌的抑制作用。63株乳酸杆菌对大肠杆菌K88和K99的抑菌距离在1.0～2.6cm之间。进一步研究它们与大肠杆菌混合培养的数量关系。其中，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021对大肠杆菌K88、987P和K99的抑菌距离分别为2.0cm、2.3cm、1.8cm。
2.2乳酸杆菌与大肠杆菌体外培养的数量关系
2.2.1不同比例嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021培养物与大肠杆菌在混合培养条件下的数量关系
结果见表2。
表2  营养肉汤中含不同比例嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021培养液对大肠杆菌的抑制作用(单位：CFU/mL)
Figure BDA0000055557630000131
Figure BDA0000055557630000141
2.2.2乳酸杆菌与大肠杆菌在混合培养条件下的数量关系
表3  乳酸杆菌和大肠杆菌混合培养的数量关系(单位：CFU/mL)
从表3中可以看出，不同浓度的乳酸杆菌与大肠杆菌混合培养时对大肠杆菌的抑制作用相似，说明含有25％的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021的营养肉汤足以用来做抑制大肠杆菌的试验。嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)AI2021与大肠杆菌在含25％嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)AI2021培养物的营养肉汤中与大肠杆菌混合培养的数量关系见表8。从表中可见，AI2021对三种血清型大肠杆菌具有相对较强的抑菌能力。体外试管培养时不同微生物间的数量关系可以作为反映微生物在体内相互作用的一种指标。
本发明筛选到的编号为AI2021的菌株具有以下生物学特征：
表4  嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021生物学特性
Figure BDA0000055557630000143
根据以上生物学特征，将AI2021鉴定为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)。已将该菌株于2011年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4649。
实施例4、嗜酸乳杆菌制剂的制备
1、将嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649接种于葡萄糖营养肉汤，其组分为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，并用醋酸调节pH至6.7，置普通培养箱37度培养18-24小时后，用无菌水梯度稀释，得到浓度为(107-1010)cfu/g的菌种液。
按重量计，将含嗜酸乳酸杆菌CGMCC No.4649的菌种液1份、磷酸钙5份混合，经干燥粉碎，即得到由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和磷酸钙组成的嗜酸乳杆菌制剂A。该嗜酸乳杆菌制剂A中，二者的配比为5克磷酸钙：1010cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021。
2、将嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649接种于Rogosa SL肉汤中培养，其组分包括：10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉、10g葡萄糖、5g***糖、5g蔗糖、15g乙酸钠、2g枸橼酸铵、6g磷酸二氢钾、0.30g无水硫酸镁、0.12g硫酸锰、0.03g硫酸亚铁、1mL吐温-80、1000ml蒸馏水，并用醋酸调节pH至6.7；置普通培养箱37℃培养18-24小时后，用无菌水梯度稀释，得到浓度为(107-1010)cfu/g的菌种液。
按重量计，将含嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649的菌种液10份、稻壳粉5份混合，喷雾干燥，稻壳粉事先进行过微粉化处理，即得到由嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)AI2021和稻壳粉组成的嗜酸乳杆菌制剂B。该嗜酸乳杆菌制剂B中，二者的配比为0.5克稻壳粉：107cfu权利要求1所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)AI2021。
