CN106191044A

CN106191044A - 一种提高乳酸菌素plnK产量的基因工程方法

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Publication number: CN106191044A
Application number: CN201610634985.2A
Authority: CN
Inventors: 王全溪; 王长康; 樊倩; 许丽惠
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2016-08-05
Filing date: 2016-08-05
Publication date: 2016-12-07

Abstract

本发明公开了一种提高乳酸菌素plnk产量的基因工程方法。根据乳酸菌素plnk的基因序列，设计一对特异性引物，选择高效表达溶合蛋白的原核表达载体PET‑32a（+），构建pET‑32a‑plnK重组质粒，通过对诱导表达体系的优化表明，诱导表达温度16‑43℃，诱导表达时间8‑16h，IPTG浓度0.2‑0.6 mmoL/L是最佳诱导体系。纯化目的蛋白后的抑菌实验表明，体外重组表达乳酸菌素plnK仍然具有较高的抑菌效果。

Description

一种提高乳酸菌素plnK产量的基因工程方法

技术领域

本发明属于兽药与饲料添加剂技术领域，具体涉及提高乳酸菌素plnK产量的基因工程方法。

背景技术

抗生素作为畜禽抑菌药物和促生长剂在畜牧业生产中得到了广泛应用。然而长期使用抗生素,不但影响动物疾病的防治效果；还会产生抗药性和残留,造成严重的畜产品污染，有的甚至会诱发人和动物产生癌变和畸变，危及人类的健康与安全。因此，2006年1月1日起，欧盟全面禁止食品动物使用抗生素促生长饲料添加剂。全面禁止抗生素作为食品动物促生长饲料添加剂，越来越来引起全球的普遍重视。然而，欧盟由于全面禁止抗生素饲料添加剂也给动物生产带来一些问题，如肠道细菌疾病的增加。为了扭转动物健康的下降，只能大量使用治疗性抗生素来治疗。同时，由于肠道细菌性疾病的增加也增加了动物性食品被肠道细胞污染的机会如沙门氏菌污染。为此，研制一种能改善畜禽健康,提高生产性能且安全无毒的能替代抗生素的产品已成为动物营养研究的一个热点。

乳酸菌素是在乳酸菌代谢过程中，合成并分泌到环境中的一类对革兰氏阳性菌(尤其是亲缘性较近的细菌)和革兰氏阴性菌具有抑制作用的蛋白或多肽。由于乳酸菌素无毒副作用、无残留、无耐药性,并可以抑制或杀死一些致病菌,具有一定的热稳定性,易被动物体消化道的部分蛋白酶降解,因此不会在体内蓄积引起不良反应。细菌素的治疗潜力引起了人们对这一领域的关注。至今，只有一种羊毛硫细菌素Nisin用于食品防腐，绝大多数处于试验阶段，究其原因主要是产细菌素的野生菌株产量低，分离纯化困难，距离产业化生产还有很长距离。因此，通过体外的技术获得乳酸菌素是获得高产量乳酸菌素的重要途径。

乳酸菌素plnk是乳酸菌素的一种，现已证实其具有广谱的抑菌效果，然而由于野生型乳酸菌产量低且难以和其它蛋白分离，而阻碍了其产业化生产。因此，优化乳酸菌素plnk的生产体系对于解决乳酸菌产业化生产具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高乳酸菌素plnK产量的基因工程方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高乳酸菌素plnK产量的基因工程方法，通过构建目的基因重组表达质粒，优化表达体系，获得能够在体外大量表达乳酸菌素plnk的基因工程技术。

具体方法为：

1.设计一对plnK特异性引物，引物序列为上游引物F：5’-GCGGATCCATGAAAATTAAATTAACTGT-3’；下游游引物R：5’-GCGTCGACTCACTTATTATAATCCCTTG-3’。

