CN105802873A - 高效降解***的产碱假单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株能高效降解***磷酸钠和***的产碱假单胞菌；本发明还提供了利用该菌株制备微生物净化剂的方法及用该微生物净化剂生物修复性处理被***磷酸钠和***污染的医疗废水和城市废水的效果。利用本发明提供的菌株和制备的微生物净化剂能有效清除水坏境中污染的***磷酸钠和***，具有成本低、处理效果好、无二次污染的优点，可防止***在水环境中蓄积后对生物和人带来的危害。提供的能高效降解***磷酸钠和***的产碱假单胞菌菌株还可进一步制成生物制剂，消除***类药物的副作用，具有潜在的临床应用价值。

Description

高效降解***的产碱假单胞菌及其应用

发明所属领域：

本发明属于废水处理领域，具体地说，本发明涉及高效降解***的产碱假单胞菌，及该菌在处理废水中污染的***磷酸钠和***的应用。

背景技术：

环境激素(estrogen)是指由植物以及人和动物来源的内分泌干扰物，是一类广泛存在于环境，特别是水体中的污染物，对人和动物的危害已经得到证实，并且威胁着人类的健康。在众多的环境内分泌干扰物中，甾体激素的干扰活性最强，并且难以降解，在极低的浓度(0.1ng/L)便可造成明显的影响。甾体激素又称类固醇激素(本文中统一称为甾体激素)，按其药理作用不同可分为肾上腺皮质激素(简称皮质激素)和性激素两大类。甾体激素进入环境的方式主要是通过人体和生物的***，在自然环境的污水中难以降解，经过普通水处理方法也难以有效地被清除，可长期存在于自然环境的水体中，发挥潜在的内分泌干扰作用，从而影响生物的内分泌***与其它***的调控。

早在上世纪70年代，人们就发现了环境***对野生动物的影响，到80-90年代，人们开始关注其对人类的影响(PurdomCE，等.Chem.Eco1，1994，8(4)：275～285)。本世纪初，有关类固醇***(SteroidEstrogens，SEs)危害的研究增多，2003年，Pelley发表了由类固醇***引起的湖泊鱼类灭绝的研究(PelleyJ,等.EnbironSciTechnol,2003,37(17)：313A-314)，2009年初，德国Goethe大学生态学系的Wagner等报道了市售塑料瓶装饮用水中含有***成分，可能对人类身体健康造成很大危害的研究(WagnerM，等.EnvironSciPollutResInt.2009,16(3):278-86)。由于这些激素在普通水处理技术中难以有效地去除，对人和其它生物具有潜在的内分泌干扰作用。环境中的激素还可通过食物链的传递和生物蓄积作用使其在水环境中浓度增高，对生物和人类健康造成严重影响(VanderLindenSC，等,EnvironSciTechnol.2008，42(15):5814-20)。因此，各个国家开始对水环境激素污染引起重视，并研究其治理措施。

***(Dexamethasone)是以天然的氢化可的松为原料人工合成的长效糖皮质激素，其化学成分为C22H29FO5，与性激素的化学结构相似，具有同样的环戊烷多氢菲核，化学结构稳定，几乎不溶于水，溶于乙腈、乙醇、甲醇等有机溶剂。因此，临床常用制剂为易溶于水、易吸收的***衍生物，如易溶于水的***磷酸钠(DexamethasoneSodiumPhosphate)、***醋酸酯和其它衍生物。近十余年来，***类药物广泛应用于临床各科多种疾病的治疗，如自身免疫性疾病，过敏，炎症，哮喘及皮肤科、眼科疾病。至今，上市的***类药物已达12种以上。由于***类药物在临床的应用越来越广泛，使其用量逐年增加，现今中国已成为世界上最大的***类药物市场。***的作用机制是透过细胞膜进入细胞内，在细胞内与胞浆受体结合，形成激素胞浆受体复合物，该复合物通过变构而透过核膜，进入细胞核，再与核内受体相互结合，转变为激素-核受体复合物，促进或抑制相应的RNA合成，调控相应靶蛋白质的合成。

临床上最常用的***类药物是***磷酸钠，该药是磷酸与***C₂₁位上的羟基成酯后又形成的钠盐，其化学成分为C22H28FNa2O8P，易溶于水，极易自消化道吸收。***磷酸钠多用于治疗和预防药物引起的过敏及病毒性感冒引起的发烧等症，而且是抢救垂危病人不可缺少的急救药品。在***磷酸钠的应用过程中，药物残液可经各种途径污染环境，特别是医院的废水；也可从应用者体内经分泌液和尿液排出(Hansrn等.ToxicologicalSciences,1999,48:230-239.)，污染更广泛的环境。

目前，医院废水的处理主要采用的是物理、生物化学和消毒的方法，这些方法可清除废水中的病原体、放射性物质、重金属等，但尚未对激素类污染物进行有效处理(胡平，等.环境与可持续发展，2007，4：29-30)。Chang等(2007年)报道在废水厂处理后的废水和江水中存在6种糖皮质类激素。荷兰VanderLinden等报道在工厂、医院的废水和饮用水、地表水中均存在糖皮质类激素，其中，城市污水厂处理后的废水中的***的含量达11-243ng/L。荷兰Schriks等报道在医院处理前的废水中的糖皮质类激素的含量为13-1900ng/L(SchriksM,等.EnvironSciTechnol.2010,44(12):4766-74.)。国内石中全等报道某医院处理前的废水中***的含量高达452.05±8.10ng/L，处理后为52.83±1.36ng/L；某养猪场粪水池废水中***的含量高达1050.90ng/L(石中全,等.中国医药指南,2012,10(9)：319-321)。这些报道表明城市废水，特别是医院废水中存在***污染，如果不对医院污水中的***进行处理而直接排放，也将会在环境中蓄积，最终危害人类健康。