3、将步骤1中培养得到的嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649置于发酵罐中进行一级发酵，37℃培养18-24小时后，用无菌水梯度稀释，得到浓度为(107-1010)cfu/g的菌种液。发酵罐培养基组分为脱脂奶粉、蛋白胨、蔗糖、乳糖、甘油、淀粉，六者的重量比为10份∶15份∶1份∶3份∶1份∶2份。另加适量水，并用醋酸调节pH至6.7。培养基中碳氮磷比为100∶5∶0.5。
按重量计，将含嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649的菌种液10份、稻壳粉2份，脱脂奶粉1份，喷雾干燥，稻壳粉事先经过微粉化处理(90％的粉体粒度小于100μm，平均粒径小于50μm，所述平均粒径为50％粉体粒径)，即得到由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和载体组成的嗜酸乳杆菌制剂C，二者的配比为0.3克所述载体：108cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；所述载体由稻壳粉和脱脂奶粉组成，所述稻壳粉和脱脂奶粉的质量比为2∶1。
4、将步骤1中培养得到的嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649置于种子罐中进行一级发酵，然后置于生产罐中进行二级发酵，用无菌水梯度稀释，得到浓度为(107-1010)cfu/g的菌种液。两级发酵罐培养基组分均为稻壳粉12份、蛋白胨10份，脱脂奶粉10份、蔗糖1份、乳糖2份、甘油1份、淀粉3份，混合，另加适量水。并用醋酸调节pH至6.7。培养基中碳氮磷比为100∶10∶5。
按重量计，将含嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649的菌种液10份、稻壳粉1份、麦芽糊精1份、脱脂奶粉1份混合，喷雾干燥，稻壳粉事先经过微粉化处理(90％的粉体粒度小于100μm，平均粒径小于50μm，所述平均粒径为50％粉体粒径)，即得到由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和载体组成的嗜酸乳杆菌制剂D，二者的配比为0.3克所述载体：109cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉和麦芽糊精组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉和麦芽糊精的质量比为1∶1∶1。
5、将步骤2中培养得到的嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649置于种子罐中进行连续进行两次发酵，然后置于生产罐中进行三级发酵，用无菌水梯度稀释，得到浓度为(107-1010)cfu/g的菌种液。发酵罐培养基组分为稻壳粉12份、蛋白胨6份，脱脂奶粉10份、蔗糖1份、糖蜜1份，乳糖2份、甘油1份、淀粉3份，碳氮磷比为100∶7∶2。加入水，并用醋酸调节pH至6.7。
按重量计，将含嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649的菌种液6份、麸皮1份、脱脂奶粉1份混合，喷雾干燥，稻壳粉事先经过微粉化处理(90％的粉体粒度小于100μm，平均粒径小于50μm，所述平均粒径为50％粉体粒径)，即得到由酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和载体组成的嗜酸乳杆菌制剂E，二者的配比为0.3克所述载体：107嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；所述载体由脱脂奶粉和麸皮组成，所述脱脂奶粉和麸皮的质量比为1∶1。
6、含嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649菌种液制备方法同步骤4。
按重量计，将含嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649的菌种液10份、稻壳粉2份、麸皮1份、脱脂奶粉1份、混合，喷雾干燥，稻壳粉和麸皮事先经过微粉化处理(90％的粉体粒度小于100μm，平均粒径小于50μm，所述平均粒径为50％粉体粒径)，即得到由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和载体组成的嗜酸乳杆菌制剂F，二者的配比为0.4克所述载体：1010cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉和麸皮的质量比为2∶1∶1。
