CN101050446A - 一株高效利用亚硝态氮的沼泽红假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对亚硝态氮有高同化利用效率的光合细菌，具体地说是提供一种同化亚硝态氮的沼泽红假单胞菌菌株及其复壮、保藏、生物测定和应用技术。本发明属于生物净水剂和生物肥料的范畴，提供的光合细菌可用于控制水产养殖水体亚硝态氮含量、改善环境污染、消除苯丙烯酸和苯甲酸、固氮生物肥料、连作黄瓜增产促生长剂等。

Description

一株高效利用亚硝态氮的沼泽红假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种能够高效利用亚硝态氮(以NO2 -及其盐类形态存在的含氮化合物)的光合细菌，具体地说是提供一种能够高效同化还原亚硝态氮的沼泽红假单胞菌2-8(Rhodopseudomonas palustris 2-8)菌株(CCTCC M 205147)及其产业化培养方法、菌种保藏方法、菌株复壮方法和亚硝态氮消除的生物测定方法。它属于生物净水剂和生物肥料的范畴。
背景技术
水产养殖水体中的残饵、鱼虾***物、死亡的生物残体以及药物、肥料等在水体底层积累、分解、转化，形成硫化氢、氨氮、亚硝态氮以及其它氮氧化物等对鱼虾有毒害的化合物，使水质恶化，严重威胁养殖动物的生存和正常生长。在高密度、集约化养殖条件下，大量投饵往往使水体中的亚硝态氮含量严重超标，NO2 -在水产动物体内和血红素结合成高铁血红素，高铁血红蛋白不能运载氧，水产动物便死于缺氧。养殖池中非离子态氨氮和亚硝态氮含量增加与爆发性鱼病有密切关系，因此水产养殖水体亚硝态氮的生物消除成为水产健康养殖中一个突出的亟待解决的问题。
亚硝态氮在自然界通过同化代谢和异化代谢两种反硝化途径被消除。同化代谢是在微生物或植物的亚硝酸盐同化还原酶作用下，将亚硝态氮还原成NH4 +，然后NH4 +在细胞内参与氨基酸等物质的合成并最后转化为蛋白质以及生物体内的其它含氮物质；异化代谢是在亚硝酸盐异化还原酶的作用下，还原成N2O，进一步转化生成N2释放到环境中。本发明提供的沼泽红假单胞菌2-8菌株对亚硝态氮的消除为同化消除：其在含亚硝酸钠的培养基中厌氧生长，虽然培养基中NO2 -逐步减少，但并不出现NH4 +和NO3 -的增加，也无气体产生。亚硝酸盐还原酶广泛存在于微生物和植物体中，在氮素循环中发挥着重要的作用。虽然自然界广泛存在各种类型的反硝化细菌，能够最终把NO2 -转化为NO、N2O和N2，但养殖水体特有的富营养环境，使水体中自有的微生物体系对亚硝态氮的自净能力不足以将亚硝态氮浓度降低到养殖动物耐受的水平，因此常常需要借助其它途径如添加具有代谢亚硝态氮的微生物、添加化学试剂或者两种方式结合的方法来降低水体中亚硝态氮的含量。目前养殖水体中亚硝态氮的去除主要使用化学氧化法和微生物处理法。化学氧化法见效快，但维持时间短，要不断投入化学药物将其氧化，成本高且存在二次污染的问题。以各种反硝化细菌为主的微生物产品也在一定程度上能够消除水体亚硝态氮，但受水体微生物类群的影响，难以有效发挥功效，实际生产中成功几率小，严重制约了生物制剂在水产品健康养殖中的使用。
光合细菌(Photosynthetic Bacteria，简称光合细菌)是能够进行光合作用的一类细菌，是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物，它与其它光合生物一起构成了自然界生态***中的原始生产者，并在自然界物质转化和能量循环中起着重要作用。其中某些科、属，能在光照厌氧条件下降解小分子有机物，并利用有机物经异养菌分解产生的有机酸、硫化氢和氨氮作为合成菌体的基础物质，从而降低水体中的COD和氨氮，提高水的溶氧量，因而能有效地净化有机废水，改善海水、淡水的养殖生态环境，提高养殖产量。有些科、属，还能降低水中重金属离子的含量。研究表明光合细菌能够使水产养殖池水体中的氨氮、硫化氢下降50％以上，溶氧率提高14％～85％，所以光合菌是一种改善环境污染的有效生物武器。另外，光合细菌菌体的蛋白质含量高达65％以上，富含B族维生素及多种生理活性物质如辅酶等，而且生成的菌体也对人、畜、禽等各种生物无毒、无害，因此，在水产养殖、畜禽养殖、农业生产、保健制品、生物医药等各个领域都得到了应用。
