CN102304489B - 一株罗伊氏乳杆菌及其应用 - Google Patents
一株罗伊氏乳杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株罗伊氏乳杆菌及其应用。该罗伊氏乳杆菌为Lactobacillus reuteri RI021，2011年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4650。本发明的罗伊氏乳杆菌及其罗伊氏乳杆菌制剂主要作为动物的饲料添加剂，可用于调节动物肠内微生态平衡，从而具有增强非特异性免疫功能来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、促进动物生长和提高饲料转化率。
Description
技术领域
本发明涉及一株罗伊氏乳杆菌及其应用。
背景技术
饲料中添加抗生素对集约化畜牧业发展做出重大贡献的同时，其产生的副作用如内源性感染和二重感染、耐药性的产生、肠道正常菌群的破坏和畜产品及环境中的残留等对养殖业、动物以及人类食品安全带来严重威胁，因此研究开发替代抗生素的新型绿色安全添加剂是目前饲料发展的重要方向。
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是一种栖息于人和动物的肠道中，具有肠道表皮粘附能力的专性异型乳酸发酵菌，也是乳酸菌中重要的种群之一。美国食品和药品管理协会(FDA)于1989年将罗伊氏乳杆菌列为安全的微生物菌种，并得到广泛的应用。我国***于2003年批准罗伊氏乳杆菌可用于保健食品的益生菌种。目前国内罗伊氏乳杆菌主要用于人类酸奶食品中，且报道数量较少，而用于动物领域更鲜有报道，主要原因可能是该菌从分离鉴定到产品制备以及动物生产中的应用没有***的研究，从而限制了该菌种在动物领域的应用。因此，根据目前畜牧业的需求，研制开发一种罗伊氏乳杆菌制剂，具有广阔的发展前景。
发明内容
本发明的目的是提供一株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021及其应用。
本发明所提供的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.4650。该罗伊氏乳杆菌抗逆性强、抗杂菌能力强、具有益生特性。
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021具有以下生物学特性：
(1)在pH2.0处理4小时之后的存活率为72％；
(2)在75℃水浴中加热15min后的存活率为31.7％；
(3)室温下放置1个月后的存活率为85.6％；
(4)接种在肉汤培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养22小时生长浓度最高，接近1010cfu/ml(图1)。
本发明的另一个目的是提供一种罗伊氏乳杆菌制剂，该制剂能够替代现有的饲用抗生素，并具有抗病、促生长，改善肠道健康，提高免疫力的作用。
本发明所提供的罗伊氏乳杆菌制剂，它的活性成分为所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021。
所述制剂具有下述至少一种用途：
1)制备调节动物肠内微生态平衡的产品；
2)制备增强非特异性免疫的产品；
3)提高动物饲料转化效率；
4)促进动物对营养物质的消化和吸收；
5)制备降低动物腹泻发病率的产品；
6)制备提高动物生产性能的产品。
上述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021或制剂可用于制备大肠杆菌抑制剂。
所述大肠杆菌抑制剂中的大肠杆菌具体可为大肠杆菌K88、大肠杆菌K99或大肠杆菌987P。
所述提高动物生产性能可为提高断奶仔猪的生产性能，具体体现为提高仔猪平均日增重和/或仔猪平均日采食量。
所述降低动物腹泻发病率具体可体现为降低大肠杆菌感染仔猪腹泻率；所述降低腹泻率具体可体现为降低大肠杆菌感染仔猪腹泻指数。
所述制剂具体可由所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021和载体组成；所述载体具体可为稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精、麸皮中的至少一种。
所述载体可经过微粉化处理。经过微粉化处理后，90％的粉体粒径小于100μm，平均粒径小于50μm，所述平均粒径为50％粉体粒径。
所述制剂具体可为下述A)-F)中的任一种：
A)由所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021和所述载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂A，所述罗伊氏乳杆菌制剂A中，二者的配比为8克所述载体：1010cfu所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮的质量比为2∶2∶2∶1；
B)由所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021和所述载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂B，所述罗伊氏乳杆菌制剂B中，二者的配比为0.5克所述载体：107cfu所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮的质量比为2∶2∶2∶1；
C)由所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021和所述载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂C，所述罗伊氏乳杆菌制剂C中，二者的配比为0.5克所述载体：108cfu所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮的质量比为2∶1∶1∶1；
D)由所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021和所述载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂D，所述罗伊氏乳杆菌制剂D中，二者的配比为0.4克所述载体：109cfu所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮的质量比为1∶1∶1∶1；
E)由所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021和所述载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂E，所述罗伊氏乳杆菌制剂E中，二者的配比为0.4克所述载体：107cfu所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021；所述载体由脱脂奶粉和麸皮组成，所述脱脂奶粉和麸皮的质量比为1∶1；
F)由所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021和所述载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂F，所述罗伊氏乳杆菌制剂F中，二者的配比为0.4克所述载体：1010cfu所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉和麸皮的质量比为1∶1∶1。
本发明所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021或所述制剂可以作为添加剂用于制备动物饲料，其中的动物包括但不限于猪、牛、羊、鸡等各种动物。该饲料具有与抗生素饲料类似的功能，但无抗生素饲料的副作用。