2.选择具有优良的表达溶合蛋白功能的载体PET32a, 构建plnk原核表达重组质粒，命名为pET-32a-plnK。

3.pET-32a-plnK转染至BL21(a)感受态细胞，优化诱导表达条件，获得能够在体外诱导表达的重组蛋白。

4.纯化重组蛋白，并进行蛋白验证。

5.抑制实验证实该重组蛋白仍然具有广谱抑菌活性。

本发明的优点在于：

1.本发明成功建立了可以进行体外表达乳酸菌素plnK的基因工程方法，该方法突破了野生菌株无法大量表达乳酸菌素的缺点。

2.本发明通过基因工程方法所得的乳酸菌素plnK重组蛋白仍然具有广谱的抑菌效果，该方法可用于工业化规模化生产乳酸菌素。

附图说明

图1 乳酸菌素plnK基因的PCR扩增结果，M：DNA 分子质量标准；1：乳酸菌素plnK基因扩增产物。

图2阳性重组表达质粒的PCR鉴定，M : DNA 分子质量标准；1：plnK上下游引物PCR产物2：T7引物PCR产物， 3：T7下游引物和目的正向引物PCR产物；4 ：T7上游引物和目的反向引物PCR产物。

图3重组表达质粒的酶切鉴定，M1、M2：DNA分子质量标准；1：未酶切的pET-32a-plnK质粒；2：pET-32a-plnK的BamH I单酶切；3：pET-32a-plnKSal I单酶切；4：pET-32a-plnK BamH I和Sal I双酶切。

图4 乳酸菌素plnK基因核苷酸序列同源性比对分析。

图5 乳酸菌素plnK与其他菌株plnK基因核苷酸序列遗传进化树的分析。

图6 E.coli BL21(DE3)中重组pET-32a-plnK蛋白的诱导表达结果，M：蛋白质分子质量标准；1：空白组诱导组；2：pET-32a(+)空载体菌诱导组；3: pET-32a-plnK重组质粒菌未诱导组；4：pET-32a-plnK重组质粒菌诱导组。

图7诱导温度的优化，M：蛋白质分子质量标准；1：空白组诱导组；2～7：分别为16℃，25 ℃，31 ℃，37 ℃，43 ℃梯度温度下诱导的pET-32a-plnK重组质粒菌组。

图8诱导时间的优化，M:蛋白质分子质量标准；1：空白组诱导组；2～9：分别为诱导后0 h，4 h，12 h，16 h梯度下诱导的pET-32a-plnK重组质粒菌组。

图9 IPTG诱导浓度的优化，M：蛋白质分子质量标准；1：空白组诱导组；2～9：分别为IPTG诱导浓度为0 mmoL/L，0.2 mmoL/L，0.4 mmoL/L，0.6 mmoL/L，0.8 mmoL/L，1.0mmoL/L，1.2 mmoL/L，1.5 mmoL/L梯度下诱导的pET-32a-plnK重组质粒菌组。

图10 pET-32a-plnK重组蛋白纯化结果，M：蛋白质分子质量标准；1：纯化前蛋白溶液，2～9：分别为40 mM，80 mM，120 mM，160 mM，200 mM，240 mM，280 mM和320 mM等咪唑洗脱液的纯化结果

图11 BCA法建立的BSA标准曲线。

图12 pET-32a-plnK蛋白的Western-blot分析，His抗体为一抗；1：pET-32a-plnK组；2：pET-32a(+)组;3：空白菌组。

图13 重组蛋白换抑菌结果，A:金黄色葡萄球菌B：大肠杆菌C：沙门氏菌D：巴氏杆菌。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1（毒、菌）株、实验动物及表达载体

表达宿主菌： E.coli DH5α感受态细胞, E.coliBL 21 (DE3) 感受态细胞（购自北京全式金生物公司）；表达载体：pET-32a(+)（购自Promega北京生物技术有限公司）。