光合细菌中的紫色非硫细菌是地球上发现的新陈代谢机制最多变的生物，并成为探索许多重要生命过程的模式生物。这些细菌能够利用微生物的五种主要模式进行新陈代谢，包括需氧和厌氧化学异养型、需氧化能自养型、厌氧光能自养型和光能异养型。沼泽红假单胞菌属于紫色非硫细菌，广泛存在于土壤和水体中，与其它的紫色非硫细菌或任何现存的生物相比，具有其独特性，能够在单细胞中催化更多的生化过程。沼泽红假单胞菌有极其广泛的生存条件，非常强的生活能力，能以上面所列的所有代谢模式中的任何一种进行生长和繁殖；而且它在光能异养生长时对有机碳源(包括芳香族碳水化合物和木质素单体)的利用、以及在以二氧化碳为唯一碳源进行光能自养时，对电子供体(硫化合物和氢气)的利用上都有相当强的灵活性。早在1981年，就在荚膜红假单孢菌中发现了亚硝酸盐同化还原酶，而且国内也有关于沼泽红假单胞菌消除亚硝态氮的报道。雷爱莹等(2005)报道筛选到一株能降解亚硝酸盐的沼泽红假单胞菌，此菌能在第九天把0.0461mg/L的亚硝态氮降低到0.0309mg/L，而此时对照组中亚硝酸盐浓度则从初始的0.0418mg/L上升至0.0825mg/L，实际此菌株能在第九天把0.0825mg/L的亚硝酸盐降低到0.0309mg/L，其降解率为62.54％左右。徐姗楠等(2004)从河水和鱼塘底泥等样品中分离得到的28株紫色非硫光合细菌中有18株沼泽红假单孢菌，其中有3株沼泽红假单孢菌具有亚硝态氮的消除能力，它们在灭菌的养殖水体中培养72h后对2.9mg/L亚硝态氮的降解能力分别为68.96％、81.03％、93.79％。文献的结果显示沼泽红假单胞菌中确实存在具有亚硝态氮消除能力的菌株，通过模拟文献(徐姗楠等，2004)所描述的条件，发现本专利菌株能够在24h内将灭菌虾塘水中2.9mg/L的亚硝态氮降低99.68％，并同时能够把不灭菌的虾塘水中同样的亚硝酸盐在30h左右降低98.45％，显然本专利菌株在同等条件下比文献报道菌株的亚硝酸盐消除能力更强、更快。值得注意的是，水产养殖生产实践中所需要的菌株，不仅需要其具备消除亚硝态氮的潜力，还需要能够在水体中快速繁殖，否则很难用于生产实践，因为养殖水体不仅含有各种丰富的有机物，还含有各种类型的微生物，尤其包括大量的以细菌为食的浮游生物，这些微生物的存在会影响到应用的效果。本发明专利提供的沼泽红假单胞菌，针对上述问题，经过了长达2年、30余次的提纯、复壮和大量的田间试验证实，该菌株不仅具有高效快速降低自然养殖水体亚硝态氮的能力，还具有在养殖水体中利用各种有机物快速生长的能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有快速、高效地同化还原亚硝态氮能力的沼泽红假单胞菌菌株、以及本菌株的产业化培养基和培养方法、利用该方法生产的产品的用途和使用方法、菌种保藏方法、菌株复壮方法、亚硝态氮消除的生物测定方法和用途。
本发明提供的光合细菌为沼泽红假单胞菌2-8(Rhodopseudomonas palustris 2-8)，已于2005年12月16日保藏在中国典型培养物保藏中心(缩写为CCTCC)，保藏号为CCTCC M 205147。该菌株分离自广东韶关鱼塘的池底污泥，该菌为革兰氏阴性细菌，菌体小，呈杆状到卵形，较老的培养物形成玫瑰花形和集束形，不对称***。菌株在酸性培养基中成圆形，碱性培养基中菌体圆形至椭圆，部分成杆状。在加硫化钠的固体培养基中生长成小的无色透明小菌落，后期菌落由中心开始变成棕红，不断向外扩散。菌液在初期为桃红色，后期变为深红色。离心收集菌体，并用40％蔗糖溶液重新悬浮后测得菌体在750～900nm和790～1030nm处有吸收峰，不能在含3％NaCl的培养基中生长，能够在含有丙氨酸、丙酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、对氨基苯甲酸的培养基中生长，不能利用酒石酸盐做唯一碳源生长，具有明胶液化能力，能够水解淀粉、能够在纤维素钠或果胶为唯一碳源的培养基上生长，具有固氮能力。
