CN101302552B - 一种微生物催化制备(r)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种微生物催化制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的方法，该方法利用已知的高对映体选择性羰基还原酶的产生菌株河流弧菌(Vibrio fluvialis)，需土金杆菌(Aureobacterium terregens)，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)，博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)等，在优化条件下发酵产酶，并在单一水相体系或水/有机溶剂两相体系中，以2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮为底物，并添加葡萄糖和大孔树脂，当底物2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮浓度为50mmol～140mmol/L(即9.5g/L～26.5g/L)，转化48h，转化条件优化后得到产物(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇达到光学纯度e.e值99.6％e.e、摩尔转化率99％以上，在整个反应过程中不需要添加辅酶。由此提取制备得到的(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇含量达到99.2％，光学纯度99.8％e.e.。
Description
技术领域
本发明涉及微生物催化制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的方法，属于生物催化不对称还原制备医药化工中间体卤代芳基手性醇的技术领域。
背景技术
手性药物及其手性中间体越来越受到重视，例如抗抑郁首选药氟西汀(Fluoxetine)，原是一种外消旋体的抗抑郁药，1997年销售额曾达到27亿美元，后来发现其S-氟西汀是R-氟西汀药效的3倍(欧志敏等：无锡轻工大学学报2003，22(1)：43-48)，该产品很快为S-氟西汀所替代，其重要的手性中间体即为手性芳基醇3-氯-1-苯丙醇。又如抗哮喘药福莫特罗，是一种长效β2受体激动药，它有两个手性中心，四种异构体。研究表明第一个碳原子的R构型是主要有效成分，其(R，R)异构体的药效是其(S，S)对映体的1000倍(王永梅等：CN1228448C，2005)，其重要中间体也是(R)-卤代芳基醇。
本发明所涉及的化合物卤代芳基手性醇主要用于合成β3肾上腺素素受体激动剂。从80年代初就有关于β3肾上腺素素受体激动剂的研究报道，许多国际大型制药公司都在研发此类药物，例如：SR58611，化学名称为[(7S)7-[(2R)2-(3-氯苯基)-2-羟乙基胺基]-5，6，7，8-四氢萘-2-基氧基]乙酸乙酯(结构式I)，是一种由Sanofi-Aventis公司研制的β3肾上腺素能受体激动剂，目前已处于III期临床研究。在II期临床的研究过程中发现，SR58611疗效优于氟西汀，且耐受性良好。在IIb期临床研究时与另一抗抑郁首选药帕罗西汀(paroxetine，Paxil)的比较发现，SR58611的疗效和耐受性更好，足以保证继续进行III期临床研究(中国药理学通报.2005，10:1153-1157)。研究表明SR58611在抗抑郁、抗肥胖、抗糖尿病、心血管舒张、胃肠道的解痉和抗炎以及尿道解痉等方面有显著的疗效。
结构式I
又如Solabegron，化学名称为3′-[(2-{[(2R)-2-(3-氯苯基)-2-羟乙基]氨基}乙基)氨基]联苯-3-甲酸(结构式II)，是一种由Glaxosmithkline研究开发的β3肾上腺素能受体激动剂，主要用于治疗抑郁症，目前已处于临床II期
结构式II
该药物有两个手性中心，所以一共有(2R，2′S)、(2R，2′R)、(2S，2′S)、(2S，2′R)四种异构体。研究表明第一个碳原子的R构型要好于其S构型，并且(2R，2’S)要好于其对映体(2R，2′R)、(2S，2′S)与(2S，2′R)。(European Journal of Medicinal Chemistry.1994，29(4)：259～267)。在SR58611与Solabegron的合成过程中的关键手性中间体为(1R)-2-氯-(氯代苯基)乙醇(结构式III)。
结构式III
已有报道采用不对称催化还原(1R)-2-氯-(卤代苯基)乙酮的方法合成(1R)-2-氯-(卤代苯基)乙醇(Marc Devocelle，et.al.：Tetrahedron Letters 40，4551-4554，1999；Ohkuma.T，et.al.：Organic Letters，9(2)，255-257，2007)，描述了使用銠(Rh)催化剂，这种方法的催化剂昂贵、价格高、反应条件比较苛刻、催化剂回收复杂，大规模工业化生产易造成污染。中国专利CN1063422C(儿玉浩宣，等：1996)公开了以外消旋的2-卤代-1-(取代苯基)乙醇和邻苯二甲酸酐反应所得产物，再采用光学活性有机碱作为拆分剂，得旋光性中间体，最后水解或醇解得到光学活性的化合物2-卤代-1-(取代苯基)乙醇，该方法需从外消旋的原料入手经三步反应才得产物，收率低，同时在拆分过程中还需要价格较高的生物碱、多种溶剂和试剂，增加了生产成本，同时还有50％的无用对映体及部分副产物难以处理，从而造成环境污染。