CN105420150A - 一种嗜酸乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有高抗胃肠道胁迫的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus？acidophilus)，保藏编号为CGMCC？No.10436。本发明筛选出的嗜酸乳杆菌具有高的抗胃肠道胁迫的能力，可广泛用于食品工业、医药等领域，为进一步研究嗜酸乳杆菌的抗胃肠道胁迫机理奠定理论基础。

Description

一种嗜酸乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株具有高抗胃肠道胁迫的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)，属于微生物技术领域。

背景技术

ExpertCommittee定义益生菌为“活的微生物，以一定数量摄入，能对健康产生益处，并且这种益处超越一般的固有营养”，这表明：益生菌必须是活的，同时要以高数量存在，通常日摄入剂量为10⁹细胞量。益生菌的大部分菌株为乳杆菌属和双歧杆菌属，因这些乳酸菌生产发酵乳制品有一段长的记录历史，所以一直被沿用。

益生菌进入机体，需要耐受胃肠道酸性环境及胃肠道胆盐环境，所以如何耐受住胃酸、肠酸及胆汁，成为益生菌发挥作用的前提。因此，筛选出具有高抗胃肠道胁迫的乳酸菌是非常必要的。

东北农业大学工学硕士学位论文“抗胃肠道胁迫益生菌的筛选及产品开发”(田芬等)一文就抗胃肠道胁迫的益生菌进行了筛选，并且利用细菌生态学、生理学和基因序列分析，筛选出性能较佳的5株益生菌作为研究对象，分别为嗜酸乳杆菌KLDSAD1和AD2，动物双歧杆菌KLDS2.0001、2.0002和2.0604，继续后续的研究，并且得出嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌都有很好的酸和胆汁盐耐受性，动物双歧杆菌的耐酸性较强于嗜酸乳杆菌的耐酸性。

虽然研究得出的嗜酸乳杆菌KLDSAD1和AD2均具良好的胃酸耐受性，但是仍然不能达到高酸条件下的具有很好的胃肠道胁迫能力，因此，在此基础上，申请人进行了进一步的研究，进一步筛选更高的抗胃肠道胁迫能力的乳杆菌。

发明内容

本发明的目的之一是筛选出一种嗜酸乳杆菌CGMCC10436，其具有更高的胃肠道胁迫能力。

本发明的另一目的是公开这种嗜酸乳杆菌的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)CGMCC10436，该菌株是从传统乳制品中分离的乳酸菌中筛选出的，于2015年01月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏号为CGMCCNo.10436，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

具体的，所述的嗜酸乳杆菌来自于内蒙古锡林郭勒盟、海拉尔市及鄂尔多斯市等地区的牧民家中采集传统方法制作的传统稀奶油或酸化奶油，用于乳酸菌的筛选。具体如下：

(1)将25g样品在无菌条件下剪碎，溶于225mL无菌生理盐水中，梯度稀释后选择合适的稀释度，取1mL稀释液加入无菌平皿，倾注于20mLMRS固体培养基上，30℃培养72h。

(2)选取菌落数量在15～150的平板，随机选取符合乳酸菌菌落形态特征的菌落，从中挑取少量细菌，溶于于MRS液体培养基中，并进行30℃培养48h。

(3)将分离到的菌株在MRS固体培养基上反复划线进行纯化。

(4)将纯化好的菌株进行革兰氏染色及过氧化氢酶实验。

(5)将所有革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不形成芽孢的菌株(初步判断为乳酸菌)选出来，在其培养液中加入甘油，使甘油的最终浓度为30％(v/v)，贮藏于-80℃待用。

(6)将上述分离到暂定为乳酸菌的菌株在MRS液体培养基中活化3代后进行筛选实验。

(7)以标准菌株嗜酸乳杆菌作为对照菌株，进行以下生理生化试验：H2S试验、甲基红试验、石蕊牛乳试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、柠檬酸盐利用试验、尿素分解试验、硝酸盐降解试验及乙偶姻产生试验，选取与标准菌株嗜酸乳杆菌生理生化试验相同的乳酸菌。

(8)提取菌株基因组DNA，进行16SrDNA测序，将本发明菌株的16SrDNA序列与NCBI嗜酸乳杆菌的序列进行比对，鉴定出，此菌株为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)。

然后，将本发明嗜酸乳杆菌与嗜酸乳杆菌(嗜酸乳杆菌KLDSAD1、嗜酸乳杆菌酸乳杆菌KLDSAD2)进行对比，研究此次筛选出的嗜酸乳杆菌的抗胃肠道胁迫能力。试验结果表明，本研究筛选出的嗜酸乳杆菌对酸液、肠液及人工胆盐均具有较好的耐受力，并且效果明显优于嗜酸乳杆菌KLDSAD1、酸乳杆菌KLDSAD2。