室内生物测定发现，本发明提供的菌株能够在接种量为0.14‰的情况下，12h内把1.89mg/L的亚硝态氮消除99.2％以上，经过驯化，本菌株在同样接种量的情况下，在24h内，能够把35mg/L的亚硝态氮消除99.98％以上。其具有快速、高效、用量少、消除彻底的优点，并且消除亚硝态氮的能力能够通过驯化得到提高；在含亚硝酸钠的培养基中培养此菌，随着培养基中亚硝态氮的逐步减少，不出现NH4 +和NO3 -的增加，也无气体产生，除此之外，本菌株同时还具有代谢苯丙烯酸和苯甲酸的能力及固氮能力。
本发明包括以下几方面内容：
(1)沼泽红假单孢菌2-8，属于紫色非硫细菌的红假单胞菌属，具有同化代谢NO2 -的能力(即厌氧培养消除亚硝态氮后，在培养基中检测不到NH4 +和NO3 -的升高，也无气体产生)，其能够在黑暗好氧和光照好氧的条件下代谢NO2 -。
(2)适用于(1)中光合细菌产业化培养的培养基配方和培养方法。本发明在已知培养基的基础上根据本专利菌株的特性，对本菌株的最适培养基进行了优化改进，筛选出三个适用于产业化培养的培养基，它们分别是：①乙酸钠0.2％、氯化铵0.1％、磷酸氢二钠0.05％、氯化镁0.001％、六水氯化铁0.001％、七水硫酸锌0.0022％、氯化钠0.2％、酵母膏或蛋白胨0.1～0.2％、10％碳酸氢钠溶液50ml/L，乙醇1.5～2.0ml/L，用0.1N磷酸调至pH7.0；②丙酸钠0.2％、氯化铵0.1％、磷酸氢二钠0.05％、氯化镁0.001％、六水氯化铁0.001％、七水硫酸锌0.0022％、氯化钠0.2％、酵母膏或蛋白胨0.1～0.2％、10％碳酸氢钠溶液50ml/L，乙醇1.5～2.0ml/L，用0.1N磷酸调至pH7.0；③琥珀酸钠0.2％、氯化铵0.1％、磷酸氢二钠0.05％、氯化镁0.001％、六水氯化铁0.001％、七水硫酸锌0.0022％、氯化钠0.2％、酵母膏或蛋白胨0.1～0.2％、10％碳酸氢钠溶液50ml/L，乙醇1.5～2.0ml/L，用0.1N磷酸调至pH7.0。采用本优化培养基可以把培养液的细菌浓度从108cfu/ml提高到1.8×1011cfu/ml以上。
(3)上述(1)中提及的沼泽红假单胞菌，按上述(2)中提及的任何一种配方规模化生产，获得的发酵液，其活菌数达到1011cfu/ml以上，将此发酵液按4公斤/亩施用，此菌能够在24h内将南美白对虾养殖水体中0.3mg/L以上的严重超标的水体亚硝态氮降低至0.05mg/L以下，并在以后的10d内，持续维持亚硝态氮含量在0.05mg/L左右。此后，每隔15天投放一次，可以完全控制养殖水体亚硝酸盐不超标。
(4)上述(1)～(3)中提及的菌株及其培养产物，用于水产养殖水体中亚硝态氮的消除。
(5)一种适用于(1)～(4)任何一项提及的菌株和其它具有亚硝态氮同化能力的光合细菌菌株复壮方法。具体操作：称取虾塘或鱼塘肥沃新鲜底泥200～300g，置于500ml盐水瓶中，然后在盐水瓶中加入10g南美白对虾饲料，用鱼塘或虾塘水加满盐水瓶，经高压灭菌冷却后，按3％的接种量接入待复壮菌株，密封后光照培养2～6天，既可获得具有高活性亚硝态氮还原能力的菌株。如有必要，可以重复上述操作三次以上。
(6)一种适用于(1)～(5)中任何一项提及的菌株及其它具有亚硝态氮同化能力的光合细菌保持其高效亚硝态氮还原能力的菌种保藏方法。具体操作为：按3％的接种量接种待保藏菌液到无菌对虾饲料底泥培养基(即称取虾塘或鱼塘肥沃新鲜底泥200～300g，置于500ml盐水瓶中，然后在盐水瓶中加入10g南美白对虾饲料，用鱼塘或虾塘水加满盐水瓶，经高压灭菌冷却后备用)中，光照培养3天后，弱光照室温保藏。