临床上***类药物在应用生理剂量治疗时无明显不良反应，长期或大剂量使用后可引起医源性库欣综合征，儿童生长抑制、青光眼、白内障、心血管***损害等不良反应，还可以降低人体的免疫力(Huff,等..AvianDis.2013，57(4)：730-736)，加重癫痫持续状态(Duff,等NeurobiolDis.2014Mar；63:229-36)，动物实验已证实***可引起兔的胎儿发育迟缓和上腭腭裂(Takahashi,等.CancerChemotherPharmacol,2011,(68):653–659)，使斑马鱼头部骨骼产生骨质疏松(韦英杰等.药学学报，2013,48(2)：255-260)，还会影响新生小鼠的大脑发育，以至于抑制其对环境的反应(Menshanov,等.BehavBrainRes,2014，1(9):43-50)。因此***已作为一种新型的医源性环境激素威胁着人类的健康，治理***类化合物的污染已具有重要的实际意义。

生物修复技术是指人为地利用生物特别是微生物及其产生的酶催化降解有机物，消除环境污染的过程。多项研究发现，在自然界含有特定有机物的环境中，存在具有相应代谢途径的微生物，这种微生物在含有相应有机物的培养条件下可被驯化为能高效降解这种有机物的微生物，去除环境污染的有害有机物。近年已从石油、农药、塑料污染的水和土壤中分离出降解多环芳烃、氯乙烯、氯氰菊酯、苄嘧磺隆等的微生物。从20世纪80年代起已成功应用于黑臭河道、海岸线溢油、土壤重金属污染的治理。较之其它治理措施，生物修复技术成本低、处理效果好、无二次污染，已广泛应用于土壤和天然水体污染的治理。

我们曾从***污染的医院废水中分离到一株可降解***磷酸钠和***的产碱假单胞菌(201209YZB，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号CCTCCM2014231)，该菌对***磷酸钠和***的降解率分别为50.89％和23.63％(YiW,ZhibangY,等.JBasicMicrobiol.2015，55(2)：262-268)，但在处理污水中还存在着较高的***磷酸钠和***残留，尚不能用于制备清除***污染的净化剂。

发明技术内容：

本发明的一个目的是提供一种经过驯化的产碱假单胞菌菌株，该菌株能够以***磷酸钠为唯一碳源和能源，能够高效降解***磷酸钠和***，可用于制备清除水中***磷酸钠和***污染的微生物净化剂，有效消除废水中***磷酸钠和***污染，预防其对生物和人造成危害。

本发明的另一个目的是提供一种含有能够高效降解***磷酸钠和***的产碱假单胞菌微生物净化剂及其配制方法。

本发明的再一个目的是提供微生物净化剂在废水处理中的应用。

本发明针对水环境中存在***污染的现状及其对生物和人类健康的潜在危害，在从医院污染***磷酸钠的废水中分离到一株可降解***磷酸钠和***的产碱假单胞菌的基础上，介于已分离的产碱假单胞菌对***磷酸钠和***降解率低的现状，对该菌株进行驯化诱导，并从中筛选到一株能高效降解***的产碱假单胞菌，其特征在于，该菌株能够以***磷酸钠为唯一碳源和能源，为产碱假单胞菌2014YZBPseudomonasalcaligenes2014YZB，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015205，保藏日期是2015年4月7日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，是中国专利局指定的保藏机构，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctccwhu.edu.cn。

该菌株对***磷酸钠的降解率从驯化前的50.86％提高到了98.75％，将***降解为其它物质的降解率从23.63％提高到了75.21％。该菌株可先将***磷酸钠转化为***，再将***降解为小分子的含碳化合物，可用于制备清除污水中***磷酸钠和***污染的净化剂，预防废水***磷酸钠和***污染对生物和人造成危害。

产碱假单胞菌2014YZB是将从重庆市肿瘤医院的处理前的医疗废水中分离到的***降解菌201209YZB经长期反复驯化筛选获得，该菌株有如下特征：

形态特征：该菌株经革兰染色后在显微镜(油镜)下观察为革兰阴性杆菌，扫描电镜观察可见菌体呈杆状，8μm～15μm×4μm～15μm，有的菌体呈二***相，不规则分散排列。

菌落特征：该菌株在LB固体培养基上生长，形成中等大小、直径1.5～2.0μm，浅黄色、圆形、表面凸起、光滑湿润、边缘整齐、不透明菌落。

生化反应特征：该菌株氧化酶反应、精氨酸双水解、脱硝酸盐作用、明胶水解阳性；能利用精氨酸；其余累积β-羟基丁酸阴性；不能利用葡萄糖、海藻糖、酮葡糖酸盐、烟酸肌醇、香叶醇、缬氨酸、丙氨酸；不分解木糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇。L-脯氨酸芳胺酶、吡咯烷基芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、乳酸盐产碱阳性。

