CN103969447A - 用于血管内皮生长因子定量测定试剂盒及其发光底物溶液 - Google Patents

用于血管内皮生长因子定量测定试剂盒及其发光底物溶液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于血管内皮生长因子定量测定试剂盒及其发光底物溶液，所述底物溶液包括发光液A和发光液B；所述发光液A各组分浓度为：鲁米诺0.40－0.50g/L、对碘酚0.10－0.15g/L、1,2-环己二胺四乙酸0.10－0.15g/L、硼酸4.60－5.40g/L、硼砂11.00－12.00g/L、氯化钠10.00－12.00g/L；所述发光液B各组分浓度为：过氧化脲0.20－0.25g/L、Tween201.00－1.50ml/L、硼酸4.60－5.40g/L、硼砂11.00－12.00g/L、氯化钠10.00－12.00g/L；所述发光液A和发光液B使用时的体积比为1：1。本发明的发光底物溶液，稳定性好、灵敏度高、光子强度平台期长的优点。

Description

用于血管内皮生长因子定量测定试剂盒及其发光底物溶液
技术领域
本发明涉及一种蛋白免疫检测方法，特别涉及一种用于血管内皮生长因子定量测定试剂盒及其发光底物溶液。
背景技术
血清肿瘤标志物（tpgmor marker，TM）是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶（同工酶）、多胺及癌基因产物等。肿瘤标志物检测简便且创伤小，因而在肿瘤筛查、诊断、治疗等方面广泛应用。
癌细胞的生长、转移依赖新生血管的形成,血管内皮生长因子(VEGF)是最有效的促血管生长因子(Ferraraetal.Endocr.Rev.1997，18：4-25)。血管内皮生长因子（Vascpglar Endothelial Growth Factor，VEGF）是近些年发现和研究较为广泛的一种全新广谱肿瘤标记物（Cancer biomarker），被认为是最有意义的血液肿瘤筛查的标记物。根据本公司的研究成果和国外的文献报道血管内皮生长因子检测试剂盒有四大功能：VEGF血液学检测可作为（1）肿瘤的筛查、（2）肿瘤的辅助诊断（Kondo S,Biochim Biophys Acta.1994Mar31;1221(2):211-4）、（3）肿瘤治疗疗效的评估和监测、（4）肿瘤预后、以及复发的监测（Marpg D Clin Cancer Res April2,2013;DOI:10.1158/1078-0432.CCR-12-3409）。
VEGF相对分子量为45kDa，是由二硫键连接的糖蛋白二聚体，由同一N端而其他区域有某些差异的两条多肽链组成。VEGF基因位于染色体6p21.3，该基因经过转录水平的剪切，可产生5种不同的转录子，分别编码23，121，165，186和206个氨基酸多肽，VEGF是一种典型的外分泌蛋白。VEGF分解的单体无活性,去除N2糖基对生物效应无影响,但可能在细胞分泌中起作用。血管内皮细胞生长因子基因由8个外显子和7个内含子组成，定位于染色体6p21.3，由于外显子剪切的不同而形成不同的亚型，产生出分别VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等至少5种蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，在人类中表达，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。
近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。用于检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、酶联免疫吸附法、和化学发光免疫分析。这些方法既可以作为初筛试验也可以作为确认试验，其中化学发光法具有检测线性范围宽、检测仪器简单、操作方便等优点。
但是，化学发光方法因其所用发光底物溶液稳定性差、光子强度平台期段、信噪比高等缺点，其应用受到很大的局限。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够使采用其的试剂盒具有稳定性好、灵敏度高的用于血管内皮生长因子定量测定的发光底物溶液。
本发明的另一目的是提供一种稳定性好、灵敏度高的用于血管内皮生长因子定量测定试剂盒。
本发明的用于血管内皮生长因子定量测定的化学发光底物溶液，包括发光液A和发光液B；
所述发光液A以水为溶剂，并且其中的各组分浓度为：鲁米诺0.40－0.50g/L、对碘酚0.10－0.15g/L、1,2-环己二胺四乙酸0.10－0.15g/L、硼酸4.60－5.40g/L、硼砂11.00－12.00g/L、氯化钠10.00－12.00g/L，所述发光液A的pH值为8.0—10.0；