(7)一种适用于评价(1)～(6)中任何一项提及的菌株和其它具有类似功能的菌株亚硝态氮消除能力的生物测定方法。该方法采用双评价***。评价***1：在培养基1(氯化铵0.1％、磷酸氢钠0.05％、硫酸镁或氯化镁0.02％、氯化钠0.2％、酵母膏或蛋白胨0.1～0.2％，将以上成分溶于水，121℃蒸汽灭菌20min。分别制备下列溶液并过滤除菌：①10％碳酸氢钠、②乙醇 ③0.1N磷酸。在上述基础培养基中加入碳酸氢钠溶液50ml，乙醇1.5～2.0ml，用0.1N磷酸调至pH7.0)中加入亚硝酸钠，按照106cfu/ml的浓度加入待测微生物，厌氧光照培养，每隔4～6h测定培养基中剩余亚硝酸盐的含量，连续测定3～4次，数据可用于评价不同菌株或不同处理方式的亚硝态氮消除能力差别；评价***2：采集含有亚硝酸盐的塘水和该塘的底泥，按每升塘水加200～400g底泥的比例混合过夜澄清，取上清。测定前按2g/L的浓度加入乙酸钠，然后按评价***1中的接种量接种，光照好氧或保持自然光照与室温，每4～6h测定一次亚硝酸盐的含量，用于比较亚硝态氮消除能力的差异。评价***1和评价***2联合使用，能够较好的反映菌株亚硝态氮消除能力的差异，具体见实施例5。但在生物测定的过程中，需要注意：①本发明中所使用的亚硝态氮显色试剂能够对0～1.9mg/L的NO2 -正常显色，且在520nm处的OD值和NO2 -的浓度存在线性关系，显色试剂配方为：1.0gα-萘胺，10g对氨基苯磺酸，89g酒石酸，于研钵中研磨成粉末状，然后混合均匀，保存于棕色瓶中备用。②每次测定加入稍过量的试剂，约0.01～0.1g(如果塘水太混浊，需经双层滤纸过滤后再加入显色试剂)，混匀，静置显色10min，用分光光度计在520nm下测定显色后液体的OD值。③如果塘水的亚硝态氮含量太高，显色时出现沉淀，需要对塘水进行稀释以免出现沉淀影响OD值的测定。④显色反应前，需要使用15000rpm的速度离心15min去除菌体，尤其是光合细菌，其含有的色素在520nm处具有一定的吸收峰，如不离心去除菌体，则会影响测定的结果。
(8)上述(1)～(7)中任何一项提及的光合细菌经过驯化培养，对亚硝酸钠的最高耐受能力能够达到35mg/L，并能将该浓度的亚硝态氮降低99.98％。
(9)上述(1)～(8)中任何一项提及的光合细菌具有固氮的能力，可以用作固氮生物肥料。
(10)上述(1)～(9)中任何一项提及的光合细菌对黄瓜有增产作用，可用作连作黄瓜增产、促生长菌剂。
(11)上述(1)～(10)中任何一项提及的光合细菌能够利用苯丙烯酸和苯甲酸做唯一碳源生长，可用于苯丙烯酸和苯甲酸生物消除。
具体实施方式
下面列举本发明的实施例说明本发明的实施方案和效果，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1  菌种的制备
取沼泽红假单胞菌2-8菌液100μl涂布接种到含培养基2的平板上，置于厌氧罐中，在光照强度为2000lux，温度为28℃～30℃条件下培养3天后，从培养基斜面挑取1接种环菌种接种到液体培养基1中，同样温度光照条件下厌氧培养3天，然后按3％的接种浓度在液体培养基1中再扩增2次，即得到可用于大规模生产的菌株培养液。
A、培养基1的配方如下：氯化铵0.1％、磷酸氢钠0.05％、硫酸镁或氯化镁0.02％、氯化钠0.2％、酵母膏或蛋白胨0.1～0.2％，将以上成分溶于水，121℃蒸汽灭菌20min。分别制备下列溶液并过滤除菌：①10％碳酸氢钠 ②乙醇 ③0.1N磷酸。在上述基础培养基中加入碳酸氢钠溶液50ml(注：在1L上述培养基中加入50ml碳酸氢钠溶液)，乙醇1.5～2.0ml，用0.1N磷酸调至pH7.0。
B、培养基2的配方为，在培养基1的基础上添加1.5％的琼脂粉。
实施例2  菌体的大规模生产培养
先用次氯酸钠溶液消毒培养用容器和自来水，然后用硫代硫酸钠中和。然后在培养容器中按发明内容(2)中所述的任何一种培养基配方加入试剂，配制成培养基，接入10％的三级菌种，最后用消毒后经中和剂中和过的自来水加满整个容器，置于28℃～30℃，光照强度为2000lux下培养5～7天，即可得产品。
消毒处理试剂和时间如表1：
表1、本专利菌株2-8大规模生产时消毒技术参数
  消毒对象   次氯酸钠液体用量(ml/L)   消毒后水中余氯量(mg/L)   消毒处理时间(min)   中和剂   中和剂用量(mg/L)   中和时间(min)
  自来水容器   0.063.0   5.0300   3060   NaS2SO4NaS2SO4   8.5510   3030
实施例3  菌株的复壮
