CN102154166A - 一种产碱假单胞菌及其制备l-薄荷醇的方法和应用 - Google Patents
一种产碱假单胞菌及其制备l-薄荷醇的方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种产碱假单胞菌及其制备l-薄荷醇的方法和应用。其制备l-薄荷醇的方法包括如下步骤：（1）将产碱假单胞菌加入到培养基中发酵培养；（2）将发酵液处理，将底物进行转化反应，得到反应液，底物指薄荷醇异构体酯化物的混合物；薄荷醇异构体酯化物的混合物含有l-薄荷醇酯化物，且含有l-异薄荷醇酯化物、l-新异薄荷醇酯化物、l-新薄荷醇酯化物、d-薄荷醇酯化物、d-异薄荷醇酯化物、d-新异薄荷醇酯化物、d-新薄荷醇酯化物中的任一种或任几种；（3）将反应液减压蒸发，分离反应底物与产物，萃取得到l-薄荷醇。
Description
技术领域
本发明涉及一种产碱假单胞菌（Pseudomonas alcaligenes）以及制备l-薄荷醇（即(-)-薄荷醇，化学名为(1R,2S,5R)-2-异丙基- 5-甲基环己醇）的方法。
背景技术
天然薄荷醇主要为l-薄荷醇，l-薄荷醇具有特征的薄荷香气和强烈的清凉作用，气味更加新鲜轻快； l-薄荷醇具有更强的生理活性，它具有杀菌止痒、兴奋镇痛、镇静、防腐杀菌、治疗疼痛等功效，因此具有更大的医疗价值。l-薄荷醇的这些性质，使它比其他构型的薄荷醇具有更高的工业价值。
由于人们对于生活质量的日益关注，对l-薄荷醇的需求量也日益增长。但是，天然提取的l-薄荷醇过度依赖人工栽培的薄荷植物，受地域、气候的影响，越来越难以满足生产与生活的需要。人们通过合成的手段制备l-薄荷醇来满足需求，由于化学法制备的产品是由薄荷醇的8种异构体组成的，分别为l-薄荷醇((1R,2S,5R)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、l-异薄荷醇((1R,2S,5S)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、l-新异薄荷醇((1S,2S,5S)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、l-新薄荷醇((1R,2R,5S)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、d-薄荷醇((1S,2R,5S)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、d-异薄荷醇((1S,2R,5R)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、d-新异薄荷醇((1R,2R,5R)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)、d-新薄荷醇((1S,2S,5R)-2-异丙基-5-甲基-环己醇)。其中l-薄荷醇的含量较低，严重影响使用效果，从8种薄荷醇异构体的混合物中分离出的l-薄荷醇产品，价格低廉比天然来源的低，各项品质相当，因此工业化过程的一个主要环节就是分离l-薄荷醇。
化学制备技术、生物制备技术与天然原料提取技术，是目前制备l-薄荷醇研究的3个主要方面。化学制备技术目前在工业上应用的，主要是日本高砂公司利用发明的手性催化剂(S)-BINAP-Rh催化烯丙胺不对称异构化合成得到l-薄荷醇，该技术目前年产1000吨l-薄荷醇。从天然植物来源提取工艺是将薄荷草经蒸气蒸馏制得薄荷原油。经反复结晶得到l-薄荷醇，过程复杂，能耗高，生产率低。生物催化法制备l-薄荷醇的研究中，主要涉及到两种拆分反应，一种是利用微生物或酶催化的酯化或转酯化反应，另一种是利用微生物或酶催化的水解反应。杨立荣等开发了一种利用苏云金芽孢杆菌立体选择性水解薄荷醇异构体酯化的混合物的方法，以制备l-薄荷醇，最高转化率达到74%，选择性d.e.=90.1%(杨立荣，孟彦. 一种苏云金芽孢杆菌以及L-薄荷醇的制备方法：CN101671639A [P]2009.8.13)。利用不对称水解制备l-薄荷醇的方法中，由于l-薄荷醇与薄荷醇异构体酯化的混合物极性差别不大，分离过程需要通过硅胶柱层析等繁琐昂贵的过程(许建和,郑高伟。枯草芽孢杆菌酯酶及其用于生产l-薄荷醇的应用：CN 101338287A [P]2008.7.25)