1.1.2主要试剂

高纯度质粒小提中量试剂盒(DP107)（购自北京天根生化公司）；琼脂糖凝胶DNA快速回收试剂盒(CW2302)（购自北京康为世纪生物技术公司）；GoScrip^TMReverse TranscriptionSystem 和T4连接酶（购自Promega公司）；BamH I QuickCut 和和Sal I QuickCut限制酶(购自大连宝生物公司)；TransTaq^TMDNA Polymerase High Fidelity(HiFi)(AP131-11)、ProteinIso^TM Ni-NTA Resin蛋白纯化柱（DP101-01）、BCA蛋白浓度测定试剂盒、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔及兔抗鸭二抗和抗抗His标签蛋白一抗（购自北京全式金公司）；PageRuler Prestained Protein Ladder（10～180 ku）、SuperSignal West Pico化学发光底物（购自赛默飞世尔科技公司）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（AR0138）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，Triton-X 100和苯甲基磺酰氟(PMSF)均购自博士德生物技术有限公司。

1.2试验方法

1.2.1引物的设计与合成

参照GenBank登录的乳酸菌（登录号:X94434）plnK基因全长序列，运用 PCrimerPremier 6.0软件设计了一对特异性引物，扩增全长190 bp(174bp+16 bp酶切位点)，设计的引物序列（如下表1所示）送往上海立菲生物技术公司按PAGE级纯化方法合成，TE缓冲液稀释浓度为10 μmoL/L于-20 ℃冷冻备用。

表1 plnK基因引物序列表

1.2.2 乳酸菌素plnK基因的扩增

1.2.2.1 细菌总DNA的提取

按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，具体操作步骤如下：

（1）取细菌培养液1-5 ml，10000r/min离心1 min，尽量吸净上清；

（2）向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮；

（3）向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀。

（4）加入220μL缓冲液GB，振荡15 sec，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

（5）加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

（6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000 r/min 离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

（7）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000 r/min离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

（8）向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 r/min离心30 sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

（9）重复操作步骤8。

（10）将吸附柱CB3放回收集管中，12000 r/min离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（11）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min， 12000 r/min离心2 min，将DNA溶液收集到离心管中。

1.2.2.3 PCR扩增

GoScrip^TMReverse Transcription System反转录过程及条件参照GoTaq® 2-StepRT-qPCR System Kit说明。以上游引物F和下游引物R作为扩增引物，乳酸菌总DNA为模板，对乳酸菌素plnK基因进行PCR扩增，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，具体PCR反应体系和反应条件（见下表2）。

表2 PCR扩增体系表和反应条件

1.2.2重组表达质粒的构建与鉴定

1.2.2.1 PCR扩增产物的纯化

（1） PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，切下目的条带，利用胶回收试剂盒进行纯化，将胶回收纯化的PCR产物置于-80 ℃保存备用。

1.2.2.2目的片段与表达载体的双酶切鉴定

将准备好的pET-32a(+)原核表达载体与纯化后的目的片段分别用BamH I和Sal I进行双酶切反应，反应体系及反应条件(如下表3和表4所示)，双酶切反应结束后，再次胶回收纯化酶切的目的片段和载体片段以备进行连接反应。

表3 乳酸菌素plnK基因的双酶切体系及条件

表4 pET-32a(+)载体的双酶切体系及条件

1.2.2.3 连接反应

取再次胶回收纯化的酶切的PCR目的片段和载体片段，进行琼脂糖凝胶电泳估算二者浓度，接着以目的片段与载体摩尔比例为3:1进行连接反应，摩尔与体积计算方法见T₄连接酶说明书（promega公司），连接体系与反应条件（详见下表5）：

表5连接反应体系及条件

1.2.2.4 重组质粒转化

将连接后的重组质粒，转化至DH5α感受态细胞进行扩增，操作步骤如下：

（1）加连接产物于50 μLDH5α感受态细胞中，混匀后，冰上放置25 min；

（2）冰浴完成之后，42 ℃热激45 s，立即置于冰上2 min；

（3）加入250 μL平衡至室温的LB培养基Amp^-，200 r/min，37 ℃振荡孵育培养1 h；

（4）取200 μL菌液均匀涂于含有LB的固体培养板Amp^＋，倒置于37 ℃恒温培养箱中，过夜培养（为得到较多的克隆，4000 r/min离心1 min，弃掉部分上清，保留100～150 μL，轻轻弹匀悬浮菌体，取全部菌液涂板）。

