CN104250625A - 一株好氧反硝化菌及在水体中脱氮的应用 - Google Patents

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骆坚平
刘玉娟
潘涛
董娜
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Abstract

一株好氧反硝化菌，为假单胞菌属(Pseudomonas)物种，菌株命名为AO0049，该菌株已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.9089。本发明的好氧反硝化菌可以用于景观水体及其他富营养化水体的脱氮治理。

Description

一株好氧反硝化菌及在水体中脱氮的应用
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体地涉及一株好氧反硝化菌。
本发明还涉及上述好氧反硝化菌株的筛选及扩大培养方法。
本发明还涉及上述好氧反硝化菌株在水体中脱氮的应用。
背景技术
随着经济的发展，人们的居住环境也在不断改善。城市景观水体作为城市建设的一项重要内容，引入了人们的生活。景观水体包括天然湖泊、人造湖泊、人造景观湖和各种景观河道，可以调节区域小气候，美化环境。但由于水源水质较差，雨水径流污染，底泥及人为污染，同时景观水体多数为静态水，且水域面积小，水体自净能力较差，极易造成氮磷元素及有机物的累积，造成水体富营养化，严重可引起水华。
水体微生物修复就是通过合适的方法利用微生物对水体中的污染物进行吸收、富集、降解和脱除，减少或最终消除水体污染的过程，该方法在静态景观水体的修复中具有治本性、经济性和高效性的特点。由于景观水体碳氮比较低，且溶解氧浓度一般为4mg/L以上，因此，强化氮循环微生物***好氧转化和去除氮营养盐污染物对于景观水体的富营养化控制和生态重建具有重要的意义。好氧反硝化菌能够在有氧条件下将含氮化合物转化为氮气等气态氮化物，多数同时还具有异养硝化的能力，为水体脱氮提供了一种全新的思路。
自20世纪80年代研究人员首次分离得到好氧反硝化菌Thiosphaerapantotropha(Paracoccus pantotrophus)以来，学者们相继从土壤、活性污泥、养殖水体等多种环境中分离得到此类菌株。目前，好氧反硝化菌种在景观水体脱氮中应用多停留在实验小试阶段，一个规模化应用的主要瓶颈是高性能好氧反硝化菌种的获得以及简易、可靠的扩大化培养方法的建立。
发明内容
本发明的目的是提供一株高效好氧反硝化菌株。
本发明的另一目的是提供一种筛选和扩大培养上述好氧反硝化菌株的方法。
本发明的又一目的是上述好氧反硝化菌株应用于景观水体及其他富营养化水体脱氮。
为实现上述目的，本发明提供的好氧反硝化菌株，为假单胞菌属(Pseudomonas)物种，菌株命名为AO0049，该菌株已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.9089。
所述的好氧反硝化菌，为革兰氏阴性菌，在LB固体培养基上为土黄色，利用硝酸盐为唯一氮源生长。
本发明的好氧反硝化菌的筛选方法，是将采集的水体于富集驯化培养基中进行培养、筛选，得到好氧反硝化菌。
所述的筛选方法中，采集水体是用灭菌采样瓶取深度在0.5m左右的表层水。
所述的筛选方法中，富集驯化培养基组成为：KNO31g/L，KH2PO41g/L，FeC12·6H2O0.5g/L，CaCl2·7H2O0.2g/L，MgSO4·7H2O1g/L，琥珀酸钠8.5g/L，pH7.0。
本发明的好氧反硝化菌的扩大化培养方法，是将上述筛选得到的好氧反硝化菌，于发酵培养基中维持培养液pH为6.5-7.5，溶解氧浓度在2mg/L以上，培养液总氮和COD均降至较低浓度，此时扩大化培养完成。
所述的扩大化培养方法中，发酵培养基组成为：NH4Cl0.4～1.2g/L；KH2PO40.75～1.5g/L，FeC12·6H2O0.4～1.2g/L，CaCl2·7H2O0.1～0.3g/L，MgSO4·7H2O0.75～1.2g/L，柠檬酸三钠5～10g/L，pH6.8～7.5。
本发明的好氧反硝化菌可以应用在景观水体及其他富营养水体中进行脱氮。
本发明的好氧反硝化菌对硝态氮转化率能达到90％以上，并且亚硝态氮很少累积，无二次污染。
本发明的好氧反硝化菌对景观水体中氨氮、硝态氮、亚硝态氮及COD均去除效果良好，具有很大的应用价值。
附图说明
图1为实施例2中菌株AO0049景观水脱氮效果。
图2为实施例3中基于16S rRNA基因序列构建的菌株AO0049的***发育进化树。
具体实施方式
本发明提供的好氧反硝化菌株，为假单胞菌属(Pseudomonas)物种，命名为AO0049。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNO.9089，保藏日期为2014年4月25号。
本发明的菌株AO0049为革兰氏阴性菌，在LB固体培养基上为土黄色，可利用硝酸盐为唯一氮源生长。
本发明对菌株AO0049进行了***进化分析，获得全长1401bp的16SrRNA基因序列，在GenBank的登录号为KJ734677。经BLAST((Basic LocalAlignment Search Tool)序列同源性比对及***发育进化树的构建，初步鉴定该菌株为Pseudomonas属物种。
菌株AO0049从景观水体筛选得到，其中水样取自北京市某公园。将新鲜水样接种至好氧反硝化菌富集驯化培养基TB中，待培养液中总氮浓度降至较低水平时，采用溴百里酚蓝(BTB)分离培养基进行平板筛选并采用TB培养基进行菌株好氧反硝化性能的测定。经初筛和复筛实验，得到一株高效好氧反硝化脱氮菌株，命名为AO0049。
