CN102191192B - 一种动物双歧杆菌及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
一种动物双歧杆菌及其应用方法，它是动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobactrium amimalisSubspLactis)B174，保藏号：CGCCNO.4182，保藏日期：2010年9月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。动物双歧杆菌乳亚种B174可以在人体内定植，对人体胃酸和胆盐有耐受性。同时该菌株对大肠菌有较好的抑制作用，可在室温下可存活30天。该菌株与其他类型的乳酸菌有较好的协同生长作用，并且同乳酸菌复配效果较好，产品具有较佳风味，可应用于制备发酵酸奶、动物饲料添加剂以及抑菌液，也可广泛应用于其他食品及生物制品领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物双歧杆菌及其应用方法。
背景技术
双歧杆菌是人体肠道内典型的有益菌，是人类最早发现的生理性细菌，它的生长繁殖存在于人的生命之中，是一群能在健康人肠道内定植的益生菌。它的存在可降低人体内***PH值，而使肠道菌群发生变化，抑制和杀灭病原菌，从而增强人体免疫抗病力，双歧杆菌在肠道内可合成多种维生素。润肠通便，降低胆固醇和甘油三脂，抑制癌细胞作用，抗衰老等作用。因此在科学上已确认人体内双歧杆菌数量和品质是人体健康的重要标准之一。
双歧杆菌的多种生理功能，可作为宿主氮的来源。双歧杆菌是一类专性厌氧菌，对氧的环境及营养要求高，用于制作发酵乳时产酸力低，凝乳间长，且属于异性发酵使产品风味欠佳。当菌体耐酸，耐胆盐能力不足时进不到肠道，就会失去它的作用。
因此，要发挥这些益生作用，须首先能耐受人体胃肠的消化过程，能抵御胃液和胆汁对其杀灭的作用。Berrada等报导食物在胃中排空的时间是90min，胃内PH值为3.0，最低可达1.3，人体小肠胆汁液浓度在0.03%-0.3%之间。
据目前相关报导，得到能够耐人体胆盐的双歧杆菌方法有三种：一是从自然界（人体粪便）中筛选，二是从自然发酵食品中筛选，三是对现有菌种进行驯化。但现有双歧杆菌，由于菌株之间的差异较大，往往无法在具备耐酸、胆盐的功能下，能够长时间在室温下存活，同时还具备抑菌，能与乳酸菌复配等多种优点。
发明内容
本发明提供一种来源于发酵食品，对酸、胆盐、室温有较好的耐受性，对大肠菌群有较强的抑制效果，与其他类型的乳酸菌有较好的协同生长作用，并且同乳酸菌复配效果较好，产品具有较佳风味的动物双歧杆菌，以及这种动物双歧杆菌的应用方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
这种动物双歧杆菌，它是动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobactrium animalis)B174，保藏号：CGCC NO.4182，保藏日期：2010年9月16 日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述动物双歧杆菌乳亚种B174对人体胃酸和胆盐有耐受性。
所述动物双歧杆菌乳亚种B174对室温有耐受性。
所述动物双歧杆菌乳亚种B174对大肠杆菌菌群有抑制作用。
所述动物双歧杆菌乳亚种B174与下列乳酸菌之一或一种以上复配，有协同生长作用；
嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophius）；
德氏乳杆菌保加利亚种（Lactobacillus delbrueckii）；
干酪乳杆菌亚种（Lactobacillus casei subsp.Casei）；
嗜热链球菌（Streptococcus thermophius）；