对抗生素敏感性：该菌株对临床常用抗生素均敏感，如对β-内酰胺类抗生素如氨苄西林、头孢唑林等；氨基糖苷类抗生素如庆大霉素、卡那霉素等；四环素类如四环素、妥布霉素等及氧氟沙星、磺胺类抗生素，说明该菌株非耐药菌株。

16SrDNA序列：该菌株扩增的DNA经2％琼脂糖凝胶电泳显示，在约1400bp处可见条带。扩增产物经英杰生物公司测序为1409bp，在NCBI上进行BLAST在线分析，与产硷假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)同源性为99％。确定所获得的细菌与驯化前的细菌(YiW,ZhibangY,等.JBasicMicrobiol.2015，55(2)：262-268)同为产硷假单胞菌(AF390747.1Pseudomonasalcaligenes)。

生长特征：该菌株在接种到***磷酸钠培养液后数小时即进入对数生长期，常规培养近50h达生长高峰，以后进入稳定期，稳定期长达220h。在pH值为6.0、7.0、7.5、8.0的***磷酸钠培养液中均可正常生长，在pH值为7.0的环境中降解作用最强。在30℃、35℃、37℃、40℃不同培养条件下菌株生长正常，但在37℃的环境中降解作用最强。该菌的生长条件适于制备清除环境污染的微生物净化剂。

代谢特征：该菌株在生长繁殖过程中能以***磷酸钠为唯一碳源进行代谢，产生所需能量。对***磷酸钠的降解率从驯化前的50.86％提高到98.75％，将***降解为其它无害小分子物质的降解率从23.63％提高到75.21％，经过处理的污水中的***磷酸钠和***残留量小，可消除污染废水对生物和人造成危害。该菌的降解作用是通过产生分解***磷酸钠及***的胞内酶，将***磷酸钠先转化为***，再将***降解为其它小分子含碳化合物，而失去***的活性。

本发明还公开了一种含产碱假单胞菌2014YZB的微生物净化剂及其配制方法，该微生物净化剂的活性成分为产碱假单胞菌2014YZB，活菌数为4.0-5.0×10⁹cfu/mL，保存剂为20％的红糖水。

该微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：

(1)菌种的复苏取保存的驯化菌琼脂斜面菌种，接种于LB琼脂平板上，37℃培养18小时，再将琼脂平板上生长的菌落接种于***磷酸钠培养液。

(2)增菌培养将在***磷酸钠培养液生长的驯化菌菌液再接种于***磷酸钠培养液，在37℃，200r/min震荡培养5天，反复培养3次。

(3)检测降解作用用常规高效液相色谱法检测驯化菌对***磷酸钠的降解作用，以降解率达在70％以上为质控标准。

(4)配制微生物菌剂采用光电比浊计数法计数菌液中的细菌量，将菌液加入20％红糖水保存剂中，使其活菌数达到4.0-5.0×10⁹cfu/ml。

本发明还公开了微生物净化剂在处理含***磷酸钠废水中的初步应用。

本发明的优点：

1.提供的产碱假单胞菌驯化菌2014YZB在常规培养下能良好生长，具有高效降解***磷酸钠和***的特性，该菌对***磷酸钠的降解率从驯化前(201209YZB)的50.86％提高到98.75％，将***降解为其它物质的降解率从驯化前(201209YZB)的23.63％提高到75.21％，经过处理的污水中的***磷酸钠和***残留量小，能消除污染废水对生物和人造成危害。

2.提供的能降解***磷酸钠和***的产碱假单胞菌2014YZB，可用于制备***磷酸钠和***污染的废水净化剂，具有应用价值。也可进一步用于制备消除***临床副作用的制剂，还具有潜在应用价值。

3.产碱假单胞菌2014YZB能降解污染***磷酸钠和***的医疗废水和城市废水，能有效消除***在环境中蓄积，防止水环境***污染，对生物，特别是对人类健康造成危害。

附图说明：

图1是产碱假单胞菌2014YZB形态图：A是在LB平板上生长的菌落；B是革兰染色形态和染色性(1000×)；C是扫描电镜形态。

图2是产碱假单胞菌2014YZB的PCR扩增产物电泳图。图中第一泳道为DNAMarker；第二泳道为扩增的16SrDNA产物；第三泳道为阴性对照。

图3是产碱假单胞菌2014YZB的16SrDNA区序列***发育树图。

图4是2014YZB菌量与OD_600nm值间关系的标准曲线。

图5是产碱假单胞菌生长图，a表示2014YZB的生长曲线，b表示201209YZB的生长曲线。

图6产碱假单胞菌降解曲线图，a表示2014YZB的降解曲线,b表示201209YZB的降解曲线。

图7是pH对2014YZB降解作用的影响。

图8是温度对2014YZB降解作用的影响。

图9是2014YZB对临床常用抗生素的敏感性分析

图10是标准高效液相色谱图：A***磷酸钠标准高效液相色谱图；B是***标准高效液相色谱图。

图11是检测标准曲线：A是检测***磷酸钠的标准曲线，B是检测***的标准曲线。

图12是201209YZB降解***磷酸钠的高效液相色谱图：A是201209YZB对照培养液高效液相色谱图；B是201209YZB培养液高效液相色谱图。

图13是2014YZBA降解***磷酸钠的高效液相色谱图：A是2014YZB对照培养液高效液相色谱图；B是2014YZB培养液高效液相色谱图。

图14是2014YZB各部位蛋白SDS-PAGE分析电泳图。图中M为蛋白质Marker，第一泳道为驯化菌胞外蛋白液，第二泳道为驯化菌周质蛋白液，第三泳道为驯化菌胞内蛋白液。