所述动物饲料中，每克所述动物饲料中具体可含有107CFU以上的所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021。
本发明的罗伊氏乳杆菌及其罗伊氏乳杆菌制剂主要作为动物饲料的添加剂，可替代现有动物日粮中的抗生素，调节动物肠内微生态平衡，从而具有增强非特异性免疫功能来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、降低腹泻、促进动物生长和提高饲料转化率、提高断奶仔猪以及生长育肥猪的生产性能。
本发明的罗伊氏乳杆菌及其罗伊氏乳杆菌制剂对防治动物消化***疾病起到保健作用，同时对幼年动物可刺激其胃肠道发育，所以将之作为饲料添加剂应用在饲料中能起到抗病促生长的作用。同时，本发明的罗伊氏乳杆菌及其罗伊氏乳杆菌制剂无耐药性和药物在动物产品中残留，不会对人类的健康产生潜在的危害，是一种有前途的绿色饲料添加剂。
下面结合具体实施例详细描述本发明，所述实施例用于理解而不是限制本发明。
保藏说明
菌种名称：罗伊氏乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus reuteri
菌株编号：RI021
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2011年3月11日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4650
附图说明
图1为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021的生长曲线。
图2为平皿挖沟法测定乳杆菌培养物对大肠杆菌的抑制。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri RI021，可先接种于Rogosa SL琼脂的Hungates滚管培养基中进行培养，得到的种子培养物再接种于Rogosa SL肉汤厌氧培养基里进行培养。
其中所述的琼脂培养基为适合罗伊氏乳杆菌培养的任何培养基，本领域技术人员都知晓何种培养基适合罗伊氏乳杆菌培养。具体可选用Rogosa SL琼脂的Hungates滚管培养基，这里所述的Rogosa SL琼脂的Hungates滚管培养基理解为在Rogosa SL完全选择性培养基的基础上，适当修改的适合罗伊氏乳杆菌培养的培养基。所述适合罗伊氏乳杆菌培养的培养基可以为现有技术任何适合罗伊氏乳杆菌培养的培养基，这为本领域技术人员所知晓，具体可为：胰蛋白胨1-20g，牛肉膏1-20g，酵母浸粉1-15g，葡萄糖1-20g，***糖1-15g，蔗糖1-15g，醋酸钠5-25g，枸橼酸钠1-10g，磷酸二氢钾1-15g，七水硫酸镁0.1-1.5g，四水硫酸锰0.1-1.5g，硫酸亚铁0.01-0.10g，吐温-80 0.1-2.0mL，琼脂5-20g，蒸馏水100-2500mL；优选为胰蛋白胨5-15g，牛肉膏5-15g，酵母浸粉3-10g，葡萄糖5-15g，***糖3-10g，蔗糖3-10g，醋酸钠10-20g，枸橼酸钠1-5g，磷酸二氢钾1-10g，七水硫酸镁0.1-1g，四水硫酸锰0.1-1g，硫酸亚铁0.01-0.05g，吐温-80 0.5-1.5mL，琼脂10-15g，蒸馏水500-2000mL；更优选为胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，***糖5g，蔗糖5g，醋酸钠15g，枸橼酸钠2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，硫酸亚铁0.03g，吐温-801mL，琼脂13g，蒸馏水1000mL。
其中的液体培养基为适合罗伊氏乳杆菌培养的任何培养基，本领域技术人员也知晓这种液体培养基，其中可优选肉汤厌氧培养基，这里所述的肉汤厌氧培养基理解为在普通肉汤厌氧培养基的基础上，适当修改的培养基，所述适当修改的培养基可以为现有技术任何适合罗伊氏乳杆菌培养的培养基，这为本领域技术人员所知晓，优选Rogosa SL肉汤厌氧培养基，其中培养基的配方为：胰蛋白胨5-15g，酵母浸粉3-10g，葡萄糖5-15g，***糖3-10g，蔗糖3-10g，醋酸钠10-20g，枸橼酸钠1-5g，磷酸二氢钾1-10g，七水硫酸镁0.1-1g，四水硫酸锰0.1-1g，硫酸亚铁0.01-0.05g，吐温-80 0.5-1.5mL，蒸馏水500-2000mL；优选为胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，***糖5g，蔗糖5g，醋酸钠15g，枸橼酸钠2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，硫酸亚铁0.03g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL。
应用上述培养基，本领域技术人员一般都知晓具体培养过程，这里优选为上述Rogosa SL琼脂培养基的Hungates滚管中培养，优选在培养箱中，37℃下，培养15-72小时；其中的罗伊氏乳杆菌扩大培养优选在Rogosa SL肉汤厌氧培养基中，37℃下培养15-80小时。上述培养基的pH值可为6-7。
所述的罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650菌种液为经过一次发酵、二次发酵或三次发酵所得的菌种液。其中所述的一次发酵、二次发酵或三次发酵的培养基中碳氮磷比为5～100∶3～12∶0.5～5；优选100∶10∶3。
所述的罗伊氏乳杆菌制剂培养基，为任何适合制作罗伊氏乳杆菌制剂的培养基，其培养基成分优选为：糖蜜、蔗糖、葡萄糖，三者的重量比为20-60份∶10-70份∶10-40份。
所述的罗伊氏乳杆菌制剂培养基，为任何适合制作罗伊氏乳杆菌制剂的培养基，其培养基成分在上述培养基的基础上还包括蛋白胨，其与糖蜜的重量比为10-30份∶10-60份。
所述的罗伊氏乳杆菌制剂培养基，为任何适合制作罗伊氏乳杆菌制剂的培养基，其培养基成分在上述培养基的基础上还包括磷酸和/或可溶性磷酸盐，其与糖蜜的重量比为10-30份∶10-60份。
所述的后处理为将罗伊氏乳杆菌菌液经过一次、二次、三次发酵扩繁，将发酵菌液加入磷酸盐缓冲液中，喷雾干燥即可，所述的磷酸盐缓冲液的pH为6.5～6.7。
本发明的动物饲料包括：常用动物饲料和本发明的罗伊氏乳杆菌制剂。其中罗伊氏乳杆菌制剂的含量至少为0.001％，优选为0.001-3％，更优选0.01％-2％，最优选0.05％-0.2％。本发明的罗伊氏乳杆菌制剂可以同目前市面上任何常用动物饲料进行配合，即本发明所述动物饲料保护范围不为配合的常用动物饲料种类所限制。
然而其中的常用动物饲料可优选为日粮，进一步优选为猪用日粮、鸡用日粮、反刍动物用日粮和水产动物用日粮。对于不同的动物，其日粮的配方各不相同，但是，现有技术中公开的任何日粮都可以作为本发明的动物饲料，其配方都是该领域的公知常识。
下述实施例中所用的培养基配方如下：
1、Rogosa SL肉汤培养基
胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，***糖5g，蔗糖5g，醋酸钠15g，枸橼酸钠2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，硫酸亚铁0.03g，吐温-80 1mL，用蒸馏水定容至1L。
2、Rogosa SL琼脂培养基
1L Rogosa SL肉汤培养基中加琼脂13g。
3、MRS肉汤培养基
蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，磷酸氢二钾2g，枸椽酸二铵2g，葡萄糖20g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，醋酸钠5g，用蒸馏水定容至1L。
4、MRS琼脂培养基
1L MRS肉汤培养基中加琼脂14g。
5、葡萄糖营养肉汤
蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，葡萄糖2.5g，用蒸馏水定容至1L。