采集虾塘或鱼塘肥沃新鲜底泥200～300g，置于500ml盐水瓶中，并加入10g南美白对虾饲料，然后用鱼塘或虾塘水加满盐水瓶，经高压灭菌冷却后，按3％的接种量接入待复壮菌株，厌氧光照培养2～6天，即可获得具有高活性亚硝态氮还原能力的菌株。如有必要，可以重复上述操作三次以上。菌株复壮后按照实施例6介绍的评价方法对复壮后菌株的亚硝态氮同化能力进行测定。
按照上述方法复壮本专利菌株2-8后，经实施例6的评价方法测定，结果如下表：
表2、复壮菌株与原始菌株在评价***1中对亚硝态氮的消除能力比较
  测试时间(h)   原始菌株   复壮菌株
  亚硝酸盐剩余值(mg/L)   消除率(％)   亚硝酸盐剩余值(mg/L)   消除率(％)
  06122448   0.460.630.210.340.00   0-35.7553.8926.30100.70   0.590.970.420.270.01   0-64.2329.1054.0097.49
表3、复壮菌株与原始菌株在评价***2中对亚硝态氮的消除能力比较
  测试时间(h)   原始菌株   复壮菌株
  亚硝酸盐剩余值(mg/L)   消除率(％)   亚硝酸盐剩余值(mg/L)   消除率(％)
  06172430   1.221.211.271.461.78   00.68-4.55-19.78-46.69   1.221.170.560.350.03   03.9753.9071.4697.50
对菌株复壮的目的是为了提高菌株在自然水体中利用各种有机物快速繁殖并消除亚硝态氮的能力，从评价结果来看，虽然原始菌株和复壮菌株均能在评价***1中有效的消除亚硝态氮，但原始菌株不能在评价***2中消除虾塘水中的亚硝酸盐，而复壮菌株则能够有效的在30h将虾塘水中的亚硝态氮消除97.50％，很显然通过上述的复壮操作，提高了菌株在自然水体中的生存能力，从而达到稳定消除亚硝态氮的目的。
实施例4  高浓度亚硝态氮对菌株耐受能力的驯化
将本专利菌株的发酵液按3％的接种量接入含有15mg/L亚硝酸钠的培养基1中，置于光照培养箱，光照度控制在1200-2000lux范围内，28℃下进行光照厌氧培养，每隔12h测定培养基中剩余的亚硝态氮浓度，培养7天后，将驯化培养液按3％的接种量接种到亚硝酸盐浓度为25mg/L的培养基1中，置于同样条件培养，同时每隔12h测定培养基中剩余亚硝态氮浓度，培养七天后，再将培养液按3％的接种量接种到亚硝酸盐浓度为35mg/L的培养基1中。结果表明，在上述的耐受能力梯度驯化中，菌株均在24h内分别把25mg/L、35mg/L的亚硝酸盐消除99.86％、99.98％以上。本研究未做最大亚硝酸盐耐受浓度的测定。
实施例5  菌株的保藏
称取虾塘或鱼塘肥沃新鲜底泥200～300g，置于500ml盐水瓶中，然后在盐水瓶中加入10g南美白对虾饲料，用鱼塘或虾塘水加满盐水瓶，经高压灭菌冷却后，按3％的接种浓度接入待保藏菌株，光照培养6天后，弱光照室温保藏，每半年转接一次，并测定其亚硝态氮同化能力以及培养性状有无变化。这样的方法可以保持菌株的功能和生长性能不退化。
经上述方法保藏后的菌株，活化后，通过实施例6所述的评价***评价结果如下表所示。
表4、保藏活化菌株在评价***1中对亚硝态氮的消除能力测定
  测试时间(h)   原始菌株   保藏活化菌株
  亚硝酸盐剩余值(mg/L)   消除率(％)   亚硝酸盐剩余值(mg/L)   消除率(％)
  061224   1.241.251.210.10   0-0.522.8291.55   1.241.191.240.09   03.930.3992.52
从表4结果可知，通过上述菌种保藏方法活化出的菌株与原始菌株相比，亚硝态氮消除能力仍然保持较高水平。
实施例6  菌株同化亚硝态氮能力的生物测定
(1)亚硝酸钠含量标准曲线的测定
