CN103074239B - 山梨木糖假丝酵母及其在制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种山梨木糖假丝酵母及在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M 2012420，保藏日期2012年10月22日；本发明提供了一种山梨木糖假丝酵母ZJB-12164新菌株及这种山梨木糖假丝酵母ZJB-12164菌株在生物转化合成(S)-CHBE中的应用，该合成反应条件温和，环境友好，流程简单，转化率高，产物光学纯度高（e.e.＞99%）。

Description

山梨木糖假丝酵母及其在制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用

（一）技术领域

本发明涉及一种新的菌株——山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（Candidasorboxylosa ZJB-12164），及其在生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

（二）背景技术

(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate, (S)-CHBE) 是一种无色透明油状液体，分子式为C₆H₁₁ClO₃，分子量166.6，相对密度1.19g/mL，沸点93-95℃/5mmHg，(S)-CHBE结构如式（Ⅰ）所示。(S)-CHBE作为重要的手性药物中间体，可用于合成他汀类药物—羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂，其制剂立普妥（阿托伐他汀钙）是美国第一个年销量超过一百亿美元的药物，目前也是全球最高销量的药物。另外，(S)-CHBE还可以转化生成1，4-二氢吡啶类β-阻滞剂。因此，制备光学活性(S)-CHBE备受研究者的关注。

(S)-CHBE的制备方法可以分为外消旋体拆分法和不对称催化合成法。由于外消旋体拆分的方法制备效率不高，理论收率仅为50％，且产物的分离纯化困难，因此，对于外消旋体的手性拆分制备(S)- CHBE意义不大。与拆分法相比较而言，采用不对称合成(S)-CHBE受到了更多的关注。以潜手性底物4-氯乙酰乙酸乙酯（Ethyl 4-chloroacetoacetate, COBE）为原料，在一定条件下使其反应生成(S)-CHBE过量，甚至全部为单一的对映体，从而避免和减少拆分过程。由于底物COBE价格便宜，很容易合成，因此不对称合成法是最经济有效的合成(S)-CHBE方法。

以COBE为原料不对称合成制备(S)-CHBE，可分为化学催化法和生物催化法两类。化学催化法是采用手性的钌化合物（例如RuX₂[(S)-BINAP]）作为催化剂不对称加氢还原，产物的e.e.值可达97%以上，但这种方法需要高压加氢，对反应器要求较高，而且所用催化剂价格昂贵，因此生产成本较高；而采用的生物催化剂既可以是提纯的酶，也可以是微生物细胞。由于生物还原需要价格昂贵的辅酶参与，因此，通常采用具备辅酶再生***的微生物全细胞作为催化剂。微生物法羰基不对称还原制备(S)-CHBE具有反应条件温和，产物单一，立体选择性高等优点，代表着绿色化学的发展方向。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种新菌株—山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（Candida sorboxylosa ZJB-12164），及其在羰基不对称还原制备(S)-CHBE中的应用，该菌株稳定性好，立体选择性严格，产物光学纯度高。

本发明采用的技术方案是：

本发明涉及一种山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（Candida sorboxylosa ZJB-12164），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M 2012420，保藏日期2012年10月22日。

本发明所述的山梨木糖假丝酵母ZJB-12164是通过以下程序筛选得到的：

(1) 将来自于浙江、四川、云南和江苏等地200余份土壤样品加入到生理盐水中，制成土壤悬液并接种于富集培养基中，在30℃，150r/min的摇床上培养直至培养液变浑浊后，按2%（v/v）接种量转接到新的富集培养基中继续培养，培养条件同上。富集培养基配方为：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，COBE 12g/L，溶剂为水，自然pH。

(2) 第二次富集培养液经稀释后涂布到平板培养基上，30℃培养箱恒温培养48小时，挑取单菌落转接至斜面培养后保藏，斜面培养条件为30℃培养箱恒温培养48小时。平板培养基及斜面培养基配方为：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，自然pH。