1.2.3.5 PCR鉴定重组子及重组质粒提取

挑选白色单克隆至10 μL无菌水中，涡旋混合，以此混合液为模板进行PCR鉴定阳性重组质粒或以载体上的T7引物（引物序列见下表6）进行扩增。同时将同一菌落接种于液体含氨苄LB培养基，200 r/min，37 ℃振荡培养过夜。利用高纯度质粒小提中量试剂盒提取PCR阳性的质粒DNA。

表6 T7引物序列表

1.2.2.6 重组表达质粒的酶切鉴定及序列测定

提取PCR鉴定阳性的重组质粒进行双酶切鉴定，酶切体系如下表7所示，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR及酶切反应产物，鉴定结果符合预期的重组质粒送往上海立菲生物技术公司测序并将测序结果正确的重组表达质粒命名为pET-32a-plnK。

表7重组质粒的酶切鉴定体系

1.2.4 乳酸菌素plnK 基因的序列分析

利用NCBI网站核甘酸序列比对分析测序结果；同时运用Mega生物软件进行基因同源性分析及推导的氨基酸序列分析。

1.2.5重组质粒pET-32a-plnK在E.coliBL21 (DE3)中的诱导表达

将重组质粒 pET-32a-plnK转化至E.coli BL21 (DE3)感受态细胞中，方法同1.2.3.4所述，于平板中挑取白色单克隆菌落接种于1 mL的液体LB培养基，置于200 r/min，37 ℃的摇床中培养4-6h，取其中一份加入IPTG至终浓度为1 mmoL/L诱导蛋白表达，另一份加入同比例的双蒸水作为对照组，继续置于摇床中培养24 h，同时设pET-32a(+)空载体菌诱导组和空白诱导组。取300 μL的菌液加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，振荡混匀后于沸水中煮沸5min，冰上冷却5min，于4 ℃，12000 r/min离心5min，取上清溶液进行蛋白SDS-PAGE电泳分析。同时，收集所有的菌体，PBS缓冲液重悬洗涤3次，最终以1/10体积的PBS缓冲液（已加入蛋白酶抑制剂）重悬菌体，置于超声波下完全破碎菌体，收集菌液进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.6 pET-32a-plnK蛋白的SDS-PAGE电泳分析

分别吸取10μL以上样品蛋白溶解液进行胶浓度为12%的SDS-PAGE电泳分析，SDS-PAGE凝胶配置如下表8，电泳结束后，取出胶置于0.1%(W/V)考马斯亮蓝R-250染色溶液中染色45min，脱色溶液中进行洗脱，待背景脱色干净后拍照。

表8 SDS-PAGE凝胶配制表

1.2.7 pET-32a-plnK蛋白诱导表达体系优化

1.2.7.1 IPTG最佳诱导温度的优化

将保存的阳性克隆菌复苏，以1:100的比例接种于LB培养基，200 r/min，37℃摇床中培养，加入IPTG使其终浓度为1.0 mmol/L，分别置于不同的温度梯度16℃，25℃，31℃， 37℃，43℃条件下进行诱导表达，取10μL蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。

1.2.7.2 IPTG最佳诱导时间的优化

在最佳诱导温度条件下，确保IPTG终浓度为1.0 mmoL/L培养条件不变下，分别在不同的时间点取样：0h，4 h，8 h，12 h，16 h，取10μL以上蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。

1.2.7.3 IPTG最佳诱导浓度的优化

在优化得到的最佳诱导温度和培养时间基础上，分别加入不同终浓度的IPTG诱导剂：0mmoL/L，0.2 mmoL/L，0.4 mmoL/L，0.6 mmoL/L，0.8 mmoL/L，1.0 mmoL/L，1.2 mmoL/L，1.5mmoL/L进行诱导，最终确定最佳的诱导浓度。取样及SDS-PAGE步骤参见1.2.5和1.2.6。