配制1L培养基1(氯化铵0.1％、磷酸氢钠0.05％、硫酸镁或氯化镁0.02％、氯化钠0.2％、酵母膏或蛋白胨0.1～0.2％，将以上成分溶于水，121℃蒸汽灭菌20min。分别制备下列溶液并过滤除菌：①10％碳酸氢钠、②乙醇 ③0.1N磷酸。在上述基础培养基中加入碳酸氢钠溶液50ml，乙醇1.5～2.0ml，用0.1N磷酸调至pH7.0)，高压灭菌后，无菌操作，加入过滤除菌后的其他组分，并调好pH值，然后用灭菌的500ml容量瓶，以上述培养基1为溶剂，配成终浓度为5mg/L的亚硝酸钠母液，以亚硝酸钠的含量衡量亚硝态氮含量。取一定量的含亚硝酸钠的培养基1与一定量的不含亚硝酸钠的培养基1溶液到灭菌的干净试管中，使亚硝酸钠的终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、1.9mg/L，每个浓度三次重复。再加入稍过量(使亚硝态氮完全显色)的如发明内容(5)中所述的显色试剂(1.0gα-萘胺，10g对氨基苯磺酸，89g酒石酸，于研钵中研磨成粉末状，然后混合均匀)约0.1g，混匀，静置显色10min后，用分光光度计在520nm下测定显色后液体的OD值。最后根据亚硝酸钠浓度及其对应的OD520nm值绘制培养基中亚硝酸钠浓度标准曲线。得到OD值和亚硝酸钠浓度之间的方程为y＝0.4526x+0.0356(其中y为OD520nm，X为培养基1中亚硝酸钠浓度，方程的相似性系数达到R2＝0.9966)，本方程用于发明内容(7)中所述的评价***1。
同理，按照上述亚硝酸钠浓度标准曲线测定过程，将培养基1换成蒸馏水，测定水体中亚硝酸盐标准曲线，根据此标准曲线得出水体中亚硝酸钠浓度和OD值之间的方程式为y＝0.4633x+0.0313，其中y为OD520nm值，X为亚硝酸钠浓度，方程的相似性系数达到R2＝0.9954，本方程用于发明内容(7)中所述的评价***2。
(2)测定本专利菌株2-8对培养基1中亚硝酸钠的消除能力(发明内容(7)中评价***1的应用实例)
在50ml的磨口锥形瓶中，加入50ml无菌的培养基1和过滤除菌的亚硝酸钠溶液，使亚硝酸钠终浓度达1.4mg/L，然后接种本专利菌种2-8，接种量按106cfu/ml计算，以不接种的培养基为对照。30℃，2000lux下厌氧培养，每隔6h测定培养基中剩余的亚硝酸钠含量。
测定方法：取2ml菌液15000rpm离心15min，取出上清液到试管中，加入稍过量约0.01～0.1g(先加少许约0.01g，摇匀后液体无色则无需再加，如摇匀后有红色出现，则需再加一定量的显色剂，但总量需控制在0.1g，过量的显色剂会影响测定结果的准确性)的如发明内容(7)中所述的显色试剂，混匀，静止显色10min，然后用分光光度计在520nm下测定显色后液体的OD值。根据用于评价***1的方程，得出液体中剩余的亚硝态氮含量，然后根据对照的亚硝态氮含量，计算亚硝态氮剩余值，具体结果见表5。
表5、本专利菌株2-8在评价***1中对亚硝态氮的消除生物测定结果
  处理时间   对照的亚硝酸盐剩余值(mg/L)   处理的亚硝酸盐剩余值(mg/L)
  0小时6小时12小时24小时   1.16221.16221.16221.1622   1.16220.86230.0250-0.0399
从表5的数据可以看到，在含亚硝态氮的培养液中接种本专利菌株24h，已经将评价***1中的亚硝酸钠100％消除。
(3)测定本专利菌株2-8在虾塘水中对亚硝态氮的同化能力(发明内容(7)中评价***2的应用实例)
自南美白对虾养殖池塘中采回含亚硝态氮的塘水和底泥，首先对塘水的基本情况进行记录(如：盐度、pH值、颜色、混浊度、含藻情况等)，并加入如前述的显色剂，静置10min后，测定OD520nm值，根据标准曲线y＝0.4633x+0.0313计算出塘水的初始亚硝态氮含量。然后按照发明内容(5)中评价***2的方法，取1000ml塘水，加入200g底泥，搅拌后，澄清过夜，第二日上午8:00左右，倒出上清，在上清液中按2g/L浓度加入乙酸钠，混合均匀后按50ml/瓶分装到洁净的具盖玻璃瓶中，然后按106cfu/ml的接种量接入本专利菌株2-8，以不接种的加乙酸钠塘水为对照。混合物在室温，2000lux光照下好氧培养，每隔6h测定塘水中剩余的亚硝态氮含量，测定方法同评价***1，结果见表6。
表6、本专利菌株2-8在评价***2中对亚硝态氮的消除生物测定结果