实验例5、嗜酸乳杆菌制剂对仔猪生产性能的影响。
1.1材料与方法：
试验动物
选取28±2d断奶的杜长大三元杂种仔猪36头，平均体重7.56±0.52kg(断奶后在哺乳舍饲养料7天，饲养教槽料)，按体重随机区组分为2个处理组，每组6个重复，每个重复3头仔猪。
1.2嗜酸乳杆菌制剂
采用实施例4的嗜酸乳杆菌制剂A-F。
1.3试验分组
试验共分为两个处理，处理1为试验组，基础日粮添加重量比0.1％实施例4的嗜酸乳杆菌制剂A-F中的任一种；处理2为对照组，基础日粮各处理的安排见表5。基础日粮的组成及营养成分见表5。
表5  生长试验的基础日粮组成和营养水平
Figure BDA0000055557630000171
注：1.粗蛋白、赖氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、苏氨酸、钙和磷为实测值。
2.每公斤预混料提供：维生素A，11,000IU；维生素D3，1503IU；维生素E，44.1IU；维生素K，4.0mg；核黄素，5.22mg；泛酸，20.0mg；烟酸，26.0mg；维生素B12，0.01mg；锰，35.0mg；铁，100.0mg；锌，90.0mg；铜，16.5mg；碘，0.30mg；硒，0.30mg。
1.4饲养管理
试验于国家饲料工程技术研究中心代谢室进行。试验期21天。试验期间仔猪饲养在全封闭式的保育仔猪舍内，舍内的温度保持在24～27℃。自由采食，每个栏圈安装有鸭嘴式饮水器供仔猪自由饮水。基础日粮的1％预混料自配，不含有任何抗生素。仔猪的免疫按猪常规兽医传染病的免疫程序进行，仔猪饲养管理措施严格执行卫生防疫制度。
1.5样品收集与处理
试验在开始、7d、14d和21d时称仔猪个体重，记录每周的日增重和饲料采食量。
1.6数据统计
试验所有数据采用SPSS12.0(SPSS Inc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理统计。
2.结果与讨论
2.1嗜酸乳杆菌制剂对仔猪断奶后生长性能的影响
表6  嗜酸乳杆菌制剂E对断奶仔猪生长性能的影响
Figure BDA0000055557630000181
注：表中值为平均值±标准差。
从表6看出，断奶后第1wk、第2wks和第3wks，试验组的仔猪平均日增重(ADG)比对照组分别提高3.27％、3.17％和3.21％差异显著(P＜0.05)，平均日采食量(ADFI)比对照组分别提高3.17％、3.29％和3.16％，差异显著(P＜0.05))。
用嗜酸乳杆菌制剂A-D和F进行同样的实验也得到了相同的结论。
实验例6、嗜酸乳杆菌制剂对大肠杆菌感染仔猪腹泻的影响。
1.材料与方法
实施例4的嗜酸乳杆菌制剂E。
1.1试验动物与饲养管理
选择12头28±2d断奶的健康杜×长×大商品杂交仔猪，体重为7.65±1.10kg。随机分成2组，在代谢笼内单笼饲养，代谢室的室温控制在25℃～27℃，处理组6头仔猪每天饮水口服液态嗜酸乳杆菌制剂，每日饮进嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649的总数约为107CFU，对照组6头仔猪饮用自来水作为对照。试验第8d用20mL大肠杆菌K99、K88和987P(来源同实施例3)的混合培养液(总菌数为108CFU)口服攻毒，该混合液中三种血清型的大肠杆菌的比例相等，一日二次，共1d，攻毒后猪只仍然自由饮自来水和采食，测定攻毒后腹泻发病时间和腹泻指数，试验期14d。
1.2试验日粮
试验仔猪采食基础日粮，不含任何抗生素，参照NRC(1998)推荐的需要量进行配制。基础日粮配置见实施例5表5。
1.3腹泻指数
腹泻指数是腹泻头次乘以相应的腹泻得分，腹泻得分根据表7的腹泻评分标准计算。腹泻率为攻毒后7d内腹泻的仔猪总头次除以每天的仔猪头数乘以7。
表7  腹泻评分标准
Figure BDA0000055557630000191
1.4统计分析
数据的统计分析采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)软件的独立样本t-检验进行统计分析。
2结果与讨论
试验结果见表8，试验组腹泻发病率比对照组下降69.6％，腹泻指数下降了67。对照组在攻毒后第2d即有第一头仔猪发生腹泻，而实验组一直到攻毒后第5d才发现第一头仔猪腹泻。在我国，许多试验研究证明了益生素能有效防治哺乳仔猪和断奶仔猪的腹泻，有些效果优于抗生素或基因工程疫苗。在嗜酸乳杆菌制剂中含有的产乳酸菌素的嗜酸乳杆菌乳酸杆菌在体外具有很好的抗大肠杆菌特性，据Hoefling报道新生仔猪腹泻中有26％是由于肠毒性大肠杆菌引起的。试验组仔猪在攻毒前7d，一直口服含嗜酸乳杆菌的水，嗜酸乳杆菌在胃肠道食糜和粘膜已经大量存在，并在特定的胃肠道微生境发挥益生作用。仔猪受到大肠杆菌攻毒时，由于嗜酸乳杆菌能抑制大肠杆菌的生长繁殖，从而有效地保护了机体免受大肠杆菌大量繁殖造成的严重损害，降低腹泻发病率和腹泻的严重程度，同时推迟腹泻发病时间。