所述发光液B以水为溶剂，并且各组分浓度为：过氧化脲0.20－0.25g/L、Tween201.00－1.50ml/L、硼酸4.60－5.40g/L、硼砂11.00－12.00g/L、氯化钠10.00－12.00g/L，所述发光液B的pH值为8.0—10.0；
所述发光液A和发光液B使用时的体积比为1：1。
优选的，所述发光液A中各组分浓度为：鲁米诺0.41g/L、对碘酚0.10g/L、1,2-环己二胺四乙酸0.12g/L、硼酸4.95g/L、11.44g硼砂g/L、氯化钠11.6g/L；
所述发光液B中各组分浓度为：过氧化脲0.23g/L、Tween201ml/L、硼酸4.95g/L、硼砂11.44g/L、氯化钠11.6g/L。
本发明还提供了一种血管内皮生长因子化学发光定量测定试剂盒，其含有：前述的化学发光底物溶液、酶标记的VEGF单克隆抗体、VEGF的单克隆抗体包被的固相载体和VEGF校准品，其中所述的酶能够与所述的化学发光底物溶液中的鲁米诺或异鲁米诺反应产生光信号。
优选的，所述的酶为碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶。
优选的，所述的载体是固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
本发明还提供了一种前述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1）用VEGF的单克隆抗体包被固相载体；
2）使待测样品和VEGF校准品分别与所述的VEGF的单克隆抗体包被固相载体接触,使其发生抗原抗体结合反应；
3）酶标记VEGF的单克隆抗体；
4）使酶标记VEGF的单克隆抗体与结合在固相载体上的VEGF接触，并发生抗原抗体结合反应；
5）加入化学发光底物溶液，并使其与所述的酶发生反应；
6）检测固相载体上待测样品和校准品对应的发光值，并通过与校准品比较确定待测样品中的VEGF含量。
本发明的试剂盒的分析灵敏度（最低检出量）不大于20pg/ml、稳定性可达12个月。
附图说明
图1为新型夹心法受体包被VEGF化学发光试剂反应原理图；
图2为图1试剂盒校准曲线，以校准品浓度为横坐标，RLpg值为纵坐标会出的标准曲线。
图3为VEGF标准曲线。
具体实施方式
1.小鼠免疫和单克隆抗体制备
1.1小鼠免疫方案：用VEGF121、VEGF145、VEGF165抗原分别免疫一组BALA/c小鼠，共二个大组，包括大肠杆菌来源VEGF和人工合成短肽；每大组分4个免疫小组，每小组2只6-8周龄雌性balb/c小鼠，免疫抗原设立4个剂量200μｇ、100μg、50μg、25μg，免疫方式两种：皮下多点注射及腹腔注射，免疫佐剂利用弗氏佐剂及自制佐剂两种，免疫间隔2-3周。
1.2效价检测：免疫后10-14天鼠眼内眦取血，检测抗体效价，达到106方可进行细胞融合。
1.3细胞融合：免疫小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞融合。CLIA筛选阳性细胞株。
1.4有限稀释及扩增冻存：挑选的阳性细胞株进行有限稀释，反复4-6次;有限稀释同时扩增冻存细胞株。
1.5单克隆抗体性质鉴定：性质鉴定包括利用Sigma抗体分型试剂检测。单抗细胞株上清，应用免疫印记试验和竞争实验检测抗体特异性。利用竞争CLIA检测抗体亲和力。
2.VEGF抗原的来源
购自NIBSC的WHO英国国家生物制品检定所的重组人血管内皮生长因子（VEGF）国际约定校准品WHO/NIBSC code:02/286。
3.VEGF-CLIA试剂制备
试剂采用一种新型夹心法作为本课题的主要研究方法，基本原理是以VEGF165抗体包被，以VEGF121抗体作检测抗体，制成夹心法CLIA。具体试验过程包括以下一个步骤。
3.1包被受体及酶标抗体浓度确定：棋盘试验，对不同配对组合下校准品的RLU值作统计学分析，以VEGF浓度为横坐标X值，RLU值为纵坐标Y值，求线性相关系数R值。最终挑选具有良好线性，较高R值的受体、二抗用过碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶，酶标二抗应用浓度和抗体包被浓度作为夹心法CLIA检测方法的关键条件在选择时应同时满足S0RLU值＜100，S6/S0（P/N）最大等条件。
3.2包被板的制备：以Na2CO3.2H2O、2.9g/l NaHCO3.12H2O、9g/lNacl(pH9.4)作为包被液，包被VEGF165抗体（0.2g/l）100μl/孔在发光板上，4℃过夜。用生理盐水（0.9%NaCl）洗涤5遍，用0.2g/l NaH2PO4·2H2O、2.9g/lNa2HPO4·2H2O、10g/l BSA和1ml/l Proclin300、5.0g/l蔗糖（C12H22O11）、10g/l明胶，作为封闭液(pH7.0)，按250μl/孔加入发光板中，于18—26℃静置3小时，然后将所述的包被板晾干，置于2—8℃保存。
