CN111454859A - 一种低温好氧反硝化细菌的培育方法 - Google Patents

一种低温好氧反硝化细菌的培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种低温好氧反硝化细菌的培育方法，其是以好氧池活性污泥为菌种来源，首先以液体富集培养基进行曝气培养，再进行低温驯化培育，最终得到低温好氧反硝化菌群；该方法筛选到的菌群能在低温状况下耐受较高的硝态氮，具有很好的降解COD和硝态氮活性，为同步硝化‑反硝化提供可能；同时，筛选得到的菌群能产生一定的碱度，可供给硝化作用消耗，减少碱度投加，降低运行成本，为废水的生物脱氮提供强有力的保障。

Description

一种低温好氧反硝化细菌的培育方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种低温好氧反硝化细菌的培育方法。
背景技术
随着工业和农业的迅速发展，含氮废水的排放量日益增长，使得全国乃至全球的水质急剧下降。含氮污水的排放会降低水体的质量，给环境造成严重的危害，甚至于危害人体健康。目前对于废水中氮素污染的治理多采取脱氮处理。根据脱氮原理，将脱氮技术分为物理脱氮、化学脱氮和生物脱氮。其中，生物脱氮因其投资及运行成本低、适用范围广、操作简单、无二次污染、稳定性强等优势，成为了脱氮的最佳处理方式。
传统的生物脱氮分为两个过程，即硝化作用和反硝化作用。硝化作用将氨氮(NH4 +-N)氧化为亚硝酸盐氮(NO2-N)或硝酸盐氮(NO3-N)，该过程是由亚硝化细菌或硝化细菌在好氧的条件下进行的；反硝化作用将亚硝酸盐氮或硝酸盐氮还原为氮气(N2)，该过程是由反硝化细菌在缺氧条件下完成的；因需氧条件不同，这两个过程无法实现同步。目前生物脱氮的处理工艺主要是A2/O、A/O/A/O、和A/O/A等缺氧***和好氧***的排列组合，其中A2/O、A/O/A/O工艺需要增设硝化液回流，以便利用缺氧***的COD降低好氧***产生的硝态氮；而A/O/A无需增设回流***，但是经好氧***处理过的水质COD往往偏低，难以满足反硝化作用需要的C/N，需投加碳源，大大增加了运行成本。
目前针对缺氧反硝化、好氧反硝化、厌氧氨氧化等方面研究较多，而针对低温环境下好氧反硝化方面研究较少。因此寻找一种低温好氧反硝化细菌成为本领域技术人员现在难以解决的问题。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种低温好氧反硝化细菌的培育方法，该方法培育的反硝化细菌能在低温状况下耐受较高的硝态氮，具有很好的降解COD和硝态氮活性。
有鉴于此，本申请提供了一种低温好氧反硝化细菌的培育方法，包括以下步骤：
A)将好氧池活性污泥在富集培养基中曝气培养，得到低温好氧反硝化混合菌群；所述曝气培养的温度为25～35℃；
所述富集培养基以水配制，其中包括：葡萄糖1.0～2.0g/L，NaNO3 0.606～3.636g/L，K2HPO41.0～2.0g/L，FeSO40.5～1.0g/L， CaCl20.2～0.5g/L，MgSO41.0～2.0g/L，NaCl 0.5～1g/L，柠檬酸钠 7～8.5g/L；
B)将所述低温好氧反硝化混合菌群在第一培育培养基中进行第一曝气培养；所述第一曝气培养的温度为15～25℃；
所述第一培育培养基以水配制，其中包括：NaNO3 0.606～1.212g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，FeSO40.5～1.0g/L，CaCl2 0.2～0.5g/L，MgSO41.0～2.0g/L，NaCl 0.5～1g/L，柠檬酸钠7～8.5g/L， 1％溴百里酚蓝指示剂0.5～1mL/L；