上述的生物方法分离l-薄荷醇的研究虽然取得了一些进展，但普遍存在产物的光学纯度不高，转化率低、生物催化剂种类少和生物催化剂成本高等缺点，并且分离纯化过程不易实现，制约了工业化的应用。如果利用高选择性的微生物催化剂，则可大大降低原料成本，提高产品纯度，目前尚未见有关于利用产碱假单胞菌（Pseudomonas alcaligenes）对薄荷醇异构体酯化物的混合物进行拆分的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种产碱假单胞菌及其制备l-薄荷醇的方法和应用。
为实现上述目的，发明人首次分离纯化到一株能够产选择性转酯化l-薄荷醇酯化物的新菌株。经过16S rDNA和生理生化鉴定，该菌株为产碱假单胞菌属（Pseudomonas alcaligenes），命名为产碱假单胞菌LM99（Pseudomonas alcaligenes LM99）。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2010年12月3日，保藏号为CGMCC No. 4405。
产碱假单胞菌CGMCC No. 4405可用于作为通过分离薄荷醇异构体酯化的混合物来制备l-薄荷醇的催化剂。
利用产碱假单胞菌CGMCC No. 4405制备l-薄荷醇的方法包括如下步骤：
（1）将保藏号为CGMCC No. 4405的产碱假单胞菌加入到培养基中进行发酵培养；
（2）按以下第一方案、第二方案或第三方案对薄荷醇异构体酯化物的混合物进行催化，得到反应液，所述薄荷醇异构体酯化物的混合物含有l-薄荷醇酯化物，且含有l-异薄荷醇酯化物、l-新异薄荷醇酯化物、l-新薄荷醇酯化物、d-薄荷醇酯化物、d-异薄荷醇酯化物、d-新异薄荷醇酯化物、d-新薄荷醇酯化物中的任一种或任几种：
第一方案：将所述薄荷醇异构体酯化物的混合物加入到步骤（1）得到的发酵液中，反应后得到反应液；
第二方案：将步骤（1）得到的发酵液离心得到上清液，将所述薄荷醇异构体酯化物的混合物加入所述上清液中，反应后得到反应液；
方案B第三方案：将步骤（1）得到的发酵液进行脱水处理得到发酵液的固体制剂，后将该发酵液的固体制剂与薄荷醇异构体酯化物的混合物一起加入到pH为5～10的缓冲溶液中进行反应，得到反应液；
（3）将所述反应液进行分离得到l-薄荷醇。
进一步地，本发明在步骤（2）中，所述的薄荷醇异构体酯化物的混合物是指薄荷醇异构体混合物中的各薄荷醇异构体与脂肪族羧酸或芳香族羧酸形成的酯的混合物。
进一步地，本发明在步骤（2）的第三方案中，所述缓冲溶液为磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；所述发酵液的固体制剂相对于缓冲溶液的质量浓度为1g/L~100g/L。
进一步地，本发明在步骤（2）中，所述发酵培养的培养基的成分为：酪蛋白1~10g/L、吐温-80 1~15g/L、酵母膏1~8g/L、硫酸铵0~10g/L、磷酸氢二钾1~6g/L、氯化钙0~0.5g/L和无水硫酸镁0~1g/L；培养基的pH为5~10；所述产碱假单胞菌相对于培养基的接种量为1%~10%（体积）；发酵时间为12 ~48小时；发酵温度为15~50℃。
进一步地，本发明在步骤（3）中，所述分离是指对所述反应液先进行减压蒸发、后用有机溶剂萃取得到l-薄荷醇。
本发明方法相对于化学制备方法、生物制备方法和传统的天然原料提取方法，具有以下优点：
（1） 采用传统从天然薄荷植物中提取l-薄荷醇的方法，不仅生产过程效率比较低、能耗大，而且容易受到薄荷植物种植产量的影响；而化学制备方法由于催化剂本身昂贵易失活，且需要使用大量的有机溶剂与助剂，在生产成本与环境成本上都较高；而相比之下，本发明采用产碱假单胞菌LM99（Pseudomonas alcaligenes LM99），选择性水解薄荷醇异构体酯化物的混合物中的l-薄荷醇酯化物，不仅具有较高选择性和转化率的优点，而且可以从工艺上大量减少有机溶剂的使用，对环境友好。