表8  嗜酸乳杆菌制剂E对大肠杆菌感染断奶仔猪腹泻的影响
Figure BDA0000055557630000192
用实施例4的其它五种嗜酸乳杆菌制剂进行同样的实验也得到了相同的结论。
实验例7、嗜酸乳杆菌制剂对早期断奶仔猪胃肠道微生物菌群、养分消化率的影响。
材料与方法
1.1试验动物与日粮处理
选择36头28±2d断奶仔猪，体重7.65±1.09kg，按完全随机区组设计动物试验，试验分2个处理，每个处理6个重复，每个重复3头仔猪，高层网上平养，栏圈尺寸为2.0×2.0m，每圈为一个重复，每个处理3圈公猪，3个圈母猪。处理1为试验组，基础日粮添加0.1％(质量含量)实施例4的嗜酸乳杆菌制剂F；处理2为对照组，基础日粮添加50mg/kg卡巴氧，各处理的安排见表5。试验期间仔猪饲养在全封闭式的保育仔猪舍内，舍内的温度保持在24～27℃。自由采食，每个栏圈安装有鸭嘴式饮水器供仔猪自由饮水。基础日粮的1％预混料自配，不含有任何抗生素。仔猪的免疫按猪常规兽医传染病的免疫程序进行，仔猪饲养管理措施严格执行卫生防疫制度。试验期21d，在试验开始、7d、14d和21d时称仔猪个体重，记录每周的日增重和饲料采食量。在最后1周日粮中添加0.5％的硅藻土作为指示剂测定营养物质的消化率，基础日粮组成见表5。
表9  试验动物安排
1.2样品收集与处理
试验第21d每个重复取一头仔猪，屠宰后取回肠食糜测定氨基酸消化率。无菌法取胃，十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠各5cm长，两端结扎后，放置在-80℃冰箱中，用于测定内容物和粘膜的微生物菌群，取胃、十二指肠、空肠上段、空肠中段、空肠下段、回肠、盲肠、结肠降段和结肠升段的内容物装于塑料管中，放置在-80℃冰箱中。试验最后三天以圈为单位收集刚从***排出的新鲜粪便，放置在-20℃冰箱中，测定营养物质消化率。
1.3微生物分析
无菌称取不同部位的胃肠道食糜1g，溶解于99mL的无菌生理盐水，在无菌生理盐水的瓶子里放置5～8粒小玻璃珠。然后再进行逐级10倍稀释，一直到10-7，在10-5～10-7每个稀释度，取0.3mL稀释液于相应的滚管培养基中进行乳酸杆菌、双歧杆菌和厌氧菌培养。在10-2～10-5每个稀释度，取0.3mL稀释液于相应的平板培养基中进行大肠杆菌、肠杆菌和好氧菌的计数。粘膜微生物测定方法参考Rojas和Conway(1996)的方法，无菌取1cm2胃肠粘膜，用无菌PBS溶液冲洗粘膜至无可见的食糜，用无菌滤纸吸干表面上的水，然后用无菌镊子将组织块浸入10mL无菌HEPES缓冲液，并不断振荡冲洗5min，然后再进行逐级10倍稀释，直到10-3。在每个稀释度，取0.3mL稀释液于相应的平板或滚管培养基中。微生物用选择性培养基培养，培养基的制作参照陈天寿(1995)的方法，大肠杆菌和肠杆菌培养基用伊红美蓝(EMB)培养基(蛋白胨，10g；乳糖，10g；磷酸氢二钾，2g；琼脂，13g；伊红-Y，0.4g；美蓝，0.065g；蒸馏水，1000mL；pH，7.1)，乳酸杆菌用Rogosa SL完全选择性培养基(胰蛋白胨，10g；酵母浸粉，5g；葡萄糖，10g；***糖，5g；蔗糖，5g；醋酸钠，15g；枸椽酸铵，2g；磷酸二氢钾，6g；七水硫酸镁，0.58g；四水硫酸锰，0.25g；硫酸亚铁，0.03g；吐温-80，1g；琼脂，13g；0.1％刃天青，1mL；蒸馏水，1000mL；用醋酸调节pH至5.2)。双歧杆菌用双歧杆菌培养基(BM)：葡萄糖，20g；胰酪胨，20g；酵母浸粉，10g；蛋白胨，10g；西红柿汁，333mL；吐温-80，2g；蒸馏水，1000mL；pH 6.6，碳酸钙，10g；半胱氨酸，0.5g；0.1％刃天青，1mL。好氧菌和厌氧菌用好氧菌和厌氧菌培养基(酪胨，15g；葡萄糖，5g；L-胱氨酸，0.5g；硫乙醇酸钠，0.5g；酵母浸粉，5g；氯化钠，2.5g；0.1％刃天青，1mL；琼脂，13g，蒸馏水，1000mL；pH7.1)，厌氧菌、乳酸杆菌和双歧杆菌培养基制作成Hungates滚管，好氧菌、大肠杆菌和肠杆菌用平板培养。Hungates管和培养基平皿放置在37℃培养箱，培养48h后计数。每个稀释度做三个平板或滚管，以50～150个菌落的平板或滚管的稀释度作计数用。
1.4化学分析将粪便从冰箱中取出，以圈为单位将粪便混合后，取300g左右放置于铝盒中，将铝盒放在65℃的烘箱中鼓风干燥96h。日粮和粪便样品粉碎后，过40目筛。食糜样品进行冷冻干燥，用于测定氨基酸的日粮样品和食糜粉碎过60目筛。日粮和粪的粗水分、粗蛋白、粗灰分、钙和总磷分别参照中华人民共和国国家标准GB/T6435-1986(2001)、GB/T 6432-1994(2001)、GB/T 6438-1992(2001)、GB/T 6436-1992(2001)和GB/T 6437-1992(2001)测定。其中，粗蛋白采用KJELTEC1035全自动分析仪进行测定。