中国专利CN1228448C(王永梅等，2005)描述了使用生物催化还原的方法制备(R)-2-卤代-1-(取代苯基)乙醇，但从该专利的实施例中可以看出，该专利采用普通市售酵母作生物催化剂，由于其酶系复杂，造成其转化产物光学纯度不高，且产率低。并且以上专利均未涉及化合物(R)-2-氯代-1-(3-氯苯基)乙醇。还没有关于酵母以外的其它种属微生物羰基还原酶催化不对称还原反应生产芳基手性醇(R)-2-氯代-1-(3-氯苯基)乙醇的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供了产高立体选择性羰基还原酶的微生物，提供了一种新的能有效催化不对称还原反应制备手性卤代芳基醇的方法，并利用该类微生物菌株催化2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮不对称还原，以获得高光学纯度、高反应产率、高产物浓度的(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇。
为实现上述目的，本发明提供了微生物催化制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的方法，其特征是以选择性羰基还原酶产生菌为微生物催化不对称还原反应用菌株，在单一水相体系或水/有机溶剂两相体系中，以2-氯代-(氯代苯基)乙酮为底物，在酶反应过程中补充添加底物，并添加葡萄糖和大孔树脂，制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇。
本发明(R)-2-卤代-1(卤代苯基)乙醇的制备方法反应式如下：
以下是本发明方法的详细步骤描述如下。
(1)菌株：由本发明筛选得到的能有效催化不对称还原反应制备手性卤代芳基醇的微生物菌株是河流弧菌(Vibrio fluvialis)ATCC 33810，ATCC 33812，需土金杆菌(Aureobacterium terregens)ATCC 13345，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 15554，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AS 1.785，AS 1.786，AS 1.787，AS 1.788，AS1.792，皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)AS 2.571，或博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)AS 2.1644等；
其中粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 15554转化效果较优，作为实例中进一步研究出发菌株。
(2)微生物菌体的培养：培养基组成为：酵母膏5～50g/L，玉米浆干粉5～50g/L，蛋白胨5～50g/L，CoCl20.01～0.1mmol/L，pH5～9，温度20～40℃，培养1～4天，发酵液过滤获得湿菌体；
(3)配制反应体系：以2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮为底物，用0.2M，pH6.5的磷酸缓冲液配制成单一水相反应体系，底物浓度为50mmol～140mmol/L(即9.5g/L～26.5g/L)；或者用有机溶剂与pH6.5的磷酸缓冲液配制成水/有机溶剂两相体系，再加入底物浓度0mmol～140mmol/L(即9.5g/L～26.5g/L)；
(4)微生物催化反应：在上面(3)的单一水相反应体系中，或者水/有机溶剂两相体系中，加入湿菌体，加湿菌体量以底物计为1～40g/g，反应温度为20～50℃，反应时间为2～72小时；在微生物催反应过程中补充添加底物，并添加葡萄糖或添加大孔树脂；
在反应过程中添加葡萄糖，其浓度为1％-10％重量。
在反应过程中添加大孔树脂，采用添加树脂是用来吸附底物、产物，以抑制底物、产物对菌体的毒性。树脂与底物的质量比为0.6-6：1，大孔树脂为DA201、Hz816、Hz803、AB-8、D4006、HPD300、HPD100A、NAK-II、X-5、CAD-40、SD300、DM—11、XAD—7、D101、AB-8、H—103、DM-130大孔吸附树脂，D201GF、D392、D315、D290、D280、D293大孔阴离子树脂，HD-2、D61、D001、HD-1、D001-CC、D113大孔阳离子树脂，所述大孔树脂的孔径为100～180。上述树脂均为市售，为上海华东理工大学华震科技开发公司、南开大学化工厂等产品。
在水/有机溶剂两相体系中，用有机溶剂与pH6.5的磷酸缓冲液，按体积比0.1：1～1：0.1配制成水/有机溶剂两相体系，再加入底物浓度10～50g/L，所用的有机溶剂为邻苯二甲酸二辛酯，或邻苯二甲酸二丁酯、乙酸正丁酯、环己烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、癸烷、壬烷等，均为市售化学纯产品。
在上述反应过程中，在进行上述步骤(2)时可以不进行过滤而是采用在湿菌体培养发酵液中直接添加2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮为底物，其浓度为50mmol～140mmol/L，即9.5g/L～26.5g/L替代步骤(3)配制反应体系，然后进行步骤(4)的微生物催化反应。
(5)转化液后处理：微生物催化反应后的转化液过滤或离心分离菌体，清液以乙酸乙酯萃取，吸附树脂用乙酸乙酯洗脱，合并萃取液和洗脱液，再向其中加入1％-5％(w/v)的无水硫酸钠，搅匀后静置过夜，除去残余的水份。将有机相用滤纸过滤，收集有机相。50℃水浴旋转蒸发回收溶剂，得到无色油状液体(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇。