实施例1、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021的分离鉴定
本发明的罗伊氏乳杆菌是从猪胃肠道粘膜中提取、分离、筛选、纯化得到的。
(一)罗伊氏乳杆菌的分离与纯化
1.1试验材料
取健康仔猪胃肠道粘膜5cm2(胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠)，在灭菌杯中，用无菌生理盐水冲洗粘膜上的食糜，将粘膜浸入装有15mL HEPES缓冲液的烧杯中，用镊子来回摇动粘膜5min后，得到上清液。
1.2菌株的分离培养
用无菌注射器吸取0.2mL上清液注入装有Rogosa SL琼脂培养基的Hungates滚管中，用手轻轻滚动使上清液均匀分布在管中琼脂表面。放入5％CO2培养箱，37℃培养72h之后，在生物安全柜里无菌操作将白色针尖大小的菌落用针头挑取转移到厌氧无菌Rogosa肉汤培养基里进行培养，观察肉汤是否变浑浊，有浑浊的放置4℃冰箱贮藏备用。
1.3革兰氏染色
用无菌注射器吸取少量Rogosa SL肉汤培养物，滴在载玻片上，在酒精灯火焰上轻轻烘干固定。滴加结晶紫染色液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液媒染，作用1min，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮∶95％乙醇＝3∶7)脱色30s，水洗；滴加沙黄染色液复染1min，水洗，待干，在普通光学显微镜上观察，菌体呈红色为阴性，紫色的为阳性。呈革兰氏阳性形态一致的杆菌，进一步进行接触酶试验。
1.4接触酶试验
做Rogosa SL斜面培养基，取培养物约0.2mL注入装有Rogosa SL琼脂培养基斜面，5％CO2培养箱，37℃培养24h，长出菌落后，将3％过氧化氢溶液滴加到菌落上，若没有气泡产生说明是阴性，若有气泡产生说明是阳性。通过Rogosa SL上厌氧培养的培养物经革兰氏染色阳性和接触酶试验阴性可初步认为是乳杆菌属(Lactobacillus)。
2结果与讨论
本试验从健康仔猪胃肠道粘膜中利用经过盐酸校正后Rogosa SL完全选择性培养基筛选出6790株乳杆菌。将仔猪胃肠道粘膜在HEPES缓冲液中摇动5min，用无菌注射器吸取0.2mL上清液装入含Rogosa SL琼脂培养基的滚管中培养24h，再挑去白色菌落在厌氧无菌的Rogosa SL肉汤培养基里进行培养。经过革兰氏染色和接触酶试验，证明乳杆菌是健康仔猪胃肠道的优势菌群，说明经盐酸校正的Rogosa SL琼脂培养基适合分离胃肠道粘膜乳杆菌。
菌种的筛选是及其烦琐的过程。大多数乳杆菌的选育过程是从消化道上皮分离益生菌，这样便可以获得具有良好定殖效果的菌种。
(二)罗伊氏乳杆菌的抗逆性选育
1.1耐酸性能选育
制备pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5的Rogosa SL肉汤培养基，并分别接种已培养24h的胃乳杆菌和肠乳杆菌，接种量1％，于37℃培养24h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐酸。从接种开始和第8h用无菌注射器取出1mL进行梯度稀释至10-5后，取0.3mL稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，平皿放置在37℃，5％CO2培养箱中，培养24h，计算存活率。然后镜检看是否染菌。能够生长的乳杆菌菌株的最初分离样品保存在-80℃冰箱备用。
1.2耐胆盐性能选育
制备含猪胆盐0.3％的麦芽汁培养基，接种已培养24h的菌培养物，接种量1％，于28℃培养24h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐胆盐。然后镜检看是否染菌。能够生长的乳杆菌菌株的最初分离样品保存在-80℃冰箱备用。
1.3耐高铜性能选育
制备含有250mg/kg五水硫酸铜的肉汤培养基，接种已培养24h的菌培养物，接种量1％，于28℃培养12-72h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐高铜。然后镜检检查是否染菌。能够生长的乳杆菌菌株的最初分离样品保存在-80℃冰箱备用。
1.4耐高锌性能选育
制备含有1％氧化锌的肉汤厌氧培养基，接种已培养24h的菌培养物，接种量1％，于28℃培养12-72h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐高锌。然后镜检看是否染菌。能够生长的乳杆菌菌株的最初分离样品保存在-80℃冰箱备用。
2.结果与讨论
2.1耐酸性能选育
通过耐酸性能选育，6790株乳杆菌中，有4753株乳杆菌可以在pH2.0的RogosaSL肉汤培养基中生长繁殖，淘汰率为30％。这说明胃肠道的大多数乳杆菌耐酸性能较好，有70％的乳杆菌可以在仔猪的胃肠道中进行繁殖。乳杆菌一般通过定殖在消化道上皮发生益生特性。因此，如果菌种对胃酸没有耐受性，很难对动物的生产性能产生良好的作用。
2.2耐胆盐性能选育
将通过耐酸性能选育的4753株乳杆菌进行耐胆盐性能选育，有856株乳杆菌可以在含胆盐0.3％的麦芽汁培养基中生长繁殖，淘汰率为82％。研究表明，胆盐是肠乳杆菌在动物胃肠道内遇到的比胃酸更不利的因素。Chou和Weimer研究发现用胆盐选择性驯化乳杆菌对胆盐的耐受力是有效的，经过几代胆盐驯化之后得到的乳杆菌耐胆盐的能力比亲代乳杆菌强，乳杆菌容易对胆盐性能产生耐受性，且具有一定的遗传性，选育出耐胆盐的罗伊氏乳杆菌在生产中具有重要的意义。
2.3耐高铜性能选育
将通过耐胆盐性能选育的856株乳杆菌进行耐高铜性能选育，有257株乳杆菌可以在250mg/kg五水硫酸铜的Rogosa SL肉汤培养基中生长繁殖，淘汰率为70％。证明该乳杆菌具有较强的耐高铜特性。由于高铜日粮具有促生长的作用，目前我国比较普遍使用的日粮，因此选择具有耐高铜的罗伊氏乳杆菌是极其必要的。
2.5耐高锌性能选育
将通过耐高铜性能选育的257株乳杆菌进行耐高锌性能选育，有77株乳杆菌可以在含1％氧化锌的肉汤厌氧培养基中生长繁殖，淘汰率为70％。高锌具有防止腹泻、促进生长的作用，因此在我国利用氧化锌来配制仔猪饲料，尤其是断奶仔猪饲料的厂家很多。因此选育出耐高锌的罗伊氏乳杆菌也是必要的。
3.小结
通过本试验获得77株来源于仔猪胃肠道粘膜，对消化道内环境有一定抵抗能力的乳杆菌菌株，这为以后的选种工作打下了基础。
(三)罗伊氏乳杆菌的益生特性选育
1.1乳杆菌代谢产物抑制大肠杆菌能力的选育
大肠杆菌(K88、K99和987P)购自中国兽药监察所。K88在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为：CMCC44742，K99在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为：CMCC44820，987P在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为：CMCC44317。
乳杆菌：77株耐酸、耐胆盐、耐高铜和耐高锌的乳杆菌。
培养基：麦康凯(MacConkay)培养基(购自北京天坛生物制品股份有限公司)。
在Hungates管里加MRS肉汤培养基约15mL，充二氧化碳，制成无菌厌氧MRS肉汤。每个管中分别接种从健康仔猪胃里分离到的77株耐酸、耐胆盐、耐高铜和耐高锌的乳杆菌，乳杆菌经18h培养后按1％接种于肉汤中，在37℃培养箱里培养24h后，置4℃冰箱保存备用。
