CN102115719B - 一株好氧反硝化菌及其筛选方法和应用 - Google Patents

一株好氧反硝化菌及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株好氧反硝化菌及其筛选方法和应用，属于生物工程技术和环境保护领域。本发明公开的好氧反硝化菌(Pseudomonas sp.)是从污水处理厂的活性污泥中筛选所得，根据好氧反硝化菌在培养过程中的产碱性能确定筛选方案。其具体筛选步骤为：富集培养，初筛，复筛，反硝化性能测试，最后得到一个性能较好的菌株。该菌株可以有效的去除污水中的硝态氮和亚硝态氮，去除硝态氮和去除亚硝态氮的能力分别为1.954gNO3-N/d/g和0.978gNO2-N/d/g，当初始硝态氮浓度为40mg/L时，8h去除率达到99％以上，可用于环境污水处理，具有很好的应用前景。

Description

一株好氧反硝化菌及其筛选方法和应用
技术领域：
本发明涉及一株好氧反硝化菌及其筛选方法和应用，属于生物工程技术和环境保护领域。 
背景技术：
随着水体富营养化的日益严重，去除水中氮素污染已经成为当今水污染防治领域的一个热点问题。长期以来，脱氮主要强调污水中氨氮的脱除，不对硝态氮进行处理，导致水体中硝酸盐含量不断升高。传统生物脱氮包括硝化和反硝化两个过程，即氨氮由硝化细菌转化为硝态氮，然后再通过反硝化细菌还原为氮气，排出水体。传统的反硝化主要是在厌氧或缺氧条件下进行，在此过程中，硝酸盐依次被还原为亚硝酸盐、NO、N2O和氮气。然而，最新的研究表明，一些微生物在不同的溶氧条件下，也能表现出一定的反硝化能力。比如文献上所报导的Thiosphaera pantotropha，Alcaligenes faecalis，Pseudomonas aeruginosa，Thaurea mechernichensis，Acinetobacter calcoaceticus，Providencia rettgeri，Pseudomonas stutzeri和Bacillus strains等均可在好氧条件下进行反硝化。好氧反硝化菌的出现为生物脱氮提供了一条全新的途径，使得传统的生物脱氮途径更加完善，也为脱氮工艺研究提供了一定的理论基础。传统的生物脱氮由于硝化菌和反硝化菌对氧的需求不同，分为硝化工艺和反硝化工艺。而如今随着好氧反硝化菌的出现，短程硝化反硝化，同时硝化反硝化都成为了可能。 
好氧反硝化菌的筛选方法很多，主要包括：1.富集培养法：利用选择性培养基进行筛选，在培养基中添加限制性碳源和氮源，或根据反硝化为碱增加的过程在培养基中添加pH指示剂。2.稀释法，将样品稀释一定倍数后培养，然后将pH值发生变化的再进行稀释，重复操作，将本来不占优势的好氧反硝化菌分离出来。3.间歇曝气法，好氧反硝化菌可同时利用氧分子和硝态氮，好氧、缺氧的频繁转换有利于其在竞争中取得优势地位。 
发明内容：
本发明的所要解决的技术问题是提供一株好氧反硝化菌，能够在好氧条件下有效降解水体中的硝态氮及亚硝态氮。 
所述好氧反硝化菌16s rDNA分子鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，于2010年8月30日，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2010209，保藏单位地址为武汉市武昌珞珈山。 
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种筛选好氧反硝化菌的方法。 
本发明的菌种筛选采用多种筛选方法相结合，首先通过添加限制性氮源，间歇曝气来富集好氧反硝化菌，然后再通过在培养基中添加pH指示剂来快速有效地筛选好氧反硝化菌。 
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是： 
对污水处理厂的活性污泥进行曝气富集培养，筛选出好氧菌；然后根据反硝化菌产碱的性能，通过在培养基中添加溴甲基芬兰指示剂的方法，来有效地筛选好氧反硝化菌；最后用模拟好污水复筛高反硝化能力的好养反硝化菌。 
其步骤依次是取样，曝气富集培养，初筛，复筛，最后得到1株在好氧条件下，能同时降解模拟污水中的硝态氮和亚硝态氮，反硝化能力较高的菌株。 
硝态氮检测方法：紫外分光光度法(HJ/T 346-2007) 
亚硝态氮检测方法：N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(GB 7493-87) 
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种好氧反硝化菌的应用污水处理的方法，具体为菌体扩大培养后，接种于含硝态氮和亚硝态氮污染的水体。 
本发明提供的菌株可以有效的去除污水中的硝态氮和亚硝态氮，去除硝态氮和去除亚硝态氮的能力分别为1.954gNO3-N/d/g和0.978gNO2-N/d/g，当初始硝态氮浓度为40mg/L时，8h去除率达到99％以上，可用于环境污水处理，具有很好的应用前景。 
具体实施方式：