  处理时间   对照的亚硝态氮剩余值(mg/L)   处理的亚硝态氮剩余值(mg/L)
  0h6h12h24h30h   0.96091.38191.89081.24121.3129   0.96090.52300.01570.01520.0747
从表6的数据可以看到，在含亚硝态氮的培养液中接种本专利菌株12h后，已经将评价***2中的亚硝态氮降低到正常水平。虽然从6h到12h期间，对照的亚硝态氮浓度有很大幅度的升高，但2-8处理的虾塘水亚硝态氮剩余含量仍然保持稳定。
实施例7  本专利菌株消除水产养殖水体中亚硝态氮的处理方法
在进行实验前首先按照实施例2所述方法大规模培养好菌液，浓度达1011cfu/ml，然后按照按4公斤/亩的量施用。施用前先将产品在较大容器内混合均匀，并在阳光下照射2h左右，以激活本专利菌株，然后整个水面均匀泼洒。在加入菌液之前对虾塘的亚硝态氮初始含量进行测定，每隔12h，取塘水测定养殖塘水中剩余亚硝态氮的含量。2005年12月在广东中山坦洲的冬棚南美白对虾养殖池塘中田间试验，24h内，按上述方式使用，本专利菌株将该养殖水体的亚硝态氮从0.3mg/L降到0.05mg/L，并持续维持了20天左右。
实施例8  菌株利用苯丙烯酸和苯甲酸
(1)苯丙烯酸和苯甲酸标准曲线的测定
首先分别配制一系列一定浓度的苯甲酸和苯丙烯酸标准溶液，然后用分光光度计分别在290nm和272nm处测定这些标准溶液所对应的OD值，根据苯丙烯酸和苯甲酸的标准浓度以及它们所对应的OD绘制标准曲线，并得出OD值和苯丙烯酸以及OD值和苯甲酸浓度间的计算方程式分别为y＝46.394x-0.0023(其中Y为OD290nm，X为苯丙烯酸浓度g/L，R2＝0.9997)和y＝3.6171x+0.0038(其中Y为OD272nm，X为苯丙烯酸浓度g/L，R2＝0.9992)。
(2)本专利菌株利用苯丙烯酸以及苯甲酸能力的测定
首先，配置光合细菌基本培养基(无有机碳源)，此培养基配方为氯化铵0.1g、碳酸氢钠①0.1g、磷酸氢钾0.02g、七水合硫酸镁0.02g、氯化钠0.1g、生长辅助因子②1ml、蒸馏水100ml、微量元素溶液③1ml、pH7.0。
①事先制备5％碳酸氢钠水溶液，(碳酸氢钠5g，蒸馏水100ml)经过滤除菌后，取2ml与其它经高压灭菌的培养基混合。
②生长辅助因子：称取β-氨基苯甲酸0.1mg，溶于10ml蒸馏水中，过滤除菌。
③微量元素溶液：六水合氯化铁5mg、五水合硫酸铜0.05mg、硼酸1mg、四水合氯化锰0.05mg、七水合硫酸锌1mg、六水合硝酸钴0.5mg，将以上试剂分别溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，然后过滤除菌。
(以上除①、②、③外，各成分溶解后121℃蒸汽灭菌20min，然后分别加入①、②、③，再调pH为7.0)
然后，在上述基本培养基中分别加入1.0g的苯丙烯酸和苯甲酸。并将本专利菌株2-8按3％的浓度接种于上述含苯丙烯酸或苯甲酸的培养基中，每个浓度设置三个重复。(以基本培养基同样条件下培养为对照)观察其生长情况，并记录。用“+”表示其生长的程度，“-”表示不生长。最后用紫外分光光度计测定OD值(波长分别为290nm和272nm)，结果见表7。
结果显示本菌株能在第四天降解50％以上的苯丙烯酸，但对苯甲酸的降解率不是很高，只能达到28％左右。
表7、本专利菌株2-8对苯丙烯酸和苯甲酸的降解测定结果
  自然降解率   生物降解率   总降解率
  苯丙烯酸降解率苯钾酸降解率   18.52％18.66％   40.53％9.57％   59.05％28.23％
实施例9  菌株固氮能力测定
将1.5ml在上述培养基1中培养好的菌株，12000rpm，离心5min，然后用无菌的生理盐水清洗数次，并用1ml无菌的生理盐水重悬浮，接种于阿须贝无氮培养基上。每株菌接3个平皿，另取1平皿接种1ml无菌生理盐水作为对照，30℃培养5d后，观察其生长情况。结果显示此菌能在无氮培养基上生长，说明它具有固氮特性。
阿须贝无氮培养基配方：葡萄糖10.0g、磷酸二氢钾0.2g、硫酸镁0.2g、氯化钙0.2g、硫酸钙0.1g、碳酸钙5.0g、蒸馏水1000ml、pH7.0。