C)将步骤B)得到的混合菌群在第二培育培养基中进行第二曝气培养，得到低温好氧反硝化细菌；所述第二曝气培养的温度为 5～15℃；
所述第二培育培养基以水配制，其中包括：NaNO3 0.606～1.212g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，FeSO40.5～1.0g/L，CaCl2 0.2～0.5g/L，MgSO41.0～2.0g/L，NaCl 0.5～1g/L，柠檬酸钠7～8.5g/L，1％溴百里酚蓝指示剂0.5～1mL/L。
优选的，所述步骤C)之后还包括：
D)将步骤C)得到的低温好氧反硝化细菌在液体验证培养基中验证。
优选的，所述液体验证培养基以水配制，其中包括：NaNO3 1.212～2.424g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，FeSO40.5～1.0g/L，CaCl2 0.2～0.5g/L，MgSO41.0～2.0g/L，NaCl0.5～1g/L，柠檬酸钠7～8.5g/L，1％溴百里酚蓝指示剂0.5～1mL/L。
优选的，步骤A)中，所述曝气培养的溶解氧为2.0～5.0mg/L；步骤B)中，所述第一曝气培养的溶解氧为2.0～5.0mg/L；步骤C)中，所述第二曝气培养的溶解氧为2.0～5.0mg/L。
优选的，步骤A)、步骤B)和步骤C)的培养过程中独立的按照以下方法培养：
每天检测总氮指标和总氮指标，总氮浓度降至10mg/L以下后更换培养基，培养基初始硝态氮浓度为100mg/L，同一硝态氮浓度培养基更换3～5次；之后更换培养基时提高硝态氮浓度，每次梯度为 50～100mg/L，直至硝态氮浓度达到400～600mg/L且降解量达到390～590mg/L·d时培养结束。
优选的，步骤A)、步骤B)和步骤C)中培养后的菌群的处理方法独立的为：
将得到的菌群沉降2～4h，弃上清，留沉淀，沉淀占培养体系的比例为25％～45％。
优选的，所述富集培养基的pH为6.5～7，所述第一培育培养基的 pH为6.5～7，所述第二培育培养基的pH为6.5～7。
优选的，所述第一培育培养基和所述第二培育培养基均经过了120～150℃灭菌20～30min。
本申请提供了一种低温好氧反硝化细菌的培育方法，其以好氧池活性污泥为菌种来源，首先以液体富集培养基进行曝气培养，再进行低温驯化培育，最终得到了低温好氧反硝化混合菌群，该方法筛选到的菌群能在低温状况下耐受较高的硝态氮，具有很好的降解COD和硝态氮活性，为同步硝化-反硝化提供可能；同时，筛选得到的菌群能产生一定的碱度，可供给硝化作用消耗，减少碱度投加，降低运行成本，为废水的生物脱氮提供强有力的保障；同时，该菌群还可以产生碱度，降低运行成本的同时为同步硝化-反硝化的实现提供了菌源，在总氮去除工程中具有很好的应用前景。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
鉴于目前低温好氧反硝化细菌的缺乏，本申请提供了一种低温好氧反硝化细菌的培育方法，该方法培育的菌群能够在低温下耐受较高的硝态氮，具有很好的降解COD和硝态氮活性，为同步硝化和反硝化提供了可能，同时，筛选得到的菌群能够产生一定的碱度，可供给硝化作用消耗，减少碱度投加。具体的，本发明实施例公开了一种低温好氧反硝化细菌的培育方法，包括以下步骤：
A)将好氧池活性污泥在富集培养基中曝气培养，得到低温好氧反硝化混合菌群；所述曝气培养的温度为25～35℃；