图15是2014YZB培养液中代谢产物的气相色谱图。

图16是分析在2014YZB生长的***磷酸钠培养液中***变化的GC-MS色谱图。

图17是2014YZB处理医院废水的高效液相色谱图：A是医院废水对照液的高效液相色谱图；B是医院废水处理后的高效液相色谱图。

图18是2014YZB处理城市废水的高效液相色谱图：A是城市废水对照液的高效液相色谱图；B是处理后的城市废水高效液相色谱图。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例：

实施例1：仪器和试剂及其配制

1.1试剂和仪器

Agilent1100高效液相色谱***，该***配有G1314A型紫外检测器，G1313A型自动进样器及G2070-60069色谱管理软件，为美国Agilent公司生产；色谱柱：AgilentC₁₈柱(5μm，4.6mm×150mm)，系列号SN.USFMAO1068，为美国Agilent公司产品；LC-20A高效液相色谱***，为日本岛津有限公司生产；色谱柱：BostonpHlex-2C18(5μm，4.6mm×150mm),为美国Boston公司产品；福立气相色谱仪GC9790Ⅱ(FID检测器)，购自浙江福立公司；色谱柱：安捷伦DB-ALC1(0.32mm×30m，1.8μm)为美国Agilent公司产品；生物梅里埃细菌鉴定药敏分析仪(InstalledVITEK2SystemsVersion:05.01)为生物梅里埃公司产品；SK-1型快速混匀器为上海沪西分析仪器厂售品；KQ-3200E型超声仪为江苏医疗仪器厂售品；BS210S电子分析天平(精度0.0001g)为德国Sartorious公司生产；LD-50G-D型超纯水处理器为重庆利迪实验仪器设备有限公司售品；一次性细菌过滤器为青岛蓝翼医疗设备公司售品；***磷酸钠、***(HPLC用纯品，批号：09/2013)为sigma公司售品；甲醇(色谱纯)为Merck公司售品；AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒、16SrDNA检测试剂盒为日本TaKaRa公司售品；LB固体培养基为青岛海博生物技术有限公司售品；肠杆菌科和非发酵细菌微量生化反应***为杭州天和微生物试剂有限公司售品；实验中用水为双蒸水，其余所用试剂均为分析纯售品。

1.2主要培养基

无机盐液体培养基，成份：K₂HPO₄·7H₂O1.6g，KH₂PO₄0.4g，MgSO₄·7H₂O0.2g，NaCl0.1g，(NH₄)₂SO₄0.5g，蔗糖3.0g；缺碳液体培养基，成份：K₂HPO₄1.6g，KH₂PO₄0.4g，MgSO₄·7H₂O0.2g，NaCl0.1g，(NH₄)₂SO₄0.5g。上述成分加850mL双蒸水溶解，用1mol/LNaOH调节pH值至7.0，定容至1000mL，121.3℃,103.4KPa高压灭菌30min。LB固体培养基按说明书配制后高压灭菌，冷却至50℃，倾注平板。上述培养基制备后4℃保存备用。***磷酸钠液体培养基为使用前按10％的体积比在缺碳培养基中加入5mg/mL的***磷酸钠液,使培养基中***磷酸钠的终含量为500μg/mL。

实施例2：对产碱假单胞菌201209YZB的驯化,筛选和鉴定

2.1对201209YZB菌株的驯化和筛选

因***不溶于水，溶于乙醇等有机溶剂；前期试验已证实，若用乙醇等有机溶剂溶解***后加入培养液中，则201209YZB难以生长。而201209YZB能先将***磷酸钠降解为***，再降解为其它小分子物质。故观察降解菌对***的降解作用，均采用***磷酸钠培养液。取常规培养后的驯化菌菌液，用比浊法初步测定其菌液浓度后，再用无菌生理盐水稀释为约300CFU/mL，取0.5mL涂布接种于***磷酸钠琼脂平板，置37℃培养2天后，随机挑取平板上生长的单菌落10个，分别接种于***磷酸钠培养液，同时置37℃、200r/min震荡培养和常规培养10天。将驯化前后的细菌用***磷酸钠培养液配成4.2×106CFU/mL浓度的菌液，取1mL加入含9mL新配制的***磷酸钠培养基液中，同时以不加菌液的含10mL新配制的***磷酸钠培养液为对照，同时放200r/min震荡和常规37℃培养5天，以新配制的含280μg/mL***磷酸钠的甲醇溶解液为标准液，用高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)测定培养液和对照培养液中***磷酸钠和***含量。根据培养液、对照液中***磷酸钠及***的浓度计算***磷酸钠及***的降解率(YiW,ZhibangY,等.JBasicMicrobiol.2015，55(2)：262-268)。从中筛选到一株能高效降解***磷酸钠和***的产碱假单胞菌(表1)。该菌株能够以***磷酸钠为唯一碳源和能源，命名为产碱假单胞菌2014YZBPseudomonasalcaligenes2014YZB，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015205，保藏日期是2015年4月7日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，是中国专利局指定的保藏机构，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctccwhu.edu.cn。在本专利公开后，任何人可依法从保藏机构索取本菌种并重现本发明。

