CN102174433A - 一株高抗逆性贝氏梭菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株能直接利用未脱毒木质纤维酸解糖液发酵产丁醇的高抗逆性贝氏梭菌及应用。本发明公开了一株贝氏梭菌，分类命名为Clostridium beijerinckii IB4，其保藏登记号为CCTCC No.M2010310。本发明通过离子束诱变，经含有酚类等抑制物的刃天青平板和摇瓶发酵筛选，得到的突变菌株以未脱毒的玉米芯酸解糖液作为碳源，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了10.3g/L和7.1g/L，分别是同等条件培养的出发菌株的4.3倍和4.4倍，糖转化率为0.35；其抗逆性强、溶剂产量高、糖转化率高、重复性好，是一种适合利用木质纤维原料发酵产丁醇的优良菌种。
Description
技术领域
本发明涉及一株能利用未脱毒木质纤维酸解糖液的贝氏梭菌及其应用，属于生物发酵技术领域。
背景技术
丁醇是一种重要的C4平台化合物，已广泛应用于各种精细化学品的制造；并作为一种重要的具有极大潜力的新型生物燃料受到重视，***国际能源署将生物丁醇列为第二代生物燃料。作为燃料，丁醇具有能量密度大、可直接用于内燃机、运输方便等优点，在能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。由于国内产量不能够满足需要，我国已经是世界上最大的丁醇进口国。
目前，丁醇主要通过化学法合成，随着石油资源加速枯竭和价格飞涨，发酵法生产丁醇又受到了广泛的重视，已经成为生物能源的研究热点之一。丙酮丁醇梭菌和贝氏梭菌可直接有效利用玉米等淀粉物质或糖蜜等原料，但这些原料的成本相对比较高，同时存在与人相争的问题。在粮食短缺与能源危机的双重威胁下；探索纤维质原料生产燃料丁醇成为生物质能源发展战略的重要组成，也是研究的热点之一。
近年来，国内外对纤维原料发酵产丁醇的研究很多，主要围绕着菌种诱变选育、纤维原料糖液的制备、发酵工艺条件优化和溶剂提取等发面进行。
中国专利ZL95111733.5报道了通过化学诱变处理丙酮丁醇梭杆菌，利用玉米粉或高粱为底物，发酵得到总溶剂产量在20g/L左右，丁醇比为70％的稳定菌株；Mermelstein等(Biotechnology and Bioengineering.1993，42：1053～1060)利用基因工程技术构建了重组菌株，丁醇产量比出发菌株Clostridiumn acetobutylicum ATCC 824提高了37％。NasibQureshi等(Biomass and Bioenergy.2008，32：176-183)利用贝氏梭菌P260，在小麦秸秆中加入纤维素酶、木聚糖酶等进行同步糖化发酵，经过533小时的连续发酵，其溶剂的产率为0.41。Annous等(Appl.Environ.Microbiol.1991，57：2544-2548)利用化学诱变，得到了超级菌株BA101，单批发酵总溶剂最高可达25g/L以上；Thaddeus Ezeji等(Bioresource Technology.2008，99：5915-5922)利用突变株BA101，以XAD-4resin脱毒的玉米芯酸解和酶解糖液为底物发酵，总溶剂产量为9.30g/L，但其不能利用未脱毒的酸解和酶解糖液发酵产丁醇。木质纤维原料经稀酸处理后，会产生有机酸、糠醛、酚类等抑制物，这些抑制物的除去成本较高、并对微生物生长有一定的抑制作用；ThaddeusEzeji等(Biotechnology&Bioengineering.2007，97(6)：1460-1469)研究发现有机酸、糠醛等抑制物不影响丁醇的发酵，而酚类抑制物对丁醇发酵有明显的抑制效应。目前为止，还没有能够直接利用未脱毒纤维酸解糖液发酵产丁醇的专利与文献报道。
可见，木质纤维原料中的毒素抑制物严重抑制产丁醇梭菌的发酵性能；而菌种改良是提高菌株对抑制物的耐受性、发酵经济性的关键手段之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株具有高抗逆性的贝氏梭菌，其对木质纤维酸解糖液中抑制物的耐受性显著提高，且发酵的溶剂产量高、糖转化率高。
本发明还要解决的技术问题是提供上述高抗逆性贝氏梭菌菌株的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株高抗逆性贝氏梭菌，其分类命名为贝氏梭菌(Clostridium beijerinckii)IB4，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2010310，保藏日期2010年11月23日。
上述高抗逆性贝氏梭菌(Clostridium beijerinckii)IB4是以贝氏梭菌(NCIMB8052)为出发菌株离子束诱变后，利用含有酚类等抑制物的刃天青平板筛选得到对抑制物耐受性高、还原力强的菌株，最后以未脱毒的玉米芯酸解糖液为底物，经厌氧发酵筛选获得溶剂产量高、糖转化率高的贝氏梭菌目标菌株。
其具体诱变筛选步骤如下：
a)离子束诱变：将贝氏梭菌原始菌株活化培养，25mL的肖特厌氧瓶装液量10～15mL，充氮气3min，培养温度33～37℃，培养时间12～16h，得到处于对数生长期的菌液，将培养的细胞稀释到OD600＝0.05～0.1，涂布于灭菌的空培养皿中，用无菌空气吹干；以5～15KeV作为离子注入的能量，以0.4～2.4×1016 ions/cm2作为诱变剂量对菌株进行离子束诱变；
b)刃天青平板初筛：菌株经离子诱变后，用生理盐水洗出，稀释成不同浓度涂布于含抑制物和刃天青(0.002％)的常规固体培养基平板上，在33～37℃温度下厌氧培养12～30h，挑选出在该平板上透明圈较大的菌落；
c)玉米芯酸解糖液平板复筛：将步骤b)筛选的菌株接种于25mL的肖特厌氧瓶装液量10～15mL，充氮气3min，33～37℃厌氧培养10～14h，无菌生理盐水制成浓度OD＝0.1的菌悬液，吸取2μL点滴到含抑制物和刃天青(0.002％)的玉米芯酸解糖液平板上，在33～37℃温度下厌氧培养12～30h，挑选出透明圈明显大于出发菌的菌落；
