CN101695518A - 一种提取黄藤总生物碱、分离黄藤素、药根碱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种黄藤总生物碱，它含有盐酸巴马汀的重量百分含量大于60％，盐酸药根碱的重量百分含量大于10％。本发明还提供了黄藤总生物碱、黄藤素、药根碱的制备方法。采用本发明方法可制备黄藤总生物碱，同时也可以提取分离黄藤素和药根碱，其中黄藤素按干燥品以无水盐酸巴马汀(C₂₁H₂₂O₄N·HCl)计算，重量百分含量高于98.0％，纯度高，本发明提取分离方法使盐酸巴马汀的转移率达到26％以上，比现有传统工艺(约15％)高1.7倍；该提取工艺在提高黄藤素主要成分盐酸巴马汀的转移率的同时还保留了药根碱成分，大大提高了药材资源利用率；工艺中采用树脂纯化法，工艺流程简单可行，树脂可再生重复利用，与传统盐析法相比，减少了碱液对环境造成的污染。

Description

一种提取黄藤总生物碱、分离黄藤素、药根碱的方法

技术领域

本发明涉及一种黄藤总生物碱的制备方法，并从中同时分离得到高***藤素、药根碱的提取分离方法。

背景技术

黄藤为防己科植物黄藤Fibraurearecisa Pierre.的干燥藤茎，是云南、广西、广东等地常用中药。别名有：大黄藤(广西《中草药新医疗法处方集》)、土黄连(《南宁市药物态》)、藤黄连(《广西中药志》)、黄连藤(《中国药植图鉴》)。黄藤的藤茎中主要含有生物碱：巴马汀(Palmatine)、药根碱(Jatrorrhizine)、伪非洲防己碱(Pseudocolumbamine)及黄藤内酯(Fibralactone)，并含有黄藤素甲(Fibranine)，黄藤素乙(Fibraminine)、甾醇(Sterol)等。

巴马汀(Palmatine)                        药根碱(Jatrorrhizine)

巴马汀(Palmatine)本品系季铵生物碱，溶于水、乙醇，几乎不溶于氯仿、***、苯等溶剂，巴马汀盐酸盐即氯化巴马汀(palmation Chloride)C₂₁H₂₂O₄N.HCl.3H₂O为黄色针状结晶，熔点205℃(分解)，其理化性质与盐酸小檗碱类似。药根碱(Jatrorrhizine)系具酚羟基季铵盐，其理化性质与巴马汀类似，但较易溶于苛性碱液中，其盐酸盐在水中的溶解度亦比盐酸巴马汀为大。药根碱盐酸盐(Jatrorrhizine Chloride)C₂₀H₂₀O₄N.HCl.H₂O为红色针状结晶，溶点204～206℃。黄藤素是从黄藤药材中提取得到的生物碱，采用重量法，按干燥品以无水盐酸巴马汀(C₂₁H₂₂O₄N·HCl)计算不得少于95.0％(《中国药典》1977年版一部)。

黄藤中所含的巴马汀和药根碱均具有药效，巴马汀具有①抗菌作用，作用强度与小檗碱基本相同或略低于小檗碱，对白色念珠菌、亚洲乙型病毒有明显抑菌作用，对葡萄球菌及抗酸分枝杆菌有抑菌作用，对柯氏表皮癣菌等12种真菌有不同程度的抑制作用；②增强白细胞吞噬功能的作用，黄藤素腹腔注射能增强大鼠非特异性免疫、细胞免疫及体液免疫功能，反应其对机体免疫功能的提高作用。药根碱具有：①抗心律失常，黄藤中药根碱10mg/kg，iv对大鼠心肌缺血和复灌所致心律失常有对抗作用，可使心肌缺血和复灌期间心律失常的开始时间推后，持续时间缩短；②镇静作用，黄藤中药根碱100mg/kg腹腔注射可减少小鼠自发活动，延长戊巴比妥钠所致动物睡眠时间；③谭毓治等研究药根碱与华法令、硫喷妥钠、甲苯磺丁脲合用时，可使其药效(或毒性)增强，导致药物相互作用，其可能的机制是药根碱竞争血浆蛋白结合部位，使其游离药物浓度增高，药效(或毒性)增强。