所述富集培养基以水配制，其中包括：葡萄糖1.0～2.0g/L，NaNO3 0.606～3.636g/L，K2HPO41.0～2.0g/L，FeSO40.5～1.0g/L， CaCl20.2～0.5g/L，MgSO41.0～2.0g/L，NaCl 0.5～1g/L，柠檬酸钠 7～8.5g/L；
B)将所述低温好氧反硝化混合菌群在第一培育培养基中进行第一曝气培养；所述第一曝气培养的温度为15～25℃；
所述第一培育培养基以水配制，其中包括：NaNO3 0.606～1.212g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，FeSO40.5～1.0g/L，CaCl2 0.2～0.5g/L，MgSO41.0～2.0g/L，NaCl 0.5～1g/L，柠檬酸钠7～8.5g/L， 1％溴百里酚蓝指示剂0.5～1mL/L；
C)将步骤B)得到的混合菌群在第二培育培养基中进行第二曝气培养，得到低温好氧反硝化细菌；所述第二曝气培养的温度为 5～15℃；
所述第二培育培养基以水配制，其中包括：NaNO3 0.606～1.212g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，FeSO40.5～1.0g/L，CaCl2 0.2～0.5g/L，MgSO41.0～2.0g/L，NaCl 0.5～1g/L，柠檬酸钠7～8.5g/L， 1％溴百里酚蓝指示剂0.5～1mL/L。
在上述低温好氧反硝化细菌的培育过程中，本申请首先选择合适的菌种，并进行富集培养，即将好氧池活性污泥在富集培养基中曝气培养，即得到低温好氧反硝化混合菌群。上述过程中，以好氧池活性污泥作为菌种来源，其浓度为3～6g/L；所述好氧池活性污泥作为菌种来源，其有利于筛选出低温好氧菌群，降低污泥浓度会使筛选过程延长，且出现筛选效果不佳的情况。所述曝气培养的温度为25～35℃。所述曝气培养为本领域技术人员熟知的技术手段，对此本申请不进行特别的限制；在本申请中，优选采用电磁式增氧泵对培养基进行曝气，且维持溶解氧2.0～5.0mg/L。在上述富集培养的过程中，每天检测总氮指标，总氮降解后更换培养基，更换一定次数后提高硝态氮浓度，直至降解量达到390～590mg/L·d此阶段结束。在此阶段，所述富集培养基的组分如下：葡萄糖1.0～2.0g/L，NaNO30.606～3.636g/L，K2HPO4 1.0～2.0g/L，FeSO40.5～1.0g/L，CaCl20.2～0.5g/L，MgSO41.0～2.0g/L， NaCl 0.5～1g/L，柠檬酸钠7～8.5g/L，上述富集培养基以水配制，pH 为6.5～7。本申请然后将含有的混合菌群的污泥沉降2～4h，弃上清，留沉淀，沉淀占培养体系的比例为25％～45％。
按照本发明，然后将上述得到的混合菌群在第一培育培养基中进行第一曝气培养；所述第一培育培养基的添加量占富集培养基与第一培育培养基总和的55％～75％。所述第一培育培养基的组分如下： NaNO30.606～1.212g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，FeSO40.5～1.0g/L，CaCl2 0.2～0.5g/L，MgSO41.0～2.0g/L，NaCl 0.5～1g/L，柠檬酸钠7～8.5g/L，1％溴百里酚蓝指示剂0.5～1mL/L；其同样以水配制，且在120～130℃灭菌20min，pH值为6.5～7。在上述第一曝气培养的过程中，溶解氧维持为2.0～5.0mg/L，温度为15～25℃；且每天检测总氮指标，总氮降解后更换培养基，更换一定次数后提高硝态氮浓度，直至降解量达到 390～590mg/(L·d)时完成此次培养。此次培育完成之后同样将培养体系沉降2～4h，弃上清，留沉淀，沉淀占培养体系的比例为25％～45％。