d)厌氧瓶发酵筛选：将步骤c)筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，培养温度33～37℃，厌氧培养培养时间10～16h，然后在发酵培养基中发酵，接种量5％～15％(v/v)，充氮气3min，发酵温度33～37℃，厌氧发酵发酵时间60～80h；考察筛选出的菌落发酵产丁醇和总溶剂的产量，同时选出丁醇和总溶剂产量高的菌株。
步骤a)中所述的离子诱变方法中，优选10KeV作为离子注入的能量，1.6×1016ions/cm2作为诱变剂量。
步骤b)和c)所采用的常规固体培养基、碳源为葡萄糖、淀粉和木质纤维酸解糖液中的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种，固体培养基中添加琼脂。
步骤d)所采用的种子培养基和发酵培养基中，碳源为葡萄糖、淀粉、木质纤维酸解糖液中的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。
上述筛选出的高抗逆性贝氏梭菌(Clostridium beijerinckii)IB4在生产丁醇中的应用。
具体应用步骤如下：
1)平板培养：将贝氏梭菌CCTCC NO：M 2010310接种至平板培养基厌氧培养，培养温度33～37℃，培养时间12～24h；
2)种子培养：将平板培养的贝氏梭菌CCTCC NO：M 2010310接种到种子培养基中，100mL的厌氧瓶装液量40～60mL，充氮气3～5min，培养温度33～37℃，培养时间12～24h；
3)发酵产丁醇：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量5～15％(v/v)，充氮气3～5min，发酵温度33～37℃，发酵培养时间为60～80h。
其中，所述的平板培养基包含如下质量百分比的组分：碳源0.3％～1％、氮源0.5％～1％、无机盐0.5％～0.8％、琼脂1.5％～2％、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、淀粉和纤维酸解糖液中的任意一种或多种；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉和牛肉膏中的一种或几种的混合；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的任意一种或多种。
其中，所述的种子培养基包含如下质量百分比的组分：碳源0.5％～1％、氮源0.5％～1％、无机盐0.5％～0.8％、其余为水；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉和牛肉膏中的一种或几种的混合；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。
其中，所述的发酵培养基包含如下质量百分比的组分：碳源3％～6％、氮源0.1％～0.3％、无机盐0.1％～0.2％、生长因子0.05～0.1％、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、木糖、***糖、木质纤维酸解糖液和木质纤维酶解糖液中的一种或多种；所述的氮源为乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。
本发明的有益效果在于：
本发明采用离子束诱变贝氏梭菌，利用含未脱毒的玉米芯酸解糖液的刃天青平板筛选对纤维酸解糖液中的酚类等抑制物具有较强的耐受性、并能直接利用木质纤维酸解糖液发酵生产丁醇，糖转化率高、总溶剂产量高的菌株。利用本发明的菌株和工艺进行发酵，以未脱毒的玉米芯酸解糖液作为碳源，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了10.3g/L和7.1g/L，分别是出发菌株的4.3倍和4.4倍；具有重大的社会意义和经济价值。
附图说明
图1为贝氏梭菌NCIMB 8052的存活率曲线图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：本实施例说明将贝氏梭菌原始菌株进行第一步离子束诱变的方法。
贝氏梭菌NCIMB 8052原始菌株购于美国菌种保藏中心(ATCC)；进行第一步离子束诱变的方法如下：
用将贝氏梭菌NCIMB 8052原始菌株活化培养，培养温度33～37℃，25mL摇瓶装液量10～15mL，充氮气3min，培养时间12～18h，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD600＝0.05～0.1，涂布于灭菌的空培养皿中，无菌空气吹干；用10KeV注入不同剂量，脉冲方式每次注入5s，间隔15s。离子注入诱变后，将菌膜洗脱下来，计算存活率。实验结果如附图1所示；由图1可知，1.6×1016ions/cm2是最佳的诱变剂量。
实施例2：本实例说明进一步筛选优良贝氏梭菌的方法。
其中，所使用的培养基配方(％为质量百分比)：
(1)固体平板培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂1.5％，其余为水，pH 6。
(2)刃天青平板培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂1.5％，刃天青0.002％，加入1/2(v/v)的未脱毒玉米芯酸解糖液，其余为水，pH 6。
(3)玉米芯酸解糖液平板培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂1.5％，刃天青0.002％，用未脱毒玉米芯酸解糖液配置，其余为水，pH 6。
(4)摇瓶发酵筛选培养基I：葡萄糖3％，乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，七水合硫酸镁0.02％，一水合硫酸锰0.001％，七水合硫酸亚铁0.001％，氯化钠0.001％，玉米浆0.1％，其余为水，pH 6.6。
(5)摇瓶发酵筛选培养基II：乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，七水合硫酸镁0.02％，一水合硫酸锰0.001％，七水合硫酸亚铁0.001％，氯化钠0.001％，玉米浆0.1％，未脱毒玉米芯酸解糖液(总还原糖3％)，其余为水，pH 6.6。
筛选步骤：
1、刃天青平板筛选