取(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇0.05g，溶于乙酸乙酯中，定容至5mL，用GC-MASS进行定性分析，样品与标准品(Sigma Co.)质谱图对照，确定为同一物质。
分析方法：
产物(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇对映异构体过量值(e.e.)测定采用手性气相色谱法。手性气相色谱柱：CP-Chirasil Dex CB 25m×0.25mm×0.25μm；色谱条件为：10℃保留2min，以2℃/min升温至140℃保留2min；进样量0.2μL；柱流速2.0mL/min；载气H2流速30mL/min，燃烧气H2流速30mL/min，空气流速300mL/min，尾吹N2流速：25mL/min；进样口：250℃，检测器：250℃，分流比：50：1。
本发明的有益效果：
本发明筛选获得了高对映体选择性的河流弧菌(Vibrio fluvialis)ATCC 33810，ATCC33812，需土金杆菌(Aureobacterium terregens)ATCC 13345，粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)ATCC 15554，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AS 1.785，AS 1.786，AS1.787，AS 1.788，AS 1.792，皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)AS 2.571，博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)AS 2.1644等，在单一水相体系中催化不对称还原2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮生成的(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇对映体过量值达到80％-99％e.e.，在反应体系中添加树脂或者有机溶剂，供给能量物质，可以添加高浓度底物，获得高光学纯度、高反应产率、高产物浓度，更主要的是在整个反应过程中不需要添加辅酶。由此提取制备得到的(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇达到含量99.2％，光学纯度99.8％e.e.。
本发明微生物转化法相对于传统的化学不对称合成法、面包酵母氧化还原方法或用添加辅酶NADH/NAD+的酶催化不对称还原方法具有以下优点：①生成的(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇对映体过量值高，最高可达到99％e.e以上；②生物催化剂为微生物菌体，可以自行发酵生产，质量稳定，成本低廉；③在反应体系中添加树脂或者采用水/有机相两相体系，供给能量物质，可以获得高光学纯度、高反应产率、高产物浓度；④在整个反应过程中不需要添加辅酶；⑤反应条件温和，环境友好。
生物材料样品说明
本发明所用的河流弧菌(Vibrio fluvialis)ATCC 33810，ATCC 33812，需土金杆菌(Aureobacterium terregens)ATCC 13345，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 15554，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AS 1.785，AS 1.786，AS 1.787，AS 1.788，AS1.792，皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)AS 2.571，博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)AS 2.1644等。其中ATCC编号菌种保存于美国模式菌种收集中心，AS编号菌种保存中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
具体实施方式
以下是以选择性羰基还原酶产生菌为出发菌株，在单一水相体系或水/有机溶剂两相体系中，以2-卤代-(卤代苯基)乙酮为底物，微生物催化制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的实施例。但本发明并不限于所列出的几个实例。
实施例1
微生物菌株的培养和筛选
斜面培养：培养基为100mL麦芽汁(含麦芽粉10g)，琼脂2g，pH6.0，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种，菌种为表1所示的各种微生物菌株，28℃培养2天，作为斜面活化种子。
种子培养和发酵：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH6.5，装液量为250mL三角瓶装液50mL，120℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，180r/min的摇床，28℃培养24-48小时，作为种子或发酵菌液。