本申请然后将上述得到的混合菌群，在第二培育培养基中进行第二曝气培养，即得到低温好氧反硝化细菌；所述第二培育培养基占目前总培养基的55～75％。所述第二培育培养基的组分如下：NaNO3 0.606～1.212g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，FeSO40.5～1.0g/L，CaCl2 0.2～0.5g/L，MgSO41.0～2.0g/L，NaCl 0.5～1g/L，柠檬酸钠7～8.5g/L， 1％溴百里酚蓝指示剂0.5～1mL/L；其同样以水配制，且在120～130℃灭菌20min，pH值为6.5～7。在上述第二曝气培养的过程中，溶解氧维持为2.0～5.0mg/L，温度为5～15℃；且每天检测总氮指标，总氮降解后更换培养基，更换一定次数后提高硝态氮浓度，直至降解量达到 390～590mg/(L·d)时完成此次培养。此次培育完成之后同样将培养体系沉降2～4h，弃上清，留沉淀，沉淀占培养体系的比例为25％～45％。
上述各步骤中的溶解氧独立的选自2～5mg/L，该范围是为了保持好氧环境，溶解氧过低缺氧菌占优势，得不到好氧反硝化细菌，溶解氧过高可能会导致污泥氧中毒，不利于好氧反硝化细菌培养繁殖。上述各步骤中的温度是为了筛选驯化出低温反硝化细菌，温度过低影响细菌生长繁殖，过高得到常温好氧反硝化细菌。
在上述三个培养过程中，具体的培养方法是：每天检测总氮指标和总氮指标，总氮浓度降至10mg/L以下后更换液体富集培养基，富集培养基初始硝态氮浓度为100mg/L，同一硝态氮浓度培养基更换3～5 次；之后更换培养基时提高硝态氮浓度，每次梯度为50～100mg/L，直至硝态氮浓度达到400～600mg/L且降解量达到390～590mg/(L.d)时培养结束。上述培养基更换次数是依据试验效果进行筛选的，减少次数时低温好氧反硝化细菌活性维持性较差，提高浓度后会对菌群进行冲击，增加次数培养效果会好，但培养周期延迟，浪费人力物力，提高培养成本；增加的梯度范围若降低则会增加培养筛选周期，梯度增高可能导致冲击培养体系，影响反硝化活性，得不到低温好氧反硝化细菌。
按照本申请，作为优选方案，最后将上述低温好氧反硝化细菌进行活性验证、筛选，以确保得到的是低温好氧反硝化细菌。在上述验证过程中，将第二曝光培育的菌群接种到液体验证用培养基中，选取颜色变化且产生气泡的实验组检测总氮含量，降解量达到300～500mg/L·d，则确定为低温好氧反硝化细菌。上述液体验证培养基的组分如下：NaNO31.212～2.424g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，FeSO4 0.5～1.0g/L，CaCl20.2～0.5g/L，MgSO41.0～2.0g/L，NaCl 0.5～1g/L，柠檬酸钠7～8.5g/L，1％溴百里酚蓝指示剂0.5～1mL/L；该培养基同样以水配制，且在120～130℃下灭菌20min。
本申请上述四个培养步骤中的培养基中组分与含量的是根据各个培养环节来确定的，但是也并非是任意确定的，其中NaNO3是为了筛选特定反硝化细菌，而且是梯度增加，目的就是根据高浓度硝态氮的降解筛选出具有反硝化活性的菌剂。柠檬酸钠是对反硝化细菌利用效果特别好的碳源，同时反硝化作用利用柠檬酸钠后提高pH，为细菌筛选辨别提供依据。1％溴百里酚蓝指示剂的颜色变化为：pH低于6.0 显黄色，pH6.0～7.6显绿色，pH高于7.6显蓝色，根据培养基是否变蓝判断好氧反硝化细菌的生长。若缺少硝酸钠培养基无法确定筛选菌剂是否具有反硝化效果，无法筛选成功。若缺少1％溴百里酚蓝指示剂，不能直观观察反硝化细菌效果，必须通过指标检测进行确定，会为筛选工作增加大量工作。同样对于培养基的各种组分，若缺少其他一种或多种组分会影响反硝化细菌的正常生长，造成碳源不足、磷源不足、菌体繁殖慢、活性差等。缺少P、Fe、Ca、Mg等微量元素可能会造成细菌生长繁殖过程中部分合成反应缓慢或停滞，筛选到的反硝化细菌效果较差。