（2）工业化的拆分制备l-薄荷醇方法中，都是采用薄荷醇异构体的混合物作为初始原料，而现今大部分方法都采用将d-薄荷醇与l-薄荷醇这一对对映异构体首先从薄荷醇异构体的混合物中分离出来再进行拆分。而本发明直接采用化学法合成得到的薄荷醇异构体混合物作为底物，经过简单的酯化反应，不再需要预先分离过程，方法简单，在设备投资与操作费用方面优势明显。
（3）本发明利用筛选的微生物制备l-薄荷醇，可以自行发酵制备，质量稳定，存储稳定，运输方便，能大大降低原料成本，极具广大应用前景。
（4）本发明采用预先减压蒸发的方法将薄荷醇的酯化物与l-薄荷醇分离，大大简化了分离过程，能够直接制备高纯度的l-薄荷醇，降低了分离的能耗，具备工业化前景。
（5）采用本发明的产碱假单胞菌Pseudomonas alcaligenes LM99进行不对称催化反应，生成l-薄荷醇纯度在95%以上，转化率高可达90%；且未反应的底物可以直接回收，重新外消旋化成为底物薄荷醇异构体酯化的混合物，提高了底物利用率。
生物材料样品的保藏信息：
保藏的生物材料样品：产碱假单胞菌LM99（Pseudomonas alcaligenes LM99）；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称：CGMCC）；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所
（邮编：100101）；
保藏日期：2010年12月3日；
保藏登记号：CGMCC No. 4405。
附图说明
图1是产碱假单胞菌LM99催化反应的反应液的气象色谱图，图中共有8个峰信号，由左向右依次为：l-薄荷醇，l-异薄荷丙酸酯，d-异薄荷丙酸酯，dl-新薄荷丙酸酯，l-薄荷丙酸酯，d-薄荷丙酸酯，l-新异薄荷丙酸酯，d-新异薄荷丙酸酯；8个信号峰的出峰时间依次为16.440分钟、22.323分钟、22.665分钟、24.323分钟、24.757分钟、25.323分钟、27.540分钟、27.790分钟。
图2是不同反应时间下转化率和产物非对映体过量值的变化曲线。
具体实施方式
在实施例中，在对薄荷醇异构体酯化物的混合物进行催化过程中，对反应液进行底物转化率、产物非对映体过量值（d.e.p）的测定方法具体如下（其中，所述底物为薄荷醇异构体酯化物的混合物）：
在反应过程中，5mL反应液与5ml乙酸乙酯振荡萃取，然后离心（10000×g，5min）得到乙酸乙酯相，进行手性气相色谱分析。该手性气相色谱分析的体系如下：
检测仪器：GC-950气相色谱仪；
手性气相柱：CP-CYCLODEXTRIN β-2,3,6-M-19
（50m×0.25mm×0.25μm）；
检测条件：柱温130℃，检测器和进样器温度分别为260℃与250℃，载气（N2）25mL/min，空气3mL/min，氢气7mL/min。
计算公式：
底物转化率(%)=(初始底物浓度-剩余底物浓度)/初始底物浓度×100%；
d.e.s=c×d.e.p/(1-c)×100%
d.e.p(%)=[(AR-AS)/(AS+AR)]×100%
其中，c为底物转化率，d.e.p为产物非对映体过量值，其中AS、AR分别为气相色谱所测样品中(l)-薄荷醇和非(l)-薄荷醇的峰面积之和。
实施例1：菌种的筛选及鉴定
本实施例在杭州地区采集土壤，进行产碱假单胞菌LM99（Pseudomonas alcaligenes LM99）的筛选。方法如下：
富集培养：培养基成分为（g/L）：蛋白胨5.0，酵母膏3.0，l-薄荷醇丙酸酯10.0，硫酸铵4.0，磷酸氢二钾10，硫酸镁0.2，pH为7.0。121℃灭菌20min。称取新鲜土样1g加入到装有50ml富集培养基的250mL摇瓶中，置于30℃、200r/min摇床中培养。按1%的接种量，每隔一天进行一次转接，重复三次。
初筛平板：培养基成分为（g/L）：酵母膏1.0，硫酸铵2.0，磷酸氢二钾2.0，氯化钠2.0，硫酸镁0.5，l-薄荷醇丙酸酯20.0，琼脂20.0，pH为7.0。120℃灭菌20min。采用划线法，将富集菌液在平板培养基上均匀划线，30℃培养1~2天。将有水解透明圈的菌体标记，置于4℃冰箱保存。