能量采用PARR1281全自动能量测定仪(PARR Instrument Corp.，美国)测定。氨基酸(除含硫氨基酸和色氨酸)按国家标准GB/T18246-2000(2001)在110℃下6mol/L盐酸水解24h后用氨基酸自动分析仪(日立L-8800，日本)测定；含硫氨基酸(包括蛋氨酸和半胱氨酸)按照国家标准GB/T15399-1994(1996)在110℃下用过甲酸(1mL过氧化氢+9mL甲酸)氧化16h后，使用盐酸水解方法测定；色氨酸按照国家标准GB/T18246-2000(2001)在110℃下4mol/L氢氧化钠水解24h后使用高压液相色谱(岛津LC-10A，日本)测定。采用McCarthy等(1974)的方法测定盐酸不溶灰分。即取约10g样品，用100mL 4N HCl煮30min后，用无灰分滤纸过滤，用开水冲洗直至无酸，然后在650℃下灰化6h以上。
1.5消化率计算公式
按以下公式计算氨基酸回肠表观消化率或养分的全消化道消化率：
D＝100-(C1×P2)÷(C2×P1)×100
其中，D＝氨基酸回肠表观消化率或养分全消化道消化率(％)，
      C1＝待测饲料盐酸不溶灰分含量(％)，
      P2＝食糜或粪便中养分含量(％)，
      C2＝食糜或粪便中盐酸不溶灰分含量，
      P1＝待测饲料养分含量(％)。
1.6数据统计
试验所有数据采用SPSS9.0for Windows(SPSS Inc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理统计。
2结果与讨论
2.1嗜酸乳杆菌制剂F对断奶仔猪消化道食糜微生物菌群的影响
由表10可以看出，与卡巴氧相比，在仔猪消化道食糜中，实验组使仔猪胃、盲肠、和结肠等部位的大肠杆菌数量显著升高(P＜0.01)，但在回肠却降低(P＜0.01)，而在空肠二者之间没有显著差异。肠杆菌数量在空肠、盲肠和结肠极显著地升高(P＜0.01)，在回肠显著升高(P＜0.05)，而在十二指肠显著降低(P＜0.01)，在胃二组之间没有显著差异。乳酸杆菌数量在胃、十二指肠、空肠和回肠均比卡巴氧组极显著地升高(P＜0.01)，在盲肠显著升高(P＜0.05)。双歧杆菌数量在胃、空肠、回肠和盲肠极显著升高(P＜0.01)，在十二指肠和结肠显著升高(P＜0.05)。厌氧菌总数在胃、十二指肠、空肠和回肠极显著地升高(P＜0.01)，在盲肠和结肠则显著升高(P＜0.05)。Muralidhara等(1977)发现饲喂乳酸乳酸杆菌的仔猪肠道组织的乳酸杆菌数量上升，大肠杆菌数量下降。Silva等报道乳酸杆菌能够产生未知的抗菌物质抑制大肠杆菌。一些研究报道表明，乳酸杆菌能减少断奶仔猪肠道和粪便中的肠杆菌和大肠杆菌数量，在抑制仔猪的生长方面，这两种菌起着重要作用。这表明乳酸杆菌制剂能够提高消化道多数部位食糜中乳酸杆菌、双歧杆菌、厌氧菌、大肠杆菌、肠杆菌和好氧菌的数量。
表10  嗜酸乳杆菌制剂F对断奶仔猪消化道食糜微生物菌群的影响(单位；1gCFU/g，湿重)
Figure BDA0000055557630000221
Figure BDA0000055557630000231
注：表中值为平均值±标准差。
2.2嗜酸乳杆菌制剂F对营养物质消化率的影响
从表11可以看出，与卡巴氧比较，嗜酸乳杆菌制剂F显著提高了日粮中粗蛋白和总磷的全消化道表观消化率(P＜0.05)，但对能量、干物质、有机物和钙等全消化道表观消化率以及氨基酸回肠末端表观消化率都没有显著影响(P＞0.05)。饲料原料中的植酸对磷的吸收有阻碍作用，而乳酸可以缓解这种阻碍作用(Fuller，1989)。本制剂中嗜酸乳杆菌在体外筛选时具有较高产生乳酸的能力。结果表明，嗜酸乳杆菌制剂对断奶仔猪的营养物质消化率的影响并不大。
表11  复合乳酸杆菌制剂对断奶仔猪日粮养分表观消化率的影响(单位：％)
Figure BDA0000055557630000232
Figure BDA0000055557630000241
注：表中值为平均值±标准差。
实验例8、不同菌种液载体吸附所制得的制剂在室温下的长期贮存稳定性
2、实验方法
将嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649接种于葡萄糖营养肉汤，其组分为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，并用醋酸调节pH至6.7，置普通培养箱37度培养18-24小时后，用无菌水梯度稀释，得到浓度为1010cfu/g的菌种液。