本发明提供了一种低温好氧反硝化细菌的培育方法，在培育方法中，三种培养基成分简单易得且成本低廉，配置方法简便，可有效降低菌剂的生产成本；本发明低温好氧反硝化细菌的筛选方法首先对目标菌群进行富集培养，然后对目标菌群进行低温驯化和梯度培育，再进行验证试验，得到低温好氧反硝化菌群。本发明获得的菌群可直接用于制革废水COD和总氮的降解，简单易操作；同时，该菌群还可以产生碱度，降低运行成本的同时为同步硝化-反硝化的实现提供了菌源，在总氮去除工程中具有很好的应用前景。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的低温好氧反硝化细菌的培育方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
(1)低温好氧反硝化混合菌群的富集培养
取某石化污水厂污泥浓度为4g/L好氧池活性污泥，沉降2h后弃去上清，留沉淀；
配制低温好氧反硝化细菌液体富集培养基：葡萄糖1.0g/L， NaNO3 0.606g/L，K2HPO41.0g/L，FeSO40.5g/L，CaCl20.2g/L，MgSO4 1.0g/L，NaCl 0.5g/L，柠檬酸钠7g/L，pH6.5，自来水配置；
取2.5L污泥沉淀添加至装有7.5L好氧反硝化液体富集培养基的塑料桶中曝气培养，温度控制在30℃，培养体系中硝态氮浓度为 100mg/L；采用电磁式曝气泵进行供氧，维持DO在3.0mg/L，上下浮动不超过0.5mg/L；接种完成后取样检测培养体系中的COD、硝态氮、亚硝态氮和氨氮作为初始值，培养24h后取样检测培养体系中的COD、硝态氮、亚硝态氮和氨氮，三者含量之和≤10mg/L时更换新鲜培养基，连续三次硝态氮降解速率达到90mg/(L.d)及以上时，提高体系中硝态氮浓度，每次提高梯度为100mg/L，直至硝态氮浓度达到600mg/L且出水硝态氮、亚硝态氮和氨氮之和均≤10mg/L时结束培养，得到反硝化活性达到500mg/(L.d)及以上的低温好氧反硝化混合菌群；
(2)低温好氧反硝化细菌一次培育：
配制低温好氧反硝化细菌培育培养基：NaNO30.606g/L，KH2PO4 1.1g/L，FeSO40.6g/L，CaCl20.5g/L，MgSO41.3g/L，NaCl 0.7g/L，pH 6.5，柠檬酸钠7.2g/L，1％溴百里酚蓝指示剂0.7mL/L，蒸馏水配置， 121℃灭菌20min备用；
将步骤(1)中的混合菌群静置沉降4h，弃上清，留沉淀，沉淀占培养体系的比例为35％；添加液体培育培养基占培养体系的比例为 65％；
使用电磁式增氧泵对培养基进行曝气，维持溶解氧3.0mg/L，温度为20℃；
每天检测总氮指标，总氮浓度降至10mg/L以下后更换培育培养基，培育培养基初始硝态氮浓度为100mg/L，同一硝态氮浓度培养基更换5次；之后更换培养基时提高硝态氮浓度，每次梯度为90mg/L，直至硝态氮浓度达到400mg/L且降解量达到390mg/(L.d)时完成一次培育；
(3)低温好氧反硝化细菌二次培育：
配制低温好氧反硝化细菌培育培养基：NaNO30.606g/L，KH2PO4 1.1g/L，FeSO40.6g/L，CaCl20.5g/L，MgSO41.3g/L，NaCl 0.7g/L，pH 6.5，柠檬酸钠7.2g/L，1％溴百里酚蓝指示剂0.7mL/L，蒸馏水配置， 121℃灭菌20min备用；
