CN102095868A

CN102095868A - 甲胎蛋白化学发光定量检测试剂盒

Info

Publication number: CN102095868A
Application number: CN2009102003821A
Authority: CN
Inventors: 穆海东; 汪宁梅; 穆宇豪; 孙向宇
Original assignee: Shanghai Yulong Biological Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Yulong Biological Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2009-12-11
Publication date: 2011-06-15

Abstract

本发明公开了一种甲胎蛋白化学发光定量检测试剂盒，该试剂盒包括甲胎蛋白检测反应板，反应板包被有抗甲胎蛋白抗体。甲胎蛋白定量检测试剂盒，还包括：酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液。本发明可以专一的定量检测出病人血清甲胎蛋白的含量，用于原发性肝细胞癌高危人群的筛查及无症状人群的普查，原发性肝细胞癌及胎儿神经管畸形(如脊柱裂、脑积水)的早期辅助诊断、预测预后和追踪疾病的复发。与传统的ELISA技术相比，本发明不仅保留了ELISA技术的高度特异性，检测结果的稳定性、可靠性和操作的简便性，同时采用的化学发光法能提高检测的灵敏度。

Description

甲胎蛋白化学发光定量检测试剂盒

技术领域

本发明属于体外临床检验和化学发光免疫检测领域，尤其涉及一种用于定量检测肿瘤指标甲胎蛋白(AFP)的试剂盒。

背景技术

甲胎蛋白(α-Fetoprotein，AFP)是单一多聚体肽键糖蛋白，含590个氨基酸，分子量约为70KD，与血清白蛋白、维生素结合蛋白属同一基因家族。AFP主要在胎肝合成，其次是卵黄囊、胃肠道粘膜，肾脏也少量合成。AFP于胎儿6周开始合成，12-15周达到高峰。出生后1-2年降至成人水平。

AFP是诊断肝癌灵敏度高和特异性好的肿瘤标志物，是临床诊断原发性肝细胞癌的主要实验室指标，常用于原发性肝癌临床检查及普查。大部分肝癌患者呈持续性高水平升高，部分患者呈低水平增高。AFP的含量与肿瘤的大小、癌细胞的分化程度有一定的关系，其动态变化可用于观察病情进展状态，因而AFP对肝癌有早期诊断价值。检测肝癌患者血清AFP还可作为治疗效果的评价指标。一般急性肝病，可随病情好转AFP含量下降或正常，肝硬化可呈下降或持续低水平，肝癌则逐渐上升。另外，AFP阳性不是肝癌所独有的，其他组织的一些肿瘤，如胃癌、畸胎瘤、胰腺癌、结肠癌等以及妊娠期，甲胎蛋白也可升高。病毒性肝炎、肝硬变时甲胎蛋白也可见到阳性结果。

与目前常用的酶联免疫(ELISA)检测方法相比，化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。检测过程中不使用有害的试剂，试剂保持期长，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应***和化学发光***。免疫反应***的基本原理是ELISA。抗原或抗体结合到某种固相载体表面，待测样品中的抗体或抗原按一定程序与结合到固相载体上的抗原或抗体反应形成抗原-抗体复合物。再加入酶标的抗原或抗体与其反应，底物在酶的催化下变成有色产物，通过分析有色产物检测待测样本中物质。化学发光***的原理在于免疫反应中的酶作用于发光底物。发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。

发明内容

为快速、高效的定性、定量检测肿瘤标志物AFP，本发明提供一种用于定性、定量检测肿瘤标志物AFP的化学发光免疫分析定量检测试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种甲胎蛋白化学发光定量检测试剂盒，包括反应板，酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被有抗甲胎蛋白抗体。

所述的校准品以甲胎蛋白纯品配制，浓度为0，20，50，100，250，500ng/ml。

所述的质控品以甲胎蛋白纯品配制，由质控品I和质控品II两部分组成，质控品I的浓度为3-95ng/ml，质控品II的浓度为105-490ng/ml。

所述的质控品I的浓度优选为50ng/ml，质控品II的浓度优选为250ng/ml。

所述的酶结合物为HRP标记的抗甲胎蛋白抗体，所述的反应板材质是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，所述的浓缩洗涤液是pH7.0-pH8.0的中性缓冲液。