(3) 从斜面转接至摇瓶菌体培养基中，30℃培养24小时，收集菌体，用0.85%生理盐水洗涤2次，离心收集菌体，所得菌体与底物COBE 100μL分散于10mL磷酸钾缓冲液中（0.1mol/L，pH 7.0），加入0.2g的葡萄糖作为共底物，在30℃，150r/min水浴下反应24小时，反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液通过乙酸乙酯萃取、无水Na₂SO₄脱水、过滤，采用气相色谱检测分析，能将底物COBE转化生成 (S)-CHBE的菌株为目的菌株，最终从中选择出一株立体选择性最高的菌株（编号为ZJB-12164，即CCTCC No：M 2012420）做后续的菌种鉴定及转化。所述菌体培养基配方为：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，溶剂为水， pH 7.0。

本发明所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164菌株的鉴定：

(1) 菌株形态特征和生理生化特征：

形态特征：于30℃在豆芽汁琼脂培养基平板培养24小时，菌落呈卵圆形，光滑湿润，边缘整齐，有酒香味，乳白色，大小约为2~5×4~10μm。

生理生化特性：利用Biolog（GEN III）自动微生物鉴定***测定菌株ZJB-12164对65种碳源的代谢情况，经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株ZJB-12164可较强利用4种碳源，对其他61种碳源利用能力较弱或不能利用，详见表1所示。

(2) 菌株18S rDNA序列测定和分析：

以提取到的菌株细胞总DNA为模板，利用设计的引物扩增菌株的18SrDNA并测序，该片段实际长度为1470bp，与GenBank相关数据进行相似性分析发现，该菌与Candida sorboxylosa（AB054672.1）同源性最高（homology, 99%/1470bps, based on 18S rDNA），因此根据分子生物学鉴定结合生理生化鉴定，可确定该菌株为Candida sorboxylosa，命名为山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（Candida sorboxylosa ZJB-12164）。序列如SEQ ID NO.1所示：

1 cctgcatgtc caagttagaa actgcgaatg gctcattaga tcagttatca tctccttgac

61 tcattacatg gataaccgtg gaaaatccag agctaataca cgccgtgcac atattaggtt

121 ccgactctga gtatttagcg aaccgtacgc tgggtcattc gagcatctgc cctatcaact

181 agacggtagg atctttgcct acggtggtgg tgacgggtaa cggggaataa gggttcggtt

241 ccggagaggg agcctgagag acggctacca catccaagga aggcagcagg cgcgcaaatt

301 gcacactggg aacgccccga tgcactagca ggcgtaccga tgcgtttacg caatcggata

361 aacacgcgta caggcccgaa tgtagcagtg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt

421 aactccagct ccactagcgt atgttaaagt tgtagcagtt aaaacgctcg tagcgggggg

481 agcgcttata gctattactt tgagaaaatt agagtgttca aagcaggcct tgtgctcgga

541 tacgttagca tggaataatg gaacacgacg gcgtccatgg acgttgtaat gaccaagagg

601 ggcggaagag gcggtgcgta ttgggcggct aggggtgaaa tccgacgacc cgcccacgac

661 gagcgagtgc gaaggcacgc tgcagagacg tgcccgttcg tcaagaacga aagctaggga

721 atcgaaaatg atcagatacc attgtagtct tagccgtaaa cgatgtggag acacggggtg

781 cgattgtgct tcgtgggggg aaacttagtt cgttctgggg ggagtatgct cacaagggtg

841 aaacttaaag aaattggcgg aagactacct taagcaatgg gactgcggct taatttgact

901 caacacgggg aaactcacca ggtccagacg taataaggat tgaccagctg gagacttttc

961 ttgatcttac gggtggtggt gcatggccgt ttttcagtcc ttggagtgat ttgtctgctt

1021 aattgcgata acggacgaga ccttggcctc taactaggag agcgtatttg tacgcggact

1081 gcttagaggg acgacagacg ctaagtttgt ggaggcgcga ggcaacaaca ggtctgtgat

1141 gcccttagac gttctgggcc gcacgcgcgc tacactgacg gggggagcga gggccgggct

1201 gagaagccag ggcaatcagg aaaccgcgtc gtgctgggaa tagcggattg gaattgtttc

1261 ccttgaacgt ggaattgctt gtaagcgcag gtcatcagcc tgcgttgaat acgacccttg

1321 tctttgtaca caccgcccgt tgctactacc gattgaatgg cttagtgaga ggtcgggagg

1381 ccggcggagg gaactccgcg gggcgaactt gttctaactt ggctatttag agctcgtaaa

1441 agtcgtaaca aggtttccgt aggtgaacct

本发明还涉及所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，所述的应用为：以山梨木糖假丝酵母ZJB-12164发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，于pH4.0~9.0水或缓冲溶液构成的转化体系a中，在20~ 45℃下进行转化反应，反应完全后，将转化液后处理，获得所述(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

所述山梨木糖假丝酵母 ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用的化学反应式为：

进一步，所述转化体系a中底物初始浓度为10~2000mmol/L，优选50~1500 mmol/L。

进一步，转化体系a中含酶湿菌体添加量以湿菌体质量计为10~200g/L，优选50~100 g/L，所述含酶湿菌体含水质量为70~90%。

进一步，实现辅酶的再生循环，所述转化体系a中还包括辅助底物，由辅助底物、底物、催化剂与pH4.0~9.0的水或缓冲液构成转化体系b，所述辅助底物为下列之一：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或甘油，优选葡萄糖或果糖。

更进一步，所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用为：以山梨木糖假丝酵母ZJB-12164发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，加入辅助底物，于pH4.0~9.0水或缓冲溶液构成的转化体系b中，在20~ 45℃下进行转化反应，反应完全后，将转化液后处理，获得所述(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；所述转化体系b中底物初始浓度为10~2000mmol/L（优选50~1500 mmol/L），含酶湿菌体添加量以湿菌体质量计为10~200g/L（优选50~100g/L），所述含酶湿菌含水量为70~90%，辅助底物初始浓度为10~2000mmol/L，所述辅助底物为下列之一：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或甘油，优选为葡萄糖或果糖。

进一步，所述转化反应是在20~45℃下反应0.1~36h，优选30~35℃反应1~12h。

进一步，所述转化液后处理的方法为：反应结束后，将转化液离心，去除菌体细胞，取上清液用等体积乙酸乙酯萃取，取有机层用无水Na₂SO₄脱水、过滤，滤液即为含(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的粗品，将粗品分离纯化，即得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。所述粗品分离纯化采用本领域公知的技术进行，通常为旋转蒸发和减压蒸馏等。

进一步，所述转化体系a或转化体系b均是由蒸馏水、自来水、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液形成的pH4.0~9.0单相体系，或者水与有机介质形成的pH4.0~9.0双相体系；所述有机介质为正己烷、正辛烷、异辛烷、正庚烷、二甲苯、环己烷、乙酸乙酯或乙酸丁酯，优选为乙酸丁酯。

进一步，所述含酶湿菌体按如下方法制备：

(1) 斜面培养：将山梨木糖假丝酵母 ZJB-12164菌株接种于斜面培养基，于20~37℃下培养12~48小时，获得斜面活化菌种；所述斜面培养基为豆芽汁琼脂培养基，配置方法为：50~200g新鲜黄豆芽放入烧杯中，加入适量水，煮沸半个小时，纱布过滤得上清，再加入10~50g葡萄糖，15~20g琼脂，补加水至1L；

(2) 种子培养：将斜面活化菌种接种于种子培养基，在25~35℃、摇床转数100~200r/min条件下培养12~36小时得到种子液；所述种子培养基配方为：葡萄糖5~50g/L，酵母膏5~40g/L，KH₂PO₄ 0.5~5g/L，NaCl0.5~5g/L，溶剂为水，初始pH为5.0~8.0；