乳酸链球菌 （L.lactis）；
乳酸链球菌亚种（L.lactis subsp.lactis ）；
植物乳杆菌 （L.plantarum）。
所述动物双歧杆菌乳亚种B174与乳酸菌的最佳复配组合为：动物双歧杆菌乳亚种B174+嗜热链球菌+嗜酸乳杆菌，或是动物双歧杆菌乳亚种B174+嗜热链球菌+保加利亚乳杆菌。
这种动物双歧杆菌的应用方法，所述动物双歧杆菌乳亚种B174在制备发酵酸奶、动物饲料添加剂以及抑菌液中的应用。
这种动物双歧杆菌发酵酸奶的制备方法，分别将乳酸菌与权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种B174接种到灭菌脱脂乳培养基中，37℃恒温培养，至凝乳出发酵，活化2～3代，组配后接种至灭菌鲜奶中，42℃发酵，凝乳后至于冰箱内保存。
这种动物双歧杆菌抑菌液的制备方法，将置于低温冰柜的动物双歧杆菌乳亚种B174放到40～50℃水浴中解冻活化，在无菌条件下接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养12～14h，活化2～3代；将活化好的动物双歧杆菌乳亚种B174发酵液采用低温离心的方法，制备发酵上清液，得到动物双歧杆菌抑菌液。
这种动物双歧杆菌饲料添加剂的制备方法，将动物双歧杆菌乳亚种B174和其他益生菌组配，各益生菌之间的比例为：动物双歧杆菌乳亚种B174: 嗜酸乳酸杆菌:乳酸链球菌=（1～2）:（2～3）:（1～1.5）。
本发明的有益效果如下：
本发明针对人体肠胃的生理条件从自然发酵食品中选育一株可以耐受人体胃酸和胆盐浓度的动物双歧杆菌，经鉴定为双歧杆菌乳亚种。本发明的动物双歧杆菌可以在人体内定植，发挥益生作用。同时该菌株对大肠菌有较好的抑制作用，可起到调节肠道微生物菌群功能。另外，本发明的动物双歧杆菌乳亚种B174在室温下可存活30天，扩大了双歧杆菌的应用范围，延长了双歧杆菌产品的货架期，可降低生产成本。本发明的动物双歧杆菌乳亚种B174与其他类型的乳酸菌有较好的协同生长作用，并且同乳酸菌复配效果较好，产品具有较佳风味。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种B174对人体肠胃环境有耐受性，在模拟胃液PH=2.0条件下存活2小时，活菌数从2.52×108 cfu/ml, 下降到3.06×106/ml，不到两个数量级。且在PH=1.3条件下，2个小时后仍有活菌存在。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种B174对胆盐有耐受性。在模拟肠液胆盐浓度0.2%的环境下存活24小时，活菌数呈增长趋势，从1.5×107cfu/ml到9.4×107cfu/ml。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种B174对室温有耐受性，在室温下存活30天，活菌数从4.8×109cfu/ml，仅下降到3×108cfu/ml，仍有大量活菌存在。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种B174可应用于制备发酵酸奶、动物饲料添加剂以及抑菌液，也可广泛应用于其他食品及生物制品领域。
具体实施方式
实施例，这种动物双歧杆菌，它是动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobactrium animalis)B174，保藏号：CGCC NO.4182，保藏日期：2010年9月16 日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
动物双歧杆菌乳亚种B174的分离及鉴定方法如下：
1、分离方法
