CN101502616B - 白及药材的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白及药材的含量测定方法，它以双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2异丁基苹果酸酯为对照品，用高效液相色谱法测定白及药材中双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量，该方法方便、快捷、准确，为白及药材的质量控制提供了很好的标准。
Description
技术领域
本发明涉及白及药材的质量控制方法，特别是涉及白及药材的含量测定方法。
背景技术
白及药材为兰科植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥块茎，味苦、甘、涩，性微寒，具有收敛止血、消肿生肌之功能，是一种常用的中药药材，用于貂胰防裂膏，骨伤灵喷雾剂等中成药中。随着现代药理学研究的不断深入，发现其对结核杆菌、肿瘤细胞等有明显抑制作用。临床发现，白及药材还对常见病如体内外出血症、烧烫伤等具有较好疗效。但是，作为药品领域的原料药材，其有效成分的含量必须达到某一标准，否则，会大大影响其在药品领域的应用价值以及原药材制作成药品的质量。目前尚没有关于白及药材质量控制方法中的含量测定方法的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种白及药材的含量测定方法，能方便、快捷、准确的对白及药材中的有效成分进行含量测定。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
本发明白及药材的含量测定方法是以双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯为对照品，用高效液相色谱法测定白及药材中双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)的含量。
具体的，上述高效液相色谱法由以下步骤组成：
(1)色谱条件和***适用性试验：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶水＝37∶63(体积比)为流动相，检测波长为225nm，柱温40℃，理论塔板数按双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯计算不低于5000；
(2)对照品溶液的制备：精密称取双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品，加70％甲醇溶液制成每1ml含0.15mg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：精密称定白及药材粉末0.1g，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，冷浸12小时，再超声处理30分钟，放至室温，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱，测定，用外标一点法计算含量，即得。
前述方法中，按白及药材干燥品计算，双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)的含量不少于1.50％(重量)。
发明人进行了大量的试验研究及方法验证，得到了上述技术方案，具体如下：
一、含量测定研究：
(1)含量测定指标的选择：发明人对白及药材的化学成分进行了试验研究，结果从中分离和制备出含量较高、专属性较强的具有抗癌活性的化合物双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)，故选择双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)为含量测定指标。
(2)仪器与试药：安捷伦1100高效液相色谱***，包括四元梯度泵、可变波长检测器、二极管阵列检测器、自动进样器、7725i手动进样阀及Chemstation工作站；TCQ-250超声波清洗器；色谱柱，Symmetry C18(5μm，150mm×4.6mm，Waters公司)；双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)对照品(贵州省中药、民族药研究开发中心制备，纯度大于98％)；甲醇为色谱纯、水为重蒸馏水。
(3)试验条件选择：
提取方法：采用70％甲醇为溶剂，进行超声、浸渍、再超声提取。经方法学验证，该方法可行。
二、含量测定条件
检测波长的选择：根据双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)对照品的HPLC-DAD测定的结果，其在225nm处有最大吸收，故选择225nm作为检测波长。
色谱条件选择及***适用性试验：试验选用了Hypersil C18(5μm，150mm×4.6mm，大连依利特)、Diamonsil(钻石)C18(5μm，250mm×4.6mm，迪马公司)及Symmetry C18(5μm，150mm×4.6mm，Waters公司)色谱柱，保护柱为SecurityGuard C18(5μm，4.0mm×3mm，Phenomenex inc.)，以甲醇-水为流动相，结果上述三种色谱柱均能较好的对白及中双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)进行分离，再综合考虑柱压、分离时间和分离情况等因素，试验主要采用C18色谱柱进行试验，确定柱温为40℃。在该色谱条件下，对照品的保留时间约为16.2分钟，理论塔板数按militarine计算为7200，故规定理论塔板数按militarine计算应不低于5000(如图1)。