发酵菌液中湿菌体量为1.6g/100mL，离心10分钟(8,000转/分钟)收集菌体，用磷酸钾缓冲液(0.2M，pH6.5)清洗两次，将菌体转入5mL含葡萄糖(0.5M)的相同的缓冲液中，使菌体浓度为发酵液中的两倍，同时加入100mmol/L底物，于30℃，180r/min下反应。反应48小时结束，离心除去菌体，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，分离水相和有机相。向有机相加入适量无水NaSO4干燥过夜，蒸干乙酸乙酯，加入流动相(85％正己烷+15％异丙醇)800μL，液相色谱分析产物含量与对映体过量值，结果如表1。
表1产羰基还原酶微生物菌株的筛选
| 微生物菌株 | 对映体过量值(％e.e.) | 摩尔转化率(％) | 产物构型 |
| 河流弧菌(Vibrio fluvialis)ATCC 33810 | 84.84 | 46.29 | R |
| 河流弧菌(Vibrio fluvialis)ATCC 33812 | 90.77 | 90.89 | R |
| 需土金杆菌(Aureobacterium terregens)ATCC 13345 | 93.82 | 75.43 | R |
| 粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 15554 | 99.16 | 93.68 | R |
| 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AS 1.785 | 83.95 | 57.88 | R |
| 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AS 1.786 | 81.70 | 55.52 | R |
| 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AS 1.787 | 86.95 | 51.20 | R |
| 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AS 1.788 | 80.90 | 50.08 | R |
| 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AS 1.7892 | 89.15 | 61.38 | R |
| 皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)AS 2.571 | 98.02 | 88.44 | R |
| 博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)AS 2.1644 | 86.81 | 59.54 | R |
结果表明，转化产物(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇光学纯度e.e值可达到81.70％～99.16％e.e、摩尔转化率46.29～93.68％，在整个反应过程中不需要添加辅酶。其中粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 15554转化效果更好，作为进一步实施例出发菌株。
实施例2：
不同碳源对转化的影响
采用粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 15554为转化菌株，将该菌种按实施例1的方法培养，在实施例1中加入不同的碳源替代葡萄糖。从斜面上将菌种接至5ml液体培养基中，空气摇床28℃，180r/min预培养24h，然后转入50ml培养基中扩大培养24h，4℃下，12000r/min离心8min。反应条件和收集方法同实施例1。结果如表2。
表2不同碳源对转化的影响
由表2结果可以看出：样品e.e.值可以达到99％以上，各平行样的重复性良好。由转化率考虑确定以玉米浆作为实验中的培养基碳源。
实施例3：
不同氮源对转化的影响
将粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 15554菌种按实施例1的方法培养，在实施例1中葡萄糖培养基加入不同的氮源(表3所示)。从斜面上将菌种接至5ml液体培养基中，摇床180r/min，28℃，预培养24h，然后转入50ml培养基中扩大培养24h，4℃下，12000r/min离心8min。反应条件和收集方法同实施例1。结果如表3。
表3不同氮源对转化的影响
由表3结果可以看出：以(NH4)2SO4作为氮源的样品转化率虽高(80.22％)，e.e.值99.79％，但各水平之间的差异很大。综合考虑，在不影响ee值的条件下仍然以酵母膏加普通蛋白胨为氮源。
同时，在对各种产酶条件进行优化后，确定培养基配方如下：酵母膏10g/L，精制玉米浆干粉10g/L，蛋白胨20g/L，CoCl20.1mmol/L，pH6.5。在上述条件下，100mmol/L的底物在48h后的转化率可达到99.8％，e.e.值99.9％。
实施例4：
不同底物浓度对转化的影响
将粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 15554菌种按实施例1的方法培养，发酵培养基按优化碳氮源后的培养基，即酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，玉米浆20g/L，pH6.5。从斜面上将菌种接至5ml液体培养基中，空气摇床28℃，180r/min预培养24h，然后转入50ml培养基中扩大培养24h，4℃下，12000r/min离心8min。反应条件和收集方法同实施例1。结果如表4。
表4不同底物浓度对转化的影响
| 底物浓度(mmol/L) | 对映体过量值(％e.e.) | 摩尔转化率(％) |