所筛选出来的嗜酸乳杆菌具有高的抗胃肠道胁迫能力。

并且所述的嗜酸乳杆菌能够制成发酵乳制品，这些发酵乳制品选自酸奶酪、乳清乳酸菌饮料、干奶酪、含发酵酸奶的加工食品、含发酵酸奶的保健食品等。所述的加工食品或保健食品的原料选自选自动物奶、奶酪蛋白、谷物、谷物蛋白质、小麦、小麦蛋白质、大豆、大豆乳、脱脂大豆、大豆蛋白质及其混合物等，并且并不限于此。具体嗜酸乳杆菌在乳制品中的含量可以根据实际需要进行添加。

进一步地，所述的发酵乳制品还包括双歧杆菌或其他一切对肠道有好处的益生菌。

所述的嗜酸乳杆菌还能够制成具有高抗胃肠道胁迫功能的活菌制剂，制剂包括胶囊、片剂、口服液、粉剂等一切临床上可以接受的制剂形式。

本发明的有益效果：

本发明通过耐酸、耐胆盐及抑菌试验等筛选出一株具有高抗胃肠道胁迫活性的嗜酸乳杆菌，并且其可以有效的制成乳制品或药物制剂并且保持活性，广泛用于食品工业、药物等领域。

本发明筛选出的嗜酸乳杆菌具有较高的抗胃肠道胁迫的能力，为进一步研究嗜酸乳杆菌的抗胃肠道胁迫机理奠定理论基础。

附图说明

图1为本发明嗜酸乳杆菌以16SrDNA全序列为基础的***发育树。

图2为本发明嗜酸乳杆菌对人工胃液的耐受力；

图3为嗜酸乳杆菌KLDSAD1对人工胃液的耐受力；

图4为嗜酸乳杆菌KLDSAD2对人工胃液的耐受力；

图5为三株乳酸杆菌对人工肠液的耐受力；

图6为嗜酸乳杆菌KLDSAD1的耐胆盐能力；

图7为嗜酸乳杆菌KLDSAD2的耐胆盐能力；

图8为本发明嗜酸乳杆菌的耐胆盐能力；

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

一、材料与试剂

菌株：嗜酸乳杆菌KLDSAD1和嗜酸乳杆菌KLDSAD2均分离自内蒙古传统稀奶油或酸化奶油，由乳品科学***重点实验室菌种保藏中心(KLDS-DICC)保藏，菌种使用前用MRS培养基活化以上菌株，以2％接种量在37℃下培养14h，以备实验使用；

培养基：MRS培养基。

MRS培养基配制：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温-801ml/L，pH6.3±0.1，121℃、15分钟灭菌；

主要试剂：磷酸氢二钾：天津光复科技发展有限公司；硫酸锰：天津东丽区天大化学仪器厂；柠檬酸氢二胺：天津东丽区天大化学仪器厂。

主要仪器：JY92-2D超声破碎粉碎机：SCIENTZ公司；厌氧箱FormaAnaerobicsystem1029：THERMOELECTRONCORPORATION公司；DU800型紫外分光光度计：BECKMANCOULTER；GL-21M型低温冷冻离心机：上海市离心机械研究所。

二、嗜酸乳杆菌菌株的筛选

从内蒙古锡林郭勒盟、海拉尔市及鄂尔多斯市等地区的牧民家中采集传统方法制作的传统稀奶油或酸化奶油，用于乳酸菌的筛选。具体如下：

(1)将25g样品在无菌条件下剪碎，溶于225mL无菌生理盐水中，梯度稀释后选择合适的稀释度，取1mL稀释液加入无菌平皿，倾注于20mLMRS固体培养基上，30℃培养72h。

(2)选取菌落数量在15～150的平板，随机选取符合乳酸菌菌落形态特征的菌落，从中挑取少量细菌，溶于于MRS液体培养基中，并进行30℃培养48h。

(3)将分离到的菌株在MRS固体培养基上反复划线进行纯化。

(4)将纯化好的菌株均进行革兰氏染色及过氧化氢酶实验。

(5)将所有革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不形成芽孢的菌株(初步判断为乳酸菌)选出来，在其培养液中加入甘油，使甘油的最终浓度为30％(v/v)，贮藏于-80℃待用。