将步骤(2)中的混合菌群静置沉降2h，弃上清，留沉淀，沉淀占培养体系的比例为35％；添加液体培育培养基占培养体系的比例为 65％；
使用电磁式增氧泵对培养基进行曝气，维持溶解氧4.5mg/L，温度为13℃；
每天检测总氮指标，总氮浓度降至10mg/L以下后更换培育培养基，培育培养基初始硝态氮浓度为100mg/L，同一硝态氮浓度培养基更换5次；之后更换培养基时提高硝态氮浓度，每次梯度为60mg/L，直至硝态氮浓度达到550mg/L且降解量达到500mg/(L.d)时完成二次培育；
(4)低温好氧反硝化有效菌株的活性验证
配制低温好氧反硝化细菌筛选液体验证培养基：NaNO31.212g/L， KH2PO41.0g/L，FeSO40.5g/L，CaCl20.3g/L，MgSO41.5g/L，NaCl 0.5g/L，柠檬酸钠7.5g/L，pH 6.8，1％溴百里酚蓝指示剂0.5mL/L，蒸馏水配置，121℃灭菌20min备用；
将(3)中得到的低温好氧反硝化菌群按1‰的接种量接种到液体验证用培养基中，150r/min、10℃条件下培养，11h培养基慢慢变为蓝色，细菌生长处于对数期，硝态氮降解速率较快，亚硝态氮和氨氮有所积累，pH开始上升；15h后培养基表面出现白色密集的气泡，细菌生长处于稳定期；20h后硝态氮和亚硝态氮降解完成，pH趋于稳定；26h后无氨氮积累，证明筛选得到的菌株为低温好氧反硝化细菌。
(5)应用效果
以步骤(3)得到的或步骤(4)验证后的好氧反硝化菌群为处理用细菌，某制革厂废水COD 5000mg/L，总氮250mg/L，取制革废水好氧池泥水混合物分装于两个10L的塑料桶中，每桶5L，其中一桶以泥水混合物为空白对照组，另一桶的实验组按1％接种量接种低温好氧反硝化细菌，曝气培养，DO维持在4mg/L，温度控制在5℃；26h 后，实验组总氮降解率达到99.38％，COD降解率达到92.01％，远远高于空白对照组的5.69％和41.4％。
实施例2
(1)低温好氧反硝化混合菌群的富集培养
取某石化污水厂污泥浓度为6g/L好氧池活性污泥，沉降2h后弃去上清，留沉淀；
配制低温好氧反硝化细菌液体富集培养基：葡萄糖1.5g/L， NaNO30.909g/L，K2HPO41.5g/L，FeSO40.9g/L，CaCl20.5g/L，MgSO4 1.7g/L，NaCl0.8g/L，柠檬酸钠8.5g/L，pH6.9，自来水配置；
取4.5L污泥沉淀添加至装有5.5L好氧反硝化液体富集培养基的塑料桶中曝气培养，温度控制在25℃，培养体系中硝态氮浓度为 150mg/L；采用电磁式曝气泵进行供氧，维持DO在4.0mg/L，上下浮动不超过0.5mg/L；接种完成后取样检测培养体系中的COD、硝态氮、亚硝态氮和氨氮作为初始值，培养24h后取样检测培养体系中的COD、硝态氮、亚硝态氮和氨氮，三者含量之和≤10mg/L时更换新鲜培养基，连续三次硝态氮降解速率达到150mg/(L.d)及以上时，提高体系中硝态氮浓度，每次提高梯度为50mg/L，直至硝态氮浓度达到600mg/L且出水硝态氮、亚硝态氮和氨氮之和均≤10mg/L时结束培养，得到反硝化活性达到400mg/(L.d)及以上的低温好氧反硝化混合菌群；
(2)低温好氧反硝化细菌一次培育：
配制低温好氧反硝化细菌培育培养基：NaNO30.909g/L，KH2PO4 1.6g/L，FeSO40.9g/L，CaCl20.2g/L，MgSO41.8g/L，NaCl 0.8g/L，pH 7.0，柠檬酸钠8g/L，1％溴百里酚蓝指示剂0.5mL/L，蒸馏水配置，121℃灭菌20min备用；