巴马汀等成分为苄基异喹啉类季胺生物碱，属水溶性生物碱，易溶于水、酸水等极性大的溶剂。巴马汀硫酸盐或醋酸盐在水中溶解度大，故提取时多选用硫酸或醋酸溶液作提取溶媒。工业生产黄藤素，多以酸水提取该类生物碱成分，向所得的酸水提取液经适当调节pH值后加入食盐进行盐析，利用生物碱的盐溶解度的差异，使其从水液中析出分离，得到黄藤粗碱；粗碱再经结晶法精制，得到黄藤素，如：唐爱莲，刘笑甫，冯冬梅.用煎煮法和冷浸法对黄藤中巴马丁成分提取的比较研究[J].华夏医学，2003，1(16)分别用煎煮法和冷浸法对黄藤中的巴马丁成分提取进行比较，结果，煎煮法提取巴马汀的得率较高；张举成，苏一兰，闵勇，等.超声波提取黄藤中黄藤素[J].云南化工，2006，33(6)：9～10研究了超声提取最优工艺为：超声时间为30min，料剂比为1∶6，H₂SO₄的质量分数为2％，认为此法优于热提法和冷浸法；黄祖良等，从黄藤中提取黄藤素工艺的改进，基层中药杂志，2001年第15卷第3期，报道了从黄藤中提取黄藤素的理想工艺为：黄藤粉碎后用0.2％的硫酸溶液浸泡4次，时间为48h，24h X 3，提取液用NaOH调pH 10，静置沉淀除杂，滤液加7％NaCl(碘盐)盐析，静置一昼夜，过滤，沉淀晒干得粗碱，粗碱粉碎后按1∶5用80％酒精提取3次，提取液用HCl调pH2，冷却结晶精品；郑云花，金在久，等.黄藤掌叶防己碱提取条件的探索[J].延边大学医学学报，1999，22(3)：176～178研究的结果是以20ml/L冰醋酸水溶液，浸渍24h，碱化pH值10，使用11％氯化钠为宜；李晓莹，廖华卫.pH值对黄藤中巴马汀盐析的影响[J].广东药学院学报，1999，15(3)认为在pH3时进行盐析，有利于提高收率。此外，还有相关专利申请，如：申请号：200410013988.1，发明名称：从黄藤总生物碱中精制巴马汀的方法及其应用，该发明涉及一种从黄藤总生物碱中精制巴马汀的方法。本发明将利用现有技术已制取的含量低于或达到96％巴马汀的黄藤总生物碱采用溶剂pH分离或柱层析分离的方法，利用不同生物碱在溶解性能上的差异，选用pH差或溶剂极性差的原理将其分离，辅以相关技术进行精制。申请号：200710085987.1，发明名称：盐酸巴马汀的提取精制方法及其应用，均是采用盐析法提取分离黄藤素。按目前报道的方法仅用于提取黄藤素，提取的黄藤素含无水盐酸巴马汀的含量均在95.0％-98％，不能得到更高纯度的黄藤素，同时若按目前报道的工艺进行成本估算，生产1吨黄藤素，其粗碱母液达4000吨，盐约250吨，将粗碱母液全部废弃，不仅损失了大量的盐，对环境造成污染，而且也浪费了药材中大量药根碱成分。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种黄藤总生物碱的制备方法，本发明还提供了一种黄藤素的提取分离方法，本发明的另一技术方案是提供了一种药根碱的提取分离方法。

本发明提供了一种黄藤总生物碱，它含有盐酸巴马汀的重量百分含量大于60％，盐酸药根碱的重量百分含量大于10％。

本发明提供了一种制备黄藤总生物碱的提取方法，它包括如下步骤：

a、取防己科植物黄藤Fibraurea recisa Pierre.的干燥藤茎，加0.1％-1.0％硫酸溶液，浸渍，过滤，得滤液；

b、将滤液过大孔吸附树脂，分别用蒸馏水和10％-60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；

c、将乙醇洗脱液回收乙醇，浓缩，蒸干，得黄藤总生物碱。

其中，步骤a所述的硫酸浓度为0.2％。

其中，步骤b所述的乙醇浓度为：40％乙醇。

其中，b步骤所述的洗脱液的的流速为1-3BV/h。进一步优选地，所述的洗脱液的流速为1-2BV/h。

本发明还提供了一种黄藤素的提取分离方法，它包括下述步骤：

①步骤b所述的乙醇洗脱液回收乙醇，浓缩，加入盐酸调pH2，静置，过滤，得滤液和沉淀；

②取步骤①所述的沉淀，烘干燥、粉碎，得黄藤素精品，再精制，得黄藤素精品。

其中，所述的精制方法为：将黄藤素粗品与碱性氧化铝按重量配比为1∶50-100混合，上氧化铝柱，以95％乙醇洗脱，收集黄色谱带，回收乙醇，在室温下冷却，过滤，得黄藤素精品。进一步优选地，黄藤素粗品与碱性氧化铝按重量配比为1∶80。