(6)将上述分离到暂定为乳酸菌的菌株在MRS液体培养基中活化3代后进行鉴定实验。

三、嗜酸乳杆菌菌株的鉴定

1、生理生化鉴定

以标准菌株嗜酸乳杆菌作为对照菌株，进行以下生理生化试验：H₂S试验、甲基红试验、石蕊牛乳试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、柠檬酸盐利用试验、尿素分解试验、硝酸盐降解试验及乙偶姻产生试验，选取与标准菌株嗜酸乳杆菌生理生化试验相同的乳酸菌。

2、分子鉴定

提取菌株基因组DNA，进行16SrDNA测序，其核苷酸序列如序列表SeqIDNo1所示，将本发明菌株的16SrDNA序列与NCBI嗜酸乳杆菌的序列进行比对，本发明菌株的16SrDNA序列与Lactobacillusacidophilus序列相似性达95％以上，根据16SrDNA序列分析，该菌株被鉴定为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)，其以16SrDNA全序列为基础的***发育树如图1所示。鉴定出，此菌株为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)。并且于2015年01月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏号为CGMCCNo.10436，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

将本发明的嗜酸乳杆菌与嗜酸乳杆菌KLDSAD1和嗜酸乳杆菌KLDSAD2进行如下试验：

试验1嗜酸乳杆菌对胃液的耐受性试验

乳酸菌通过口腔后经过食道首先到达胃部，胃液中的酸环境和复杂的消化酶，会造成大部分微生物不能在此存活，而乳酸杆菌必须通过胃部并以足够多的数量到达肠道才能发挥作用，因此，有必要研究乳酸杆菌对胃液的耐受力。胃液的pH一般在3.0左右，空腹或进食酸性食物时pH可达到0.9-1.8，食用碱性食品时pH可达4-5，食物通过胃的时间大约为1-2h。人工胃液的配制方法参考中华人民共和国药典，用浓度为1mol/L的盐酸分别调节pH为1.5、2.5、3.5、4.5。将活化好的三株嗜酸乳杆菌以4％的接种量分别接入不同pH值的人工胃液中，37℃恒温水浴培养，分别在0、0.5、1、1.5、2、3h取样，涂布平板法进行活菌计数，平行实验3次。本发明的嗜酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌KLDSAD1和嗜酸乳杆菌KLDSAD2的结果分别见图2、图3和图4。

由图2可知，本发明嗜酸乳杆菌在pH为1.5时，活菌数开始下降，并在3h时降为0，当pH为2.5-4.5时，活菌数对数值一直保持在7以上，并且在3h时仍没有下降的趋势，说明该菌对不同pH的人工胃液都具有很好的耐受性。由图3可知，当pH为1.5时，嗜酸乳杆菌KLDSAD1在0.5h时就已经没有活菌存在；pH2.5时，活菌数保持稳定，并在3h时有上升的趋势，说明该菌对此pH坏境具有很好的适应性；当pH为3.5和4.5时，活菌数虽下降一个数量级，但在3h内仍保持较高的存活率，因此本发明嗜酸乳杆菌和嗜酸乳杆菌KLDSAD1对人工胃液均具有很好的耐受性。由图4可知，pH为1.5时，KLDSAD2在0.5h时活菌数也降为0；当pH分别为2.5、3.5、4.5时，活菌数随时间的变化开始下降，在2h时下降到1×106CFU/mL以下，由于食物经过胃的时间一般在1-2h，因此我们认为嗜酸乳杆菌KLDSAD2对人工胃液也具有耐受能力。由此可知，三株嗜酸乳杆菌耐受人工胃液的能力大小为：本发明嗜酸乳杆菌＞嗜酸乳杆菌KLDSAD1＞嗜酸乳杆菌KLDSAD2。

试验2嗜酸乳杆菌对肠液的耐受性试验

小肠是体内大多数微生物的寄居地，也是各种口服益生菌发挥益生作用的主要场所。益生菌需要适应小肠环境并保持最大存活率才有可能在小肠中发挥益生作用。小肠液的pH大约为7.6，并且含有多种消化酶和胆汁酸等，其中胰蛋白酶是最主要的消化酶。食物经过小肠的时间约为1.5h。人工肠液的配制方法参考中华人民共和国药典。将活化好的乳酸杆菌以4％的接种量分别接种于配置好的人工肠液中，37℃恒温水浴培养，分别在0、0.5、1、1.5、2、3h取样，涂布平板法进行活菌计数，平行实验3次。结果见图5。

由图5可知，三株嗜酸乳杆菌对人工肠液均具有较好的耐受性，0-2h时，本发明嗜酸乳杆菌活菌数有所上升，说明该菌的耐受能力和适应能力强于其他两株菌。在1.5h时，嗜酸乳杆菌KLDSAD2和嗜酸乳杆菌KLDS1015虽有所下降，但活菌数对数值仍保持在7以上。因此，在模拟人工肠液环境中，三株嗜酸乳杆菌均具有良好的耐受性能，强弱大小为本发明嗜酸乳杆菌＞嗜酸乳杆菌KLDSAD2＞嗜酸乳杆菌KLDSAD1。