TB富集驯化培养基：KNO31g/L，KH2PO41g/L，FeC12·6H2O0.5g/L，CaCl2·7H2O0.2g/L，MgSO4·7H2O1g/L，琥珀酸钠8.5g/L，pH7.0。
溴百里酚蓝(BTB)分离培养基：Agar20g/L，KNO31g/L，KH2PO41g/L，FeC12·6H2O0.5g/L，CaCl2·7H2O0.2g/L，MgSO4·7H2O1g/L，琥珀酸钠8.5g/L，BTB(1％溶解于无水乙醇)1mL，pH7.0。
本发明的菌株AO0049扩大化培养的优化方法如下：
采用培养基SCT，维持培养液pH为6.5-7.5，溶解氧浓度在2mg/L以上，培养4d以上，总氮和COD均降至较低水平，此时扩大化培养完成。培养基SCT：NH4Cl0.4～1.2g/L；KH2PO40.75～1.5g/L，FeC12·6H2O0.4～1.2g/L，CaCl2·7H2O0.1～0.3g/L，MgSO4·7H2O0.75～1.2g/L，柠檬酸三钠5～10g/L，pH6.8～7.5。
以下具体实施例详细阐述了本发明的技术方案，其目的是为了更好地理解本发明，而不是用于限制本发明。
实施例1：景观水体中好氧反硝化菌的筛选及好氧反硝化性能测定
采样地点为北京市某公园景观水体，用灭菌采样瓶取深度在0.5m左右的表层水。在超净工作台中将10mL水样加入到90mL灭菌的TB培养基中，置于30℃、160rpm转速的摇床。每隔24h取培养液，离心后测定上清液中总氮的浓度并计算除氮率。约72h后，培养液中总氮含量降低80％以上，完成好氧反硝化菌的富集驯化过程。
从培养液中取样依次稀释至10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9六个梯度，吸取100μL至溴百里酚蓝(BTB)分离培养基涂布均匀后置于30℃恒温培养箱培养2天。好氧反硝化菌可利用硝酸盐产生碱度，因而会使菌落周围培养基变为蓝色。观察并挑取出现蓝色晕圈的单菌落至新的BTB培养基，三线法划线纯化，将纯化后菌株进行编号和保藏，至此完成好氧反硝化菌的初筛，共20株。
从固体培养基取一环生长良好菌体接种至LB液体培养基，取10mL处于对数生长期的培养液，8000rpm转速离心洗涤后接种至100mL灭菌的TB培养基，设置3个重复，置于30℃，160rpm转速摇床培养，每隔24h测定培养液中硝态氮和亚硝态氮浓度。经过48h的培养，20株细菌有18株总氮去除率在50％以上，3株在90％以上，其中菌株AO0049总氮去除率为98.94％，亚硝态氮累积量仅为0.01mg/L，是除氮效果最好菌株。表1为菌株AO0049在TB培养基中脱氮效果。
溴百里酚蓝(BTB)分离培养基：Agar20g/L，KNO31g/L，KH2PO41g/L，FeC12·6H2O0.5g/L，CaCl2·7H2O0.2g/L，MgSO4·7H2O1g/L，琥珀酸钠8.5g/L，BTB(1％溶解于无水乙醇)1mL，pH7.0；
TB富集驯化培养基：KNO31g/L，KH2PO41g/L，FeC12·6H2O0.5g/L，CaCl2·7H2O0.2g/L，MgSO4·7H2O1g/L，琥珀酸钠8.5g/L，pH7.0；
LB培养基：Tryptone10g/L，Yeast Extract5g/L，NaCl10g/L，pH7.0。
实施例2：菌株AO0049景观水脱氮实验
以取样地点的景观水为实验用水，测定其pH为7.0，氨氮，硝态氮，亚硝态氮，总氮浓度及COD分别为34、44、2、80、30mg/L。取500mL水样于1L摇瓶中，加入柠檬酸钠调节碳氮比至15:1。
取LB培养基中处于对数生长期菌液，离心后弃去上清，加入生理盐水洗涤两次，将菌悬液接种至上述水样中，在30℃、160rpm转速的摇床中震荡培养，每隔24h测定水样的pH，氨氮，硝态氮，亚硝态氮，总氮浓度及COD。至48h，总氮降至5mg/L，COD降至20mg/L，总氮去除率达93.75％。氨氮，硝态氮，亚硝态氮的浓度变化如图2所示。该景观水经菌株AO0049脱氮处理后，总氮及COD得到了较好去除效果，，可见该菌株在景观水体及其他富营养水体脱氮中具有很大的应用潜力。
实施例3：菌株AO0019扩大培养方法
基于上面的研究成果，可以发现菌株AO0049在景观水脱氮治理中效果良好，而在实际的应用中，不仅要保证菌株的脱氮性能，又要采用优化培养使得菌体密度达到最高，以利于制剂化研究和应用。下面为好氧反硝化菌株扩大培养的优化方法。
从斜面挑取菌体至灭菌后的SCT培养基，置于30℃摇床以160rpm转速培养。约24h菌体生长至对数期，将其离心洗涤后按10％比例(v/v)接种至放有10L新鲜培养基SCT的无菌培养瓶中，室温下培养。为了保证好氧反硝化菌的氧气需求，采用曝气装置以维持培养基中的溶解氧浓度在2mg/L以上。
菌株扩大培养过程中，维持培养液pH为6.5-7.5。随着亚铁的氧化，培养液颜色由浅绿色逐渐变为红棕色。经过5d的培养，培养液总氮降至10mg/L左右，COD降至100mg/L左右。此时菌株的扩大培养完成，可将培养液投加至反应器或待处理污水中。
SCT发酵培养基：NH4Cl0.47g/L；KH2PO41.0g/L，FeC12·6H2O1.07g/L，CaCl2·7H2O0.2g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，柠檬酸三钠5g/L，pH7.0。表1：菌株AO0049在TB培养基中脱氮效果
注：NO3-N及NO2-N浓度为三个重复实验结果的平均值。