用生理盐水洗出经离子束诱变的菌株，稀释成不同浓度涂布于含有酚类抑制物(0.02％)和刃天青(0.002％)的常规固体培养基平板上，在35℃温度下厌氧培养30h，挑选可以在筛选平板上生长、菌落较大、且变色圈明显较大的菌落30株。
2、玉米芯酸解糖液平板复筛
将筛选的菌株接种于25mL的肖特厌氧瓶装液量10～15mL，充氮气3min，35℃厌氧培养10～14h，无菌生理盐水制成浓度OD＝0.1的菌悬液，吸取2uL点滴到含有酚类抑制物(0.15％)和刃天青(0.002％)的玉米芯酸解糖液平板上，在35℃温度下厌氧培养12～24h，挑选出透明圈明显大于出发菌的菌落。
最终菌株IB4和IB9显示了较强的抑制物耐受性和还原活力。
3、摇瓶发酵筛选
将菌株IB4、IB9和原始菌株接入种子培养基扩大培养，培养温度35℃，250mL的肖特厌氧瓶装液量100mL，充氮气3min，培养时间12h。然后在以发酵培养基中发酵，接种量10％(v/v)，发酵温度35℃，100mL肖特厌氧瓶装液量60mL，充氮气3min，发酵时间72h后检测各菌株的总溶剂产量和丁醇产量如表1所示：
表1筛选培养基中IB4、IB9和原始菌发酵结果
经过平板组合筛选获得的两株突变株在发酵过程中总溶剂产量和丁醇产量均明显高于出发菌株，其中IB4具有最高的总溶剂产量、糖转化率也最高。这与组合平板筛选的结果一致。
实施例3：本实施例说明突变株IB4和IB9的传代稳定性。
在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，检测突变株IB4和IB9的传代稳定性。菌株IB4和IB9传代发酵试验结果如表2所示：
表2菌株IB4和IB9传代发酵试验结果
从实验结果可知，经过7次连续传代，两株突变株的总溶剂产量和丁醇产量较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例4：本实施例说明贝氏梭菌C.beijerinckii IB4发酵生产丁醇的工艺。
本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：
平板培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂粉1.5％，其余为水，pH 6。
种子培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，其余为水，pH 6。
发酵培养基：葡萄糖3％；乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，其余为水，pH 6.6。
将贝氏梭菌C.beijerinckii IB4接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃，培养时间12h。将平板培养的IB4接种到种子培养基中，250mL肖特厌氧瓶装液量100mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10％(v/v)，发酵温度35℃，100mL肖特厌氧瓶装液量60mL，充氮气3min，发酵培养72h后，检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了12.6g/L和9.2g/L，比同等条件培养的出发菌株提高了16.7％和24.3％，糖转化率达到0.42。
实施例5：本实施例说明贝氏梭菌C.beijerinckii IB4发酵生产丁醇的工艺。
本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：
平板培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂粉1.5％，其余为水，pH 6。
种子培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，其余为水，pH 6。
发酵培养基：混合糖(葡萄糖∶木糖∶***糖质量比＝5∶4∶1)3％；乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，其余为水，pH 6.6。
将贝氏梭菌C.beijerinckii IB4接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃，培养时间12h。将平板培养的IB4接种到种子培养基中，250mL肖特厌氧瓶装液量100mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10％(v/v)，发酵温度35℃，100mL肖特厌氧瓶装液量60mL，充氮气3min，发酵培养12h，发酵培养72h后，检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了12.1g/L和9.0g/L，比同等条件培养的出发菌株提高了19.4％和28.6％，糖转化率达到0.40。
实施例6：本实施例说明贝氏梭菌C.beijerinckii IB4发酵生产丁醇的工艺。
本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：
平板培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂粉1.5％，其余为水，pH 6。
种子培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，其余为水，pH 6。
发酵培养基：乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，活性炭脱毒的玉米芯酸解和酶解的糖液(总还原糖为3％)配置，其余为水，pH 6.6。
将贝氏梭菌C.beijerinckii IB4接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃，培养时间12h。将平板培养的IB4接种到种子培养基中，250mL肖特厌氧瓶装液量150mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；将种子接种到装有1L发酵培养基的2L发酵罐中，接种量10％(v/v)，发酵温度35℃，连续通入氮气，流速为0.3L/min，发酵培养72h后，检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了11.6g/L和8.3g/L，比同等条件培养的出发菌株提高了22.1％和32.6％，糖转化率达到0.38。