试验3嗜酸乳杆菌对胆盐的耐受性试验

在MRS液体培养基加入牛胆汁粉，调节其浓度分别为1、2、3、4g/kg，121℃，15min高压灭菌。将活化好的乳酸杆菌以4％的接种量接种于不同浓度的培养基中，37℃恒温培养，分别在0、0.5、1、1.5、2、3h取样，涂布平板法活菌计数，平行实验3次。

人体肠道中不同部位的胆盐浓度是不同的，其中十二指肠中胆盐浓度在0.3-3g/kg范围内波动，而食物通过十二指肠的时间相对极短。益生菌必须能耐受不同浓度的胆盐，并维持一定的存活率，才能保证其益生作用的发挥，因此，评价益生菌对胆盐的耐受性是非常重要的。将三株嗜酸乳杆菌悬浮于含有不同浓度胆盐的MRS液体培养基中，于37℃恒温培养，在0、0.5、1、1.5、2、3h分别取样测定活菌数。

嗜酸乳杆菌KLDSAD1和嗜酸乳杆菌KLDSAD2在所测不同浓度的胆盐中活菌数都有所上升(分别见图6和图7)，说明这两株菌对人体范围内的胆盐浓度具有很好的耐受性。由图8可知，当胆盐浓度在1g/kg-3g/kg范围内时，本发明嗜酸乳杆菌具有较好的耐受性，而当胆盐浓度为4g/kg时，该菌在1h后数量逐渐下降，但是在3h时其活菌数仍在1×10⁷CFU/mL以上，由于食物经过十二指肠的时间极短，所以嗜酸乳杆菌在此时间内也可以很好地耐受胆盐浓度的环境。

试验例4

以上述筛选出的嗜酸乳杆菌生产发酵奶。嗜酸乳杆菌菌株在100g10％(重量百分比)脱脂乳中37℃培养14h，之后与3.2kg的新鲜培养基相混合在37℃继续培养14小时。发酵之后，全部发酵奶(嗜酸乳杆菌细胞数目3.4×10⁸个/mL)作为上述脱脂乳的促酵物再在35℃下培养22小时得到发酵奶。

还可以在此基础上进一步制得酸奶饮品，如取44kg已制得的发酵奶与2.75kg白砂糖、3kg水、0.25kg高甲氧基果胶匀浆制得50kg酸奶酪饮品。酸奶酪饮料有较好的适口感，测得pH4.2，活菌数为1.6×10⁸个/mL。

并且并不限于此，还可以按照常规的方法加工成各种乳制品，添加量也可以根据实际情况进行增减，并且所述的乳制品还可以添加其他的菌，比如说双歧杆菌，对此并没有限制。

实验例5

以上述筛选出的嗜酸乳杆菌制成药物制剂。将上述嗜酸乳杆菌MRS培养基培养；取培养14h的嗜酸乳杆菌菌液50ml，离心取菌泥，然后溶于1ml无菌PBS中，得菌泥；将菌泥搅拌均匀，然后按照常规的方法加入合适的辅料制成临床可接受的剂型。剂型包括胶囊剂、片剂、粉剂等各种剂型。

Claims (7)

1.一种嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)，其特征在于，所述的嗜酸乳杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10436。

2.一种发酵乳制品，其特征在于，该发酵乳制品中包含权利要求1所述的嗜酸乳杆菌。

3.根据权利要求2所述的发酵乳制品，其特征在于，该发酵乳制品中还包括双歧杆菌。

4.根据权利要求2或3所述的发酵乳制品，其特征在于，所述的发酵乳制品选自酸奶酪、乳清乳酸菌饮料、干奶酪、含发酵酸奶的加工食品或含发酵酸奶的保健食品。

5.根据权利要求4所述的发酵乳制品，其特征在于，所用加工食品或保健食品的原料选自动物奶、奶酪蛋白、谷物、谷物蛋白质、小麦、小麦蛋白质、大豆、大豆乳、脱脂大豆、大豆蛋白质及其混合物。

6.一种具有高抗胃肠道胁迫功能的活菌制剂，其特征在于，该活菌制剂包括权利要求1所述的嗜酸乳杆菌。

7.根据权利要求6所述的具有高抗胃肠道胁迫功能的活菌制剂，其特征在于，所述的活菌制剂包括胶囊、片剂、口服液、粉剂。