本发明提供的甲胎蛋白(AFP)化学发光定量检测试剂盒具有以下优越性：

1.本发明可定性、定量的检测病人甲胎蛋白的含量，并通过甲胎蛋白的含量多少诊断病情，判断病人病情发展、变化。

2.本发明采用化学发光免疫分析技术，既保留了酶联免疫的操作简便、快速的特点，又具有放射免疫的高灵敏度，易于标准化操作，适合在医院普及、推广使用。

3.本发明通过检测发光信号值分析显色底物，大大提高了检测的灵敏性，与ELISA法相比，其分析灵敏度大幅度提高。

4.试剂盒制作工艺简单，操作安全，检测所需样本量少、时间短，实用性强。

附图说明

图1 AFP化学发光定量检测试剂盒临界值的确定。

图2甲胎蛋白化学发光定量检测试剂盒与Roche试剂盒相关性的比较。

具体实施方式

实施例1：制备本发明的甲胎蛋白化学发光定量检测试剂盒

1.固相包被板的制备

1)包被：取1mol/L Na₂HPO4 77.4ml和1mol/L NaH₂PO4 22.6ml混匀，加入去离子水定容至1000ml即成10倍包被液，临用前稀释十倍，加入适量抗AFP单抗混匀，然后加入到微孔板板孔中，100μl/孔，4℃16小时；

2)封闭：弃去包被液，在吸水纸纸上拍干，加入含有3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，200μl/孔，37℃2小时；

3)封袋：弃去封闭液，在吸水纸上拍干，室温下于真空干燥箱中抽5小时，立即进行真空封袋，检查有无漏气，如有重新封袋，贴上标签后于2-8℃保存。

2.酶标AFP单克隆抗体的制备

抗AFP单抗用过碘酸盐氧化法与辣根过氧化物酶交联，通过方阵滴定，确定酶标抗体的使用浓度。加入甘油，-20℃以下保存。

3.AFP校准品的制备

用含有3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释AFP纯品(购自瑞典康乃格)，分装0，20，50，100，250，500ng/ml共6个浓度。

4.AFP质控品的制备

用含有3％BSA，1％海藻糖和0.05％防腐剂(Proclin^TM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释AFP纯品配制质控品1，2。浓度分别为50ng/ml和250ng/ml。

5.化学发光底物液

购买(购自ThermoFisher)商品化发光底物液进行分装。

6.浓缩洗涤液

取NaCl 170g，吐温-20 10ml加水定容至1L即成，临用前稀释20倍。

7.半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装后即为半成品。抽检合格后组装成试剂盒成品，成品还需抽检，合格后才能出厂。

综上，本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对本发明所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体及包被抗体的活性，载体的颜色、吸附性和变异大小，化学发光的发光强度、持续时间。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被缓冲液和保护液进行了实验，选出最适合的包被缓冲液和保护液，通过抗体不同包被浓度实验，找到最佳的浓度条件，同时也对真空干燥的时间和温度也进行了研究，最后确定了干燥时间最短，稳定性最好的时间。对于HRP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到简便，产率高，成本低，质量可靠的标记方法。

实施例2：本发明的试剂盒的使用方法

以实施例1制备的AFP化学发光定量检测试剂盒的具体操作如下：

1.试剂、样本准备

1)试剂准备

①试剂盒置于室温(18-26℃)平衡20分钟。

②从试剂盒中取出浓缩洗涤液，用纯化水1∶20稀释后加入洗板机的洗液瓶中。

2)样本准备

使用前将待测的合格血清或血浆置于室温(18-26℃)平衡20分钟。

2.试验条件

在室温(18-26℃)严格按照试剂盒说明书进行操作。

3.操作步骤

1)取出所需的AFP抗体包被微孔板反应条置于微孔架上(剩余的微孔反应条立即放回铝箔袋中，并重新密封铝箔袋)。

2)加入校准品1～6、质控品1～2和待测样本，每孔50μl，充分混匀，置于37℃恒温箱孵育20分钟。

3)手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干；或洗板机洗涤：程序设置4个循环，每孔350μl，洗涤后拍干。