实施例7：本实施例说明贝氏梭菌C.beijerinckii IB4发酵生产丁醇的工艺。
本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：
平板培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂粉1.5％，其余为水，pH 6。
种子培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，其余为水，pH 6。
发酵培养基：乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，用未脱毒的玉米芯酸解糖液(总还原糖为3％)配置，其余为水，pH 6.6。
将贝氏梭菌C.beijerinckii IB4接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃，培养时间12h。将平板培养的IB4接种到种子培养基中，250mL肖特厌氧瓶装液量150mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；将种子接种到装有1L发酵培养基的2L发酵罐中，接种量10％(v/v)，发酵温度35℃，连续通入氮气，流速为0.3L/min，发酵培养72h后，检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了10.3g/L和7.1g/L，是同等条件培养的出发菌株的4.3倍和4.4倍，糖转化率达到0.35。
实施例8：本实施例说明贝氏梭菌C.beijerinckii IB4发酵生产丁醇的工艺。
本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：
平板培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂粉1.5％，其余为水，pH 6。
种子培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，其余为水，pH 6。
发酵培养基：乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，用未脱毒的蔗渣酸解糖液(总还原糖为3％)配置，其余为水，pH 6.6。
将贝氏梭菌C.beijerinckii IB4接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃，培养时间12h。将平板培养的IB4接种到种子培养基中，250mL肖特厌氧瓶装液量150mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；将种子接种到装有1L发酵培养基的2L发酵罐中，接种量10％(v/v)，发酵温度35℃，连续通入氮气，流速为0.3L/min，发酵培养72h后，检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了10.6g/L和7.3g/L，是同等条件培养的出发菌株的3.8倍和3.6倍，糖转化率达到0.36。
Claims (6)
1.一株高抗逆性贝氏梭菌，其分类命名为贝氏梭菌(Clostridium beijerinckii)IB4，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2010310。
2.权利要求1所述的高抗逆性贝氏梭菌在生产丁醇中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于具体应用步骤如下：
1)平板培养：将贝氏梭菌CCTCC NO：M 2010310接种至平板培养基厌氧培养，培养温度33～37℃，培养时间12～24h；
2)种子培养：将平板培养的贝氏梭菌CCTCC NO：M 2010310接种到种子培养基中，100mL的厌氧瓶装液量40～60mL，充氮气3～5min，培养温度33～37℃，培养时间12～24h；
3)发酵产丁醇：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量5～15％(v/v)，充氮气3～5min，发酵温度33～37℃，发酵培养时间为60～80h。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的平板培养基包含如下质量百分比的组分：碳源0.3％～1％、氮源0.5％～1％、无机盐0.5％～0.8％、琼脂1.5％～2％、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、淀粉和纤维酸解糖液中的一种或多种；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或几种的混合；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的种子培养基包含如下质量百分比的组分：碳源0.5％～1％、氮源0.5％～1％、无机盐0.5％～0.8％、其余为水；所述的碳源为淀粉和葡萄糖的一种或两种的混合；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或几种的混合；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的发酵培养基包含如下质量百分比的组分：碳源3％～6％、氮源0.1％～0.3％、无机盐0.1％～0.2％、生长因子0.05％～0.1％、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、木糖、***糖、木质纤维酸解糖液和木质纤维酶解糖液中的一种或多种；所述的氮源为乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。
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