抑制大肠杆菌试验：制作麦康凯培养基，加热溶解后在121℃高压灭菌15min后，无菌倾倒平皿。用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域，每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌培养液(4.0×108CFU/mL)于培养基表面，然后在距平皿中线约3cm的地方挖一宽为0.5cm的沟，沟与接种划线垂直，用热接种棒补底，如图2所示。分别用不同的乳杆菌培养物将沟填满(不能溢出)，置普通培养箱37℃培养18h后，观察出现大肠杆菌菌落的位置，大肠杆菌的菌落为红色，测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟的距离。每个乳杆菌作两个平行样，以平均值表示结果。
1.2乳杆菌与大肠杆菌混合培养抑制作用选育
大肠杆菌(K88、K99和987P)来源与1.1节同。
乳杆菌：65株肠代谢产物对大肠杆菌具有较强抑制作用的乳杆菌。
大肠杆菌的检测培养基：麦康凯(MacConkay)培养基与1.1同。
乳杆菌接种于厌氧无菌MRS肉汤中，37℃培养24h后，置4℃冰箱保存备用。
1.2.1不同浓度乳杆菌对大肠杆菌的抑制
随机选择一株乳杆菌，取5mL培养物(8.2×109CFU/mL)分别与5、10、15mL营养肉汤混合，制成3个含不同乳杆菌培养物浓度的营养肉汤，接种大肠杆菌，接种量为培养液的5％，置37℃，5％CO2培养箱培养4、8和18h后，分别用无菌注射器取出培养液，培养液经梯度稀释成10-2～10-5后，每个稀释度作4个平行样，取0.3mL稀释液，用“L”棒均匀涂布于麦康凯琼脂平板上，置于37℃，普通培养箱培养18h，取菌落数在50～150个的平皿计数，以平均值表示结果，计算每毫升培养液中大肠杆菌的数量。
1.2.2含1/4乳杆菌的营养肉汤中乳杆菌与大肠杆菌的数量关系
取5mL乳杆菌培养物(108CFU/mL)分别与15mL营养肉汤混合，接种24h大肠杆菌培养物，接种量分别为培养液的10％(107CFU/mL)，起始混合液中乳杆菌的数量为大肠杆菌的10倍，用0.1M NaOH溶液调节培养液的pH为7.0，置37℃培养箱培养24h后，分别用无菌注射器取出培养液，培养液经梯度稀释至10-5，10-6，10-7后，取0.3mL稀释液用“L”棒均匀涂布于MRS琼脂培养基上，每个梯度的培养液作3个平行样，MRS琼脂培养基(pH5.4)置37℃、5％CO2培养箱培养18h，取菌落数在50～150个的平皿计数，以平均值表示乳杆菌的数量，计算每毫升培养液中乳杆菌的数量。培养24h后直接用无菌注射器取1mL培养液经梯度稀释至10-2后，取0.3mL稀释液置于麦康凯琼脂上，用“L”棒均匀涂布，每个管做3个平行样，将平板置于37℃，普通培养箱培养18h，计算每个平板的大肠杆菌菌落数，以平均值表示结果。
1.3乳酸产量的选育
乳杆菌：63株抗大肠杆菌能力强的乳杆菌。
MRS肉汤培养基用冰醋酸调节pH至5.4，混合后装进Hungates管，每管装10mL肉汤，趁热充1.5％CO2 1min，封口，高压灭菌，制成厌氧无菌肉汤，63株乳杆菌分别经该厌氧无菌肉汤培养24h后，再按1％接种于MRS肉汤中培养20h。取2mL培养液，3500rpm离心15min，取上清液，用超纯水稀释10倍后，用D-乳酸检测试剂盒(编号K-DATE，上海宝曼生物科技有限公司)和Technicon RA 100生化仪酶法测定上清液中的乳酸浓度。每个菌株测两个平行样，以平均值表示结果。
2结果
2.1乳杆菌代谢产物抑制大肠杆菌的选育
乳杆菌代谢产物抑制大肠杆菌的效果以离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟的距离为指标，距离越大，说明抑菌效果越好。本试验所采用的平皿挖沟法是对经典的平皿挖孔法的改进，基本原理是放置在沟中的抗菌物质能渗透过琼脂来抑制大肠杆菌，随着离沟距离的增大，能渗透过去的抗菌物质的浓度就越小。大肠杆菌菌落与小沟的距离越大，说明乳杆菌代谢产物所含抗菌物质的抑菌能力越强。用平皿挖沟法在同一平皿可以同时测定乳杆菌代谢产物对3株大肠杆菌的抑制作用，而用平皿挖孔法在同一平皿只能测定对一株大肠杆菌的抑制作用。有65株乳杆菌对大肠杆菌K88和K99的抑菌距离在1.0～2.7cm之间，进一步研究它们与大肠杆菌混合培养的数量关系。其中，乳杆菌RI021对大肠杆菌K88、987P和K99的抑菌距离分别为2.1cm、2.2cm、1.9cm。
2.2乳杆菌与大肠杆菌体外培养的数量关系
2.2.1不同比例乳杆菌RI021培养液与大肠杆菌在混合培养条件下的数量关系。
结果见表2。
表2营养肉汤中含不同比例乳杆菌RI021培养液对大肠杆菌的抑制作用(单位：CFU/mL)
2.2.2乳杆菌与大肠杆菌在混合培养条件下的数量关系
表3乳杆菌和大肠杆菌混合培养的数量关系(单位：CFU/mL)
从表2中可以看出，不同浓度的乳杆菌与大肠杆菌混合培养时对大肠杆菌的抑制作用相似，说明含有25％的乳杆菌RI021的营养肉汤足以用来做抑制大肠杆菌的试验。乳杆菌RI021与大肠杆菌在含25％乳杆菌RI021培养物的营养肉汤中与大肠杆菌混合培养的数量关系见表3。从表中可见，RI021对三种血清型大肠杆菌具有相对较强的抑菌能力。体外试管培养时不同微生物间的数量关系可以作为反映微生物在体内相互作用的一种指标。
2.3乳杆菌的产酸能力
经测定，乳杆菌RI021的产酸能力为0.7231g/L，与同测的其它菌株相比，具有较高的产酸能力。
3小结
根据抑菌试验、菌种分离部位和产酸能力，筛选出乳杆菌RI021作为益生菌的生产菌种。这株菌经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)鉴定为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.4650。RI021细胞为杆状，革兰氏染色阳性，其它生物学特性如表4所示。
表4 RI021的生物学特性
该罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，是乳杆菌属(Lactobacillus)的一种。
下述实施例中所述的罗伊氏乳杆菌如无特别说明，均指罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)RI021 CGMCC No.4650。
实施例2、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)RI021 CGMCC No.4650的生物学特性研究
1.1生长曲线
在500mL锥形瓶里装300mL MRS肉汤培养基。按1％接种量接种罗伊氏乳杆菌培养物，在前24h每隔1h，24h之后在第28、32、36、40、44、48h取样，取1mL培养液进行梯度稀释后，在10-2～10-6稀释度取0.3mL稀释液在MRS琼脂培养基(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，5％CO2的培养箱中，培养24h，取平皿中的菌落数50～150的稀释度作为计算用，每个梯度做3个平行样，以平均值表示结果。每毫升细菌浓度以对数值表示。
1.2耐酸存活率
MRS肉汤培养基用冰醋酸调pH节至5.4，再用浓盐酸将pH调节至2.0，置于Hungates滚管中，每个管装20mL肉汤，制成厌氧无菌肉汤。凉下来后每管中加1mL罗伊氏乳杆菌16h的培养物，在开始时、2h、4h、6h和8h分别取样，测定存活率。用无菌注射器取出1mL进行梯度稀释后，在10-4～10-7稀释度取0.3mL稀释液在MRS琼脂培养基(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，5％CO2的培养箱中，培养24h，取平皿中的菌落数50～150的平皿计数，以平均值表示结果。
存活率的计算公式为：
S酸＝nx/n0
S酸为经过pH2.0处理后不同时间的罗伊氏乳杆菌存活率；n0为pH2.0处理前每毫升活菌数；nx为pH2.0处理2、4、6、8h后每毫升活菌数。
1.3耐热存活率
MRS肉汤培养基，调节pH为6.7，置于Hungates滚管中，每个管装20mL肉汤，制成厌氧无菌肉汤。每管中加1mL罗伊氏乳杆菌培养16h后的培养物，放置在37℃培养箱中16h后，取样进行活菌计数培养，同时将Hungates管迅速放置在75℃水浴中加热15min，取样进行活菌计数。用无菌注射器取出1mL进行梯度稀释后，在10-4～10-7稀释度取0.3mL稀释液在MRS琼脂培养基(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，5％CO2培养箱中，培养24h，取平皿中的菌落数为50～150的平皿计数，以平均值表示结果。