| 7 | 90.22 | 98.88 |
| 14 | 99.02 | 98.44 |
| 35 | 98.25 | 94.82 |
| 70 | 99.82 | 66.77 |
| 100 | 98.70 | 33.44 |
| 140 | 99.82 | 30.69 |
实施例5：
不同的菌体量对转化的影响
将粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 15554菌种按实施例4的方法培养。从斜面上将菌种接至5ml液体培养基中，空气摇床28℃，180r/min预培养24h，然后转入50ml培养基中扩大培养24h，4℃下，12000r/min离心8min。反应条件和收集方法同实施例1，底物浓度10g/L。结果如表5。
表5不同菌体量对转化的影响
| 菌体量(g/L) | 对映体过量值(％e.e.) | 摩尔转化率(％) |
| 50 | 91.81 | 40.48 |
| 100 | 99.20 | 89.68 |
| 200 | 99.68 | 99.34 |
| 400 | 99.27 | 97.13 |
实施例6：
添加树脂对转化的影响
将粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 15554菌种按实施例1的方法培养。从斜面上将菌种接至5ml液体培养基中，空气摇床28℃，180r/min预培养24h，然后转入50ml培养基中扩大培养24h，4℃下，12000r/min离心8min。反应条件和收集方法同实施例1，底物浓度20g/L。反应体系中分别添加大孔树脂DA201、Hz816、Hz803、AB-8、D4006、HPD300、HPD100A、NAK-II、X-5、CAD-40、SD300、DM—11、XAD—7、D101、AB-8、H—103、DM-130大孔吸附树脂，D201GF、D392、D315、D290、D280、D293大孔阴离子树脂，HD-2、D61、D001、HD-1、D001-CC、D113大孔阳离子树脂，所述大孔树脂的孔径为100～180
。添加量按说明书所述范围选择质量比为1：1。反应结束后滤出吸附树脂用乙酸乙酯洗脱，洗脱液用手性气相色谱检测，其中结果较好的为CAD-40、SD300、DM—11、XAD—7、D101、AB-8、H—103、DM-130，结果如表6所示。
表6添加树脂对转化的影响
| 树脂名称 | 对映体过量值(％e.e.) | 摩尔转化率(％) |
| CAD-40 | 91.71 | 88.33 |
| SD300 | 90.25 | 92.03 |
| DM—11 | 97.07 | 84.47 |
| XAD—7 | 86.67 | 29.44 |
| D101 | 99.60 | 93.66 |
| AB-8 | 84.85 | 37.69 |
| H—103 | 95.90 | 31.88 |
| DM-130 | 98.32 | 29.96 |
实施例7：
不同比例的水/有机溶剂两相反应体系对转化的影响
将粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 15554菌种按实施例1的方法培养。从斜面上将菌种接至5ml液体培养基中，摇床180r/min，28℃，预培养24h，然后转入50ml培养基中扩大培养24h，4℃下，12000r/min离心8min。反应条件和收集方法同实施例1，底物浓度为20g/L。底物预先溶于一定体积的有机溶剂中。试验的有机溶剂为邻苯二甲酸二辛酯，或邻苯二甲酸二丁酯、乙酸正丁酯、环己烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、正癸烷、壬烷、十一烷、十二烷等，反应结束后分出有机相，用手性气相色谱检测，结果如表7和8。
表7水/不同种类有机溶剂的两相反应体系对转化的影响
| 水/有机溶剂(1：1) | 对映体过量值(％e.e.) | 摩尔转化率(％) |
| 环己烷 | 99.45 | 22.80 |
| 正己烷 | 99.75 | 28.65 |
| 正庚烷 | 99.57 | 37.45 |
| 正辛烷 | 99.89 | 31.82 |
| 异辛烷 | 99.52 | 28.61 |
| 癸烷 | 99.35 | 21.83 |
| 壬烷 | 99.62 | 78.61 |
| 乙酸正丁酯 | 98.69 | 4.26 |
| 邻苯二甲酸二丁酯 | 99.68 | 88.33 |
| 邻苯二甲酸二辛酯 | 99.66 | 95.21 |
表8不同比例水/邻苯二甲酸二辛酯两相反应体系对转化的影响
| 水/邻苯二甲酸二辛酯两相比例 | 对映体过量值(％e.e.) | 摩尔转化率(％) |
| 5：0 | 96.69 | 14.26 |
| 5：2.5 | 98.38 | 74.90 |
| 5：5 | 99.78 | 96.22 |
| 5：8 | 97.49 | 93.96 |
| 5：10 | 96.39 | 82.53 |
实施例8：
微生物催化反应产物的提取
按实施例6的方法，微生物催化反应后的转化液过滤，并离心分离菌体，清液以乙酸乙酯萃取，滤出的吸附树脂用乙酸乙酯洗脱，合并萃取液和洗脱液，再向其中加入1％-5％(w/v)的无水硫酸钠，搅匀后静置过夜，除去残余的水份。将有机相用滤纸过滤，收集有机相。50℃水浴旋转蒸发回收溶剂，得到无色油状液体(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇，GC测定含量99.2％，光学纯度99.8％e.e.。