表110株驯化菌对***磷酸钠和***的降解作用

2.2对驯化筛选的2014YZB的进一步鉴定

形态和染色性鉴定：观察LB琼脂平板上生长的菌落，革兰染色观察细菌形态和染色性，扫描电镜观察细菌形态。在LB琼脂平板上生长的2014YZB菌落为中等大小(d＝1.5～2.0mm)、浅黄色、圆形、表面凸起、光滑湿润、边缘整齐、不透明，如图1A所示。革兰染色后，在油镜下观察为革兰阴性杆菌，如图1B所示，扫描电镜观察可见菌体呈杆状，8μm～15μm×4μm～15μm，有的菌体呈二***相，不规则分散排列，如图1C所示。

生化反应鉴定：经用微量生化反应***检测，2014YZB菌株的生化反应特征为：氧化酶反应、精氨酸双水解、脱硝酸盐作用、明胶水解阳性；能利用精氨酸；其余累积β-羟基丁酸阴性；不能利用葡萄糖、海藻糖、酮葡糖酸盐、烟酸肌醇、香叶醇、缬氨酸、丙氨酸；不分解木糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇。L-脯氨酸芳胺酶、吡咯烷基芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、乳酸盐产碱阳性。此结果符合Bergey细菌鉴定手册中Pseudomonasalcaligenes的生化反应特性(Holt，等.Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology(9thEdition),Baltimore,Maryland21202,USA,1994.P93,154,168)。

16SrDNA鉴定：取在***磷酸钠培养液生长的菌液，按照细菌基因组DNA小量制备试剂盒说明书提取DNA。以提取的细菌DNA为模板，根据16SrDNA基因序列PCR扩增试剂盒说明书扩增DNA。

引物Eubac27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；

Eubac1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。

反应体系为：10×ExTaqbuffer2.0μL，25mMMgCl₂1.6μL，2.5mMdNTPMix1.6μL，5pPrimerI1μL，5pPrimerⅡ1μL，Template0.5μL，5uExTaq0.2μL，ddH₂O12.1μL，总体积20μL。反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环后再72℃延伸10min。反应结束后，取5μL扩增产物送英杰生物公司测序鉴定。

该菌株扩增的16SrDNA经2％琼脂糖凝胶电泳显示，在约1400bp处可见条带，如图2所示。扩增产物经英杰生物公司测序为1409bp，在NCBI上进行BLAST在线分析，与产硷假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)同源性为99％。采用Kimura2-parameter法建立***进化树分析，如图3所示，最相近的细菌是产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)，由此确认2014YZB为201209YZB经长期驯化而产生。

实例3：2014YZB的生长特征

3.1制作2014YZB细菌量与OD_600nm值间关系的标准曲线

采用光电比浊计数法计数细菌量，先制作2014YZB细菌量与OD_600nm值之间关系的标准曲线。取LB平板上培养18h的菌落，用***磷酸钠液体培养基稀释为不同浓度，用倾注平板法计数活菌数，同时以***磷酸钠培养液为空白对照，测定不同浓度菌液的OD_600nm值。测定结果在spss软件上对细菌菌量与OD值的关系进行回归分析，最后以每毫升细菌数(cfu/mL)的对数为纵坐标，OD_600nm值为横坐标绘制标准曲线，如图4所示。

3.2制作2014YZB的生长曲线和降解曲线

取***磷酸钠培养液生长的2014YZB菌液，配制为含菌量4.2×10⁶cfu/ml的菌液。取1mL菌液加入含9mL新配制的***磷酸钠培养液中，37℃、200r/min震荡培养12天，在培养的不同时间点取菌液测定OD_600nm值，以从标准曲线测出的细菌数乘以稀释倍数计算菌液的活菌数(cfu/mL)；再以细菌量的对数为纵坐标，时间为横坐标，汇制生长曲线，如图5中A所示。同时，在培养的不同时间点取菌液采用常规高效液相色谱法测定***磷酸钠和***的含量，与对照培养液比较，计算其降解率。在不同时间段对***磷酸钠的降解率为后一时间点所测的降解率减前一时间点所测的降解率。再以降解率为纵坐标，时间为横坐标，汇制降解曲线，如图6中A所示)。

从生长曲线可见2014YZB在接种到培养液后数小时即进入对数生长期，在近50h达生长高峰，以后进入稳定期，稳定期长达220h，与201209YZB菌株(图5中B)基本一致。从驯化菌的降解曲线可见，驯化菌在数小时后即出现降解作用，在接种后48h，出现降解高峰，比降解菌在96h才出现降解高峰(图6中B)提前了约48h。

3.32014YZB菌株的生长条件

分别配制pH值为6.0、7.0、7.5、8.0的缺碳培养液，在使用前按10％的体积比在培养液中加入5mg/mL的***磷酸钠液，使其成为不同pH值的***磷酸钠培养液。将在***磷酸钠培养液中生长的2014YZB菌液配制为含菌量4.2×10⁶cfu/ml的菌液，取1mL加入含9mL不同pH值的***磷酸钠培养液中，在培养300h内的不同时间点取菌液检测***磷酸钠浓度。配制pH值7.0的***磷酸钠培养液，按前述方法接种2014YZB，分别置30℃、35℃、37℃、40℃条件下，以200r/min震荡培养，在培养300h内的不同时间点测定培养液中的***磷酸钠浓度。计算降解率，以降解率为纵坐标，时间为横坐标，汇制降解曲线。结果表明2014YZB在pH值为6.0、7.0、7.5、8.0的***磷酸钠培养液中均可正常生长，在pH值为7.0的环境中降解作用最强如图7。在30℃、35℃、37℃、40℃不同培养条件下均可正常生长，但在37℃的环境中降解作用最强如图8。该菌的生长特征与201209YZB相同，适宜在外界环境中生长。