3.3VEGF校准品制备:将VEGF重组抗原纯品用PBS配制成六个浓度点：0pg/ml(S0)、25pg/ml(S1)、50pg/ml(S2)、100pg/ml(S3)、200pg/ml(S4)、400pg/ml(S5)、800(S6)，准确度为90%—110%。用2ml规格的管制玻璃瓶分装校准品溶液，分装量为0.5ml/瓶。置于2—8℃保存。
3.4VEGF酶结合物制备:用经典过碘酸钠氧化法把辣根过氧化物酶HRP标记在VEGF121抗体上,制成酶标记物（VEGF-HRP）。然后将0.2g/lNaH2PO4·2H2O、2.9g/l Na2HPO4·2H2O、10g/l BSA、10g/l酪蛋白、3g/l氨基吡啉和1ml/l Proclin300，用纯化水溶解作为酶稀释液(pH7.0)，按1：9000（V/V）的比例向酶稀释液中加入酶标记物（VEGF-HRP），配制成酶结合物，置于2—8℃保存。
3.5检测流程：加待检样品50μl/孔,加酶结合物50μl孔37℃1h,洗涤5次，加入底物发光液100μl/孔，避光5min，检测RLU值。具体步骤需要参考最终确定的检测条件。
4.发光底物溶液制备
4.1称量0.41g鲁米诺、0.10g对碘酚、0.12g1,2-环己二胺四乙酸、4.95g硼酸、11.44g硼砂、11.6g氯化钠，将上述试剂放入洁净容器中，加双蒸水溶解，定容至1000ml，调节pH值为8.0—10.0，制成发光液A。然后用8.0ml规格塑料瓶按3.0ml/瓶分装，置于2—8℃保存。
4.2称量0.23g过氧化脲、1ml Tween20、4.95g硼酸、11.44g硼砂、11.6g氯化钠，将上述试剂放入洁净容器中，加双蒸水溶解，定容至1000ml，调节pH值为8.0—10.0，制成发光液B。然后用8.0ml规格塑料瓶按3.0ml/瓶分装，置于2—8℃保存。
试剂盒的组成成份
1.VGEF校准品：VGEF（人体体液中提取），0.5ml/瓶*7瓶，浓度为0(S0)、25(S1)、50(S2)、100(S3)、200(S4)、400(S5)、800(S6)pg/ml；
2.包被板：VGEF单克隆抗体(鼠源)，2.5μg/mL，1块，96人份，真空密封于铝箔袋内；
3.酶结合物溶液：VGEF单抗（鼠源）辣根酶结合物，磷酸盐缓冲液（pH7.4），1瓶，6mL；
4.底物液A：鲁米诺，1瓶，3mL；
5.底物液B：过氧化物，1瓶，3mL；
6.浓缩洗液（20×）：磷酸盐缓冲液（pH7.2），1瓶，30mL；
5.分析性能分析和稳定性试验
采用建立的双抗体夹心CLIA方法检测VEGF标准品，计算不同浓度范围标准曲线的线性相关系数，R值最大的一组浓度范围即此方法最佳浓度范围。对线性关系重复性、特异性、准确性等需要反复验证。
5.1外观
微孔板应清洁，无异物污染和加工缺陷；液体部分应清亮、无沉淀或絮状物。
5.2最低检出量
VEGF标准品的最低检出量不大于20pg/ml。
5.3精密度
批内精密性CV（%）应不高于10%（n≥20）；批间精密性CV（%）应不高于15%（n≥5）
5.4准确性
回收率应介于90%-110%之间。
5.5线性范围
在（0～800）pg/ml的线性范围内，试剂盒的相关系数r应≥0.99。
5.6稳定性
2-8℃储存，有效期为12个月。
6、临床应用性能
6.1患者资料
选择718例样本，其中肿瘤组血清469例，正常血清249例，进行临床研究试验：
VEGF浓度的计算公式为:y=0.0046x+0.0167.标准曲线见图3。
VEGF标准曲线线性关系良好,相关系数r=0.9987。该实验的重复性好,批内和批间CV分别为3.4%和6.3%。
肿瘤组VEGF检测浓度明显高于正常对照组。两组间比较，差异有统计学意义(P<0.01)(见表1)
表1两组血清VEGF检测值统计表
6.2VEGF在不同种类肿瘤患者血清中表达的定性分析
VEGF的诊断标准为：6.25～142.2pg/ml视为阴性，≥142.2pg/ml视为阳性。卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、淋巴癌、***、食管癌、黑色素瘤、肝转移癌、及肝癌病人血清中VEGF表达的阳性率见表2。
表2各肿瘤中VEGF含量的阳性率
6.3VEGF临床性能指标统计学分析结果
根据718例样本的检测结果构建四格表，计算VEGF在区分肿瘤患者和正常人群时的灵敏度、特异性等临床评价指标。结果显示VEGF能较好地区分肿瘤患者和正常人群灵敏度和特异性分别达到了93.2%和80.9%，作为一个新的肿瘤标志，对肿瘤的临床诊断具有一定临床应用价值，对健康人群筛查也有一定意义。（表3）
表3VEGF的临床指标统计表
检测设备：自动化学发光仪