复筛摇瓶：培养基成分为（g/L）：蛋白胨5.0，葡萄糖5.0，酵母膏5.0，橄榄油50.0，硫酸铵5.0，磷酸氢二钾2.0，氯化钠1.0，硫酸镁0.2，pH为7.0。120灭菌20min。将初筛获得的单菌落接入20mL复筛培养基中，30℃，200rpm下生长24小时后，取新鲜发酵液5ml，加入薄荷醇异构体酯化物的混合物，薄荷醇异构体酯化物的混合物浓度为20g/L，30℃振荡反应24小时，加入乙酸乙酯振荡萃取水解产物，用于手性气相色谱进行分析，将底物选择性较高的和产物非对映体过量值均较高的菌株保藏备用。
菌种鉴定：16S rDNA鉴定和生理生化鉴定。
经过筛选，编号为LM99的菌株，其非对映体对量值最高，且具有相对较好的转化率，气相谱图见图1。从图1可知，产物l-薄荷醇出峰位置在16.440min。对菌株LM99作16S rDNA PCR测序分析和生理生化实验（见表1），测序结果如SEQ No. 1所示，由测序分析和生理生化实验的结果可确定所筛选出的菌株为产碱假单胞菌属，该菌株命名为产碱假单胞菌LM99（Pseudomonas alcaligenes LM99）。
表1产碱假单胞菌LM99（Pseudomonas alcaligenes LM99）的生理生化实验结果
| 特征 | LM99 | 特征 | LM99 | 特征 | LM99 |
| 明胶液化 | + | 硝酸盐还原 | + | 运动性 | + |
| M.R试验 | - | 氧化酶 | + | 葡萄糖 | + |
| D-酒石酸 | - | 脓青素 | - | 新生霉素抗性 | + |
| D-山梨醇 | - | Meso-酒石酸 | + | 葡萄糖产气 | + |
| V-P试验 | - | 革兰氏染色 | - | 蔗糖利用 | + |
实施例2：
选择发酵培养基成分为：酪蛋白10g/L, 吐温-80 9g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵8g/L，磷酸氢二钾6g/L，调节pH至7.0。将产碱假单胞菌LM99（Pseudomonas alcaligenes LM99）的种子液以1%（v/v）接种量接种于50mL的上述发酵培养基中，置于50℃、200r/min恒温摇床中发酵20小时后，取出5mL发酵液制得粗酶，粗酶以1g/L的浓度，薄荷醇异构体丙酸酯的混合物（各异构体的含量为：d-异薄荷醇丙酸酯12.3%，l-异薄荷醇丙酸酯12.3%，d-薄荷醇丙酸酯24.4%，l-薄荷醇丙酸酯24.4%，d-新异薄荷醇丙酸酯13.3%，l-新异薄荷醇13.3%）以1g/L的浓度加入到5ml磷酸盐缓冲液（缓冲液pH=7.0）中，置于35℃、200r/min恒温摇床中振荡反应10h，反应完成后加入5ml乙酸乙酯振荡萃取，再进行气相色谱分析，得到最终底物的转化率为51.1%，产物非对映体过量值95.3%。
实施例3：
选择发酵培养基成分为：酪蛋白8g/L, 吐温-80 3g/L，酵母膏1g/L，硫酸铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，氯化钙 0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，调节pH至8.0。将产碱假单胞菌LM99（Pseudomonas alcaligenes LM99）的种子液以12%（v/v）接种量接种于50mL的上述发酵培养基中，置于18℃、200r/min恒温摇床中发酵40小时后，薄荷醇异构体丁酸酯的混合物（各异构体的含量为：d-异薄荷醇丁酸酯10.3%，l-异薄荷醇丁酸酯10.3%，d-薄荷醇丁酸酯26.4%，l-薄荷醇丁酸酯26.4%，d-新异薄荷醇丁酸酯13.3%，l-新异薄荷醇丁酸酯13.3%）以60g/L的浓度加入到5ml 磷酸缓冲液中（pH=10.0）中，置于45℃、200r/min恒温摇床中振荡反应60h，反应完成后加入5ml乙酸乙酯振荡萃取，再进行气相色谱分析，如图2所示：得到最终底物的转化率为79.4%，产物非对映体过量值99%。
实施例4：