3.4测定2014YZB对抗生素的敏感性

将2014YZB接种LB琼脂平板37℃培养18h，用生理盐水洗下，配成含菌量106CFU/mL菌液。用生物梅里埃细菌鉴定药敏分析仪检测对临床常用抗生素的敏感性，结果见图9。

结果表明，2014YZB对临床常用抗生素绝大多数敏感，如对氨苄西林、头孢唑林等的β-内酰胺类抗生素；对庆大霉素、卡那霉素等的氨基糖苷类抗生素；对四环素、妥布霉素等的四环素类及氧氟沙星、磺胺类抗生素均敏感，仅对氨曲南和呋喃妥因耐药，说明该菌非耐药菌株，在应用中不会引起耐药性传递。

实施例4：2014YZB降解***磷酸钠和***的检测

3.1常规高效液相色谱法检测2014YZB对***磷酸钠和***的降解率

3.1.1常规高效液相色谱法测定方法

采用常规高效液相色谱法测定***磷酸钠和***的含量，判定细菌的降解作用(石中全，杨致邦等，中国微生态学杂志2014,26(11):1250-1256)。色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论塔板数按***磷酸钠峰计算不低于3000，按***峰计算不低于4000。色谱条件：流动相：三乙胺溶液：甲醇：乙腈＝55：40：5，检测波长：242nm；柱温：室温(28-30℃)。取三乙胺7.5mL，加水至1000mL，用磷酸调节pH值至3.0±0.05的三乙胺溶液。分别精密称取***磷酸钠和***标准品25mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释，摇匀，作为储备液，取储备液适量用流动相定量稀释成一系列工作溶液，即为标准稀释液。取不同浓度的标准稀释液20μL，注入高效液相色谱仪，用紫外吸收检测器于波长242nm处测定***磷酸钠和***峰，以峰面积制备标准曲线。

***磷酸钠和***标准液经HPLC测定，其色谱图见图10中A、B所示。以峰面积y为纵坐标，浓度x为横坐标，绘制***磷酸钠和***标准曲线，如图11中A、B，线性回归后获得***回归方程为y＝47.28x-539893，r＝0.999(n＝5)；***磷酸钠回归方程为y＝29.50x-187685，r＝0.9999(n＝5)，如所示。***磷酸钠和***在10～500μg/mL浓度范围内呈良好线性关系。***磷酸钠最低检测浓度为100ng/mL，***最低检测浓度为125ng/mL，平均回收率***磷酸钠为99.30％,***为99.60％。

将待测液用0.45um微孔滤膜过滤，分别精密吸取20μL，注入高效液相色谱仪，同法测定***磷酸钠和***的峰面积，计算其含量。以含500μg/mL***磷酸钠的培养液为对照液，根据对照培养液、待测菌培养液中***磷酸钠及***的浓度计算***磷酸钠及***的自然降解率和待测菌对***磷酸钠和***的降解率。

3.1.2降解率评价方法

以标准液色谱峰面积为标准，如图10中A、和B所示，根据色谱峰面积计算试验液和对照液的***磷酸钠和***含量，再根据降解率计算公式计算细菌的降解率。计算公式如下：

***磷酸钠降解率(％)＝(对照培养液***磷酸钠含量-培养液***磷酸钠含量)÷对照培养液***磷酸钠含量×100％；

***降解率(％)＝[(对照培养液***磷酸钠含量-培养液***磷酸钠含量)×(***分子量/***磷酸钠分子量)-培养液***含量]÷[(对照培养液***磷酸钠含量-培养液***磷酸钠含量)×***分子量/***磷酸钠分子量]×100％

3.2菌株2014YZB与201209YZB的降解特性比较

将2014YZB与201209YZB同时放200r/min震荡和常规孵箱37℃培养10天后，高效液相色谱法(LC-20A高效液相色谱***)检测对***磷酸钠和***的降解率。在震荡培养中，201209YZB对***磷酸钠的降解率为50.86％。其中，75.23％的***磷酸钠被降解为***，23.63％的***磷酸钠被进一步降解为其它物质(表2)。2014YZB对***磷酸钠的降解率为98.75％，其中，24.79％的***磷酸钠被转化为***，74.99％的***磷酸钠被进一步降解为其它物质，如表3。2014YZB将驯化前的201209YZB对***磷酸钠的降解率从50.86％^[提高到98.75％，将***降解为其它物质的降解率从201209YZB的23.63％提高到75.21％。201209YZB对照培养液高效液相色谱图见图12中A所示；201209YZB培养液高效液相色谱图见图12中B所示；2014YZB对照培养液高效液相色谱图见图13中A所示；2014YZB培养液高效液相色谱图见图13中B所示。

表2201209YZB***磷酸钠和***的降解作用

表32014YZB***磷酸钠和***的降解作用

经用spss软件对其结果用配对t检验统计学分析，2014YZB与201209YZB对***磷酸钠与***的降解率有显著的统计学差异，其p＝0.01，p＜0.05。而且，2014YZB在常规培养中对***磷酸钠与***也有显著的降解作用如表4。因此，2014YZB菌株在应用上有显著的优势。