存活率的计算公式为：
S热＝n1/n0；
S热为经过75℃处理后的罗伊氏乳杆菌存活率；n0为加热处理前每毫升活菌数；n1为加热处理15min后每毫升活菌数。
1.4耐贮藏存活率
MRS肉汤培养基，调节pH为6.7，置于Hungates滚管中，每管装20mL MRS肉汤培养基，制成厌氧无菌肉汤后，每管中加1mL罗伊氏乳杆菌培养16h的培养物，放置在37℃培养箱中16h后，取样1mL进行活菌计数。室温下放置1个月后，取样1mL进行活菌计数培养。计数方法用无菌注射器取出1mL进行梯度稀释后，在10-4～10-7稀释度取0.3mL稀释液在MRS琼脂培养基(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，5％CO2的培养箱中，培养24h，取菌落数为50～150个的平皿计数，以平均值表示结果。
存活率的计算公式为：
S贮＝n1/n0
S贮为经过1个月贮藏后的罗伊氏乳杆菌存活率；n0为贮藏前每毫升活菌数；n1为贮藏1个月后每毫升活菌数。
2结果与讨论
2.1罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021 CGMCC No.4650的生长曲线
生长曲线主要反映一种微生物的生长特性，微生物的生长一般经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段，这是一种典型的生长曲线模型。延迟期是微生物对新的生长环境的适应过程，在这一过程中，微生物表现为数量不变或下降，对其自身的大分子和小分子的组成进行调整，同时也会产生特定的物质如酶等来适应新的环境。对数生长期是微生物对新的环境适应之后，生长繁殖速度呈几何级数的阶段，是数量增长最快的一个阶段，表现为菌体数量和重量的增加。但是到了对数期的末期，由于菌体生长代谢对营养物质的消耗和有毒产物的积累，细菌的生长繁殖速率下降。稳定期是细菌生长速率与死亡速率趋于平衡的阶段。衰亡期细菌数量明显下降。测定生长曲线对于确定合适的发酵时间具有重要作用。
罗伊氏乳杆菌的生长曲线如图1所示，从图1可见，罗伊氏乳杆菌的浓度在开始时有下降的趋势，经过2h之后从103个数量级迅速上升，到第22h接近1010个数量级，到40h，细菌的数量级开始缓慢下降，主要原因是培养基营养物质浓度下降和有害代谢产物增加引起菌体自溶死亡增加，生长繁殖的菌体数量比死亡的菌体数量更多，导致总的活菌数量减少。从生长曲线可以看出，罗伊氏乳杆菌的最佳收获期是在培养后的20～28h。
2.2罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021 CGMCC No.4650的耐酸存活率
罗伊氏乳酸杆菌经pH2.0处理不同时间的菌体浓度见表5。
表5 pH2.0处理不同时间对罗伊氏乳酸杆菌活菌浓度的影响(单位：CFU/mL)
从表5可见，在pH2.0处理前2h，罗伊氏乳酸杆菌的数量几乎保持在100％的存活率，到第4h存活率下降为72％，第6h下降为34.4％。该罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)RI021 CGMCC No.4650是一株分离自十二指肠粘膜的菌种，这个存活率对于其耐过胃酸的抑制作用或杀灭作用应是较为理想的，也表明该菌株可以有足够数量的活菌数到达十二指肠。
2.3罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021 CGMCC No.4650的耐热存活率
罗伊氏乳杆菌RI021经75℃处理15min之后的存活率达到31.7％。一般仔猪饲料的制粒温度为70℃～85℃之间，耐高温之后存活率低也是乳杆菌作为饲料添加剂的主要限制性因素之一，根据Fuller(1989)的研究，乳杆菌经过75℃处理10min之后基本上没有活菌。从耐热存活率看，本试验选育的罗伊氏乳杆菌可以耐受制粒时的高温，作为饲料添加剂将会有较好的应用前景。
2.4罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021 CGMCC No.4650的耐贮藏存活率
经过一个月的贮藏之后，罗伊氏乳杆菌的存活率为85.6％。
实施例3、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021 CGMCC No.4650制剂的制备
1、将罗伊氏乳杆菌接种于葡萄糖营养肉汤，并用醋酸调节pH至6.7，置普通培养箱37℃度培养18-24小时后，用无菌水梯度稀释，得到浓度为(107-1010)cfu/g的菌种液。
按重量计，将含罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650的菌种液1份、稻壳粉1份、脱脂奶粉1份、麦芽糊精1份、麸皮0.5份混合，经干燥粉碎，即得到由罗伊氏乳杆菌和载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂组成的罗伊氏乳杆菌制剂A。该罗伊氏乳杆菌制剂A中，二者的配比为8克载体：1010cfu罗伊氏乳杆菌，所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮的质量比为2∶2∶2∶1。
2、将罗伊氏乳杆菌接种于Rogosa SL肉汤培养基中，用醋酸调节pH至6.7，置普通培养箱37℃培养18-24小时后，用无菌水梯度稀释，得到浓度为(107-1010)cfu/g的菌种液。
按重量计，将含罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650的菌种液10份、稻壳粉1份、脱脂奶粉1份、麦芽糊精1份和麸皮0.5份混合，喷雾干燥，稻壳粉和麸皮事先进行过微粉化处理(90％的粉体粒径小于100μm，平均粒径小于50μm，所述平均粒径为50％粉体粒径)，即得到由罗伊氏乳杆菌和载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂组成的罗伊氏乳杆菌制剂B。该罗伊氏乳杆菌制剂B中，二者的配比为0.5克载体：107cfu罗伊氏乳杆菌；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮的质量比为2∶2∶2∶1。
3、将步骤1中培养得到的罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650置于发酵罐中进行一级发酵，37℃培养18-24小时后，用无菌水梯度稀释，得到浓度为(107-1010)cfu/g的菌种液。发酵罐培养基组分为脱脂奶粉、蛋白胨、蔗糖、乳糖、甘油、淀粉，六者的重量比为10份∶15份∶2份∶3份∶1份∶2份。另加适量水，并用醋酸调节pH至6.7。培养基中碳氮磷比为100∶5∶0.5。
按重量计，将含罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650的菌种液10份、稻壳粉2份，脱脂奶粉1份，麦芽糊精1份，麸皮1份混合，喷雾干燥，稻壳粉和麸皮事先经过微粉化处理(90％的粉体粒径小于100μm，平均粒径小于50μm，所述平均粒径为50％粉体粒径)，即得到由罗伊氏乳杆菌和载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂组成的罗伊氏乳杆菌制剂C，二者的配比为0.5克所述载体：108cfu罗伊氏乳杆菌；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮的质量比为2∶1∶1∶1。