(3) 发酵培养：将种子液按照体积比1~5%接入发酵培养基，在25~35℃、摇床转数100~200r/min条件下培养12~48小时，将培养液离心、洗涤，收集含酶湿菌体，冷藏备用；所述发酵培养基配方为：葡萄糖5~50g/L，酵母提取粉5~100g/L，KH₂PO₄ 0.5~5g/L，NaCl 0.5~5g/L，CuCl₂ 0.01~0.1g/L，溶剂为水，初始pH为5.0~8.0。

本发明中产物(S)-CHBE摩尔转化率和光学纯度（对映体过量值（e.e.%））采用气相色谱测定，方法如下：

反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na₂SO₄脱水、过滤后用岛津GC-14气相色谱仪分析。非手性 GC分析条件：HP-5弱极性色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)，柱温120℃，保留2.5min，以50℃/min程序升温至165℃，保持1.2min。载气为氮气，流量1.0mL/min，进样量1μL，分流比50：1，检测器温度为250℃，进样口温度为230℃；非手性色谱柱可以检测底物COBE和产物CHBE的含量，进一步计算反应的摩尔转化率。手性 GC分析条件： BGB-174手性毛细管气相色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，柱温110℃，以0.5℃/min程序升温至125℃，载气为氦气，流量为1.0mL/min，进样量1μL，分流比40：1，检测及进样口温度均为220℃；手性色谱柱可以检测(S)-CHBE和(R)-CHBE的含量，进一步计算产物的光学纯度（对映体过量值，e.e.%）。

本发明所述转化体系a和转化体系b均为转化体系，为便于区分不同步骤中转化体系构成元素不同而命名，字母本身没有含义。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种Candida sorboxylosa ZJB-12164新菌株及这种Candida sorboxylosa ZJB-12164菌株在生物转化合成(S)-CHBE中的应用，该合成反应条件温和，环境友好，流程简单，转化率高，产物光学纯度高（e.e.＞99%）。

（四）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：微生物的筛选、鉴定

(1) 微生物的筛选

菌种富集培养基配方：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，COBE 12g/L，溶剂为水，自然pH。

平板培养基和斜面培养基配方均为：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，自然pH。

发酵产酶培养基配方：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，溶剂为水，pH7.0。

从来自浙江、四川、云南和江苏等地的菜园、果园植物丛采集土样，共200余份用以菌种筛选。具体过程如下：

取少许土样加入到生理盐水中，制成土壤悬液，于菌种富集培养基中150r/min，30℃的摇床上经过两次富集培养，经过稀释涂布，选取单菌落转接至试管斜面并编号于30℃生化培养箱中培养培养48小时。再从斜面转接至摇瓶发酵产酶培养基中，30℃培养24小时，收集菌体，用0.85%生理盐水洗涤2次，离心收集菌体，所得菌体与底物COBE 100μL分散于10mL磷酸钾缓冲液中（0.1mol/L，pH 7.0），加入0.2g的葡萄糖作为共底物，在30℃，150r/min水浴下反应24小时，反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液通过乙酸乙酯萃取、无水Na₂SO₄脱水、过滤，采用气相色谱检测分析，能将底物COBE转化生成 (S)-CHBE的菌株为目的菌株，最终从中选择出一株立体选择性最高的菌株（编号为ZJB-12164，即CCTCC No：M 2012420）做后续的菌种鉴定及转化。

(2) 微生物菌株编号为“ZJB-12164”菌株的生理生化鉴定

菌株形态特征：于30℃在豆芽汁琼脂培养基平板培养24小时，菌落呈卵圆形，光滑湿润，边缘整齐，有酒香味，乳白色，大小约为2~5×4~10μm。

生理生化特性：利用Biolog自动微生物鉴定***考察菌株ZJB-12164对65种不同碳源的代谢情况：将菌株接种于平板培养基，28℃恒温培养2天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液（无菌水）混合，制成菌悬液，用浊度计调整至47%T。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在Biolog YT微孔鉴定板的各孔中，每孔100μL。将微孔鉴定板放在28℃培养箱中，分别在培养24h、48h和72h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株可较强利用4种碳源，对其他61种碳源不能利用或利用能力较弱，详见表1所示。

