CN103451241A - 一种制备丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种制备丁醇的方法，其包括：在厌氧条件下，在存在碳源的情况下，培养贝氏梭菌，以便获得丁醇，其中，所述培养是pH为4.7~6.0的培养环境中进行的。在该pH的培养环境中，能够有效的制备丁醇，并且提高制备丁醇的效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工领域，更具体的，本发明涉及一种制备丁醇的方法。
背景技术
近年来，随着国际石油价格的剧烈波动以及基于石油资源不可再生性的共识，发展生物燃料包括燃料乙醇、生物柴油、生物丁醇、生物气体、生物甲醇、生物二甲醚等，已成为许多国家提高能源安全、减排温室气体、应对气候变化的重要措施。目前市场上以燃料乙醇和生物柴油最为常见，生物丁醇作为一种新一代生物燃料与乙醇相似，可以和汽油混合，但与乙醇相比，具有能量值高、挥发性小、可与汽油等其他燃料以任意比例混合使用、运输较为方便等优势。丁醇还是优良的有机溶剂和重要的化工原料，广泛应用于化工、塑料、有机合成、油漆等工业。丁醇可以通过化学法裂解石油产生，也可通过微生物发酵法产生。从长远的战略角度考虑，探索以再生资源替代石油原料的发酵法来获取化学品以及能源材料是一条及其重要的途径。因此，发酵法生产生物丁醇的技术日益引起了广泛关注。
然而，目前制备丁醇的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效制备丁醇的方法。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：pH在丁醇梭菌厌氧发酵过程中起着至关重要的作用。为此，发明人进行了大量的实验进行发酵条件的优化，由此，完成了本发明。
根据本发明的实施例，本发明提出了一种制备丁醇的方法，其包括：在厌氧条件下，在存在碳源的情况下，培养贝氏梭菌，以便获得丁醇，其中，所述培养是pH为4.7-6.0的培养环境中进行的。发明人惊奇地发现，在该pH的培养环境中，能够有效的制备丁醇，并且提高制备丁醇的效率。另外，贝氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的底物抗逆性相对较强，产物转化率较高，底物利用范围较广。
根据本发明的实施例，在所述培养过程中，向培养环境中引入氮气，以便维持厌氧条件。由此，可以有效地维持培养环境为厌氧状态，从而进一步提高制备丁醇的效率。
根据本发明的实施例，所述碳源为选自葡萄糖、木糖、蔗糖、木糖、***糖的至少一种。可选的，所述碳源为玉米芯酸解糖液。由此，可以进一步提高微生物将这些碳源转化为丁醇的效率。
根据本发明的实施例，所述贝氏梭菌的分类命名为贝氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）IB4，以保藏编号CCTCC NO：M2010310，保藏于中国典型培养物保藏中心。贝氏梭菌（Clostridium beijerinckii）IB4是以贝氏梭菌NCIMB8052为出发菌株经离子束诱变后获得的菌株[已经记载在中国专利申请CN201110020102.6中]，其特性是对木质纤维酸解糖液中抑制物的耐受性高、溶剂产量高、糖转化率高，因此是一种适合利用低劣质原料发酵产丁醇的优良菌株。在本发明中，通过调控适宜的pH值从而使贝氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）IB4能高效利用木质纤维素酸解糖液等低劣质原料，从而提高发酵法制备生物丁醇的经济性。
在本发明的实施例中，所述培养是在pH为5.5的环境中进行的。由此，可以进一步提高利用本发明的方法制备丁醇的效率。并且该pH适合多种碳源作为发酵底物。
在本发明的实施例中，在所述培养环境中设置pH感应器，当所述培养环境中pH高于5.5时，向所述培养环境中添加2mol/L的盐酸，当所述培养环境中pH低于5.5时，向所述培养环境中添加2mol/L的氢氧化钠。由此，可以有效地监控培养环境中的pH，进而提高制备丁醇的效率。
在本发明的实施例中，所述培养是在液体培养基中随着搅拌进行的。可选的，所述搅拌的速度为100-200rpm。由此，可以提高微生物与底物接触的几率，从而有效地进一步提高制备丁醇的效率。
在本发明的实施例中，所述培养是在35摄氏度下进行的。由此，可以进一步提高制备丁醇的效率。
另外，本领域技术人员可以理解，由于，通常贝氏梭菌是利用甘油冷冻包藏的，因此，在利用贝氏梭菌进行制备丁醇之前，还可以对贝氏梭菌菌种预先进行活化培养和种子培养的步骤。菌种活化培养可以是任何常规的贝氏梭菌所采用的菌种活化方法。根据本发明的实施例，可以包括：将菌种由冻存的甘油管中接入50mL血清瓶的pH为6.0-7.0的含有淀粉的能提供碳源、氮源以及无机盐的常规液体培养基中，通入N2或CO2，在恒温培养箱中培养，温度为30-37℃，活化培养12-24h，用于种子培养基接种和菌种保存。种子培养可以是任何常规的贝氏梭菌所采用的种子培养方法。根据本发明的实施例，种子培养的培养基为pH6.0-7.0的含有糖类的能提供碳源、氮源以及无机盐的常规液体培养基，培养时将500mL血清瓶中加入种子培养基100-400mL，115-121℃灭菌15-30min，冷却后接入活化的种子液，通入N2或CO2，培养温度为30-40℃，在恒温培养箱中培养，培养时间为8-12h，用于发酵培养。
在进行活化培养和种子培养之后，可以将所得到的种子培养液用于制备丁醇的培养。例如，本发明所述的厌氧发酵生产丁醇的步骤中，发酵培养的培养基为pH6.0-7.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基，5L发酵罐中发酵培养基的体积为2-4L；在本发明中，接种量为体积比5%-10%,温度为35～40℃，发酵罐通入通入N2或CO2，以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速在100-200rpm，发酵时间为36-72h，在发酵培养过程中，优选将培养液的pH控制在4.7-6.0之间，优选5.5。
根据本发明的实施例，本发明的技术方案可以实现下列优点至少之一：
根据本发明的实施例，利用氢氧化钠和盐酸能够体系的pH控制在最适值，达到丙酮丁醇的高效率生产，提高了丁醇以及总溶剂的产量以及生产强度，缩短了发酵时间；以及
根据本发明的实施例，采用pH感应器实时测定发酵体系的pH值，并利用氢氧化钠和盐酸控制发酵体系的pH值，对于缩短发酵时间，提高分批和连续发酵的生产强度都具有重要的理论意义和应用价值。
具体实施方式
下面利用具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，这些具体实施例仅仅是对本发明的一种解释，而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