称取样品（自然发酵食品）5g至45ml无菌缓冲盐溶液中（加适量玻璃珠）作为母液，震荡10min充分混匀，以无菌缓冲盐溶液做梯度稀释，选择三个合适的梯度，吸取0.1ml于NPNL-BL培养基中进行滚管分离，每个稀释梯度做两个重复，厌氧管放入37℃培养箱中培养48～72小时，挑选光滑、凸园、边缘整齐、白色或乳白色菌落镜检。对疑似菌落按上述步骤在BL培养基中进行再此分离、纯化，直到菌落完全纯化。
形态学鉴定：革兰氏染色，细胞形态，有无芽孢
生理生化鉴定：接触酶，氧化酶，果糖—6—磷酸盐磷酸铜酶，碳水化合物产酸
分子生物学鉴定:16SrDNA序列分析
2．实验结果
2.1生理生化特性及形态特征
表1 B174的生理生化特性
2.2 16SrDNA序列测定
根据上述16SrDNA序列测定结果构建该菌株的***发育树，鉴定结果B174为动物双歧杆菌乳亚种。
3．鉴定结果
结合以上鉴定结果，本发明的动物双歧杆菌为动物双歧杆菌乳亚种。
动物双歧杆菌乳亚种B174的耐酸、耐胆盐、耐温实验如下：
1．实验方法
1.1 胆盐耐受试验
动物双歧杆菌乳亚种B174用灭菌的改良MRS培养液37℃严格厌氧培养15h。将活化菌株培养液以10%接种量接入含不同胆盐浓度的无菌改良MRS液体培养基中（胆盐浓度为0.2%、0.3%、0.5%、1.0%、1.6%）,同时以不含胆盐的改良MRS培养液为对照。在37℃厌氧培养0、2、4、6、24小时后取样测定活菌数。
2.2 酸耐受性试验
动物双歧杆菌B174用无菌改良MRS培养液37℃严格厌氧培养15h，将活化的培养液以10%的接种量接入不同PH值的无菌改良MRS中（PH分别为1.3 ，2.0 ，3.0），同时以PH7.0的培养液为对照。37℃厌氧培养，分别于0min 30min 60min 90min 120min.取样测定活菌。
2.3 室温耐受性试验
动物双歧杆菌如亚种B174用无菌改良MRS培养液37℃培养15 h后转室温下放置，每隔两天测定一次培养液的活菌数，以0天的活菌数做对照。
3．实验结果
3.1 耐胆盐实验结果
B174对不同胆盐浓度的耐受性见表2，胆盐浓度小于等于0.3%时对其无抑制作用，6h内活菌数不断增加，在0.5%-1.6%的胆盐浓度中生长具有一定的耐受性。
表2 B174对胆盐的耐受性
| 胆盐浓度 | 0h(cfu/ml) | 2h | 4h | 6h | 24h |
| 0 | 1.54×107 | 7.84×108 | 1.25×109 | 4.37×109 | 1.05×109 |
| 0.2% | 1.54×107 | 1.52×108 | 2.17×108 | 2.2×108 | 1.84×108 |
| 0.3% | 1.54×107 | 1.4×108 | 1.7×108 | 1.25×108 | 9.4×107 |
| 0.5% | 1.54×107 | 3.05×107 | 2.95×107 | 2.08×107 | 8.4×106 |
| 1.0% | 1.54×107 | 1.87×106 | 3.5×106 | 1.85×106 | 9.8×105 |
| 1.6% | 1.54×107 | 1.25×106 | 3.35×106 | 1.49×106 | 6.3×105 |
3.2 耐酸实验结果
B174在不同的酸性培养液中活菌数变化见表3，在PH2.0条件下，培养2小时仍有大量活菌存在，说明该菌株对酸有很强的耐受性。
表3 B174对酸的耐受性
| 0min(cfu/ml) | 30min | 60min | 90min | 120min | |
| PH7.0 | 2.52×108 | 3.31×108 | 3.5×108 | 3.6×108 | 3.8×108 |
| PH 3.0 | 2.52×108 | 2.48×108 | 1.71×108 | 1.73×108 | 1.76×108 |
| PH 2.0 | 2.52×108 | 1.28×108 | 3.06×10 | 1.25×107 | 3.06×106 |