1.2.8 pET-32a-plnK蛋白的纯化及蛋白浓度测定

1.2.8.1 pET-32a-plnK蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化

200 r/min，37℃摇床中大量培养阳性菌并按以上条件诱导表达后，收集菌体，PBS缓冲液洗涤3次，蛋白平衡缓冲液以1/10体积重新悬起，超声波完全破碎菌体，离心取上清作为待纯化样品。依据ProteinIso^TMNi-NTA Resin操作方法进行蛋白分离纯化，将不同浓度咪唑（40 mmoL/L，80 mmoL/L，120 mmoL/L，160mmoL/L，200 mmoL/L，240 mmoL/L，280 mmoL/L，320 mmoL/L）洗脱的收集液进行SDS-PAGE电泳分析，确定咪唑的最佳洗脱浓度。ProteinIso^TMNi-NTA Resin对His标签蛋白进行分离纯化的过程通常包括：装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、再生等步骤，如下：

（1）装柱：重悬吸取填料（蛋白载量10～20 mg/mL），加入层析柱内静置至柱高约为层析柱的2/3体积；

（2）平衡：5～10倍层析柱体积的平衡液缓冲液平衡层析柱，对于结合能力强的重组蛋白，可加入低浓度咪唑（10～20 mmoL/L）以提高特异性结合提高纯化效率；

（3）上样：蛋白样品缓冲液尽可能与平衡缓冲液保持一致。蛋白样品溶液可经离心或微滤(0.45 μmoL/L)处理以免堵塞层析柱；

（4）洗涤：5～10倍柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱，收集流出液；

（5）蛋白洗脱：配制平衡缓冲液配制不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白，收集流出液；

（6）层析柱回收：先用5～10倍体积的平衡缓冲液洗涤，再加5～10倍体积超纯水洗涤，最后用5倍体积75%乙醇洗涤，最后取出填料保存于层析柱缓冲液。超纯水洗涤柱子干燥保存。

1.2.8.2纯化后蛋白的浓度测定

运用BCA蛋白浓度定量测试盒，用酶标仪检测并绘制标准曲线，计算纯化的pET-32a-plnK蛋白浓度，详细操作步骤如下:

（1）BSA标准液：1×PBS将BSA Standard SolutionA（25 mg/mL）稀释至浓度为0.5 mg/mL；

（2）BCA工作液：根据样品数，将BCA Solution A和BCA Solution B按50：1的比例稀释成为BCA工作液，振荡混匀备用；

（3）在干净的96孔的样品孔中，以此加入0，1，2，4，8，12，16，20 μL稀释后浓度为0.5mg/mL的BSA标准液，1×PBS补足至每孔20 μL的终体积；