4、将步骤1中培养得到的罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650置于种子罐中进行一级发酵，然后置于生产罐中进行二级发酵，用无菌水梯度稀释，得到浓度为(107-1010)cfu/g的菌种液。两级发酵罐培养基组分均为稻壳粉12份、蛋白胨10份、脱脂奶粉10份、蔗糖1份、乳糖2份、甘油1份、淀粉3份，混合，另加适量水。并用醋酸调节pH至6.7。培养基中碳氮磷比为100∶10∶3。
按重量计，将含罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650的菌种液10份、稻壳粉1份、脱脂奶粉1份、麦芽糊精1份、麸皮1份混合，喷雾干燥，稻壳粉和麸皮事先经过微粉化处理(90％的粉体粒径小于100μm，平均粒径小于50μm，所述平均粒径为50％粉体粒径)，即得到由罗伊氏乳杆菌和载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂D，二者的配比为0.4克所述载体：109cfu罗伊氏乳杆菌；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮的质量比为1∶1∶1∶1。
5、将步骤2中培养得到的罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650置于种子罐中进行连续两次发酵，然后置于生产罐中进行三级发酵，用无菌水梯度稀释，得到浓度为(107-1010)cfu/g的菌种液。发酵罐培养基组分为稻壳粉12份、蛋白胨6份，脱脂奶粉10份、蔗糖1份、糖蜜1份，乳糖2份、甘油1份、淀粉3份，碳氮磷比为100∶7∶2。加入水，并用醋酸调节pH至6.7。
按重量计，将含罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650的菌种液6份、麸皮1份、脱脂奶粉1份混合，喷雾干燥，麸皮事先经过微粉化处理(90％的粉体粒径小于100μm，平均粒径小于50μm，所述平均粒径为50％粉体粒径)，即得到由罗伊氏乳杆菌和载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂E，二者的配比为0.4克所述载体：107罗伊氏乳杆菌；所述载体由脱脂奶粉和麸皮组成，所述脱脂奶粉和麸皮的质量比为1∶1。
6、含罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650菌种液制备方法同步骤4。
按重量计，将含罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650的菌种液10份、稻壳粉2份、麸皮1份、脱脂奶粉1份混合，喷雾干燥，稻壳粉和麸皮事先经过微粉化处理(90％的粉体粒径小于100μm，平均粒径小于50μm，所述平均粒径为50％粉体粒径)，即得到由罗伊氏乳杆菌和载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂F，二者的配比为0.4克所述载体：1010cfu罗伊氏乳杆菌；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉和麸皮的质量比为1∶1∶1。
实验例4、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021 CGMCC No.4650制剂对仔猪生产性能的影响
1.1材料与方法：
试验动物
选取28±2d断奶的杜长大三元杂种仔猪48头，平均体重7.56±0.52kg，按体重随机区组分为2个处理组，每组6个重复，每个重复4头仔猪。
1.2罗伊氏乳杆菌制剂
采用实施例3的罗伊氏乳杆菌制剂A-F。
1.3试验分组
试验共分为两个处理，处理1为试验组，基础日粮添加重量比为0.1％的实施例3中的罗伊氏乳杆菌制剂A-F中的任一种；处理2为对照组，基础日粮各处理的安排见表6。基础日粮的组成及营养成分见表6。
表6生长试验的基础日粮组成和营养水平
注：1.粗蛋白、赖氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、苏氨酸、钙和磷为实测值。
2.每公斤预混料提供：维生素A，11,000IU；维生素D3，1503IU；维生素E，44.1IU；维生素K，4.0mg；核黄素，5.22mg；泛酸，20.0mg；烟酸，26.0mg；维生素B12，0.01mg；锰，35.0mg；铁，100.0mg；锌，90.0mg；铜，16.5mg；碘，0.30mg；硒，0.30mg。
1.4饲养管理
试验于国家饲料工程技术研究中心代谢室进行。试验期21天。试验期间仔猪饲养在全封闭式的保育仔猪舍内，舍内的温度保持在24～27℃。自由采食，每个栏圈安装有鸭嘴式饮水器供仔猪自由饮水。基础日粮的1％预混料自配，不含有任何抗生素。仔猪的免疫按猪常规兽医传染病的免疫程序进行，仔猪饲养管理措施严格执行卫生防疫制度。
1.5样品收集与处理
试验在开始、7d、14d和21d时称仔猪个体重，记录每周的日增重和饲料采食量。
1.6数据统计
试验所有数据采用SPSS12.0(SPSS Inc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理统计。
2.结果与讨论
2.1罗伊氏乳杆菌制剂对仔猪断奶后生长性能的影响
表7罗伊氏乳杆菌制剂C对断奶仔猪生长性能的影响
注：表中值为平均值±标准差。
从表7看出，断奶后第1wk、第2wks和第3wks，试验组的仔猪平均日增重(ADG)比对照组分别提高38.5％，44.1％和27.4％，差异显著(P＜0.05)，平均日采食量(ADFI)比对照组分别提高21.3％，41.8％和18.6％，差异显著(P＜0.05))。
用罗伊氏乳杆菌制剂A、B、D、E和F进行同样的实验也得到了相同的结论。
实验例5、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021 CGMCC No.4650对大肠杆菌感染仔猪腹泻的影响
1.材料与方法
实施例3的罗伊氏乳杆菌制剂E。
1.1试验动物与饲养管理
选择24头28±2d断奶的健康杜长大三元杂种仔猪，体重为7.66±1.00kg。随机分成2组，在代谢笼内单笼饲养，代谢室的室温控制在25℃～27℃，处理组12头仔猪每天饮水口服液态罗伊氏乳杆菌制剂，每日饮进罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650的总数约为107CFU，对照组12头仔猪饮用自来水作为对照。试验第8d用20mL大肠杆菌K99、K88和987P(来源同实施例1)的混合培养液(总菌数为108CFU)口服攻毒，该混合液中三种血清型的大肠杆菌的比例相等，一日二次，共1d，攻毒后仔猪仍然自由饮自来水和采食，测定攻毒后腹泻发病时间和腹泻指数，试验期14d。
1.2试验日粮
试验仔猪采食基础日粮，不含任何抗生素，参照NRC(1998)推荐的需要量进行配制。基础日粮配置见实施例4的表6。
1.3腹泻指数
腹泻指数是腹泻头次乘以相应的腹泻得分，腹泻得分根据表7的腹泻评分标准计算。腹泻率为攻毒后7d内腹泻的仔猪总头次除以每天的仔猪头数乘以7。
表7腹泻评分标准
1.4统计分析
数据的统计分析采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)软件的独立样本t-检验进行统计分析。
2结果与讨论
试验结果见表8，试验组腹泻发病率比对照组下降64.8％，腹泻指数下降了63。对照组在攻毒后第2d即有第一头仔猪发生腹泻，而实验组一直到攻毒后第4d才发现第一头仔猪腹泻。在我国，许多试验研究证明了益生菌能有效防治哺乳仔猪和断奶仔猪的腹泻，有些效果优于抗生素或基因工程疫苗。在罗伊氏乳杆菌制剂中含有的产乳酸菌素的罗伊氏乳杆菌在体外具有很好的抗大肠杆菌特性，据Hoefling报道新生仔猪腹泻中有26％是由于肠毒性大肠杆菌引起的。试验组仔猪在攻毒前7d，一直口服含罗伊氏乳杆菌的水，罗伊氏乳杆菌在胃肠道食糜和粘膜已经大量存在，并在特定的胃肠道微生境发挥益生作用。仔猪受到大肠杆菌攻毒时，由于罗伊氏乳杆菌能抑制大肠杆菌的生长繁殖，从而有效地保护了机体免受大肠杆菌大量繁殖造成的严重损害，降低腹泻发病率和腹泻的严重程度，同时推迟腹泻发病时间。