| PH 1.3 | 2.52×108 | 4.9×106 | 2.2×105 | 6.0×103 | 1.0×103 |
3.3耐温实验结果
一般双歧杆菌制剂在室温下的保存期为7天左右，而B174在室温放置30天依然有较多的活菌存在，大大的延长了该菌的货架期，在室温保存条件下，活菌数的变化与天数的关系见表4。
表4 B174对室温的耐受性
| 储存天数（d） | 活菌数（CFU/ML） |
| 0 | 4.8×109 |
| 6 | 1.83×109 |
| 12 | 1.2×109 |
| 18 | 1.0×109 |
| 22 | 1.3×109 |
| 27 | 5.3×109 |
| 30 | 3.0×109 |
本实验分离得到的动物双歧杆菌乳亚种B174对酸、胆盐及室温都有很好的耐受性。人的胃内PH值在2—3之间，吃酸性食物后最低可达1.5。B174在 PH=2的酸性环境中存活2个小时，活菌数从2.52x108cfu/ml下降到3.06x106cfu/ml,仅下降了两个数量级；而在PH=3的酸性条件下，两个小时后活菌数的数量级没有发生变化。而食物（尤其是流体）通过胃的时间相对较短，一般1～2h便进入小肠。所以，双歧杆菌乳亚种B174的耐酸性可以保证其有相当数量的活菌通过胃到达肠道。
人体小肠的胆盐浓度在0.03—0.3%之间，本实验中胆盐浓度小于0.3%时对B174没有抑制作用，6h内活菌数不断增加。B174对胆盐有很强的耐受性，可以通过小肠到达大肠。
一般含有双歧杆菌的产品室温保质期为一周左右，本实验B174在室温存放30天，依然具有很高的活菌数，可以增加产品货架期，降低成本。
动物双歧杆菌乳亚种B174对大肠杆菌、乳酸菌的生物拮抗性实验如下：
1.材料与方法
1.1 菌种
动物双歧杆菌B174，大肠杆菌，嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌，植物乳杆菌，乳酸链球菌，德氏乳杆菌保加利亚种，短双歧杆菌，青春双歧杆菌，两歧双歧杆菌均来自于本实验室。
1.2 培养基
MRS液体和固体培养基，番茄汁固体和液体培养基，营养肉汤固体和液体培养基
1.3 菌种活化
双歧杆菌活化：将置于低温冰柜的双歧杆菌放到40～50℃水浴中解冻，在无菌条件下，吸取0.1ml接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养12～14h，活化2～3代。
乳酸菌的活化：同双歧杆菌，乳酸杆菌采用MRS液体培养基活化，乳酸链球菌采用番茄汁培养基活化。
大肠杆菌的活化：将置于冰箱内的大肠杆菌按照2%的接种量转接到液体营养肉汤培养基中，37℃恒温培养12 h，活化两代。
1.4 涂布营养琼脂平皿
将活化好的大肠杆菌用涂布法均匀的涂布到营养琼脂平板上，要求涂布时的活菌量在106cfu/ml。
1.5 倾注法培养乳酸菌
将活化好的乳酸杆菌和乳酸链球菌分别用倾注法均匀的铺在MRS平板上和番茄汁固体平板上，要求涂布时的活菌量在106cfu/ml。
1.6 双歧杆菌发酵液的制备
将活化好的双歧杆菌发酵液采用低温离心的方法，制备发酵上清液，离心条件为：4℃，7500rpm, 5min。
1.7 双歧杆菌发酵液抑菌效果观察
牛津杯法：将铺好的指示菌的营养琼脂平板、MRS固体平板和番茄汁固体平板自然干燥30min，再在无菌条件下将牛津杯（内径为6mm）均匀放置于平板上，稍微下压，使其与平板培养基接触面无空隙，然后吸取0.2ml发酵上清液于杯中，37℃恒温培养24h，观察抑菌圈的大小，并测定抑菌圈直径。每个样品做三个平行，结果取平均值。对照组在牛津杯中添加MRS液体培养基0.2ml，培养条件相同。
1.8实验结果
结果表明，大部分双歧杆菌对大肠菌群都有抑制作用，抑菌圈透明度高，抑菌圈直径较大。乳酸菌也表现抑菌现象，但部分抑菌圈不够透明，且本发明所述的对动物双歧杆菌抑菌效果尤为明显，具体结果见表5。
