CN102093345B - 一种应用硅胶柱层析分离去氢紫堇碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用硅胶柱层析分离去氢紫堇碱的方法：（1）取200~300目的硅胶，加入氯仿搅拌后倒入层析柱中装柱；（2）将元胡的乙醇粗提物用少量氯仿、甲醇体积比为50:1混合的溶剂溶解，制成样品溶液上样，依次用氯仿、甲醇体积比为50:1、40:1、30:1的洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱剂流速为1.6~2.5ml/min，等体积收集洗脱液，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱粗品；（3）步骤（2）得到的去氢紫堇碱粗品除色素后用甲醇或氯仿结晶，得到去氢紫堇碱纯品。本发明工艺简单，回收率高，分离得到的去氢紫堇碱纯度高。
Description
(一)技术领域
本发明涉及应用硅胶柱层析从元胡粗提物中分离得到高纯度去氢紫堇碱的方法。
(二)背景技术
元胡(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)为罂粟科(Popaveraceae)植物延胡索的干燥块茎，性味辛、苦、温，归肝、脾经，主产于浙江、江苏、安徽、四川等省，元胡是著名的“浙八味”之一。元胡具有活血、利气、止痛的作用，可用于胸胁、脘腹疼痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌扑肿痛。现代研究表明元胡有效成分主要是生物碱，据报道，元胡中生物碱大约有40余种，主要包括：延胡索乙素、原阿片碱、去氢紫堇碱(Dehydrocorydaline)等数十种生物碱。现代药理实验已经证明元胡所含的生物碱中延胡索乙素为主要的镇痛、镇静成分，去氢紫堇碱具有扩张冠状血管，提高冠脉血流量，改善心肌营养性血流量，增强心肌耐缺氧能力及保护心肌缺血、坏死等作用，为治疗冠心病、心绞痛药物元胡制剂“可达灵”的有效成分。此外，去氢紫堇碱在治疗溃疡病也取得了较好的疗效。
目前，文献报道去氢紫堇碱的分离有两种：一种是应用标准高速逆流色谱，此方法上样量小，且使用的仪器较昂贵，难以得到广泛应用；另一种是综合运用各种柱层析(大孔吸附树脂，氧化铝柱色谱及凝胶柱色谱)，此方法步骤繁琐，效率低，且经过多次层析，样品的死吸附较大。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种分离高纯度去氢紫堇碱的方法，该方法工艺简单，分离效率高，可用于工业化生产。
本发明的技术方案如下：
一种应用硅胶柱层析分离去氢紫堇碱的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取200～300目的硅胶，加入氯仿搅拌，置于超声振荡器中振荡至没有气泡后倒入层析柱中装柱，得到硅胶柱；
(2)将元胡的乙醇粗提物用少量氯仿、甲醇体积比为50∶1混合的溶剂溶解，制成供试品溶液，取供试品溶液作为样品溶液上样，使样品溶液完全吸附于硅胶上，所述样品溶液中元胡的乙醇粗提物与硅胶柱中硅胶的质量比为1∶30～105，依次用氯仿、甲醇体积比为50∶1的洗脱剂洗脱150～250min、氯仿、甲醇体积比40∶1的洗脱剂洗脱150～250min，氯仿、甲醇体积比30∶1的洗脱剂洗脱至薄层层析跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，洗脱剂流速为1.6～2.5ml/min，等体积收集洗脱液，将收集得到的洗脱液用薄层层析与高效液相色谱进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于90％的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱粗品；
(3)步骤(2)得到的去氢紫堇碱粗品除色素后用甲醇或氯仿结晶，得到去氢紫堇碱纯品。
所述元胡的乙醇粗提物按如下方法制得：取元胡药材粉碎，用60～98％乙醇回流提取1～5次，合并各次的提取液，抽滤后滤液减压浓缩至浸膏状，用酸溶液调pH值为2～3，静置10～30小时，取上清液过滤除去沉淀；滤液用氯仿萃取1～5次，收集合并氯仿层，旋转蒸发回收氯仿，得元胡的乙醇粗提物。
所述的酸溶液为质量浓度为1～2％的盐酸水溶液或1～2％的硫酸水溶液。
所述步骤(3)中，去氢紫堇碱粗品除色素的方法为下列之一：
(A)去氢紫堇碱粗品用少量无水乙醇溶解色素，用滴管吸出色素，剩余物再用甲醇或氯仿结晶，得到去氢紫堇碱纯品；
(B)去氢紫堇碱粗品溶于甲醇，加入少量活性炭，活性炭的质量用量通常以所得溶液体积计为0.01～0.02g/ml，搅拌45～60min，过滤除去活性炭，取滤液旋转蒸发除去溶剂，剩余物再用甲醇或氯仿结晶，得到去氢紫堇碱纯品。