三、线性关系考察和工作曲线绘制
线性关系考察：分别精密吸取对照品储备液(每1ml含0.2158mg)1μl、2μl、4μl、6μl、12μl，注入液相色谱，记录色谱，以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标，绘制出工作曲线，计算回归方程为：Y＝1505.91X-3.94，r＝0.9999(图2)。拟合为过原点的直线方程为Y＝1503.64X，分别将最小进样浓度和最大进样浓度所得的峰面积代入以上两个方程中分别计算，结果低浓度进样测定结果的相对偏差分别为0.23％、1.30％，高浓度进样测定结果的相对偏差分别为0.03％、0.02％，说明工作曲线截距近似为零，故采用外标一点法计算含量。在本实验条件下，militarine进样量在0.216～2.59μg范围内呈直线关系。
四、精密度试验
重复性试验：取同一批号供试品，按供试品溶液的制备方法制备9份供试液，分别进样，记录色谱，结果见表1，militarine平均含量为2.76％，RSD为1.10％，结果表明，制剂中militarine含量测定方法的重复性良好。。
表1供试品溶液中militarine含量测定重复性试验
| 编号 | 称量(mg) | 含量(％) | 平均值(％) | RSD(％) |
| 1 | 79.1 | 2.76 | 2.76 | 1.10 |
| 2 | 80.7 | 2.71 | ||
| 3 | 80.0 | 2.74 | ||
| 4 | 102.1 | 2.81 | ||
| 5 | 103.4 | 2.79 | ||
| 6 | 102.6 | 2.77 | ||
| 7 | 122.6 | 2.73 | ||
| 8 | 121.3 | 2.76 | ||
| 9 | 121.0 | 2.77 |
中间精密度试验：在不同日期、以不同分析人员按供试品溶液制备方法制备供试溶，分别测定，结果见表2。
表2中间精密度试验结果比较
五、准确度试验
加样回收率试验：精密称取militarine对照品27.92mg，置50ml量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，分别精密量取上述溶液5、10、15ml于3个100ml量瓶中，分别用70％甲醇稀释至刻度，摇匀，得每1ml含0.02792、0.05584、0.08376mg三个浓度的对照品溶液，分别精密称取已测定militarine含量(2.76％)的同一批号样品9份，分别精密量取上述3个浓度的溶液各25ml加入样品中作为提取溶剂，按供试品溶液制备方法制备供试液，测定，结果militarine平均回收率为98.7％，RSD为1.90％(表3)。
表3白及药材中militarine回收率试验结果
| 编号 | 称量(mg) | 含量(mg) | 加入量(mg) | 测得量(mg) | 回收率(％) | 平均值(％) | RSD(％) |
| 123456789 | 51.952.053.849.250.552.353.354.150.8 | 1.43241.43521.48491.35791.39381.44351.47111.49321.4021 | 0.6980.6980.6981.3961.3961.3962.0942.0942.094 | 2.12482.11102.17952.71612.80062.82023.51723.62893.4207 | 99.296.899.597.3100.898.697.7102.096.4 | 98.7 | 1.90 |
六、耐用性试验
为考察分析方法的耐用性，分别以三种不同牌号的色谱柱、不同流动相比例、不同柱温、不同检测波长分别对供试品溶液进行了测定，结果表明方法的耐用性较好。
不同色谱柱分析结果比较：由于不同品牌的色谱柱在分离上有一定差异，因此在相同比例流动相条件下，有的品牌色谱柱对白及中militarine的分离不好，因此通过调节流动相比例以适应各色谱柱对白及中militarine达到较好的分离，对同一批号供试品进行测定，从表4结果可见，三种品牌色谱柱对白及中militarine的测定结果一致。
表4不同色谱柱测定结果比较
七、不同流动相比例测定结果比较：用Symmetry C18色谱柱，以甲醇-水为流动相，按不同比例的进行分析，结果流动相微小变化对测定结果影响不大(表5)。
表5不同流动相比例测定结果比较
| 甲醇∶水 | 含量(％) | 平均值(％) | RSD(％) | 总平均值(％) | RSD(％) |
| 34∶66 | 2.802.752.76 | 2.77 | 0.96 | 2.83 | 2.5 |
| 37∶63 | 2.722.812.74 | 2.76 | 1.71 | ||
| 40∶60 | 2.932.912.91 | 2.92 | 0.40 |
八、不同柱温测定结果比较：用Symmetry C18色谱柱，以不同色谱柱温度进行测定，结果见表6。
表6不同柱温测定结果比较
| 色谱柱温度(℃) | 含量(％) | 平均值(％) | RSD(％) |
| 35 | 2.712.722.74 | 2.72 | 0.56 |
| 40 | 2.812.782.79 | 2.79 | 0.55 |
| 45 | 2.792.802.78 | 2.79 | 0.36 |
九、不同检测波长测定结果比较：除检测波长变化外，其余色谱条件不变，对同一批号供试品测定结果见表7。