表1 菌株ZJB-12164对Biolog GEN III板上65种碳源的利用能力

注: +，阳性； −，阴性； B，边界线

(3) 18S rDNA全序列测定与分析

以提取到的菌株细胞总DNA为模板，利用设计的引物扩增该菌株的18SrDNA并测序，实际长度为1470bp，与GenBank相关数据进行相似性分析发现，该菌与Candida sorboxylosa（AB054672.1）同源性最高（homology, 99%/1470bps, based on 18S rDNA），因此根据分子生物学鉴定结合生理生化鉴定，可确定该菌株为Candida sorboxylosa。

经过上述鉴定，将本发明“ZJB-12164”菌株命名为山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（ Candida sorboxylosa ZJB-12164）。

实施例2 Candida sorboxylosa ZJB-12164的发酵培养

(1) 斜面培养：将Candida sorboxylosa ZJB-12164接种于斜面培养基，于30℃下培养24小时，获得斜面菌体。斜面培养基为豆芽汁琼脂培养基（新鲜黄豆芽100g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L），自然pH。

(2) 种子培养：用接种环从斜面菌体挑取一环菌体接种于种子培养基，30℃，150r/min条件下培养24小时，获得种子液。种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母膏20g/L，KH₂PO₄ 2.5g/L，NaCl 1g/L，溶剂为水，初始pH为6.0。

(3) 发酵培养：将培养好的种子液按照2%的体积比接种到发酵培养基中，在28℃、摇床转数150r/min条件下培养24小时，获得含菌细胞发酵液。将获得的含菌细胞发酵液离心，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤两次后，离心收集沉淀，获得湿菌体，湿菌体的产量为58g/L，含水量80%。发酵培养基的配方为：葡萄糖10g/L，酵母提取粉20g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NaCl 1g/L，CuCl₂ 0.05g/L，溶剂为水，初始pH为6.0。

实施例3 Candida sorboxylosa ZJB-12164的发酵培养

(1) 斜面培养：同实施例2。

(2) 种子培养：同实施例2。

(3) 发酵培养：将培养好的种子液按照2%的体积比接种到菌体培养基中，在30℃、摇床转数150r/min条件下培养24小时，获得含菌细胞发酵液。将获得的含菌细胞发酵液离心，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤两次后，离心收集沉淀，获得湿菌体，湿菌体的产量为75g/L，含水量80%。菌体培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母提取粉50g/L，K₂HPO₄ 2.5g/L，NaCl 1g/L，CuCl₂ 0.02g/L，溶剂为水，初始pH为5.0。

实施例4 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE

湿菌体的制备同实施例2。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲液（pH7.0，0.1M），其中含有湿菌体5g，底物COBE 5mmol，在35℃恒温水浴搅拌反应4小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na₂SO₄脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度＞99%，转化率为65%。

实施例5 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE

湿菌体的制备同实施例2。在转化瓶中加入100mL柠檬酸钠缓冲液（pH6.0，0.1M），其中含有湿菌体5g，底物COBE 5mmol，辅助底物葡萄糖为5mmol，在35℃恒温水浴搅拌反应1小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na₂SO₄脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度＞99%，转化率为93%。

实施例6 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE

湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲液（pH7.0，0.1M），其中含有湿菌体10g，底物COBE 10mmol，辅助底物葡萄糖为10mmol，在35℃恒温水浴搅拌反应2小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na₂SO₄脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度＞99%，转化率为94%。

实施例7 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE

湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲液（pH7.5，0.1M），其中含有湿菌体10g，底物COBE 100mmol，辅助底物葡萄糖为100mmol，在30℃恒温水浴搅拌反应12小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na₂SO₄脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度＞99%，转化率为89%。