所述步骤(1)中装柱是向硅胶中加入氯仿搅拌，置于超声振荡器中振荡至没有气泡后倒入层析柱中装柱，并用双联球加压至硅胶面不再下降。
所述步骤(2)中上样是待氯仿与硅胶面齐平后，用滴管滴加样品溶液至样品完全吸附于硅胶上。
所述步骤(2)中将元胡的乙醇粗提物用少量氯仿、甲醇体积比为50∶1混合的溶剂溶解，所述少量是指刚好能够使元胡的乙醇粗提物完全溶解的量即可，这是本领域人员能够理解的。
所述步骤(2)中高效液相色谱的检测条件为：ODS C18 column(4.6×250mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠(32∶68，v/v)，等度洗脱；流速：0.6ml/min；检测波长：345nm；进样量：20μl。
得到的去氢紫堇碱纯品可进一步用上述高效液相色谱检测条件进行检测，进一步确定其为去氢紫堇碱，纯度大于98％。
本发明的有益效果在于：本发明分离得到的去氢紫堇碱纯度高，工艺简单，回收率高，对元胡药材的充分利用有重要作用。
(四)具体实施方式
下面以具体实施例来对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
取元胡药材1500g粉碎后用22.5L的70％乙醇回流提取30分钟，按同样方法提取3次，合并3次的提取液，抽滤后滤液减压浓缩至浸膏状，用2％盐酸溶液调pH值为3，静置15h，抽滤，滤液用4×400mL氯仿萃取，合并氯仿层用旋转蒸发仪回收氯仿，得元胡粗提物10.4g。
称取200-300目硅胶25g，加入300mL氯仿，搅拌，置于超声振荡器中振荡至没有气泡后倒入层析柱中装柱，得到硅胶柱。
称取元胡粗提物239mg(样品与硅胶比例为1∶105)，用4mL洗脱剂(氯仿-甲醇＝50∶1(v/v))溶解，得样品溶液。
用滴管将全部样品溶液滴加到硅胶表面并使其完全吸附于硅胶。
依次用氯仿、甲醇体积比为50∶1的洗脱剂洗脱250min、氯仿、甲醇体积比40∶1的洗脱剂洗脱250min，氯仿、甲醇体积比30∶1的洗脱剂洗脱至薄层层析跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，洗脱剂流速为2.5ml/min，用锥形瓶收集洗脱液，每50ml收集一瓶，将收集得到的洗脱液用薄层层析与高效液相色谱进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于90％的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱粗品。
去氢紫堇碱粗品用3mL无水乙醇溶解色素，用滴管将其吸出，剩余的成分用5mL甲醇结晶，得到黄色晶体26mg，将得到的晶体进行高效液相色谱检测，进一步确定其为去氢紫堇碱，纯度为99.6％，回收率为84.9％(以元胡粗提物计)。
高效液相色谱的检测条件为：ODS C18 column(4.6×250mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠(32∶68，v/v)，等度洗脱；流速：0.6ml/min；检测波长：345nm；进样量：20μl。
实施例2
称取200-300目硅胶20g，加入250mL氯仿，搅拌，置于超声振荡器中振荡至没有气泡后倒入层析柱中装柱，得到硅胶柱。
称取实施例1提取得到的元胡粗提物368mg(样品与硅胶比例为1∶54)，用5mL洗脱剂(氯仿-甲醇＝50∶1(v/v))溶解，得样品溶液。
用滴管将全部样品溶液滴加到硅胶表面并使其完全吸附于硅胶。
依次用氯仿、甲醇体积比为50∶1的洗脱剂洗脱150min、氯仿、甲醇体积比40∶1的洗脱剂洗脱200min，氯仿、甲醇体积比30∶1的洗脱剂洗脱至薄层层析跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，洗脱剂流速为2.0ml/min，用锥形瓶收集洗脱液，每50ml收集一瓶，将收集得到的洗脱液用薄层层析与高效液相色谱进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于90％的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱粗品。
去氢紫堇碱粗品用40mL甲醇溶解，加入0.4g活性炭，搅拌45min，过滤除去活性炭，取滤液旋转蒸发除去溶剂，剩余物再用6mL甲醇结晶，得到黄色晶体37mg，经高效液相检测确定其为去氢紫堇碱，纯度99.6％，回收率78.4％(以元胡粗提物计)。
高效液相色谱的检测条件为：ODS Ci8 column(4.6×250mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠(32∶68，v/v)，等度洗脱；流速：0.6ml/min；检测波长：345nm；进样量：20μl。