实验表明，本发明所属的动物双歧杆菌和大部分乳酸菌都能协同生长，这扩大了双歧杆菌的应用范围，具体结果见表6。
表5.动物双歧杆菌乳亚种B174、乳酸菌与大肠杆菌的拮抗试验
表6.动物双歧杆菌与乳酸菌的复配性 ( 拮抗试验 )
动物双歧杆菌乳亚种B174与乳酸菌之间的复配方法如下：
1.材料
菌种：动物双歧杆菌乳亚种B174与乳酸菌之间组合，复配成发酵酸奶。
材料：三次间歇灭菌的鲜牛奶，灭菌脱脂奶培养基。
2．实验方法
2.1 复配方法
分别将双歧杆菌和乳酸菌接种到灭菌脱脂乳培养基中，37℃恒温培养，至凝乳出发酵，活化2～3代，按照不同的比例组配，接种至灭菌鲜奶中，42℃发酵，凝乳后出发酵，至于4℃冰箱保存，12h后进行感官品评和风味物质检测，主要包括乙醛和丁二酮含量的测定。
2.2乙醛的测定方法
2.2.1试剂：(1)1%淀粉指示剂 (2)1.2%亚硫酸氢钠溶液（3）0.1N盐酸（4）1M碳酸氢酸（5）0.1N碘液（6）0.01N碘液。
2.2.2方法
将100m酸奶样品置于蒸馏瓶中，加入50ml水进行蒸馏，取100ml馏出液于350ml碘量瓶中，加入1.2% 亚硫酸氢钠溶液15ml,0.1N的盐酸7ml,摇匀于暗处1h ,加1%淀粉指示剂2ml，用0.1N碘液滴定，近邻终点时，改用0.01N碘标准液滴定至淡蓝紫色出现，加1M碳酸氢钠溶液20ml,微开瓶塞，摇荡0.5min，用0.01N碘标准液滴至淡紫色再次出现为止。同时用100ml鲜奶样品按上述方法作空白。
乙醛含量（ppm）
X=[(V1-V2)N×0.022]/100
V1:碘标准液用量
V2:空白碘标准液用量
N:碘标准液的当量浓度
0.022：每毫升当量乙醛的质量（g）
100：式样量（ml）。
2.3丁二酮的测定方法
标准曲线的测定
配制好20 mg/L的丁二酮溶液，以此为标准，配制质量浓度为1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0mg/L的溶液。
各取两只比色管分别加入10 ml上述质量浓度的溶液，向其中1 支加入0.5 ml 1%邻苯二胺溶液，充分摇匀，另一只不加，置于暗处20-30 分钟，再加入2ml 和2.5ml 4mol/L HCL溶液混匀。然后再335nm处，以不加邻苯二胺的溶液作参比。
用紫外分光度计测吸光值。
2.3.1酸奶中双乙酰的测定方法
操作步骤：
⑴蒸馏：在25 ml量筒内，放2ml左右蒸馏水，置于蒸馏装置冷凝器下端管口。于250ml三角瓶中加入100ml酸奶样品，再加50ml水，迅速放入已预先加热的沸水中，进行蒸馏，直到馏出液接近25ml时取下量筒，用蒸馏水补足至250ml。
⑵反应：混合馏出液，分别吸取10ml加入两个比色管中，第一管放入0.5ml 1%邻苯二胺溶液，充分混合置于暗处20min,再加4N HCL溶液2ml；第二管加入 4N HCL溶液2.5ml
混匀。
⑶测定：用紫外分光光度计于335nm处，用2cm吸收池吸第二管为空白对照，测定第一管（即样品）的吸收值。此项测定应在20min内完成。
⑷计算：双乙酰(PPM)=E× 1.2-0.01
E-吸收值
1.2-换算系数
0.01 –校正系数
试剂：①1%邻苯二胺：准确称取邻苯二胺0.25高，溶于4N HCL中，置于25ml容量瓶内，用4N HCL补足至刻度，储于棕色瓶中，临时用配制。
②4N HCL：取34ml浓盐酸，用水稀释至100ml。
3．实验结果
通过拮抗试验和复配品评试验，从39组复配组合中选中两组，感官状态，风味较好的组合，分别为动物双歧杆菌+嗜热链球菌+嗜酸乳杆菌，动物双歧杆菌+嗜热链球菌+保加利亚乳杆菌，并测定这两者的乙醛和丁二酮含量，以证明该双歧杆菌可应用于发酵酸奶中。具体结果见表7
表7 乙醛和丁二酮含量测定结果
| 菌株组合 | 乙醛含量（ppm） | 丁二酮含量（ppm） |
| 动物双歧杆菌+嗜热链球菌+嗜酸乳杆菌 | 22.45 | 0.69 |