（4）待测样品的制备：1×PBS将待测样品按照一定的比例稀释后加入96孔中；

（5）于每个样品孔中加入200 μL的BCA工作液，置37 ℃，30-90 min，60 ℃，30 min或室温2 h；

（6）将96孔板置于562 nm波长下用酶标仪检测，绘制标准曲线，并计算待测蛋白样品的浓度值。

1.2.9 pET-32a-plnK蛋白的Western blot鉴定

将纯化后的重组蛋白pET-32a-plnK经SDS-PAGE电泳分离后，免疫印迹法验证（Westernblot）蛋白是否正确。具体操作步骤如下：

1.2.9.1转膜

（1）取下PAGE胶，防止胶干燥，根据目标蛋白分子量，参照蛋白Marker切下所需凝胶，用适量的转移缓冲液平衡凝胶30 min；

（2）将转移夹放入较大的托盘中，加足量的转移缓冲液至没过整个转移板；

（3）依据切胶大小剪切6张滤纸和1张NC膜或（PVDF膜）；NC膜用转移液预先润湿，PVDF需先用甲醇浸泡；

（4）转印夹层顺序按3层润湿的滤纸，PAGE胶，膜，三层滤纸进行，每叠一层，需先用玻璃棒赶去气泡。

（5）合上转移夹，确保正负极，将转移夹放入转印槽，加入膜转移缓冲液，调齐转移缓冲液水平，连接电源，在冷却条件下（10-20 ℃）100 V电转2 h；

（6）取出膜，用TBST洗涤2次，清除转移缓冲液。

1.2.9.2抗体孵育

（1）封闭：10%的脱脂奶粉封闭液于4 ℃冰箱封闭过夜；

（2）洗涤：TBST缓冲液洗涤3次，每次5 min左右；

（3）一抗孵育：10%的脱脂奶粉封闭液稀释羊抗HIS阳性血清，于4 ℃冰箱孵育过夜；

（4）洗涤：TBST缓冲液洗涤3次，每次5 min左右；

（5）二抗孵育：10%的脱脂奶粉封闭液稀释HRP标记的兔抗羊IgG抗体，37℃孵育2 h；

（6）洗涤：TBST缓冲液洗涤3次，每次5 min左右。

（7）ECL化学发光检测显色，曝光，拍照。

重组蛋白体外抑菌实验

选择四种指示菌分别是金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，沙门氏菌，巴氏杆菌，牛津杯法验证体外原核表达所得的重组蛋白的抑菌活性。金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，沙门氏菌分别用普通营养琼脂培养基，巴氏杆菌用加10%牛血清的马丁培养基培养。重组蛋白使用量200μL（0.5mg/mL）

2 结果与分析

2.1 乳酸菌素plnK基因的PCR扩增结果

PCR扩增产物经核酸电泳鉴定可见一条大小约为174bp的特异性条带(如图1所示)，与预期的片段大小相符，可见所设计的引物正确可用。

2.2重组表达质粒的鉴定结果

重组质粒转染DH5α后涂板，挑选白色单克隆菌落为模板，以上游引物F和下游引物R进行PCR鉴定，阳性的菌可扩增出一条约为190bp的特异性条带；以载体通用引物T7可扩增一条高约为700 bp大小的目的条带，结果如图2所示，进而提取其质粒进行酶切鉴定，包括BamH I和Sal I双酶切、BamH I单酶切，Sal I单酶切结果如下图3所示，单酶切的产物可见一条大小约为6090 bp 左右的线性质粒条带，双酶切可见多出一条约为190 bp的条带，与预期的大小相符，初步表明重组表达质粒构建成功。测序结果进一步证明重组质粒被成功构建。

2.3序列分析结果

将测序得到的结果与Genebank中发表的乳酸菌素plnK基因序列进行核苷酸序列比对，发现该乳酸菌株与Genebank发布的8株乳酸菌株具有96%以上的同源性，其中与云南菌株5-2、北京菌株CAUH2、阿尔及利亚菌株LbM2a，浙江菌株LZ95、杭州菌株LZ206、四川菌株ZS2058同源性为100%；其中与中国菌株L-XM1、L-ZS9同源性为96%。经过对这些菌株进行进化树的分析，发现该乳酸菌株与云南菌株5-2属于同一亚型；与北京菌株CAUH2、阿尔及利亚菌株LbM2a、杭州菌株LZ206、浙江菌株LZ95、四川菌株ZS2058属于同一型；与中国菌株L-XM1、L-ZS9属于不同型。

2.4 pET-32a-plnK重组蛋白的诱导表达结果

重组表达载体表达出的预期蛋白大小约为26.2ku。SDS-PAGE结果显示（如图6所示），pET-32a-plnK重组质粒菌经IPTG诱导后，清晰可见大小约为26.2ku的特异性条带，空白菌诱导组和pET-32a(+)空载体菌诱导组均未见该特异性条带，且诱导的pET-32a-plnK重组质粒诱导组条带亮度明显大于未诱导的pET-32a-plnK重组质粒组，此外，pET-32a(+)空载体菌诱导组与空白菌相比，可见一条大小约为20 ku的条带，这也与预期的空载体标签蛋白多肽大小相符。

2.5 pET-32a-plnK重组蛋白诱导表达条件的优化结果

2.5.1 IPTG最佳诱导温度的优化

在IPTG终浓度为1.0 mmoL/L的条件下，对pET-32a-plnK重组质粒菌进行诱导24 h，分析了16 ℃，25 ℃，31 ℃，37 ℃，43 ℃温度下诱导的pET-32a-plnK重组蛋白表达量，结果如下图7所示，目的蛋白在16～37℃的温度梯度中表达量逐渐变大，在37 ℃的条件下表达量达到最大，43℃后蛋白表达量逐渐减少，