表8罗伊氏乳杆菌制剂E对大肠杆菌感染断奶仔猪腹泻的影响
用实施例3的其它五种罗伊氏乳杆菌制剂进行同样的实验也得到了相同的结论。
实验例6、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021 CGMCC No.4650制剂对早期断奶仔猪胃肠道微生物菌群、养分消化率的影响
1材料与方法
1.1试验动物与日粮处理
选择48头28±2d断奶仔猪，体重7.67±1.09kg，按完全随机区组设计动物试验，试验分2个处理，每个处理6个重复，每个重复4头仔猪，高层网上平养，栏圈尺寸为2.0×2.0m，每圈为一个重复，每个处理3圈公猪，3个圈母猪。处理1为试验组，基础日粮添加0.1％(质量含量)实施例3的罗伊氏乳杆菌制剂F；处理2为对照组，基础日粮添加50mg/kg卡巴氧，各处理的安排见表9。试验期间仔猪饲养在全封闭式的保育仔猪舍内，舍内的温度保持在24～27℃。自由采食，每个栏圈安装有鸭嘴式饮水器供仔猪自由饮水。基础日粮的1％预混料自配，不含有任何抗生素。仔猪的免疫按猪常规兽医传染病的免疫程序进行，仔猪饲养管理措施严格执行卫生防疫制度。试验期21d，在试验开始、7d、14d和21d时称仔猪个体重，记录每周的日增重和饲料采食量。在最后1周日粮中添加0.5％的硅藻土作为指示剂测定营养物质的消化率，基础日粮组成见表6。
表9试验动物安排
1.2样品收集与处理
试验第21d每个重复取一头仔猪，屠宰后取回肠食糜测定氨基酸消化率。无菌法取胃，十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠各5cm长，两端结扎后，放置在-80℃冰箱中，用于测定内容物和粘膜的微生物菌群，取胃、十二指肠、空肠上段、空肠中段、空肠下段、回肠、盲肠、结肠降段和结肠升段的内容物装于塑料管中，放置在-80℃冰箱中。试验最后三天以圈为单位收集刚从***排出的新鲜粪便，放置在-20℃冰箱中，测定营养物质消化率。
1.3微生物分析
无菌称取不同部位的胃肠道食糜1g，溶解于99mL的无菌生理盐水，在无菌生理盐水的瓶子里放置5～8粒小玻璃珠。然后再进行逐级10倍稀释，一直到10-7，在10-5～10-7每个稀释度，取0.3mL稀释液于相应的滚管培养基中进行乳酸杆菌、双歧杆菌和厌氧菌培养。在10-2～10-5每个稀释度，取0.3mL稀释液于相应的平板培养基中进行大肠杆菌、肠杆菌和好氧菌的计数。粘膜微生物测定方法参考Rojas和Conway(1996)的方法，无菌取1cm2胃肠粘膜，用无菌PBS溶液冲洗粘膜至无可见的食糜，用无菌滤纸吸干表面上的水，然后用无菌镊子将组织块浸入10mL无菌HEPES缓冲液，并不断振荡冲洗5min，然后再进行逐级10倍稀释，直到10-3。在每个稀释度，取0.3mL稀释液于相应的平板或滚管培养基中。微生物用选择性培养基培养，培养基的制作参照陈天寿(1995)的方法，大肠杆菌和肠杆菌培养基用伊红美蓝(EMB)培养基(蛋白胨，10g；乳糖，10g；磷酸氢二钾，2g；琼脂，13g；伊红-Y，0.4g；美蓝，0.065g；蒸馏水，1000mL；pH，7.1)，乳酸杆菌用Rogosa SL完全选择性培养基(胰蛋白胨，10g；酵母浸粉，5g；葡萄糖，10g；***糖，5g；蔗糖，5g；醋酸钠，15g；枸椽酸铵，2g；磷酸二氢钾，6g；七水硫酸镁，0.58g；四水硫酸锰，0.25g；硫酸亚铁，0.03g；吐温-80，1g；琼脂，13g；0.1％刃天青，1mL；蒸馏水，1000mL；用醋酸调节pH至5.2)。双歧杆菌用双歧杆菌培养基(BM)(葡萄糖，20g；胰酪胨，20g；酵母浸粉，10g；蛋白胨，10g；西红柿汁，333mL；吐温-80，2g；蒸馏水，1000mL；pH 6.6，碳酸钙，10g；半胱氨酸，0.5g；0.1％刃天青，1mL)。好氧菌和厌氧菌用好氧菌和厌氧菌培养基(酪胨，15g；葡萄糖，5g；L-胱氨酸，0.5g；硫乙醇酸钠，0.5g；酵母浸粉，5g；氯化钠，2.5g；0.1％刃天青，1mL；琼脂，13g，蒸馏水，1000mL；pH7.1)。厌氧菌、乳酸杆菌和双歧杆菌培养基制作成Hungates滚管，好氧菌、大肠杆菌和肠杆菌用平板培养。Hungates管和培养基平皿放置在37℃培养箱，培养48h后计数。每个稀释度做三个平板或滚管，以50～150个菌落的平板或滚管的稀释度作计数用。
1.4化学分析将粪便从冰箱中取出，以圈为单位将粪便混合后，取300g左右放置于铝盒中，将铝盒放在65℃的烘箱中鼓风干燥96h。日粮和粪便样品粉碎后，过40目筛。食糜样品进行冷冻干燥，用于测定氨基酸的日粮样品和食糜粉碎过60目筛。日粮和粪的粗水分、粗蛋白、粗灰分、钙和总磷分别参照中华人民共和国国家标准GB/T6435-1986(2001)、GB/T 6432-1994(2001)、GB/T 6438-1992(2001)、GB/T 6436-1992(2001)和GB/T 6437-1992(2001)测定。其中，粗蛋白采用KJELTEC1035全自动分析仪进行测定。
能量采用PARR1281全自动能量测定仪(PARR Instrument Corp.，美国)测定。氨基酸(除含硫氨基酸和色氨酸)按国家标准GB/T18246-2000(2001)在110℃下6mol/L盐酸水解24h后用氨基酸自动分析仪(日立L-8800，日本)测定；含硫氨基酸(包括蛋氨酸和半胱氨酸)按照国家标准GB/T15399-1994(1996)在110℃下用过甲酸(1mL过氧化氢+9mL甲酸)氧化16h后，使用盐酸水解方法测定；色氨酸按照国家标准GB/T18246-2000(2001)在110℃下4mol/L氢氧化钠水解24h后使用高压液相色谱(岛津LC-10A，日本)测定。采用McCarthy等(1974)的方法测定盐酸不溶灰分。即取约10g样品，用100mL 4mol/L HCl煮30min后，用无灰分滤纸过滤，用开水冲洗直至无酸，然后在650℃下灰化6h以上。
1.5消化率计算公式
按以下公式计算氨基酸回肠表观消化率或养分的全消化道消化率：
D＝100-(C1×P2)÷(C2×P1)×100
其中，D＝氨基酸回肠表观消化率或养分全消化道消化率(％)，
C1＝待测饲料盐酸不溶灰分含量(％)，
P2＝食糜或粪便中养分含量(％)，
C2＝食糜或粪便中盐酸不溶灰分含量(％)，
P1＝待测饲料养分含量(％)。
1.6数据统计
试验所有数据采用SPSS9.0for Windows(SPSS Inc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理统计。
2结果与讨论
2.1罗伊氏乳杆菌制剂F对断奶仔猪消化道食糜微生物菌群的影响
由表10可以看出，肠杆菌数量在空肠、盲肠和结肠极显著地升高(P＜0.01)，在回肠显著升高(P＜0.05)，而在十二指肠显著降低(P＜0.01)，在胃二组之间没有显著差异。乳酸杆菌数量在胃、十二指肠、空肠和回肠均比卡巴氧组极显著地升高(P＜0.01)，在盲肠显著升高(P＜0.05)。双歧杆菌数量在胃、空肠、回肠和盲肠极显著升高(P＜0.01)，在十二指肠和结肠显著升高(P＜0.05)。厌氧菌总数在胃、十二指肠、空肠和回肠极显著地升高(P＜0.01)，在盲肠和结肠则显著升高(P＜0.05)。一些研究报道表明，乳杆菌能减少断奶仔猪肠道和粪便中的肠杆菌和大肠杆菌数量，在抑制仔猪的生长方面，这两种菌起着重要作用。本实验的结果表明，罗伊氏乳杆菌制剂F能够提高消化道多数部位食糜中乳酸杆菌、双歧杆菌、厌氧菌、大肠杆菌、肠杆菌和好氧菌的数量。
表10罗伊氏乳杆菌制剂F对断奶仔猪消化道食糜微生物菌群的影响(单位：1g CFU/克，湿重)
注：表中值为平均值±标准差。
2.2罗伊氏乳杆菌制剂F对营养物质消化率的影响
从表11可以看出，与卡巴氧比较，罗伊氏乳杆菌制剂F显著提高了日粮中粗蛋白和总磷的全消化道表观消化率(P＜0.05)，但对能量、干物质、有机物和钙等全消化道表观消化率以及氨基酸回肠末端表观消化率都没有显著影响(P＞0.05)。植酸磷是影响饲料中营养物质吸收的重要的阻碍物质，而乳酸可以缓解这种阻碍作用，提高磷的利用率。本制剂中罗伊氏乳杆菌在体外筛选时具有较高产生乳酸的能力(结果见实施例1)。结果表明，罗伊氏乳杆菌制剂对断奶仔猪的营养物质消化率的影响并不大。