实施例3
称取200-300目硅胶9g，加入200mL氯仿，搅拌，置于超声振荡器中振荡至没有气泡后倒入层析柱中装柱，得到硅胶柱。
称取实施例1提取得到的元胡粗提物296mg(样品与硅胶比例为1∶30)，用4mL洗脱剂(氯仿-甲醇＝50∶1(v/v))溶解，得样品溶液。
用滴管将全部样品溶液滴加到硅胶表面并使其完全吸附于硅胶。
依次用氯仿、甲醇体积比为50∶1的洗脱剂洗脱150min、氯仿、甲醇体积比40∶1的洗脱剂洗脱150min，氯仿、甲醇体积比30∶1的洗脱剂洗脱至薄层层析跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，洗脱剂流速为1.6ml/min，用锥形瓶收集洗脱液，每50ml收集一瓶，将收集得到的洗脱液用薄层层析与高效液相色谱进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于90％的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱粗品。
去氢紫堇碱粗品用55mL甲醇溶解，加入1.1g活性炭，搅拌60min，过滤除去活性炭，取滤液旋转蒸发除去溶剂，剩余物再用5mL氯仿结晶，得到黄色晶体30mg，经高效液相检测确定为去氢紫堇碱，纯度99.4％，回收率为78.9％(以元胡粗提物计)。
高效液相色谱的检测条件为：ODS C18 column(4.6×250mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠(32∶68，v/v)，等度洗脱；流速：0.6ml/min；检测波长：345nm；进样量：20μl。
Claims (4)
1.一种应用硅胶柱层析分离去氢紫堇碱的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
（1）取200~300目的硅胶，加入氯仿搅拌，置于超声振荡器中振荡至没有气泡后倒入层析柱中装柱，得到硅胶柱；
（2）将元胡的乙醇粗提物用少量氯仿、甲醇体积比为50:1混合的溶剂溶解，制成供试品溶液，取供试品溶液作为样品溶液上样，使样品溶液完全吸附于硅胶上，所述样品溶液中元胡的乙醇粗提物与硅胶柱中硅胶的质量比为1:30～105，依次用氯仿、甲醇体积比为50:1的洗脱剂洗脱150~250min，氯仿、甲醇体积比40:1的洗脱剂洗脱150~250min，氯仿、甲醇体积比30:1 的洗脱剂洗脱至薄层层析跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，洗脱剂流速为1.6~2.5ml/min，等体积收集洗脱液，将收集得到的洗脱液用薄层层析与高效液相色谱进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品Rf值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱粗品；
所述元胡的乙醇粗提物按如下方法制得：取元胡药材粉碎，用60～98%乙醇回流提取1～5次，合并各次的提取液，抽滤后滤液减压浓缩至浸膏状，用酸溶液调pH值为2～3，静置10~30小时，取上清液过滤除去沉淀；滤液用氯仿萃取1~5次，收集合并氯仿层，旋转蒸发回收氯仿，得元胡的乙醇粗提物；
（3）步骤（2）得到的去氢紫堇碱粗品除色素后用甲醇或氯仿结晶，得到去氢紫堇碱纯品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酸溶液为质量浓度为1～2%的盐酸水溶液或1～2%的硫酸水溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（3）中，去氢紫堇碱粗品除色素后用甲醇或氯仿结晶的方法为下列之一：
（A）去氢紫堇碱粗品用少量无水乙醇溶解色素，用滴管吸出色素，剩余物再用甲醇或氯仿结晶，得到去氢紫堇碱纯品；
（B）去氢紫堇碱粗品溶于甲醇，加入少量活性炭，搅拌45～60 min，过滤除去活性炭，取滤液旋转蒸发除去溶剂，剩余物再用甲醇或氯仿结晶，得到去氢紫堇碱纯品。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中高效液相色谱的检测条件为：ODS C18 column 4.6×250 mm，5μm；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠，体积比为32:68，等度洗脱；流速：0.6 ml/min；检测波长：345nm；进样量：20μl。
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