CN102095808A - 一种依巴斯汀有关物质的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种依巴斯汀原料药中有关物质的测定方法。本方法采用反相高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱填料，选用了适当的有机相和缓冲溶液为流动相，采用梯度洗脱；有效地解决了从原料药依巴斯汀中分离出有关物质的问题。本方法快速、简单、有效且可靠。

Description

一种依巴斯汀有关物质的分析方法
技术领域：
本发明涉及一种药物的分析方法，特别是用高效液相色谱对依巴斯汀有关物质进行测定的方法。
背景技术：
在药物分析中所称的“有关物质(related substances)”是指特定药物中不是主要组成物，但与成份相关的物质。由于一种药品从合成原料药到制备有关的制剂，再经贮藏、运输、使用，要经历一段较为复杂和漫长的过程，在此期间，每一过程都有可能产生有关的物质，如生产中可能带入起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等；在贮藏和运输过程中，可能产生降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质。为保证药物的安全有效，同时也要考虑到生产实际情况，因此，国内外对药物的研究，可允许含有一定限量的无害或低毒性的有关物质，但对毒性较大，能危害人体健康的、无效的或能影响药物稳定性的有关物质则必须严格控制。因此有关物质检测是控制药品质量的重要指标。
依巴斯汀(Ebastine)，化学名称为：4-二苯基甲氧基1-[3(对-叔丁基苯甲酰基)丙基]嘧啶，是一种强效、长效、高选择性的组胺H1受体阻断剂，被广泛用于过敏性鼻炎等治疗。
现有的依巴斯汀有关物质高效液相色谱分析方法(欧洲药典6版)，测定很不方便，其分析时间周期过长，超过2个小时，流动相配置复杂。因此需要对测定条件进行探索改进，建立起一套快速、简单，并且有效、可靠的成品反应监控及有关物质分析方法。
发明内容：
本发明的目的是探索依巴斯汀有关物质高效液相色谱分析的各种条件，提供一种快速、简便、可靠、有效的依巴斯汀有关物质高效液相色谱分析方法。
本发明人经过对高效液相色谱分析中色谱柱、流动相等条件进行筛选，选用合适的缓冲溶液体系，并在流动相中加三乙胺扫尾，在流动相的比例调节上，充分兼顾成品中数十个杂质(包括EP登载杂质)分离的需要，最终建立了弱碱性的HPLC梯度洗脱方法，将分析周期控制在60分钟内，能将数十个已知杂质与主峰基线分离，达到了上述发明目的。
本发明的技术方案如下：
依巴斯汀中有关物质的高效液相色谱分析方法，其特征为：
采用反相高效液相色谱法，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用有机溶剂和缓冲溶液为流动相，将待测样品用有机溶剂配制成2.0～3.0mg/ml的样品溶液，并采用梯度洗脱法洗脱；所述有机溶剂是甲醇或乙腈；所述缓冲溶液是三乙胺水溶液。
优选的检测条件是：所述三乙胺水溶液中三乙胺浓度为0.05％～1.0％(V/V)，并用盐或酸调节至pH值为6.5～10.8，所述盐选自磷酸盐、醋酸盐、甲酸盐、六氟磷酸钾中的一种或几种。所述酸选自磷酸、醋酸、甲酸中的一种或几种。
并可选用以下检测条件，样品检测波长：210～250nm，流速：0.8～1.3ml/min，柱温：15～35℃，进样量：10μl；
本发明方法与欧洲药典方法的测定结果对比如下：
Figure B2009102496941D0000021
采用本发明的原料药依巴斯汀(4-二苯基甲氧基1-[3(对-叔丁基苯甲酰基)丙基]嘧啶)有关物质的高效液相色谱分析方法，其积极效果在于可以有效、快速、简单、可靠测定依巴斯汀所有的有关物质。
附图说明：
图1：原料药依巴斯汀欧洲药典方法测定色谱图；
图2～图17是用本发明方法对所有潜在杂质的混合测定色谱图，其中测定条件为：
图2：检测波长250nm；
图3：检测波长210nm；