菌种：贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4(CCTCC NO：M2010310)。
种子培养基：种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白陈5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L,NaCl2g/L,MgSO43g/L,KH2PO41g/L,K2HPO41g/L,FeSO4·7H2O0.1g/L,pH6.0。
发酵培养基（P2）：碳源（葡萄糖60g/L分消)，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，CH3COONH42.2g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，NaCl0.01g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L；玉米浆1g/L。
5L发酵罐培养时培养基装液量为2L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为35℃，活化培养。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有200mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种（5L发酵罐），接种量为10%（v/v），搅拌转速在120rpm，35℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，10min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。将NaOH和HCl都配成2mol/L的溶液，通过校准的pH电极测定发酵体系的pH值，控制发酵体系的pH值分别为4.7、4.9、5.2、5.5、6.0，当pH低于设定值时，采用2mol/L的NaOH升高pH值，当pH高于设定值时，采用2mol/L的HCl降低pH值，并与不控制pH值的发酵结果对比，发酵至总溶剂产量不再变化。结果如表1。
表1不同pH下发酵结果对比
由表1中的实验结果可看出，在不同的pH下，丁醇发酵的结果不一致，主要特点为，在较高的pH（5.5～6.0）下，菌体生长快，发酵时间短，丁醇产量较高，尤其当pH控制在5.5，丁醇产量及总溶剂产量达到最高，相较于对照分别提高了41%、73%，溶剂的生产强度达到0.68(g·L-1·h-1)；而在较低的pH（4.7～5.2）下,菌体生长慢，发酵时间延长，丁醇产量低。由此得出，pH5.5最适于贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4利用葡萄糖发酵产丁醇。
实施例2
菌种：贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4(CCTCC NO：M2010310)。
种子培养基：种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白陈5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L,NaCl2g/L,MgSO43g/L,KH2PO41g/L,K2HPO41g/L,FeSO4·7H2O0.1g/L,pH6.0。
发酵培养基（P2）：碳源（木糖35g/L分消)，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，CH3COONH42.2g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，NaCl0.01g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L；玉米浆1g/L。
5L发酵罐培养时培养基装液量为2L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为35℃，活化培养。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有200mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种（5L发酵罐），接种量为10%（v/v），搅拌转速在120rpm，35℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，10min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。将NaOH和HCl都配成2mol/L的溶液，通过校准的pH电极测定发酵体系的pH值，控制发酵体系的pH值分别为4.7、4.9、5.2、5.5、6.0，当pH低于设定值时，采用2mol/L的NaOH升高pH值，当pH高于设定值时，采用2mol/L的HCl降低pH值，并与不控制pH值的发酵结果对比，发酵至总溶剂产量不再变化。结果如表2。
表2不同pH下发酵结果对比
由表2中的实验结果可看出，贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4对木糖的利用效率不高，在不同的pH调控下，丁醇发酵的结果不一致，主要特点为，在较高的pH（5.5～6.0）下，菌体生长快，发酵时间短，丁醇产量较高；当pH控制在5.5时，丁醇产量及总溶剂产量达到最高；而在较低的pH（4.7～5.2）下,菌体生长慢，发酵时间延长，丁醇产量低。同实施例1的结果一致，pH5.5同样适于贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4以木糖为碳源发酵产丁醇。
实施例3
菌种：贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4(CCTCC NO：M2010310)。
种子培养基：种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白陈5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L,NaCl2g/L,MgSO43g/L,KH2PO41g/L,K2HPO41g/L,FeS04·7H2O0.1g/L,pH6.0。
发酵培养基（P2）：碳源（蔗糖35g/L分消)，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，CH3COONH42.2g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，NaCl0.01g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L；玉米浆1g/L。