实施例10  菌株对连作黄瓜的增产效果研究
2006年5月至6月间在珠海市农业科学研究中心的温室中开展对连作黄瓜的增产研究，黄瓜品种为萨瑞格(以色列进口品种)，设计小区对比试验，对照为常规种植，处理则在育苗移栽时用本专利菌株2-8菌液50ml(106cfu/ml)浇灌根部，每个小区30株苗，3个重复，并从6月1日到6月17日黄瓜开始收获时，记录了不同小区的产量，对照小区在17d内的平均总产量为3525g/30株，用2-8处理后的小区在17d内的平均总产量为5850g/30株。用2-8处理后的小区产量是对照的1.7倍，本专利菌株表现出明显的增产效果。

Claims (10)

1.一种对亚硝态氮具有高效消除率的光合细菌，本菌株为沼泽红假单胞菌2-8(Rhodopseudomonas palustris 2-8)，菌株保藏号为CCTCC M 205147。
2.用于权利要求1中光合细菌的产业化培养基，其配方为以下任一种：①乙酸钠0.2％，氯化铵0.1％，磷酸氢二钠0.05％，氯化镁0.001％，六水氯化铁0.001％，七水硫酸锌0.0022％，氯化钠0.2％，酵母膏或蛋白胨0.1～0.2％，10％碳酸氢钠溶液50ml/L，乙醇1.5～2.0ml/L，用0.1N磷酸调至pH7.0；②丙酸钠0.2％，氯化铵0.1％，磷酸氢二钠0.05％，氯化镁0.001％，六水氯化铁0.001％，七水硫酸锌0.0022％，氯化钠0.2％，酵母膏或蛋白胨0.1～0.2％，10％碳酸氢钠溶液50ml/L，乙醇1.5～2.0ml/L，用0.1N磷酸调至pH7.0；③琥珀酸钠0.2％，氯化铵0.1％，磷酸氢二钠0.05％，氯化镁0.001％，六水氯化铁0.001％，七水硫酸锌0.0022％，氯化钠0.2％，酵母膏或蛋白胨0.1～0.2％，10％碳酸氢钠溶液50ml/L，乙醇1.5～2.0ml/L，用0.1N磷酸调至pH7.0。
3.一种用权利要求1所述的光合细菌对水产养殖塘水进行消除亚硝态氮的处理方法，其特征在于使用权利要求2中的培养基的任一配方生产权利要求1所述的光合细菌，发酵液活细胞浓度达到1011cfu/ml，在南美白对虾养殖水体中，按每亩4kg的用量泼洒，10～15天投放一次。
4.权利要求1所述的光合细菌的应用，其特征在于用于水产养殖水体亚硝态氮的消除。
5.一种用于具有亚硝态氮消除能力菌株的复壮方法，具体步骤是：直接采用虾塘、鱼塘底的肥沃污泥，加入塘水和对虾饲料，经高压灭菌冷却后，接入待复壮菌株沼泽红假单胞菌2-8或其它具有亚硝态氮消除能力的菌株，厌氧光照培养2～6天，即可获得具有高活性亚硝态氮还原能力的菌株。
6.一种保持菌株高效亚硝态氮消除功能的菌种保藏方法，其特征在于采集虾塘或鱼塘肥沃新鲜底泥200～300g，置于500ml盐水瓶中，然后在盐水瓶中加入10g南美白对虾饲料，用鱼塘或虾塘水加满盐水瓶，经高压灭菌冷却，接入待保藏菌株沼泽红假单胞菌2-8或其它具有亚硝态氮消除能力的菌株，光照培养3天后，弱光照室温保藏，每半年转接一次。
7.一种适用于评价权利要求1所述的光合细菌或其他具有类似功能的菌株的亚硝态氮消除能力的生物测定方法，其特征在于采用双评价***。
8.权利要求7所述的生物测定方法，其特征在于：评价***1：在培养基中加入亚硝酸钠，按照106cfu/ml的浓度加入待测微生物，厌氧光照培养，每隔4～6h测定培养基中剩余亚硝酸钠的含量，连续测定3-4次，数据可用于评价不同菌株或不同处理方式的亚硝态氮消除能力差别；评价***2：采集含有亚硝态氮的塘水和该塘的底泥，按每升水加200～400g底泥的比例混合过夜澄清，测定前按2g/L的浓度加入乙酸钠，然后按评价***1中的接种量接种，光照好氧或保持自然光照与室温，每4～6h测定一次亚硝酸盐的含量，用于比较亚硝态氮消除能力的差异。
9.权利要求1所述的光合细菌的应用，其特征在于用于苯丙烯酸和苯甲酸的生物降解。
10.权利要求1所述的光合细菌的应用，其特征在于用于制备连作黄瓜增产微生物肥料。
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