图4：有机相为甲醇；
图5：缓冲溶液使用磷酸盐；
图6：缓冲溶液使用六氟磷酸钾；
图7：缓冲溶液使用醋酸盐；
图8：缓冲溶液pH值＝6.5；
图9：缓冲溶液pH值＝10.8；
图10：缓冲溶液三乙胺浓度0.05％；
图11：缓冲溶液三乙胺浓度1.0％；
图12：流速0.8ml/min；
图13：流速1.3ml/min；
图14：柱温15℃；图15：柱温35℃；
图16：测样浓度2.0mg/ml；
图17：测样浓度3.0mg/ml；
图18：原料药依巴斯汀中的潜在杂质A、C、B1a、的定量限检测色谱图；
图19：依巴斯汀原料中的潜在杂质B、D、E、X2、X2a、F、G的定量限检测色谱图。
所有图中，各杂质代码代表的杂质名称见表1：
表1附图中杂质代码和名称
  杂质代码   杂质名称
  A   二苯甲醇
  Bia   二苯甲基醚
  B   4-叔丁基苯乙酮
  C   4-(二苯甲氧基)哌啶
  D   1-(4-叔丁基苯)-4-(4-羟基哌啶)-丁酮
  E   4-(4-(二苯甲氧基)哌啶-1-基)-1-(4-叔戊基苯基)-丁酮
  X2   1-(4-叔丁基苯)-4-氯丁酮
  X2a   1-(4-叔丁基苯)-4-羟基丁酮
  F   1-(4-叔丁基苯基)-4-(顺-4-二苯甲氧基)-1-氧化哌啶-丁酮
  G   1-(4-叔丁基苯基)-4-(反-4-二苯甲氧基)-1-氧化哌啶-丁酮
下面通过实施例对本发明的分析方法做进一步说明，但实施例中举出的具体分析方法并不限制本发明的范围，采用实施例中的方法亦可测定多种取代基下的类似化合物。
具体实施方式
以下实施例中使用的实验仪器均为岛津高效液相色谱仪(UV检测器)；
除注明外，使用的色谱柱为Gemimi C18 4.6×150mm  5μm，柱温为25℃；进样量为10μl；流速为1.0ml/min
实施例1依巴斯汀有关物质测定——欧洲药典(EP6版)方法测定
色谱条件：
色谱柱：Agilent SB-CN 4.6×150mm 5μm，检测波长：210nm
流动相：乙腈∶磷酸(1.1g/L用40g/L氢氧化钠溶液调节pH值＝5.0)＝35∶65
供试品溶液配制：称取供试品约125.0mg，精密称定，置50ml量瓶中，加混合溶液[乙腈∶磷酸(1.1g/L用40g/L氢氧化钠溶液调节pH值＝5.0)＝65∶35]溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。(2.5mg/ml)
结果见附图1，由色谱图可知依巴斯汀的保留时间是120min，根据色谱收集时间要求(依巴斯汀保留时间的1.4倍)，整个收集时间需要170min，约3个小时；依巴斯汀主峰严重拖尾，峰比较宽(25～30min)。
实施例2依巴斯汀有关物质测定(一)
色谱条件：检测波长：250nm、210nm，流动相：A：乙腈 B：0.3％三乙胺溶液(磷酸调pH值＝6.5)，流速：1.2ml/min；梯度洗脱：
  时间(分钟)   A(％)   B(％)
  0   48   52
  9   67   33
  16   75   25
  50   75   25
  50.01   48   52
供试品溶液配制：分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量，精密称定，加乙腈逐步稀释至合适溶度，摇匀，过滤，即得。进样并记录色谱图。
结果见：附图2(检测波长250nm)、附图3(检测波长210nm)。
实施例3依巴斯汀有关物质测定(二)
色谱条件：检测波长：250nm，流动相：A：甲醇，B：0.3％三乙胺溶液(磷酸调pH值＝6.8)，流速：1.2ml/min，梯度洗脱：
  时间(分钟)   A(％)   B(％)
  0   48   52
  9   67   33
  16   75   25
  50   75   25
  50.01   48   52
供试品溶液配制：分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量，精密称定，加甲醇逐步稀释至合适溶度，摇匀，过滤，即得。进样并记录色谱图。结果见附图4(流动相中有机相为甲醇)。