| 动物双歧杆菌+嗜热链球菌+保加利亚乳杆菌 | 24.29 | 0.76 |
风味最佳酸奶归功于乙醛含量在23～41ppm，而且当乙醛和丁二酮的比值超过2.8时，酸奶风味最佳。以上两组测得风味物质含量符合这两个条件，和感官品评结果相一致。
动物双歧杆菌乳亚种B174用于制备饲料添加剂的方法如下：
本发明的动物双歧杆菌乳亚种B174益生作用明显，可以和其他益生菌组配，用于动物饲料中。试验表明，复合益生菌制剂能有效免受大肠杆菌的攻毒，提高对大肠杆菌的抵抗力。各益生菌之间的比例为：动物双歧杆菌乳亚种B174：嗜酸乳酸杆菌：乳酸链球菌=1.5:2.5:1。
Claims (10)
1.一种动物双歧杆菌，其特征在于：它是动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis)B174，保藏号：CGMCC No.4182，保藏日期：2010年9月16 日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于：所述动物双歧杆菌乳亚种B174对人体胃酸和胆盐有耐受性。
3.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于：所述动物双歧杆菌乳亚种B174对室温有耐受性。
4.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于：所述动物双歧杆菌乳亚种B174对大肠杆菌菌群有抑制作用。
5.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于：所述动物双歧杆菌乳亚种B174与下列乳酸菌之一或一种以上复配，有协同生长作用；
嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophius）；
德氏乳杆菌保加利亚种（Lactobacillus delbrueckii）；
嗜热链球菌（Streptococcus thermophius）；
乳酸链球菌 （L.lactis）；
乳酸链球菌亚种（L.lactis subsp.lactis ）。
6.根据权利要求5所述的动物双歧杆菌，其特征在于：所述动物双歧杆菌乳亚种B174与乳酸菌的最佳复配组合为：动物双歧杆菌乳亚种B174+嗜热链球菌+嗜酸乳杆菌，或是动物双歧杆菌乳亚种B174+嗜热链球菌+保加利亚乳杆菌。
7.一种如权利要求1～6所述任意一项的动物双歧杆菌的应用方法，其特征在于：所述动物双歧杆菌乳亚种B174在制备发酵酸奶、动物饲料添加剂以及大肠杆菌抑菌液中的应用。
8.一种动物双歧杆菌发酵酸奶的制备方法，其特征在于：分别将乳酸菌与权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种B174接种到灭菌脱脂乳培养基中，37℃恒温培养，至凝乳出发酵，活化2～3代，组配后接种至灭菌鲜奶中，42℃发酵，凝乳后至于冰箱内保存。
9.一种动物双歧杆菌抑菌液的制备方法，其特征在于：将置于低温冰柜的动物双歧杆菌乳亚种B174放到40～50℃水浴中解冻活化，在无菌条件下接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养12～14h，活化2～3代；将活化好的动物双歧杆菌乳亚种B174发酵液采用低温离心的方法，制备发酵上清液，得到动物双歧杆菌大肠杆菌抑菌液。
10.一种动物双歧杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于：将动物双歧杆菌乳亚种B174和其他益生菌组配，各益生菌之间的比例为：动物双歧杆菌乳亚种B174: 嗜酸乳酸杆菌:乳酸链球菌=（1～2）:（2～3）:（1～1.5）。
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