菌种液载体分别为稻壳粉、麸皮，脱脂奶粉、麦芽糊精。用载体配成的制剂中载体和嗜酸乳杆菌CGMCC No.4649的配比均为0.5克载体：109cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021。
配成制剂后立刻测量菌种活力(通过制剂中菌种的浓度体现)，然后常温下分别放置1、6、12、18个周后，再分别测量菌种活力；计算放置后菌种活力占放置前菌种活力的百分比。
3、实验结果
如表12所示
表12  不同菌种液载体吸附所制得的制剂的长期稳定性研究
Figure BDA0000055557630000242
Figure BDA0000055557630000251
可见本发明制剂在载体中比较稳定。

Claims (7)

1.一种嗜酸乳杆菌制剂，由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和载体组成；
所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.4649；
所述载体为磷酸钙、稻壳粉、麸皮、米糠、脱脂奶粉、麦芽糊精、蔗糖、甘油和淀粉中的至少一种；
所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和所述载体的配比为：（107-1010）cfu：（0.3-5）克载体；
所述制剂为A）-F）中的任一种：
A）由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和磷酸钙组成的嗜酸乳杆菌制剂A，所述嗜酸乳杆菌制剂A中，二者的配比为5克磷酸钙：（107-1010）cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；
B）由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和稻壳粉组成的嗜酸乳杆菌制剂B，所述嗜酸乳杆菌制剂B中，二者的配比为0.5克稻壳粉：（107-1010）cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；
C）由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和所述载体组成的嗜酸乳杆菌制剂C，所述嗜酸乳杆菌制剂C中，二者的配比为0.3克所述载体：（107-1010）cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；所述载体由稻壳粉和脱脂奶粉组成，所述稻壳粉和脱脂奶粉的质量比为2：1；
D）由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和所述载体组成的嗜酸乳杆菌制剂D，所述嗜酸乳杆菌制剂D中，二者的配比为0.3克所述载体：（107-1010）cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉和麦芽糊精组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉和麦芽糊精的质量比为1：1：1；
E）由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和所述载体组成的嗜酸乳杆菌制剂E，所述嗜酸乳杆菌制剂E中，二者的配比为0.3克所述载体：（107-1010）cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；所述载体由脱脂奶粉和麸皮组成，所述脱脂奶粉和麸皮的质量比为1：1；
F）由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021和所述载体组成的嗜酸乳杆菌制剂F，所述嗜酸乳杆菌制剂F中，二者的配比为0.4克所述载体：（107-1010）cfu嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉和麸皮的质量比为2：1：1。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述制剂具有下述至少一种用途：
1）制备调解动物肠内微生态平衡的产品；
2）制备增强非特异性免疫的药物；
3）提高动物饲料转化效率；
4）促进动物对营养物质的消化和吸收；
5）制备降低动物腹泻发病率的药物；
6）制备提高动物生产性能的产品。
3.含有权利要求1或2所述制剂的动物饲料。
4.根据权利要求3所述的动物饲料，其特征在于：所述动物饲料中，每克所述动物饲料中含有107CFU以上的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)AI2021。
5.权利要求1或2所述制剂的下述至少一种用途：