取(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇0.05g，溶于乙酸乙酯中，定容至5mL，用GC-MASS进行定性分析，样品与标准品(Sigma Co.)质谱图对照，确定为同一物质。
Claims (6)
1.一种微生物催化制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的方法，其特征是以选择性羰基还原酶产生菌为出发菌株，在单一水相体系或水/有机溶剂两相体系中，以2-氯代-(氯代苯基)乙酮为底物，在酶反应过程中补充添加底物，并添加葡萄糖和大孔树脂，制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇，其步骤如下：
(1)选择以下菌株：河流弧菌(Vibrio fluvialis)ATCC33810，ATCC33812，需土金杆菌(Aureobacterium terregens)ATCC 13345，粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)ATCC 15554，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AS 1.785，AS 1.786，AS 1.787，AS 1.788，AS 1.792，皮状丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)AS 2.571，或博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)AS 2.1644；
(2)微生物菌体的培养：培养基组成为：酵母膏5～50g/L，玉米浆干粉5～50g/L，蛋白胨5～50g/L，CoCl2 0.01～0.1mmol/L，pH5～9，温度20～40℃，培养1～4天，发酵液过滤获得湿菌体；
(3)配制反应体系：以2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮为底物，用0.2M、pH6.5的磷酸缓冲液配制成单一水相反应体系，底物浓度为50mmol～140mmol/L，即9.5g/L～26.5g/L；或者用有机溶剂与pH6.5的磷酸缓冲液配制成水/有机溶剂两相体系，再加入底物浓度50mmol～140mmol/L，即9.5g/L～26.5g/L；
(4)微生物催化反应：在步骤(3)的单一水相反应体系中，或者水/有机溶剂两相体系中，加入湿菌体，加湿菌体量以底物计为1～40g/g，反应温度为20～50℃，反应时间为2～72小时；在微生物催反应过程中补充添加底物，并添加葡萄糖；
(5)转化液后处理：微生物催化反应后的转化液过滤或离心分离菌体，清液以乙酸乙酯萃取，吸附树脂用乙酸乙酯洗脱，合并萃取液和洗脱液，再脱水，脱色，蒸发回收溶剂，得到无色油状液体(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇；
所述的水/有机溶剂中的有机溶剂为邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、乙酸正丁酯、环己烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、癸烷或壬烷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)ATCC 15554。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是在进行上述步骤(2)时不进行过滤而是采用在湿菌体培养发酵液中直接添加2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮为底物，其浓度为50mmol～140mmol/L，即9.5g/L～26.5g/L替代步骤(3)配制反应体系，然后进行步骤(4)的微生物催化反应。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述微生物催化反应，在反应过程中添加葡萄糖，其浓度为1％～10％重量。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述微生物催化反应，在反应过程中添加大孔树脂，所述的大孔树脂为DA201、Hz816、Hz803、AB-8、D4006、HPD300、HPD100A、NAK-Ⅱ、X-5、CAD-40、SD300、DM-11、XAD-7、D101、H-103、DM-130大孔吸附树脂，D201GF、D392、D315、D290、D280、D293大孔阴离子树脂，HD-2、D61、D001、HD-1、D001-CC、D113大孔阳离子树脂，所述大孔树脂的孔径为
，树脂与底物的质量比为0.6～6∶1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述微生物催化反应，用有机溶剂与pH6.5的磷酸缓冲液，按体积比0.1∶1～1∶0.1配制成水/有机溶剂两相体系，再加入底物浓度10～50g/L。
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| EP1400594A1 (en) * | 2001-06-25 | 2004-03-24 | Kaneka Corporation | Process for producing optically active (r)-2-chloro-1-(3'-chlorophenyl)etha nol |
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