表42014YZB与201209YZB对***磷酸钠和***的降解特性比较

实施例4：2014YZB产生胞内酶降解***

4.1确定2014YZB的酶活性定域

先确定2014YZB产生降解作用的部位。采用渗透休克法(QuanSL,等.MethodsMolBiol.2013；966:359-66).分离培养液中生长的2014YZB各部位蛋白质：将2014YZB接种到LB琼脂平板上，37℃培养18h，再从平板上挑取单个菌落，接种于***磷酸钠培养液中，37℃培养50h，使其达到降解***磷酸钠的最佳生长期。取菌液于4℃，6000r/min离心10min，取上清液(A1)冻存。将其沉淀液(B1)用0.05mol/LpH8.0的Tris-Hcl缓冲液5ml重悬，4℃，6000r/min离心10min，用前述缓冲液洗涤2次，再取上清液(A2)冻存。其沉淀液(B2)再用20％蔗糖重悬，于37℃震荡10min，4℃，15000r/min离心10min,，取上清液(A3)冻存，其沉淀液(B3)用于提取周质蛋白。将冻存的上清液A1、A2、A3混合，即含该菌的胞外蛋白质。将沉淀液B3用冷冻双蒸水重悬，在冰浴上震荡10min后，4℃，15000r/min离心10min，取上清液(A4)即含该菌的周质蛋白，其沉淀液(B4)为该菌的胞内部分。将沉淀液B4用0.01mol/mLpH7.5的Tris-Hcl重悬，在冰浴中用超声碎菌仪破碎，破碎条件为：碎菌时间4s，间隔10s，重复10次，功率200w。碎菌液4℃，15000r/min离心20min，取上清液(A5)即含该菌的胞内蛋白质，弃去沉淀。将分离的各部位蛋白液用SDS-PAGE电泳进行分析，电泳条件：分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％，缓冲液为Tris-甘氨酸。先用70V电压电泳30min，待样品进入浓缩胶后再用100V电压电泳。电泳后用考马斯亮蓝染色，脱色后用凝胶图像分析仪分析。用BCA试剂盒测定各部位分离液的蛋白浓度。

以比活力评价分离的2014YZB各部位蛋白液的酶活性。因***的甲醇溶解液并不影响酶的活性，故先将***用甲醇溶解，再用pH7.5的Tris-Hcl缓冲液配制含500μg/mL的***液，分别取分离的各部位蛋白液400μl加入400μl含500μg/mL的***液中，37℃作用24h，最后水浴加热100℃终止反应。以加双蒸水为空白对照，用高效液相色谱法检测对照液和蛋白液中***含量。计算酶活性单位，即一个酶活性单位(U)为在pH7.5，37℃条件下，1min内降解***的微克量。计算比活力(U/mg)，即每毫克蛋白所含的酶活性单位。

用渗透休克法从***磷酸钠培养液生长的2014YZB分离到的蛋白液经SDS-PAGE电泳分析显示在细胞内、外液与周质蛋白液中均有大量不同分子量的蛋白带，在胞内与周质蛋白液中还有一条较明显的分子量大约为41kDa的蛋白带，但在胞外蛋白中却没有此蛋白带，如图14所示。对各部位蛋白的***降解酶活性检测结果显示，胞内蛋白液的酶活性最高，周质蛋白液酶活性较低，胞外蛋白液中未测出酶活性，此结果说明2014YZB的酶活性主要存在于胞内蛋白中，如表5。

表52014YZB各部位蛋白的酶活性

实施例5：2014YZB可将***磷酸钠降解为小分子含碳化合物

5.1气相色谱检测菌液中的代谢产物

取在***磷酸钠培养液中生长1-5天的2014YZB菌液，以不加2014YZB的菌液为对照，离心过滤后取上清液，从第二天开始，用气相色谱(FID检测器)检测菌液中的代谢产物。气相色谱条件：

气化室温度：280℃；检测器温度：280℃；程序升温：50℃保持5min，以30℃/min速率升温到260℃，260℃保持2min；分流比为16.5；柱前压64kpa；尾吹28.7kpa；进样量1μl。其气相色谱图见图15。气相色谱(FID检测器)可检测易气化的碳氢化合物，故可以检出小分子碳氢化合物。经图谱比较，第五天的样品中甲醇峰(1.599min)明显增高，说明降解产物中有大量甲醇，甲醇可能进一步降解为小分子碳氢化合物。

5.2气相色谱和质谱联用检测菌液中的代谢产物

为评价2014YZB在清除水环境***污染中的应用价值，取在***磷酸钠培养液中生长1-5天的2014YZB菌液，以不加2014YZB的菌液为对照，离心过滤后取上清液，从第二天开始，用气相色谱和质谱联用技术(GC-MS)[HPLC配置DAD(二极管阵列检测器)，扫描波长190-500nm]分析2014YZB生长的***磷酸钠培养液中***的变化，以***液为标准液，图谱分析发现在2014YZB生长的第一天，***磷酸钠降解为***后就基本转化成有共轭体系的较大分子，第二天开始该较大分子就可能降解为其它小分子的碳氢化合物，如图16所示。结果表明2014YZB可将***磷酸钠降解为***再降解为小分子的碳氢化合物，能有效清除水环境***磷酸钠和***污染。

实施例6：产碱假单胞菌2014YZB微生物菌剂的制备

6.1菌种的复苏

取保存于琼脂斜面的产碱假单胞菌2014YZB菌种，接种于LB琼脂平板上，37℃培养18h。再将琼脂平板上生长的菌落接种于***磷酸钠培养液,37℃，200r/min震荡培养50h。