2.5.2 IPTG最佳诱导时间的优化

在37 ℃，IPTG终浓度为1.0 mmoL/L的条件下，分析了pET-32a-plnK重组质粒菌分别在0 h，4 h，8 h，12 h，16 h等不同的诱导时间下的蛋白表达量变化。结果显示(如图8所示)，pET-32a-plnK重组质粒菌在诱导4h时，已经开始表达目的蛋白，且目的蛋白的表达量随时间的推移逐渐提高，直到诱导12 h后达到最大值，此后，蛋白的表达量渐趋于平衡。

2.5.3 IPTG最佳诱导浓度的优化

在37 ℃，诱导时间为12 h的诱导条件下，分别在IPTG终浓度为0 mmoL/L，0.2 mmoL/L，0.4 mmoL/L，0.6 mmoL/L，0.8 mmoL/L，1.0 mmoL/L，1.2 mmoL/L，1.5 mmoL/L的梯度下诱导，结果如图9所示，IPTG终浓度为0 mmoL/L蛋白的表达很少，而浓度在0.2～1.0 mmoL/L的梯度间时，蛋白的表达量有逐渐递增的趋势，在0.4 mmoL/L的浓度时达到最大，

2.6 pET-32a-plnK重组蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化结果

超声破碎后的菌液通过Ni-NTA亲和层析柱，分别用不同浓度的咪唑稀释液进行洗涤纯化，并进行SDS-PAGE分析，结果显示(如图10)，经过洗脱后得到的蛋白条带越来越单一，说明非特异性的蛋白杂质已明显减少，以200 mM的咪唑浓度的洗脱液纯化效率最高。通过BCA方法（如图11所示）计算纯化后的蛋白浓度为0.5 mg/mL。

2.7pET-32a-plnK重组蛋白的Western-blot鉴定结果

Western blot分析结果显示(如图12所示)，pET-32a-plnK重组质粒菌组和pET-32a(+)空载体菌组分别在大小约为26.2 ku和20 ku出现一条特异性的条带，而空白菌组未出现该条带。结果表明pET-32a-plnK重组蛋白为所预期的蛋白，目的蛋白具有活性。

2.7 pET-32a-plnK重组蛋白抑菌结果

抑菌实验结果表明，重组蛋白pET-32a-plnK仍然能够有效的抑制金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，沙门氏菌，巴氏杆菌(见图13)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种提高乳酸菌素plnK产量的基因工程方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcggatccat gaaaattaaa ttaactgt 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgtcgactc acttattata atcccttg 28

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taatacgact cactataggg 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctagttatt gctcagcgg 19

Claims

1.一种用于提高乳酸菌素plnk产量方法的引物，其特征在于：所述的引物序列为：上游引物F：5’-GCGGATCCATGAAAATTAAATTAACTGT-3’；下游游引物R：5’-GCGTCGACTCACTTATTATAATCCCTTG-3’。

2.一种提高乳酸菌素plnK产量的基因工程方法，其特征在于：通过构建目的基因重组表达质粒，优化表达体系，获得能够在体外大量表达乳酸菌素plnK的基因工程技术。

3.根据权利要求2所述的一种提高乳酸菌素plnk产量的基因工程方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1）设计一对plnk特异性引物，引物序列为上游引物F：5’-GCGGATCCATGAAAATTAAATTAACTGT-3’；下游游引物R：5’-GCGTCGACTCACTTATTATAATCCCTTG-3’；

2）选择具有优良的表达溶合蛋白功能的载体pET-32a（+）, 构建plnK原核表达重组质粒，命名为pET-32a-plnK；

pET-32a-plnK转染至感受态细胞，优化诱导表达条件，获得能够在体外诱导表达的重组蛋白；

纯化重组蛋白，并进行蛋白验证；

抑制实验证实该重组蛋白仍然具有广谱抑菌活性。