5L发酵罐培养时培养基装液量为2L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为35℃，活化培养。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有200mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种（5L发酵罐），接种量为10%（v/v），搅拌转速在120rpm，35℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，10min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。将NaOH和HCl都配成2mol/L的溶液，通过校准的pH电极测定发酵体系的pH值，控制发酵体系的pH值分别为4.7、4.9、5.2、5.5、6.0，当pH低于设定值时，采用2mol/L的NaOH升高pH值，当pH高于设定值时，采用2mol/L的HCl降低pH值，并与不控制pH值的发酵结果对比，发酵至总溶剂产量不再变化。结果如表3。
表3不同pH下发酵结果对比
由表3中的实验结果可看出，在不同的pH调控下，丁醇发酵的结果不一致，主要特点为，在较高的pH（5.5～6.0）下，菌体生长快，发酵时间缩短，丁醇产量相比对照较高；而在较低的pH（4.7～5.2）下,菌体生长慢，发酵时间延长，丁醇产量低。同实施例1的结果一致，pH5.5同样最适于贝氏梭菌Clostridium beijerinckiiIB4以蔗糖为碳源发酵产丁醇。
实施例4
菌种：贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4(CCTCC NO：M2010310)。
种子培养基：种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白陈5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L,NaCl2g/L,MgSO43g/L,KH2PO41g/L,K2HPO41g/L,FeSO4·7H2O0.1g/L,pH6.0。
发酵培养基（P2）：碳源(玉米芯酸解糖液：木糖43.6g/L，葡萄糖5.0g/L，***糖3.1g/L)，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，CH3COONH42.2g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，NaCl0.01g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L；玉米浆1g/L。
5L发酵罐培养时培养基装液量为2L。将冻存的甘油管中的菌种接入50mL血清瓶中30mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为35℃，活化培养。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有200mL种子培养基的500mL血清瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种（5L发酵罐），接种量为10%（v/v），搅拌转速在120rpm，35℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，10min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。将NaOH和HCl都配成2mol/L的溶液，通过校准的pH电极测定发酵体系的pH值，控制发酵体系的pH值分别为4.7、4.9、5.2、5.5、6.0，当pH低于设定值时，采用2mol/L的NaOH升高pH值，当pH高于设定值时，采用2mol/L的HCl降低pH值，并与不控制pH值的发酵结果对比，发酵至总溶剂产量不再变化。结果如表4。
表4不同pH下发酵结果对比
由表4中的实验结果可看出，在不同的pH调控下，丁醇发酵的结果不一致，主要特点为，在较高的pH（5.5～6.0）下，菌体生长快，发酵时间短，丁醇产量较高，尤其当pH控制在5.5，丁醇产量及总溶剂产量分别提高了40.8%、34%，丁醇生产速率提高了58%；而在较低的pH（4.7～5.2）下,菌体生长慢，发酵时间延长，丁醇产量低。同以上实例的结果一致，pH5.5同样有助于贝氏梭菌Clostridium beijerinckii IB4利用玉米芯酸解糖液发酵产丁醇。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种制备丁醇的方法，其特征在于，包括：
在厌氧条件下，在存在碳源的情况下，培养贝氏梭菌，以便获得丁醇，其中，所述培养是pH为4.7~6.0的培养环境中进行的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述培养过程中，向培养环境中引入氮气，以便维持厌氧条件。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳源为选自葡萄糖、木糖、蔗糖、木糖、***糖的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳源为玉米芯酸解糖液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述贝氏梭菌的分类命名为贝氏梭菌（Clostridium beijerinckii）IB4，以保藏编号CCTCC NO：M 2010310，保藏于中国典型培养物保藏中心。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养是在pH为5.5的环境中进行的。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述培养环境中设置pH感应器，当所述培养环境中pH高于5.5时，向所述培养环境中添加2mol/L的盐酸，当所述培养环境中pH低于5.5时，向所述培养环境中添加2mol/L的氢氧化钠。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养是在液体培养基中随着搅拌进行的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述搅拌的速度为100~200rpm。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养是在35摄氏度下进行的。
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