化学发光仪使用北京滨松光子股份有限公司的产品，北京滨松光子股份有限公司是外商投资企业，生产光学一体化配件及设备，其生产的光电倍增管占国内市场80%的市场份额。
在一些实施方案中，所述载体是固相载体包括但不限于微孔板、塑料珠、塑料管、或磁性颗粒。
在一个优选的实施方案中，所述的载体为48或96孔的微孔板。
在一些实施方案中，所述VEGF校准品是以组分Ⅴ的牛血清白蛋白缓冲液为溶剂，加入VEGF抗原纯品（纯度不低于90%）配制而成。
在一个优选的实施方案中，所述的VEGF校准品是配成的具有多个浓度梯度的VEGF校准品。
本发明的所述试剂盒的使用方法，其包括如下步骤：1）用VEGF的单克隆抗体包被固相载体；2）使待测样品和VEGF校准品分别与所述的VEGF的单克隆抗体包被固相载体接触,使其发生抗原抗体结合反应；3）酶标记VEGF的单克隆抗体；4）使酶标记VEGF的单克隆抗体与结合在固相载体上的VEGF接触，并发生抗原抗体结合反应；5）加入化学发光底物溶液，并使其与所述的酶发生反应；6）检测固相载体上待测样品和校准品对应的发光值，并通过与校准品比较确定待测样品中的VEGF含量。
在一些实施方案中，所述载体是固相载体包括但不限于微孔板、塑料珠、塑料管、或磁性颗粒。
在一个优选的实施方案中，所述的固相载体为48或96孔的微孔板。
在一些实施方案中，所述VEGF校准品是以牛血清白蛋白缓冲液为溶剂，加入VEGF抗原纯品（纯度不低于90%）配制而成。
在一个优选的实施方案中，所述的VEGF校准品是配成的具有多个浓度梯度的VEGF校准品。
试验步骤
自2～8℃环境取出试剂，室温平衡不少于15分钟，液体组分混匀；按下表进行加样（单位μl）和操作。
用微量震荡器充分振荡混匀，37℃温育1小时。甩去反应液，用稀释后的洗涤液洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。
*:加底物前应保证吸干微孔中的残留物。底物A和B用前等体积混匀后每孔加50μl，于室温（18℃～25℃）环境，设定每孔测定1秒钟。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种用于血管内皮生长因子定量测定的发光底物溶液，其特征在于，包括发光液A和发光液B；
所述发光液A以水为溶剂，并且其中的各组分浓度为：鲁米诺0.40－0.50g/L、对碘酚0.10－0.15g/L、1,2-环己二胺四乙酸0.10－0.15g/L、硼酸4.60－5.40g/L、硼砂11.00－12.00g/L、氯化钠10.00－12.00g/L，所述发光液A的pH值为8.0—10.0；
所述发光液B以水为溶剂，并且各组分浓度为：过氧化脲0.20－0.25g/L、Tween201.00－1.50ml/L、硼酸4.60－5.40g/L、硼砂11.00－12.00g/L、氯化钠10.00－12.00g/L，所述发光液B的pH值为8.0—10.0；
所述发光液A和发光液B使用时的体积比为1：1。
2.根据权利要求1所述的发光底物溶液，其特征在于，所述发光液A中各组分浓度为：鲁米诺0.41g/L、对碘酚0.12g/L、1,2-环己二胺四乙酸0.12g/L、硼酸4.95g/L、硼砂11.44g/L、氯化钠11.6g/L；
所述发光液B中各组分浓度为：过氧化脲0.23g/L、Tween201ml/L、硼酸4.95g/L、硼砂11.44g/L、氯化钠11.6g/L。
3.一种血管内皮生长因子化学发光定量测定试剂盒，其特征在于，其含有：权利要求1所述的化学发光底物溶液、酶标记的VEGF单克隆抗体、VEGF的单克隆抗体包被的固相载体和VEGF校准品，其中所述的酶能够与所述的化学发光底物溶液中的鲁米诺或异鲁米诺反应产生光信号。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶为碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的载体是固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
6.一种权利要求3－5任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）用VEGF的单克隆抗体包被固相载体；
2）使待测样品和VEGF校准品分别与所述的VEGF的单克隆抗体包被固相载体接触,使其发生抗原抗体结合反应；
3）酶标记VEGF的单克隆抗体；
4）使酶标记VEGF的单克隆抗体与结合在固相载体上的VEGF接触，并发生抗原抗体结合反应；
5）加入化学发光底物溶液，并使其与所述的酶发生反应；
6）检测固相载体上待测样品和校准品对应的发光值，并通过与校准品比较确定待测样品中的VEGF含量。
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