4)加入酶标抗体，每孔50μl，充分混匀，置于37℃恒温孵育20分钟。

5)重复程序3)。

6)加入发光底物A、B，每孔各50μl，充分混匀。

7)放入化学发光仪中检测信号值。

4.试验结果的计算

可以采用作图法或计算法进行结果计算。

作图法：以标准品抗原含量的lg值为横坐标(x)，以其对应的信号值为纵坐标(y)绘制出标准曲线，根据检测样本测得的信号值在标准曲线上得出相应的抗原含量lg值，计算抗原含量。

计算法：以标准品抗原含量的lg值为自变量(x)，以其对应的信号值为应变量(y)，求出回归方程，将待测样本的信号值代入回归方程式，求得对应的抗原含量。

5.质量控制程序

1)质控品1测定的浓度应在50ng/ml±10％，质控品2测定的浓度应在250ng/ml±10％。

2)若AFP含量大于500ng/ml，应用校准品1重新测定，再按稀释倍数计算AFP抗原的含量。

实施例3：本发明的试剂盒的方法学鉴定

按照本领域常规的制造及检定过程对实施例1中制备的试剂盒进行检定：

1.AFP化学发光定量检测试剂盒的灵敏性检测

使用实施例1制备的AFP化学发光定量检测试剂盒，在微孔板的微孔中加入不同浓度的AFP抗原，AFP抗原的浓度分别为：0，2，5，10，20，50，100，250，500ng/ml。

2.AFP化学发光定量检测试剂盒的特异性检测

使用实施例1制备的AFP化学发光定量检测试剂盒，在微孔板的微孔中加入肿瘤其它抗原指标的抗原，浓度为100ng/ml，其他步骤再按实施例2所述的使用方法检测。

3.AFP化学发光定量检测试剂盒的稳定性检测

使用实施例1制备的AFP化学发光定量检测试剂盒，将微孔板分别放置37℃1，2，3天后，按实施例2的使用方法检测。

实施例4：正常人的AFP含量及临界值的确定

随机取300例健康人血清用实施例1制备的“甲胎蛋白(AFP)化学发光定量检测试剂盒”测定结果如下：

300例健康人血清用本发明提供的试剂盒测得的数值≤20ng/ml。

见图1，AFP化学发光定量检测试剂盒临界值的确定。

实施例5：本发明的甲胎蛋白(AFP)化学发光定量检测试剂盒的临床应用与Roche试剂盒的比较

用本发明的甲胎蛋白(AFP)化学发光定量检测试剂盒和Roche试剂盒检测10例AFP阴性血清和20例AFP阳性血清，以比较两种试剂盒的相关性。结果见图2，甲胎蛋白化学发光定量检测试剂盒与Roche试剂盒相关性的比较。其中，Roche试剂盒的测定值为X轴，本发明的试剂盒的测定值为Y轴，结果经统计学处理得到相关系数r＝0.9987，y＝1.0091x+2.78。

Claims

1.一种甲胎蛋白化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括反应板，酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被有抗甲胎蛋白抗体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的校准品以甲胎蛋白纯品配制，浓度为0，20，50，100，250，500ng/ml。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的质控品以甲胎蛋白纯品配制，由质控品I和质控品II两部分组成，质控品I的浓度为3-95ng/ml，质控品II的浓度为105-490ng/ml。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的质控品I的浓度可为50ng/ml，质控品II的浓度可为250ng/ml。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶结合物为HRP标记的抗甲胎蛋白抗体，所述的反应板材质是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，所述的浓缩洗涤液是pH7.0-pH8.0的中性缓冲液。