实施例4依巴斯汀有关物质测定(三)
色谱条件：色谱柱：Agilent Extend C18 4.6×150mm 5μm，检测波长：210nm，流动相：A：乙腈，B：0.02mol/lK2HP4水溶液(加0.3％三乙胺)，0.02mol/LKF6P水溶液(加0.3％三乙胺)，0.02mol/LCH3COONH4水溶液(加0.3％三乙胺)，梯度洗脱：
  时间(分钟)   A(％)   B(％)
  0   50   50
  15   74   26
  50   74   26
  50.01   50   50
供试品溶液配制：分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量，精密称定，加乙腈逐步稀释至合适溶度，摇匀，过滤，即得。进样并记录色谱图。
结果见附图5(缓冲溶液，0.02mol/lK2HPO4水溶液)、附图6(缓冲溶液，0.02mol/LKF6P水溶液)、附图7(缓冲溶液，0.02mol/LCH3COONH4水溶液)。
实施例5依巴斯汀有关物质测定(四)
色谱条件：色谱柱：Agilent Extend C18 4.6×150mm 5μm(pH值＝10.8)，检测波长：250nm，流动相：A：乙腈，B：0.3％三乙胺溶液(磷酸调pH值＝6.5)、(磷酸调pH值＝10.8)，流速：1.2ml/min，梯度洗脱：
供试品溶液配制：分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量，精密称定，加乙腈逐步稀释至合适溶度，摇匀，过滤，即得。进样并记录色谱图。
  时间(分钟)   A(％)   B(％)
  0   48   52
  9   67   33
  16   75   25
  50   75   25
  50.01   48   52
结果见附图8(缓冲溶液，磷酸调pH值＝6.5)、附图9(缓冲溶液，磷酸调pH值＝10.8)
实施例6依巴斯汀有关物质测定(五)
色谱条件：检测波长：250nm、流动相：A：乙腈，B：0.05％三乙胺溶液(磷酸调pH值＝6.8)，1.0％三乙胺溶液(磷酸调pH值＝6.8)，流速：1.2ml/min，梯度洗脱：
供试品溶液配制：分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量，精密称定，加乙腈逐步稀释至合适溶度，摇匀，过滤，即得。进样并记录色谱图。
  时间(分钟)   A(％)   B(％)
  0   48   52
  9   67   33
  16   75   25
  50   75   25
  50.01   48   52
结果见附图10(缓冲溶液0.05％三乙胺溶液)、附图11(缓冲溶液1.0％三乙胺溶液)。
实施例7依巴斯汀有关物质测定(六)
色谱条件：检测波长：250nm、流动相：A：甲醇，B：0.3％三乙胺溶液(磷酸调pH值＝6.8)，流速：0.8ml/min、1.3ml/min，梯度洗脱：
  时间(分钟)   A(％)   B(％)
  0   48   52
  9   67   33
  16   75   25
  50   75   25
  50.01   48   52
供试品溶液配制：分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量，精密称定，加甲醇逐步稀释至合适溶度，摇匀，过滤，即得。进样并记录色谱图。
结果见附图12(流速0.8ml/min.)、附图13(流速1.3ml/min)。
实施例8依巴斯汀有关物质测定(七)
色谱条件：检测波长：250nm，流动相：A：乙腈，B：0.3％三乙胺溶液(磷酸调pH值＝6.8)，流速：1.2ml/min，柱温：15℃、35℃，梯度洗脱：
  时间(分钟)   A(％)   B(％)
  0、   48   52
  9   67   33
  16   75   25