将步骤(1)中的混合菌群静置沉降2.5h，弃上清，留沉淀，沉淀占培养体系的比例为30％；添加液体培育培养基占培养体系的比例为70％；
使用电磁式增氧泵对培养基进行曝气，维持溶解氧3.5mg/L，温度为18℃；
每天检测总氮指标，总氮浓度降至10mg/L以下后更换培育培养基，培育培养基初始硝态氮浓度为150mg/L，同一硝态氮浓度培养基更换4次；之后更换培养基时提高硝态氮浓度，每次梯度为 50-100mg/L，直至硝态氮浓度达到450mg/L且降解量达到400mg/(L.d)时完成一次培育；
(3)低温好氧反硝化细菌二次培育：
配制低温好氧反硝化细菌培育培养基：NaNO30.606g/L，KH2PO4 1.1g/L，FeSO40.6g/L，CaCl20.5g/L，MgSO41.3g/L，NaCl 0.7g/L，pH 6.5，柠檬酸钠7.2g/L，1％溴百里酚蓝指示剂0.7mL/L，蒸馏水配置， 121℃灭菌20min备用；
将步骤(2)中的混合菌群静置沉降3.5h，弃上清，留沉淀，沉淀占培养体系的比例为40％；添加液体培育培养基占培养体系的比例为60％；
使用电磁式增氧泵对培养基进行曝气，维持溶解氧3.5mg/L，温度为12℃；
每天检测总氮指标，总氮浓度降至10mg/L以下后更换培育培养基，培育培养基初始硝态氮浓度为150mg/L，同一硝态氮浓度培养基更换4次；之后更换培养基时提高硝态氮浓度，每次梯度为80mg/L，直至硝态氮浓度达到450mg/L且降解量达到400mg/(L.d)时完成二次培育；
(4)低温好氧反硝化有效菌株的活性验证
配制低温好氧反硝化细菌筛选液体验证培养基：NaNO31.212g/L，KH2PO41.0g/L，FeSO40.5g/L，CaCl20.3g/L，MgSO41.5g/L，NaCl 0.5g/L，柠檬酸钠7.5g/L，pH 6.8，1％溴百里酚蓝指示剂0.5mL/L，蒸馏水配置，121℃灭菌20min备用。
将(3)中得到的低温好氧反硝化菌群按1‰的接种量接种到液体验证用培养基中，150r/min、10℃条件下培养，5-10h培养基慢慢变为蓝色，细菌生长处于对数期，硝态氮降解速率较快，亚硝态氮和氨氮有所积累，pH开始上升；14h后培养基表面出现白色密集的气泡，细菌生长处于稳定期；22h后硝态氮和亚硝态氮降解完成，pH趋于稳定； 26h后无氨氮积累，证明筛选得到的菌株为低温好氧反硝化细菌。
(5)应用效果
以步骤(3)得到的或步骤(4)验证后的好氧反硝化菌群为处理用细菌，某石化污水处理厂废水COD 3300mg/L，总氮180mg/L，取制革废水好氧池泥水混合物分装于两个10L的塑料桶中，每桶5L，其中一桶以泥水混合物为空白对照组，另一桶的实验组按1％接种量接种低温好氧反硝化细菌，曝气培养，DO维持在3.5mg/L，温度控制在8℃；30h后，实验组总氮降解率达到92.35％，COD降解率达到 88.71％，远远高于空白对照组的10.13％和46.55％。
实施例3
以实施例2中筛选出的好氧反硝化菌株为处理用细菌A；采用实施例2中条件参数进行低温好氧反硝化细菌富集培养和培育，将温度全部控制在25℃，得到好氧反硝化菌剂B；
用菌剂A和B同时处理某制革废水，制革厂废水COD 4300mg/L，总氮350mg/L，取制革废水好氧池泥水混合物分装于两个10L的塑料桶中，每桶5L，分别添加按1％接种量接种反硝化细菌A和B，曝气培养，DO维持在4mg/L，温度控制在7℃；32h后，添加A菌剂组总氮降解率达到93.77％，COD降解率达到89.01％，远远高于B菌剂组的15.69％和32.94％。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种低温好氧反硝化细菌的培育方法，包括以下步骤：