本发明还提供了一种药根碱的提取分离方法，它是由黄藤素的提取分离方法中步骤①所述的滤液，加15％w/vKI，静置，沉淀完全，取沉淀烘干，得药根碱提取物，精制，得药根碱。

其中，所述的精制方法为：上硅胶柱，以正丁醇-冰醋酸-水(体积比为7∶1∶2)为洗脱溶剂，收集棕红色谱带，加盐酸调pH为2后，蒸干，得药根碱盐酸盐。

采用本发明方法可制备黄藤总生物碱，同时也可以提取分离黄藤素和药根碱，其中黄藤素按干燥品以无水盐酸巴马汀(C₂₁H₂₂O₄N·HCl)计算高于98.0％，纯度高(传统工艺只能达到94％)，本发明提取分离方法使盐酸巴马汀的转移率达到26％以上，比现有传统工艺(约15％)高1.7倍；

同时，该提取工艺在提高黄藤素主要成分盐酸巴马汀的转移率的同时还保留了药根碱成分，大大提高了药材资源利用率；工艺中采用树脂纯化法，工艺流程简单可行，树脂可再生重复利用，与传统盐析法相比，减少了碱液对环境造成的污染。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1常规黄藤总生物碱、黄藤素粗品和精品的制备方法

图2本发明工艺流程

图3D₁₀₁型和AB-8型两种树脂对巴马汀成分的吸附与解吸性能示意图

图4吸附流速对动态吸附容量的影响

图5各洗脱溶媒的洗脱效果比较

图6洗脱曲线图

图7黄藤药材与树脂洗脱物HPLC色谱图(A树脂洗脱物；B黄藤药材)

图8氧化铝色谱柱洗脱流份的HPLC色谱图(A黄色谱带区；B.中间区；C.棕色谱带区)

图9硅胶层析柱洗脱流份的HPLC色谱图(A.棕红色谱带区；B.中间区；C.黄色谱带区)

图10药根碱提取物硅胶柱分离后产物

具体实施方式

实施例1本发明黄藤素、药根碱的提取分离方法

黄藤粉碎成粗粉，加0.2％硫酸溶液12倍量，浸渍24小时后，过滤，收集滤液；药渣再加0.2％硫酸溶液10倍量，浸渍24小时后，过滤，合并两次滤液，得生物碱提取液。

D₁₀₁大孔吸附树脂纯化黄藤生物碱工艺条件为：上样药液生药浓度为0.5g/ml，吸附流速控制在2BV/h之间；先用以蒸馏水1BV洗脱，弃去；再以40％乙醇洗脱，收集洗脱液至2BV；①将洗脱液回收乙醇，浓缩，蒸干，得黄藤总生物碱，或②将洗脱液回收乙醇，继续浓缩至一定体积(约洗脱液的1/5)，用盐酸调pH为2，静置，过滤，沉淀在70℃以下烘干，粉碎，即为黄藤素粗品；滤液，加15％KI(W/V)进行再次沉淀，静置，过滤，沉淀在70℃以下烘干，粉碎，得药根碱提取物。

采用氧化铝柱精制D₁₀₁大孔吸附树脂法制得的黄藤素粗品，得到了高含量的产品，其工艺方法为：黄藤素粗品(含量≥80％)与碱性氧化铝用量之比为1∶80，以95％乙醇洗脱，收集黄色谱带，回收乙醇至一定体积，在室温下冷却，过滤，得黄藤素精品。制备的黄藤素的含量≥98％。

采用硅胶柱(200～300目)分离药根碱提取物，结果：以正丁醇-冰醋酸-水(体积比7∶1∶2)为洗脱溶剂，收集棕红色谱带，加盐酸调pH为2后，蒸干，得药根碱盐酸盐，含量达80％以上。

其中所述的黄藤总生物碱中TLC色谱能同时检识出盐酸巴马汀和盐酸药根碱斑点。HPLC测定盐酸巴马汀含量大于60％，盐酸药根碱含量大于10％。

实施例2本发明方法与传统提取方法的区别

目前常规黄藤总生物碱、黄藤素粗品和精品的制备方法为：采用盐析法从药材提取液中沉淀得到黄藤粗碱(即为总碱)。再经两次结晶，制得含量为94％的黄藤素。其工艺流程和各步骤转移率见图1；本发明工艺流程和各步骤转移率，见图2。