选择发酵培养基成分为：酪蛋白5g/L, 吐温-80 15g/L，酵母膏10g/L，硫酸铵12g/L，磷酸氢二钾7g/L，氯化钙 1g/L，硫酸镁1g/L，调节pH至6.0。将产碱假单胞菌LM99（Pseudomonas alcaligenes LM99）的种子液以10%（v/v）接种量接种于50mL的上述发酵培养基中，置于30℃、200r/min恒温摇床中发酵48小时后，取出5mL发酵液制得粗酶，粗酶以30g/L的浓度，薄荷醇异构体戊酸酯的混合物（各异构体的含量为：d-异薄荷醇戊酸酯15.3%，l-异薄荷醇戊酸酯15.3%，d-薄荷醇戊酸酯24.4%，l-薄荷醇戊酸酯24.4%，d-新异薄荷醇戊酸酯10.3%，l-新异薄荷醇戊酸酯10.3%）以40g/L的浓度加入到5ml柠檬酸盐缓冲液（缓冲液pH=5.0）中，置于20℃、200r/min恒温摇床中振荡反应50h，反应完成后加入5ml乙酸乙酯振荡萃取，再进行气相色谱分析，得到最终底物的转化率为30%，产物非对映体过量值93.8%。
实施例5：
选择发酵培养基成分为：酪蛋白3g/L, 吐温-80 20g/L，酵母膏8g/L，硫酸铵2g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化钙 0.2g/L，硫酸镁1.5g/L，调节pH至10.0。将产碱假单胞菌LM99（Pseudomonas alcaligenes LM99）的种子液以5%（v/v）接种量接种于50mL的上述发酵培养基中，置于15℃、200r/min恒温摇床中发酵12小时后，取出5mL发酵液制得粗酶，粗酶以100g/L的浓度，薄荷醇异构体苯甲酸酯的混合物（各异构体的含量为：d-异薄荷醇苯甲酸酯12.3%，l-异薄荷醇苯甲酸酯12.3%，d-薄荷醇苯甲酸酯20.4%，l-薄荷醇苯甲酸酯20.4%，d-新异薄荷醇苯甲酸酯17.3%，l-新异薄荷醇苯甲酸酯17.3%）以50g/L的浓度加入到5ml 三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（缓冲液pH=9.0）中，置于60℃、200r/min恒温摇床中振荡反应1h，反应完成后加入5ml乙酸乙酯振荡萃取，再进行气相色谱分析，结果如表2所示，最终底物的转化率为90%，产物非对映体过量值90%。
表2
| 反应时间 | 10min | 20min | 30min | 40min | 50min | 60min |
| 转化率（%） | 22.7 | 37.1 | 51.6 | 68.5 | 79.3 | 90 |
| d.e.p（%） | 97.1 | 96.3 | 94.5 | 93.4 | 91.3 | 90 |
实施例6：
选择发酵培养基成分为：酪蛋白1g/L, 吐温-80 6g/L，酵母膏7g/L，磷酸氢二钾4g/L，氯化钙 0.7g/L，硫酸镁0.3g/L，调节pH至7.0。将产碱假单胞菌LM99（Pseudomonas alcaligenes LM99）的种子液以7%（v/v）接种量接种于50mL的上述发酵培养基中，置于40℃、200r/min恒温摇床中发酵48小时后，取出5mL发酵液制得粗酶，粗酶以80g/L的浓度，薄荷醇异构体丙酸酯的混合物（各异构体的含量为：d-异薄荷醇丙酸酯12.3%，l-异薄荷醇丙酸酯12.3%，d-薄荷醇丙酸酯19.4%，l-薄荷醇丙酸酯19.4%，d-新异薄荷醇丙酸酯18.3%，l-新异薄荷醇丙酸酯18.3%）以35g/L的浓度加入到5ml 磷酸盐缓冲液（缓冲液pH=7.0）中，置于37℃、200r/min恒温摇床中振荡反应22h，反应完成后加入5ml乙酸乙酯振荡萃取，再进行气相色谱分析，结果如表3所示，得到的最终底物的转化率为62.4%，产物非对映体过量值94.9%。
表3
| 反应时间 | 1h | 3h | 6h | 10h | 14h | 18h | 22h |
| 转化率（%） | 7.27 | 16.6 | 30.54 | 44.66 | 51.92 | 56.81 | 62.4 |
| d.e.p（%） | 99.5 | 98.7 | 98.6 | 97.6 | 96.6 | 95.6 | 94.9 |
实施例7：
选择发酵培养基成分为：酪蛋白12g/L, 吐温-80 1g/L，酵母膏5g/L，硫酸铵10g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钙 0.5g/L，硫酸镁0.8g/L，调节pH至5.0。将产碱假单胞菌LM99（Pseudomonas alcaligenes LM99）的种子液以8%（v/v）接种量接种于50mL的上述发酵培养基中，置于37℃、200r/min恒温摇床中发酵55小时后，离心（10000Xg，4℃）得到发酵上清液，薄荷醇异构体月桂酸酯的混合物（各异构体的含量为：d-异薄荷醇月桂酸酯11.3%，l-异薄荷醇月桂酸酯11.3%，d-薄荷醇月桂酸酯25.4%，l-薄荷醇月桂酸酯25.4%，d-新异薄荷醇月桂酸酯13.3%，l-新异薄荷月桂酸酯13.3%）以100g/L的浓度加入到5ml 发酵上清液中（发酵液的pH=5.0）中，置于50℃、200r/min恒温摇床中振荡反应35h，应完成后加入5ml乙酸乙酯振荡萃取，再进行气相色谱分析，得到最终底物的转化率为24.2%，产物非对映体过量值97.5%。