实施例8 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE

湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲液（pH7.5，0.1M），其中含有湿菌体10g，底物COBE 100mmol，辅助底物果糖为200mmol，在35℃恒温水浴搅拌反应12小时。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，有机层用无水Na₂SO₄脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度＞99%，转化率为93%。

实施例9 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE

湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入50mL磷酸钠缓冲液（pH7.5，0.1M）和50mL乙酸丁酯，其中含有湿菌体20g，底物COBE 200mmol，辅助底物葡萄糖为300mmol，在35℃恒温水浴搅拌反应8小时。反应结束后，转化液在8000rpm离心5分钟，有机层用无水Na₂SO₄脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度＞99%，转化率为85%。

实施例10 Candida sorboxylosa ZJB-12164生物催化制备(S)-CHBE

湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入60mL磷酸钠缓冲液（pH8.0，0.1M）和40mL乙酸丁酯，其中含有湿菌体20g，底物COBE 300mmol，辅助底物葡萄糖为300mmol，在35℃恒温水浴搅拌反应4小时后，补加湿菌体20g，继续反应4小时。反应结束后，转化液在8000rpm离心5分钟，有机层用无水Na₂SO₄脱水、过滤后气相色谱分析。产物(S)-CHBE光学纯度99%，转化率为92%。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 山梨木糖假丝酵母及其在制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1470

<212> DNA

<213> Candida sorboxylosa

<400> 1

cctgcatgtc caagttagaa actgcgaatg gctcattaga tcagttatca tctccttgac 60

tcattacatg gataaccgtg gaaaatccag agctaataca cgccgtgcac atattaggtt 120

ccgactctga gtatttagcg aaccgtacgc tgggtcattc gagcatctgc cctatcaact 180

agacggtagg atctttgcct acggtggtgg tgacgggtaa cggggaataa gggttcggtt 240

ccggagaggg agcctgagag acggctacca catccaagga aggcagcagg cgcgcaaatt 300

gcacactggg aacgccccga tgcactagca ggcgtaccga tgcgtttacg caatcggata 360

aacacgcgta caggcccgaa tgtagcagtg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt 420

aactccagct ccactagcgt atgttaaagt tgtagcagtt aaaacgctcg tagcgggggg 480

agcgcttata gctattactt tgagaaaatt agagtgttca aagcaggcct tgtgctcgga 540

tacgttagca tggaataatg gaacacgacg gcgtccatgg acgttgtaat gaccaagagg 600

ggcggaagag gcggtgcgta ttgggcggct aggggtgaaa tccgacgacc cgcccacgac 660

gagcgagtgc gaaggcacgc tgcagagacg tgcccgttcg tcaagaacga aagctaggga 720

atcgaaaatg atcagatacc attgtagtct tagccgtaaa cgatgtggag acacggggtg 780

cgattgtgct tcgtgggggg aaacttagtt cgttctgggg ggagtatgct cacaagggtg 840

aaacttaaag aaattggcgg aagactacct taagcaatgg gactgcggct taatttgact 900

caacacgggg aaactcacca ggtccagacg taataaggat tgaccagctg gagacttttc 960

ttgatcttac gggtggtggt gcatggccgt ttttcagtcc ttggagtgat ttgtctgctt 1020

aattgcgata acggacgaga ccttggcctc taactaggag agcgtatttg tacgcggact 1080

gcttagaggg acgacagacg ctaagtttgt ggaggcgcga ggcaacaaca ggtctgtgat 1140

gcccttagac gttctgggcc gcacgcgcgc tacactgacg gggggagcga gggccgggct 1200

gagaagccag ggcaatcagg aaaccgcgtc gtgctgggaa tagcggattg gaattgtttc 1260

ccttgaacgt ggaattgctt gtaagcgcag gtcatcagcc tgcgttgaat acgacccttg 1320

tctttgtaca caccgcccgt tgctactacc gattgaatgg cttagtgaga ggtcgggagg 1380

ccggcggagg gaactccgcg gggcgaactt gttctaactt ggctatttag agctcgtaaa 1440

agtcgtaaca aggtttccgt aggtgaacct 1470

Claims (10)