通过图1和图2对比可知，本发明提取分离方法使盐酸巴马汀的转移率达到26％以上，比现有传统工艺(约15％)高1.7倍。

实施例3黄藤素HPLC含量测定

1、色谱条件

色谱柱采用：Hypersil BDS C₁₈(5μm，4.6mm×250mm)；流动相为乙腈∶水(含0.4％磷酸和0.4％二乙胺)(30∶70)；检测波长为345nm；柱温25℃；流速1.0ml/分钟。

2、供试品溶液的制备

取黄藤素30mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇置刻度，摇匀；精密吸取储备液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇置刻度，摇匀，作为供试品溶液。注入液相色谱仪，测定。

3、对照品溶液的制备

取盐酸巴马汀对照品适量，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇置刻度，摇匀，作为对照品储备液(970μg/ml)。精密吸取储备液1.5ml，置25ml量瓶中，加甲醇置刻度，摇匀，作为对照品溶液(58.20μg/ml)。

4、样品测定

精密吸取供试品和对照品溶液各10ul，注入液相色谱仪。

实施例4黄藤素的提取工艺研究

以稀硫酸溶液为提取溶媒，以盐酸巴马汀含量为评价指标，采用单因素试验法考察了其提取工艺条件。

1、提取方法考察

以0.3％硫酸为提取溶媒，考察了浸渍法、渗漉法及煎煮法对黄藤药材中巴马汀提取效率的影响。

浸渍法：取黄藤粗粉100g，加0.3％硫酸溶液10倍量，浸渍2次，每次24小时，滤过，得提取液。

煎煮法：取黄藤粗粉100g，加0.3％硫酸溶液10倍量，煎煮2次，每次1小时，滤过，得提取液。

渗漉法：取黄藤粗粉100g，加10倍量，照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法(中国药典2005年版一部附录IO)，用0.3％硫酸溶液20倍量作溶剂，浸渍24小时后渗漉，收集漉液。

按实施例3所述的HPLC法测定提取液中盐酸巴马汀含量，结果见表1。

表1不同提取方法考察结果(n＝2)

结果表明，浸渍法与煎煮法的提取效率无明显差异，工业上一般都采用浸渍法，且煎煮法提取的杂质增多，不利于后面的纯化工艺，故本实验选择浸渍法作为提取方法。

2、稀硫酸溶液的浓度考察

取黄藤粗粉4份，每份100g，分别用水和0.2％、0.5％、1％的硫酸溶液12倍量，浸渍24小时，滤过，得提取液。

HPLC法测定提取液中盐酸巴马汀含量，结果见表2。

表2不同浓度的硫酸溶液考察结果(n＝2)

结果表明，硫酸溶液的提取效率优于水，但盐酸巴马汀量并不是随着硫酸溶液浓度的增加而提高，且硫酸的用量增加会加重环境的污染，故选择0.2％硫酸溶液作为提取溶媒。

3、提取时间的考察

取黄藤粗粉3份，每份100g，加0.2％硫酸溶液12倍量，分别浸渍12小时、24小时、48小时，滤过，得提取液。

HPLC法测定提取液中盐酸巴马汀含量，结果见表3。

表3提取时间的考察结果(n＝2)

结果表明，盐酸巴马汀量随浸渍时间的延长而增加，但浸渍24小时与48小时的巴马汀量无明显的差异，所以在实际生产中为了节省时间，浸渍时间选24小时为宜。

4、提取次数的考察

取黄藤粗粉100g，加0.2％硫酸溶液12倍量，浸渍4次，每次24小时，得每次的提取液。

HPLC法测定提取液中盐酸巴马汀含量，结果见表4。

表4提取次数的考察(n＝2)

结果表明，提取两次，盐酸巴马汀提取率达到了87％；随着提取次数的增加，提取率显著下降，而提取液体积增大，会增加后面纯化工艺的成本，所以选择提取两次为宜。

5、提取溶媒用量的考察

取黄藤粗粉4份，每份100g，分别加0.2％硫酸溶液6、9、12、15倍量，浸渍2次，每次24小时，得提取液。

HPLC法测定提取液中盐酸巴马汀含量，结果见表5。

表5提取溶媒用量的考察(n＝2)

结果表明，提取溶媒用量12倍与15倍效果相近，故选用0.2％硫酸溶液12倍量。经考察，黄藤药材的吸水率为300％；为了减少提取液体积，第2次浸渍提取时，0.2％硫酸溶液可降为10倍量。