<110> 浙江大学
<120> 一种产碱假单胞菌及其制备l-薄荷醇的方法和应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1509
<212> DNA
<213> Pseudomonas alcaligenes
<400> 1
tgaacgctag cggcaggcct aacacatgca agtcggggag aaagcagggg accttcgggc 60
cttgcgctat cagatgagcc taggtcggat tagcttctgc ctggtagtgg gggcacaacg 120
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attcatgact ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgtagg tgaactgcgg ctggatcacc 1500
tcctttcta 1509
Claims (7)
1.一种产碱假单胞菌，其特征是：其保藏号为CGMCC No. 4405。
2.一种权利要求1的产碱假单胞菌的应用，其特征是：用于作为通过分离薄荷醇异构体酯化物的混合物来制备l-薄荷醇的催化剂。
3.一种利用权利要求1的产碱假单胞菌制备l-薄荷醇的方法，其特征是，包括如下步骤：
（1）将保藏号为CGMCC No. 4405的产碱假单胞菌加入到培养基中进行发酵培养；
（2）按以下第一方案、第二方案或第三方案对薄荷醇异构体酯化物的混合物进行催化，得到反应液，所述薄荷醇异构体酯化物的混合物含有l-薄荷醇酯化物，且含有l-异薄荷醇酯化物、l-新异薄荷醇酯化物、l-新薄荷醇酯化物、d-薄荷醇酯化物、d-异薄荷醇酯化物、d-新异薄荷醇酯化物、d-新薄荷醇酯化物中的任一种或任几种：
第一方案：将所述薄荷醇异构体酯化物的混合物加入到步骤（1）得到的发酵液中，反应后得到反应液；
第二方案：将步骤（1）得到的发酵液离心得到上清液，将所述薄荷醇异构体酯化物的混合物加入所述上清液中，反应后得到反应液；
第三方案：将步骤（1）得到的发酵液进行脱水处理得到发酵液的固体制剂，后将该发酵液的固体制剂与薄荷醇异构体酯化物的混合物一起加入到pH为5～10的缓冲溶液中进行反应，得到反应液；
（3）将所述反应液进行分离得到l-薄荷醇。
4.根据权利要求3所述的制备l-薄荷醇的方法，其特征在于：所述薄荷醇异构体酯化物的混合物是指薄荷醇异构体混合物中的各薄荷醇异构体与脂肪族羧酸或芳香族羧酸形成的酯的混合物。
5.根据权利要求3所述的制备l-薄荷醇的方法，其特征在于：在步骤（2）的第三方案中，所述缓冲溶液为磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；所述发酵液的固体制剂相对于缓冲溶液的质量浓度为1g/L~100g/L。
6.根据权利要求3所述的制备l-薄荷醇的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述分离是指对所述反应液先进行减压蒸发、后用有机溶剂萃取得到l-薄荷醇。
7.根据权利要求3所述的制备l-薄荷醇的方法，其特征在于：在步骤（1）中，所述发酵培养的培养基的成分为：酪蛋白1~10g/L、吐温-80 1~15g/L、酵母膏1~8g/L、硫酸铵0~10g/L、磷酸氢二钾1~6g/L、氯化钙0~0.5g/L和无水硫酸镁0~1g/L；培养基的pH为5~10；所述产碱假单胞菌相对于培养基的接种量为1%~10%（体积）；发酵时间为12 ~48小时；发酵温度为15~50℃。
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