表11罗伊氏乳杆菌制剂F对断奶仔猪日粮养分表观消化率的影响(单位：％)
注：表中值为平均值±标准差。
实验例7、不同菌种液载体吸附所制得的制剂在室温下的长期贮存稳定性
1、实验方法
将罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650接种于葡萄糖营养肉汤，并用醋酸调节pH至6.7，置普通培养箱37度培养18-24小时后，用无菌水梯度稀释，得到浓度为1010cfu/g的菌种液。
菌种液载体分别为稻壳粉、麸皮、脱脂奶粉、麦芽糊精和糖蜜。用载体配成的制剂中载体和罗伊氏乳杆菌CGMCC No.4650的配比均为0.5克载体：109cfu罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RI021。
配成制剂后立刻测量菌种活力(通过制剂中菌种的浓度体现)，然后常温下分别放置1、6、12、18个周后，再分别测量菌种活力；计算放置后菌种活力占放置前菌种活力的百分比。
2、实验结果
如表12所示，说明本发明的制剂在载体中比较稳定。
表12不同菌种液载体吸附所制得的制剂的长期稳定性研究
Claims (10)
1.罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri)RI021，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.4650。
2.一种罗伊氏乳杆菌制剂，其特征在于：所述制剂由权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)RI021和载体组成；所述载体为稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮；
权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)RI021和所述载体的配比为：（107-1010）cfu：（0.4-8）克载体。
3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于：所述制剂具有下述至少一种用途：
1）制备调节动物肠内微生态平衡的产品；
2）制备增强动物非特异性免疫的产品；
3）提高动物饲料转化效率；
4）促进动物对营养物质的消化和吸收；
5）制备降低动物腹泻发病率的产品；
6）制备提高动物生产性能的产品；
所述动物为猪。
4.根据权利要求2或3所述的制剂，其特征在于：所述制剂具体可为A）-D)中的任意一种：
A）由权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri)RI021和所述载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂A，所述罗伊氏乳杆菌制剂A中，二者的配比为8克所述载体：1010cfu权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri)RI021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮的质量比为2:2:2:1；
B）由权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri)RI021和所述载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂B，所述罗伊氏乳杆菌制剂B中，二者的配比为0.5克所述载体：107cfu权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri)RI021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮的质量比为2:2:2:1；
C）由权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri)RI021和所述载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂C，所述罗伊氏乳杆菌制剂C中，二者的配比为0.5克所述载体：108cfu权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri)RI021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮的质量比为2:1:1:1；
D）由权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)RI021和所述载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂D，所述罗伊氏乳杆菌制剂D中，二者的配比为0.4克所述载体：109cfu权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri)RI021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮的质量比为1:1:1:1。
5.一种罗伊氏乳杆菌制剂，为如下E）或F）：
E）由权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)RI021和载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂E，所述罗伊氏乳杆菌制剂E中，二者的配比为0.4克所述载体：107cfu权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)RI021；所述载体由脱脂奶粉和麸皮组成，所述脱脂奶粉和麸皮的质量比为1:1；
F）由权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)RI021和载体组成的罗伊氏乳杆菌制剂F，所述罗伊氏乳杆菌制剂F中，二者的配比为0.4克所述载体：1010cfu权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)RI021；所述载体由稻壳粉、脱脂奶粉和麸皮组成，所述稻壳粉、脱脂奶粉和麸皮的质量比为1:1:1。
6.含有权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)RI021或权利要求2-4中任一所述制剂的动物饲料；所述动物为猪。
7.根据权利要求6所述的动物饲料，其特征在于：所述动物饲料中，每克所述动物饲料中含有107cfu以上的权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)RI021。
8.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)RI021或权利要求2-5中任一所述制剂的下述至少一种用途：
1）制备调节动物肠内微生态平衡的产品；
2）制备增强动物非特异性免疫的产品；
3）提高动物饲料转化效率；
4）促进动物对营养物质的消化和吸收；
5）制备降低动物腹泻发病率的产品；
6）制备提高动物生产性能的产品；
所述动物为猪。
9.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)RI021或权利要求2-5中任一所述制剂在制备大肠杆菌抑制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述大肠杆菌抑制剂中的大肠杆菌为大肠杆菌K88、大肠杆菌K99或大肠杆菌987P。
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