  50   75   25
  50.01   48   52
供试品溶液配制：分别称取各杂质对照品与依巴斯汀样品适量，精密称定，加乙腈逐步稀释至合适溶度，摇匀，过滤，即得。进样并记录色谱图。
结果见附图14(柱温15℃)、附图15(柱温35℃)。
实施例9依巴斯汀有关物质测定(八)
色谱条件：色谱柱：Agilent Extend C18 4.6×150mm 5μm，检测波长：250nm，流动相：A：乙腈，B：0.02mol/l(NH4)2HPO4水溶液(加0.3％三乙胺)，梯度洗脱：
  时间(分钟)   A(％)   B(％)
  0   50   50
  15   74   26
  50   74   26
  50.01   50   50
供试品溶液配制：分别称取供试品约50.0mg、75.0mg，精密称定，置25ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得(2.0mg/ml、3.0mg/ml)；对供试品溶液浓度进行考察。
结果见附图16(样品浓度2.0mg/ml)，附图17(样品浓度3.0mg/ml)。
实施例10原料药依巴斯汀中潜在杂质定量限检测
色谱条件：色谱柱：Agilent Extend C18 4.6×150mm 5μm，测波长：210nm，流动相：A：乙腈，B：0.02mol/l(NH4)2HPO4水溶液(加0.3％三乙胺)，梯度洗脱：
  时间(分钟)   A(％)   B(％)
  O   50   50
  15   74   26
  50   74   26
  50.01   50   50
供试品溶液配制：分别称取各杂质对照品，精密称定，加乙腈逐步稀释至合适溶度，摇匀，过滤，即得。进样并记录色谱图。
附图中杂质代码和名称
  杂质代码   杂质名称
  A   二苯甲醇
  B1a   二苯甲基醚
  B   4-叔丁基苯乙酮
  C   4-(二苯甲氧基)哌啶
  D   1-(4-叔丁基苯)-4-(4-羟基哌啶)-丁酮
  E   4-(4-(二苯甲氧基)哌啶-1-基)-1-(4-叔戊基苯基)-丁酮
  X2   1-(4-叔丁基苯)-4-氯丁酮
  X2a   1-(4-叔丁基苯)-4-羟基丁酮
  F   1-(4-叔丁基苯基)-4-(顺-4-二苯甲氧基)-1-氧化哌啶-丁酮
  G   1-(4-叔丁基苯基)-4-(反-4-二苯甲氧基)-1-氧化哌啶-丁酮
结果见附图18(A、C、B1a、的定量限)、附图19(B、D、E、X2、X2a、F、G的定量限)
原料药依巴斯汀中的潜在杂质的定量限结果见下表。
Figure B2009102496941D0000091
Figure B2009102496941D0000101
由于A、C、B1a三者与主峰响应值存在较大差异，我们在不改变色谱***的前提下，增大待测样品的配制浓度，以提高检测灵敏度。样品浓度为20mg/ml。

Claims (4)

1.依巴斯汀有关物质的分析方法，其特征为：采用反相高效液相色谱法，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用有机溶剂和缓冲溶液为流动相，将待测样品用有机溶剂配制成2.0～3.0mg/ml的样品溶液，并采用梯度洗脱法洗脱；所述有机溶剂是甲醇或乙腈；所述缓冲溶液是三乙胺水溶液。
2.权利要求1所述的分析方法，所述三乙胺水溶液中三乙胺浓度为0.05％～1.0％(V/V)，并用盐或酸调节pH至6.5～10.8，所述盐选自磷酸盐、醋酸盐、甲酸盐、六氟磷酸钾中的一种或几种；所述酸选自磷酸、醋酸、甲酸中的一种或几种。
3.权利要求1或2所述的分析方法，将待测样品用有机溶剂配制成2.0～3.0mg/ml的样品溶液后进行测定。
4.权利要求1所述的分析方法，其中样品检测波长：210～250nm，流速：0.8～1.3ml/min，柱温：15～35℃，进样量：10μl。
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