A)将好氧池活性污泥在富集培养基中曝气培养，得到低温好氧反硝化混合菌群；所述曝气培养的温度为25～35℃；
所述富集培养基以水配制，其中包括：葡萄糖1.0～2.0g/L，NaNO30.606～3.636g/L，K2HPO4 1.0～2.0g/L，FeSO4 0.5～1.0g/L，CaCl20.2～0.5g/L，MgSO4 1.0～2.0g/L，NaCl0.5～1g/L，柠檬酸钠7～8.5g/L；
B)将所述低温好氧反硝化混合菌群在第一培育培养基中进行第一曝气培养；所述第一曝气培养的温度为15～25℃；
所述第一培育培养基以水配制，其中包括：NaNO30.606～1.212g/L，KH2PO4 1.0～2.0g/L，FeSO4 0.5～1.0g/L，CaCl20.2～0.5g/L，MgSO4 1.0～2.0g/L，NaCl 0.5～1g/L，柠檬酸钠7～8.5g/L，1％溴百里酚蓝指示剂0.5～1mL/L；
C)将步骤B)得到的混合菌群在第二培育培养基中进行第二曝气培养，得到低温好氧反硝化细菌；所述第二曝气培养的温度为5～15℃；
所述第二培育培养基以水配制，其中包括：NaNO30.606～1.212g/L，KH2PO4 1.0～2.0g/L，FeSO4 0.5～1.0g/L，CaCl20.2～0.5g/L，MgSO4 1.0～2.0g/L，NaCl 0.5～1g/L，柠檬酸钠7～8.5g/L，1％溴百里酚蓝指示剂0.5～1mL/L。
2.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤C)之后还包括：
D)将步骤C)得到的低温好氧反硝化细菌在液体验证培养基中验证。
3.根据权利要求2所述的培育方法，其特征在于，所述液体验证培养基以水配制，其中包括：NaNO3 1.212～2.424g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，FeSO4 0.5～1.0g/L，CaCl2 0.2～0.5g/L，MgSO4 1.0～2.0g/L，NaCl 0.5～1g/L，柠檬酸钠7～8.5g/L，1％溴百里酚蓝指示剂0.5～1mL/L。
4.根据权利要求1或2所述的培育方法，其特征在于，步骤A)中，所述曝气培养的溶解氧为2.0～5.0mg/L；步骤B)中，所述第一曝气培养的溶解氧为2.0～5.0mg/L；步骤C)中，所述第二曝气培养的溶解氧为2.0～5.0mg/L。
5.根据权利要求1或2所述的培育方法，其特征在于，步骤A)、步骤B)和步骤C)的培养过程中独立的按照以下方法培养：
每天检测总氮指标和总氮指标，总氮浓度降至10mg/L以下后更换培养基，培养基初始硝态氮浓度为100mg/L，同一硝态氮浓度培养基更换3～5次；之后更换培养基时提高硝态氮浓度，每次梯度为50～100mg/L，直至硝态氮浓度达到400～600mg/L且降解量达到390～590mg/L·d时培养结束。
6.根据权利要求1或2所述的培育方法，其特征在于，步骤A)、步骤B)和步骤C)中培养后的菌群的处理方法独立的为：
将得到的菌群沉降2～4h，弃上清，留沉淀，沉淀占培养体系的比例为25％～45％。
7.根据权利要求1或2所述的培育方法，其特征在于，所述富集培养基的pH为6.5～7，所述第一培育培养基的pH为6.5～7，所述第二培育培养基的pH为6.5～7。
8.根据权利要求1或2所述的培育方法，其特征在于，所述第一培育培养基和所述第二培育培养基均经过了120～150℃灭菌20～30min。
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