表7不同检测波长测定结果比较
| 检测波长(nm) | 含量(％) | 平均值(％) | RSD(％) |
| 215 | 2.752.812.77 | 2.78 | 1.10 |
| 225 | 2.782.762.74 | 2.76 | 0.72 |
| 235 | 2.792.822.72 | 2.78 | 1.85 |
十、供试品溶液稳定性考察：取同一供试品，按供试品溶液制备方法制备供试液，分别于0、1、2、4、8小时进样，结果militarine峰面积平均值为847.874，RSD为0.33％，表明供试品溶液在8小时内稳定(表8)。
表8供试品溶液稳定性考察
| 进样时间(h) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 平均值 | RSD(％) |
| 峰面积 | 843.726 | 850.389 | 846.437 | 849.740 | 849.078 | 847.874 | 0.33 |
十一、样品测定
取白及药材供试品，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，同时配制对照品溶液，分别进样5μl，记录色谱，测定峰面积，计算militarine含量，10批白及药材测定结果为1.62％，2.02％，1.85％，2.37％，1.69％，2.37％，3.46％，1.77％，1.91％，3.10％。
根据测定结果，本品按干燥品计算，含militarine不得少于1.50％。
与现有技术相比，本发明选择双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)为对照品来测定白及药材的含量，该方法方便、快捷、准确，为白及药材的质量控制提供了很好的标准。
附图说明
图1为***适用性试验HPLC图；
图2为militarine工作曲线。
具体实施方式
照高效液相色谱法(《中国药典》一部附录VID)测定白及药材中双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)的含量。
仪器与试剂：安捷伦1100高效液相色谱***，包括四元梯度泵、可变波长检测器、二极管阵列检测器、自动进样器、7725i手动进样阀及Chemstation工作站；TCQ-250超声波清洗器；色谱柱，Symmetry C18(5μm，150mm×4.6mm，Waters公司)；双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)对照品(贵州省中药、民族药研究开发中心制备，纯度大于98％)；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂为分析纯。
(1)色谱条件与***适用性试验：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶水＝37∶63(体积比)为流动相，检测波长为225nm，柱温40℃，理论塔板数按双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯计算不低于5000；
(2)对照品溶液的制备：精密称取双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品，加70％甲醇溶液制成每1ml含0.15mg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：精密称定白及药材粉末(过三号筛)0.1g，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，冷浸12小时，再超声处理30分钟，放至室温，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱，测定，用外标一点法计算含量，即得。
本品按干燥品计算，含双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)不少于1.50％(重量)。
Claims (2)
1.一种白及药材的含量测定方法，其特征在于：所述高效液相色谱法由以下步骤组成：
(1)色谱条件和***适用性试验：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇与水的体积比为37∶63为流动相，检测波长为225nm，柱温40℃，理论塔板数按双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯计算不低于5000；
(2)对照品溶液的制备：精密称取双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品，加70％甲醇溶液制成每1ml含0.15mg的溶液，即得；
(3)供试品溶液的制备：精密称定白及药材粉末0.1g，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，冷浸12小时，再超声处理30分钟，放至室温，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱，测定，用外标一点法计算含量，即得。
2.按照权利要求1所述白及药材的含量测定方法，其特征在于：按干燥品计算，双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量不少于1.50％(重量)。
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