CN101701942A - 一种用液相色谱法分离测定恩替卡韦及其光学异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用液相色谱法分离测定恩替卡韦及其光学异构体的方法,该方法以三(3,5-二甲基苯基)-氨基甲酸酯直链淀粉为填料的手性色谱柱,以正己烷-低级醇溶液为流动相,正己烷-低级醇溶液体积比为25∶75~75∶25,可以定量测定恩替卡韦的光学异构体含量,从而有效控制产品质量。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域,具体涉及用液相色谱法分离测定恩替卡韦及其光学异构体的方法。
背景技术
恩替卡韦是一种抗乙肝病毒药,主要用于抑制乙肝病毒的复制,其分子式为C12H15N5O3.,其结构式为:
恩替卡韦分子中含有3个手性碳原子,通过不对称合成生成不同的手性异构体,在药物合成过程中需要对光学异构体进行质量控制。含多个手性碳原子的对映异构体的分离已知是手性药物合成和制剂过程中质量控制的难点,因此,实现恩替卡韦及其手性异构体的分离在恩替卡韦的合成和制剂的研究、生产过程的质量控制方面具有重要的现实意义。
2008年蒋银妹:“恩替卡韦分散片的处方工艺和质量标准研究”(沈阳药科大学学位论文),公开了以Daicel ChiralpakAD-H手性色谱柱为分离柱,以无水乙醇(含0.1%三氟乙酸)-正己烷(40∶60)为流动相,柱温30℃时可将恩替卡韦对映异构体进行分离。经验证,该方法可以将恩替卡韦对映异构体分离,但是因为流动相中含有改性剂三氟乙酸,造成基线漂移,无法准确测定成品中对映异构体的含量,不能有效控制恩替卡韦原料的质量;同时由于手性色谱柱固定相对改性剂具有记忆效应,色谱柱使用说明书上明确表示为保证色谱柱的性能良好,在每次使用完改性剂后需采用无水乙醇(色谱级)以0.5ml/min的流速冲洗3小时之后再使用常规冲洗方法进行保存,这样多次反复会不但操作繁琐而且损害柱子的使用寿命。
经反复试验,本发明人发现,用直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基-氨基甲酸酯)为填料的手性色谱柱,以正己烷-低级醇溶液为流动相,无需加酸性改性剂即可将恩替卡韦手性异构体进行有效分离,该方法下基线平稳,主峰峰形较好,有利于定量分析;由于此条件较为温和(不含改性剂),色谱柱在使用完后直接采用采用常规的冲洗方法即可,节约时间成本,同时可以保证色谱柱具有相对较长的使用寿命。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离测定恩替卡韦及其手性异构体的高效液相色谱方法,从而实现恩替卡韦手性异构体的分离与测定,有效地控制恩替卡韦的产品质量。
为实现本发明的目的,在一实施方案中,本发明所述的用液相色谱法分离测定恩替卡韦及其光学异构体的方法,其特征在于:以三(3,5-二甲基苯基)-氨基甲酸酯直链淀粉为填料的手性色谱柱,以正己烷-低级醇溶液为流动相。这里所说的液相色谱方法包括高效液相色谱法或高效液相色谱法-质谱法联用。
上述所说的以三(3,5-二甲基苯基)-氨基甲酸酯直链淀粉为填料的手性色谱柱选自牌号为Daicel CHIRALPAK AD、Daicel CHIRALPAK AD-H和Daicel CHIRALPAK IC的色谱柱。
上述所说的低级醇选自以下化合物:甲醇、无水乙醇、丙醇、异丙醇,优选为无水乙醇或异丙醇。
上述本发明的方法,其流动相正己烷-低级醇的体积比为25∶75~75∶25.,优选体积比为60∶40,更优选的是正己烷-无水乙醇或异丙醇的体积比为60∶40。
上述本发明所述的用液相色谱法分离测定恩替卡韦及其光学异构体的方法,还进一步包括以下步骤:
(1)称取恩替卡韦样品适量,用无水乙醇溶解样品,配制成每1ml含恩替卡韦0.1mg~5mg的样品溶液;
(2)设置流动相流速为0.5~2.0ml/min,流动相的流速优选为1.3ml/min;检测波长为205nm~260nm,优选检测波长为254nm,色谱柱的柱温箱温度为25℃~45℃,最佳柱温箱温度为40℃;
(3)取(1)的样品溶液2~50μl注入色谱仪,完成恩替卡韦与光学异构体的分离测定。
其中:
高效液相色谱仪的型号无特别要求,本发明采用的色谱仪为Agilent 1100型高效液相色谱仪。
色谱柱:优选Daicel CHIRALPAK AD手性柱(250mm×4.6mm)
柱温:优选40℃
流动相:优选正己烷-无水乙醇(60∶40)
进样量:10μl
在另一具体实施方案中,本发明的本发明所述的用液相色谱法分离测定恩替卡韦及其光学异构体的方法,其特征在于:以三(3,5-二甲基苯基)-氨基甲酸酯直链淀粉为填料的手性色谱柱,以正己烷-低级醇溶液为流动相,其体积比为25∶75~75∶25,其方法包括以下步骤:
(1)称取恩替卡韦样品适量,用低级醇(如无水乙醇)溶解样品,配制成每1ml含恩替卡韦0.1mg~5mg的样品溶液;
(2)设置流动相流速为0.5~2.0ml/min,流动相的流速优选为1.3ml/min;检测波长为205nm~260nm,优选检测波长为254nm,色谱柱的柱温箱温度为25℃~45℃,最佳柱温箱温度为40℃;
(3)取(1)的样品溶液2~50μl,优选10μl注入色谱仪,完成恩替卡韦与光学异构体的分离测定。
其中:
高效液相色谱仪的型号无特别要求,本发明采用的色谱仪为Agilent 1100型高效液相色谱仪。
在上述的具体实施方案中,三(3,5-二甲基苯基)-氨基甲酸酯直链淀粉为填料的手性色谱柱选自牌号为Daicel CHIRALPAK AD、Daicel CHIRALPAK AD-H和Daicel CHIRALPAKIC的色谱柱,优选Daicel CHIRALPAKAD;低级醇选自以下化合物:甲醇、无水乙醇、丙醇、异丙醇,优选为无水乙醇或异丙醇,更优选无水乙醇;其流动相正己烷-低级醇的体积比为25∶75~75∶25.,优选体积比为60∶40,更优选的是正己烷-无水乙醇或异丙醇的体积比为60∶40。