1.一种山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（Candida sorboxylosa ZJB-12164），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M 2012420，保藏日期2012年10月22日。

2.一种权利要求1所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述的应用为：以山梨木糖假丝酵母ZJB-12164发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，于pH4.0~9.0的水或缓冲液构成的转化体系a中，在20~ 45℃下进行转化反应，反应完全后，将转化液后处理，获得所述(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

3.如权利要求2所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述转化体系a中底物初始浓度为10~2000mmol/L。

4.如权利要求2所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于转化体系a中含酶湿菌体质量计为10~200g/L，所述含酶湿菌体含水质量为70~90%。

5.如权利要求2所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述转化体系a中还包括辅助底物，由辅助底物、底物、催化剂与pH4.0~9.0的水或缓冲液构成转化体系b，所述辅助底物为下列之一：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或甘油。

6.如权利要求5所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述应用为：以山梨木糖假丝酵母ZJB-12164发酵培养获得的含酶湿菌体为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，加入辅助底物，于pH4.0~9.0的水或缓冲液构成的转化体系b中，在20~ 45℃下进行转化反应，反应完全后，将转化液后处理，获得所述(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；所述转化体系b中底物初始浓度为10~2000mmol/L，含酶湿菌体添加量以湿菌体质量计为10~200g/L，所述含酶湿菌体含水质量为70~90%，辅助底物初始浓度为10~2000mmol/L，所述辅助底物为下列之一：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖或甘油。

7.如权利要求2或5所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述转化反应是在20~45℃下反应0.1~36h。

8.如权利要求2或5所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述转化液后处理的方法为：反应结束后，将转化液离心，去除菌体细胞，取上清液用等体积乙酸乙酯萃取，取有机层用无水Na₂SO₄脱水、过滤，滤液即为含(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的粗品，将粗品分离纯化，即得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

9.如权利要求2或5所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述转化体系a或转化体系b均是由蒸馏水、自来水、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液形成的pH4.0~9.0单相体系，或者水与有机介质形成的pH4.0~9.0双相体系；所述有机介质为正己烷、正辛烷、异辛烷、正庚烷、二甲苯、环己烷、乙酸乙酯或乙酸丁酯。

10.如权利要求2或5所述山梨木糖假丝酵母ZJB-12164在生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述含酶湿菌体按如下方法制备：

(1) 斜面培养：将山梨木糖假丝酵母ZJB-12164菌株接种于斜面培养基，于20~37℃下培养12~48小时，获得斜面活化菌种；所述斜面培养基为豆芽汁琼脂培养基，配置方法为：50~200g新鲜黄豆芽放入烧杯中，加入水，煮沸半个小时，纱布过滤得上清，再加入10~50g葡萄糖，15~20g琼脂，补加水至1L；

(2) 种子培养：将斜面活化菌种接种于种子培养基，在25~35℃、摇床转数100~200r/min条件下培养12~36小时得到种子液；所述种子培养基配方为：葡萄糖5~50g/L，酵母膏5~40g/L，KH₂PO₄ 0.5~5g/L，NaCl 0.5~5g/L，溶剂为水，初始pH为5.0~8.0；

(3) 发酵培养：将种子液按照体积比1~5%接入发酵培养基，在25~35℃、摇床转数100~200r/min条件下培养12~48小时，将培养液离心、洗涤，收集含酶湿菌体，冷藏备用；所述发酵培养基配方为：葡萄糖5~50g/L，酵母提取粉5~100g/L，KH₂PO₄ 0.5~5g/L，NaCl 0.5~5g/L，CuCl₂ 0.01~0.1g/L，溶剂为水，初始pH为5.0~8.0。