Claims (8)

1.一株好氧反硝化菌，为假单胞菌属(Pseudomonas)物种，菌株命名为AO0049，该菌株已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.9089。
2.根据权利要求1所述的好氧反硝化菌，为革兰氏阴性菌，在LB固体培养基上为土黄色，利用硝酸盐为唯一氮源生长。
3.权利要求1所述好氧反硝化菌的筛选方法，将采集的水体于富集驯化培养基中进行培养、筛选，得到好氧反硝化菌。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其中，采集水体是用灭菌采样瓶取深度在0.5m左右的表层水。
5.根据权利要求3所述的筛选方法，其中，富集驯化培养基组成为：KNO31g/L，KH2PO41g/L，FeC12·6H2O0.5g/L，CaCl2·7H2O0.2g/L，MgSO4·7H2O1g/L，琥珀酸钠8.5g/L，pH7.0。
6.权利要求1所述好氧反硝化菌的扩大化培养方法，将权利要求3筛选得到的好氧反硝化菌，于发酵培养基中维持培养液pH为6.5-7.5，溶解氧浓度在2mg/L以上，培养液总氮和COD均降低，此时扩大化培养完成。
7.根据权利要求6所述的扩大化培养方法，其中，发酵培养基组成为：NH4Cl0.4～1.2g/L；KH2PO40.75～1.5g/L，FeC12·6H2O0.4～1.2g/L，CaCl2·7H2O0.1～0.3g/L，MgSO4·7H2O0.75～1.2g/L，柠檬酸三钠5～10g/L，pH6.8～7.5。
8.权利要求1所述的好氧反硝化菌在景观水体及其他富营养水体中进行脱氮的应用。
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