在上述的具体实施方案中,步骤(1)中的低级醇最好与流动相的低级醇相同,优选无水乙醇。
本发明采用CHIRALPAK AD手性色谱柱,能够有效分离测定恩替卡韦的光学异构体;选用无水乙醇为溶剂溶解样品,保证了溶液的稳定性;选择进样体积为10μl,柱温为40℃,提高了色谱峰的对称性。本发明解决了分离测定恩替卡韦的光学异构体的定量测定问题,从而有效保证了恩替卡韦的质量可控。
附图说明:
图1:空白溶剂的高效液相色谱图
图2:恩替卡韦原料和恩替卡韦对映异构混合液的高效液相色谱图
图3:恩替卡韦原料的高效液相色谱图
图4:辅料空白的高效液相色谱图
图5:恩替卡韦片的高效液相色谱图
具体实施方式:
实施例1
仪器和条件
高效液相色谱仪:Agilent 1100型高效液相色谱仪
色谱柱:Daicel CHIRALPAK AD手性柱(250mm×4.6mm)
柱温:40℃
流动相:正己烷-无水乙醇(60∶40)
流速:1.3ml/min
检测波长:254nm
进样量:10μl
实施步骤
分别取恩替卡韦原料25mg和恩替卡韦对映异构体12.5mg,置同一50ml量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。
分别取试剂空白溶液和供试品溶液,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,结果见图1和图2。
图2中保留时间为3.807分钟的色谱峰为恩替卡韦对映异构体的色谱峰;5.963分钟的色谱峰为恩替卡韦的色谱峰,由图可以看出,恩替卡韦与其对映异构体能够达到基线分离度。
实施例2
仪器和条件
高效液相色谱仪:Agilent 1100型高效液相色谱仪
色谱柱:Daicel CHIRALPAK AD手性柱(250mm×4.6mm)
柱温:40℃
流动相:正己烷-无水乙醇(60∶40)
流速:1.3ml/min
检测波长:254nm
进样量:10μl
实施步骤
取恩替卡韦原料25mg,置50ml量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。
取供试品溶液,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,结果见图3。
图3证明,恩替卡韦的光学纯度达到原料药要求,本法可以用于恩替卡韦的质量监测。
实施例3
仪器和条件
高效液相色谱仪:Agilent 1100型高效液相色谱仪
色谱柱:Daicel CHIRALPAK AD手性柱(250mm×4.6mm)
柱温:40℃
流动相:正己烷-无水乙醇(60∶40)
流速:1.3ml/min
检测波长:254nm
进样量:10μl
实施步骤
取恩替卡韦片适量,约相当于恩替卡韦12.5mg,置25ml量瓶中,加无水乙醇超声处理使溶解,并用乙醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。
取供试品溶液,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,并同法进行空白辅料试验,结果见图4、图5。
图4证明,空白辅料不干扰本品的测定,图5证明本法可以用于恩替卡韦片的质量监测。
从图1-图4表明:本发明的方法,可以清楚地将恩替卡韦与其手性异构体分离,同时基线未发生漂移,有利于定量计算,可以准确地计算出手性异构体的含量,从有效控制恩替卡韦的产品质量。
Claims (8)
1.一种采用高效液相色谱法(HPLC)分离测定恩替卡韦及其对映异构体的方法,其特征在于采用三(3,5-二甲基苯基)-氨基甲酸酯直链淀粉为填料的手性色谱柱,以正己烷-低级醇溶液为流动相,正己烷-低级醇溶液体积比为25∶75~75∶25。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的手性色谱柱选自牌号为Daicel CHIRALPAKAD、Daicel CHIRALPAK AD-H和Daicel CHIRALPAK IC的色谱柱。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的正己烷-低级醇溶液体积比为60∶40。
4.根据权利要求1或3所述的方法,其特征在于所述的低级醇选自甲醇、无水乙醇、丙醇和异丙醇。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于所述的低级醇为无水乙醇或异丙醇。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的方法还进一步包含以下步骤:
a)供试品溶液的配制:取恩替卡韦或含恩替卡韦的制剂适量,加无水乙醇溶解样品,配制成每1ml含恩替卡韦0.1mg至5mg的样品溶液作为供试品溶液;
b)设置流动相的流速为0.5~2.0ml/min,设置检测波长为205nm至260nm,设置色谱柱的柱温为25℃至45℃;
c)取a)的样品溶液设置进样量为5μl~100μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,完成恩替卡韦与光学异构体的分离测定。
7.根据权利要求6所述的方法,所述的步骤b)的柱温为40℃。
8.根据权利要求6所述的方法,所述的步骤b)的检测波长为254nm。
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