1）制备调解动物肠内微生态平衡的产品；
2）制备增强非特异性免疫的药物；
3）提高动物饲料转化效率；
4）促进动物对营养物质的消化和吸收；
5）制备降低动物腹泻发病率的药物；
6）制备提高动物生产性能的产品。
6.权利要求1或2所述制剂在制备大肠杆菌抑制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述大肠杆菌抑制剂中的大肠杆菌为大肠杆菌K88、大肠杆菌K99或大肠杆菌987P。
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102640863B (zh) * 2012-02-09 2013-04-17 西华大学 一种用于观赏鱼饲的微生态制剂的制备方法
CN103783281A (zh) * 2012-10-30 2014-05-14 上海市农业科学院 一种替代抗生素的保健促生长饲料添加剂及其制备方法
CN103555611A (zh) * 2013-09-27 2014-02-05 上海源耀生物股份有限公司 一种嗜酸乳杆菌培养物饲料添加剂及其制备方法
CN103555634B (zh) * 2013-11-11 2015-02-18 山东康地恩生物科技有限公司 一种嗜酸乳杆菌及其应用
CN103602614B (zh) * 2013-11-11 2015-09-23 南京曜动节能环保科技有限公司 一种复合微生态饲料添加剂的制备及应用
CN106011037B (zh) * 2016-08-05 2019-09-13 福州大学 一种嗜酸乳杆菌及其应用
CN106191044A (zh) * 2016-08-05 2016-12-07 福建农林大学 一种提高乳酸菌素plnK产量的基因工程方法
CN106350468B (zh) * 2016-09-08 2019-05-10 济南康多宝生物技术有限公司 一种新型嗜酸乳杆菌
CN109717245A (zh) * 2017-10-31 2019-05-07 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 只用嗜酸乳杆菌作发酵剂的益生菌发酵乳及其制备方法
CN110229770A (zh) * 2019-07-19 2019-09-13 福建省农业科学院农业工程技术研究所 一种枯草芽孢杆菌制剂及制备方法
CN111575223B (zh) * 2020-05-20 2022-04-15 江南大学 一种降低鼠李糖乳杆菌表面物质分泌量的方法
CN112266880B (zh) * 2020-10-20 2022-05-13 青岛普罗百世生物科技有限公司 一种嗜酸乳杆菌及其在断奶仔猪饲料中的应用
CN115806895A (zh) * 2021-09-16 2023-03-17 我的轻食有限公司 嗜酸乳杆菌tw01菌株及其益生菌组合物与用途
CN116083300B (zh) * 2022-12-08 2023-10-17 玫斯江苏宠物食品科技有限公司 一种防治犬腹泻的益生菌复合制剂及其应用
CN116640705B (zh) * 2023-07-21 2023-09-19 山东威曼宠物食品有限公司 改善宠物毛发的嗜酸乳杆菌King45及其菌剂和应用
CN117603865A (zh) * 2023-11-23 2024-02-27 青岛农业大学 一种嗜酸乳杆菌及其相关制剂和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101463329A (zh) * 2009-01-07 2009-06-24 北京龙科方舟生物工程技术中心 一种酿酒酵母、含有该酵母的酵母制剂、饲料、其制备方法及其用途
CN101554204A (zh) * 2008-04-11 2009-10-14 北京龙科方舟生物工程技术中心 一种发酵乳酸杆菌制剂

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101554204A (zh) * 2008-04-11 2009-10-14 北京龙科方舟生物工程技术中心 一种发酵乳酸杆菌制剂
CN101463329A (zh) * 2009-01-07 2009-06-24 北京龙科方舟生物工程技术中心 一种酿酒酵母、含有该酵母的酵母制剂、饲料、其制备方法及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
黄沧海.益生乳酸杆菌抑制大肠杆菌的研究.《中国畜牧杂志》.2003,第39卷(第6期),p27-28. *
黄沧海.饲用乳酸杆菌菌种益生特性的选育.《黑龙江畜牧兽医》.2005,(第2期),p21-23. *

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