实施例1好氧反硝化菌的筛选 
1.富集培养：将从污水处理厂取得的活性污泥进行曝气富集培养，每天更换新鲜培养基。装液量2L。更换新鲜培养基时先静置1h，移除600mL体积，然后再补加600mL新鲜培养基，总共富集约40天。 
2.初筛：将富集好的活性污泥进行稀释，在溴百里酚蓝培养基上进行涂布，然后置于30℃培养箱中培养，培养2-3天。将溴百里酚蓝培养基上出现的蓝色单菌落进行分类，革兰氏染色，然后将每个形态的菌落挑选3-4个进行划线分离，置于30℃培养箱中培养，培养2-3天。对划线分离得到的蓝色单菌落进行分类，挑选有特征的菌落保存到斜面上，供复筛用。 
3.复筛：将初筛保存的菌株接入菌体扩大培养基，30℃，150rpm，培养24h，然后按5％的比例分别接入100mL检测培养基，培养48h，30℃，150rpm，测定接种前后硝态氮和亚硝态氮的变化。选择硝态氮降解率达40％以上且亚硝态氮降解率达25％以上的菌株进行反硝化性能测试，得到一株性能最好的菌株。 
4.硝态氮和亚硝态氮的测定 
硝态氮：紫外分光光度法(HJ/T 346-2007) 
亚硝态氮：N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(GB 7493-87) 
5.相关培养基 
富集培养基(g/L)：(NH4)2SO40.5；丁二酸钠·6H2O 2.17；维氏盐溶液50ml；pH 7.2。 
维氏盐溶液(g/L)：K2HPO4 5.0；MgSO4·7H2O 2.5；NaCl 2.5；FeSO4·7H2O 0.05；MnSO4·4H2O 0.05。 
初筛培养基(g/L)：琼脂20；KNO31；KH2PO41；FeSO4·7H2O 0.5；CaCl20.2；MgSO4·7H2O1；丁二酸钠·6H2O 8.5；溴百里酚蓝(取0.1g溴百里酚蓝溶于10mL酒精)1mL，pH 7.0～7.3。 
菌体扩大培养基(g/L)：KNO31；KH2PO4 1；FeSO4·7H2O 0.05；CaCl2 0.02；MgSO4·7H2O1；丁二酸钠·6H2O 8.5。 
检测培养基(g/L)：KH2PO4 1；MgSO4·7H2O 1；丁二酸钠·6H2O 2.8；分别以硝酸钠和亚硝酸钠为氮源，氮浓度100mg/L。 
实施例2.好氧反硝化菌处理模拟污水 
1.相关培养基： 
菌体扩大培养基(/L)：KNO3 1g；KH2PO4 1g；FeSO4·7H2O 0.05g；CaCl2 0.02g；MgSO4·7H2O 1g；丁二酸钠8.5g。 
检测培养基(g/L)：KH2PO4 1g；MgSO4·7H2O 1g；丁二酸钠2.8g；分别以硝酸钠和亚硝酸钠为氮源，氮浓度依据实验而定。 
2.工艺条件： 
温度：30℃；摇床转速：150rpm；装液量：100/250mL无流加 
3.好氧反硝化菌的应用 
将斜面上的反硝化菌挑取一环接入扩大培养基，在30℃，150rpm的条件下培养24h，然后按5％的比例分别接入富含硝态氮和亚硝态氮的模拟污水中，30℃，150rpm，培养24小时后，8000rpm的条件下离心5min，检测上清液中的硝态氮和亚硝态氮含量。所述菌株去除硝态氮和去除亚硝态氮的能力分别为1.954gNO3-N/d/g和0.978gNO2-N/d/g，当初始硝态氮浓度为40mg/L时，8h去除率达到99％以上。 
表一菌株的反硝化能力测试 
Figure BSA00000303021700031
Figure BSA00000303021700041
注：初始氮浓度均为100mg/L，培养24h 
表二菌株的去除硝态氮能力 
Figure BSA00000303021700042
注：初始氮浓度40mg/L，培养8h 
实施例3.好氧反硝化菌处理污水 
将斜面上的反硝化菌挑取一环接入扩大培养基，在30℃，150rpm的条件下培养24h，然后按5％的比例接入富含硝态氮和亚硝态氮的污水中，30℃，150rpm，培养24小时后，8000rpm的条件下离心5min，总氮去除率为86.59％。 
表三实际污水的脱氮效果 
  编号   DCW(g/L)   初始总氮(mg/L)   剩余总氮(mg/L)   去除率(％)
  4   1.00   36.01   4.83   86.59
注：培养24h 
实施例4：反硝化菌鉴定 
菌株经16S rDNA分子鉴定为假单孢菌属(pseudomonas sp.)，其16S rDNA序列现已提交NCBI，编号为HM218829。该菌株于2010年9月7日，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2010209。 

Claims (1)

1.一株好氧反硝化菌，属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，于2010年8月30日，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2010209。
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