6.2增菌培养

将菌种复苏后的菌液，用***磷酸钠培养液配成4.2×10⁶cfu/ml浓度，取1mL加入含9mL新配制的***磷酸钠培养基液中，37℃、200r/min震荡培养5天后，再从该管中取出1mL菌液加入新配制的9mL***磷酸钠培养液，同法培养5天。按上述方法反复循环培养3次后，将培养的菌液转种LB平板，置37℃培养2天后，取平板上生长的菌落，再用新配制的***磷酸钠培养液配成4.2×10⁶cfu/ml浓度的菌液，取1mL加入含9mL新配制的***磷酸钠培养基液中，同时以不加菌液的含10mL新配制的***磷酸钠培养液为对照培养液，同法培养5天。

6.3检测细菌对***磷酸钠和***的降解作用

以新配制的含500μg/ml***磷酸钠的甲醇溶解液为标准液，按实施例中(3.1.1)的高效液相色谱法测定对照培养液、培养液中***磷酸钠含量。计算细菌对***磷酸钠及***的降解作用，以对***磷酸钠的降解率达到70％为质控标准。

6.4配制微生物菌剂

将达到质控标准的菌液转种LB平板，置37℃培养2天后，取平板上生长的菌落，按实施例(2.3.1)中的光电比浊法计数菌液中的细菌量，配制成4.0-5.0×10¹⁰cfu/ml的菌液，以1：10的比例加入20％红糖水保存剂中，按100ml/瓶用灭菌瓶分装，使其活菌数达到4.0-5.0×10⁹cfu/ml，4℃冰箱保存。

实施例7：微生物菌剂对含***磷酸钠的医疗废水的处理

取本单位附属医院处理前的废水，先用滤纸过滤杂质，再按实施例中的高效液相色谱法测定废水中的***磷酸钠和/或***。取无***磷酸钠和/或***污染的废水10升，加入4g***磷酸钠,摇匀，使***磷酸钠充分溶解。从冰箱中取出微生物菌剂，摇匀，置37℃孵箱预温10min。取1ml加入废水中，35℃孵箱保存5天，同时以未加微生物菌剂的废水为对照，按实施例3.1.1中的高效液相色谱法测定和计算对照废水液和试验废水液中***磷酸钠和***含量。结果表明，99.89％的***磷酸钠被降解,并将降解为***中的65.44％分解为其它物质。对照废水液高效液相色谱图见图17中A所示，试验废水液高效液相色谱图见图17中B所示。

实施例8：微生物菌剂对含***磷酸钠的城市废水的处理

采取本市某污水处理厂处理前的废水，先用滤纸过滤杂质，再按例3.11中的高效液相色谱法测定废水中的***磷酸钠和/或***，取无***磷酸钠和/或***污染的废水10升，加入4g***磷酸钠,摇匀，使***磷酸钠充分溶解。从冰箱中取出微生物菌剂，摇匀，置37℃孵箱预温10min。取1ml加入废水中，35℃孵箱保存5天，同时以未加微生物菌剂的废水为对照，用高效液相色谱法测定和计算对照废水和试验废水中***磷酸钠和***含量。结果表明，99.94％的***磷酸钠降解,并将降解为***中的65.48％分解为其它物质。废水对照液的高效液相色谱图见图18中A所示，试验废水液的高效液相色谱图见图18中B所示。

Claims (7)

1.一株高效降解***的产碱假单胞菌，其特征在于,该菌株能够以***磷酸钠为唯一碳源和能源,为产碱假单胞菌2014YZBPseudomonasalcaligenes2014YZB,该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015205。

2.一种含权利要求1中所述的产碱假单胞菌2014YZB，该菌株能够高效降解水环境中的***磷酸钠和***，并将***磷酸钠和***降解为无害的小分子碳水化合物。

3.一种含权利要求1中所述的产碱假单胞菌2014YZB的微生物净化剂，其特征在于其活性成分为产碱假单胞菌2014YZB活菌，该菌在代谢过程中能产生胞内酶，高效降解***磷酸钠和***。

4.根据权利要求3中所述的一种微生物菌剂，该微生物菌剂的活性成分为产碱假单胞菌2014YZB，活菌数为4.0-5.0×10⁹cfu/ml，保存剂为20％的红糖水。

5.权利要求1中所述的产碱假单胞菌2014YZB的微生物净化剂的制备方法，该方法包括菌种的复苏、增菌培养、菌液的制备和微生物菌剂的制备。

6.根据权利要求5中所述的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)菌种的复苏：取保存的琼脂斜面菌种，接种于LB琼脂平板上，37℃培养18小时，再取琼脂平板上生长的菌落接种于***磷酸钠培养液；

(2)增菌培养：将在***磷酸钠培养液生长的2014YZB菌液接种于***磷酸钠培养液，在37℃，200r/min震荡培养5天，反复培养3次；

(3)检测降解作用：用高效液相色谱法检测2014YZB对***磷酸钠的降解作用，以降解率在70％以上为质控标准；

(4)配制微生物净化剂：采用光电比浊计数法测定菌液中的细菌量，将菌液加入20％红糖水保存剂中，使其活菌数达到(4.0-5.0)×10⁹cfu/ml。

7.权利要求1中所述的高效降解***的产碱假单胞菌在废水处理中的应用。