6、验证试验

按上述提取工艺重复试验3次，结果表明所选提取工艺盐酸巴马汀含量高，其平均提取率达到85％以上，且重现性好，见表6。

表6验证试验结果

试验号	投料量(g)	提取液(L)	盐酸巴马汀含量(mg/ml)	提取率(％)	平均提取率(％)
						1	1000	19.5	1.69	84.06
2	1000	20.0	1.65	86.39	85.93

试验号	投料量(g)	提取液(L)	盐酸巴马汀含量(mg/ml)	提取率(％)	平均提取率(％)
						3	1000	20.0	1.67	87.34

7、小结

本实验优化得到黄藤素的酸水浸渍提取工艺，盐酸巴马汀提取率达到85％以上，具体工艺参数为：

黄藤粉碎成粗粉，加0.2％硫酸溶液12倍量，浸渍24小时后，过滤，收集滤液；药渣再加0.2％硫酸溶液10倍量，浸渍24小时后，过滤，合并两次滤液，得生物碱提取液。

实施例5树脂法富集黄藤药材生物碱的工艺试验

1、强酸性阳离子交换树脂(001×7)纯化工艺考察

生物碱在中性或酸性条件下以正离子形式存在，通过阳离子交换树脂时与其H+交换而被吸附，与非碱性物质分离。在生物碱的纯化研究中使用最多的为磺酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂，如001×7型树脂。

本实验采用工业生产常用的强酸性阳离子交换树脂(001×7型，上海树脂厂生产)，以盐酸巴马汀含量为评价指标，对其吸附容量和洗脱方式进行了考察。

1.1药材提取液

称取黄藤药材200g，再实施例4制备4L提取液；HPLC法测定提取液中盐酸巴马汀含量为1.66mg/ml。

1.2树脂的预处理

001×7型新树脂在使用前为Na型，必须进行预处理，以除去杂质，并将阳离子树脂转为H型。预处理方法为：

阳离子树脂先用蒸馏水浸泡1～2天，使其充分膨胀，再反复用水冲洗，除去水溶物，至洗出液澄明无色为止，加入1倍量5％HCl溶液浸泡1小时左右，随时搅拌，去除酸液(除去酸溶性杂质)，用蒸馏水洗至pH3～4为止，倾出余水。加入1倍量5％NaOH溶液浸泡1小时左右，随时搅拌，去除碱液(除去碱溶性杂质)，再用蒸馏水洗至中性，倾去余水。最后加入3-5倍量5％HCI溶液浸泡2小时左右，随时搅拌，使阳离子树脂转为H型，倾去酸液，用蒸馏水洗至pH3～4，即可装柱应用。

1.3吸附容量的考察

精密吸取药材提取液100ml，上样于经预处理的001×7型树脂柱(10ml)内，流速1BV/h(BV为柱床沉降体积)，过柱流出液重吸附1次，收集流份，HPLC法测定流份中盐酸巴马汀含量，计算吸附容量，结果见表7。

表7001×7型树脂吸附容量

※吸附容量＝[上提取液中盐酸巴马汀量一过柱液中盐酸巴马汀量]/树脂体积

1.4洗脱方式的考察

从离子交换树脂上洗脱生物碱的方式主要有以下三种：(1)用稀酸进行洗脱，得到生物碱盐；(2)用一定浓度的氨水、氨性乙醇或碱水进行洗脱，得到游离生物碱；(3)树脂吸附生物碱后，用浓氨水碱化，再将树脂倒出晾干，以乙醇或氨性乙醇回流提取。

(1)用稀酸或稀碱进行洗脱平行取药材提取液4份，每份550ml，依法上柱(树脂100ml)，先用水洗脱除杂，至水洗脱液无色为止，再分别用2％HCl溶液、10％氨水、10％氨性乙醇液、2％NaOH溶液进行洗脱，洗脱速度1BV/h，收集洗脱液至1000ml，浓缩，得残渣，称重，HPLC法测定盐酸巴马汀含量，计算盐酸巴马汀的洗脱率，结果见表8。

表8稀酸、稀碱洗脱方式考察结果

结果表明，用稀酸或稀碱溶液洗脱时，盐酸巴马汀成分的洗脱率低。

(2)用浓氨水碱化后，以乙醇提取平行取药材提取液2份，每份55ml，依法上柱(树脂10ml)，先用水洗脱除杂，至水洗脱液无色为止，取出树脂，加浓氨水碱化，晾干，一份加乙醇100ml，回流提取两次，每次1.5小时；另一份置索氏提取器中，加入乙醇100ml，置80℃水浴中加热回流提取5小时，HPLC法测定提取液中盐酸巴马汀含量，计算盐酸巴马汀成分的洗脱率，结果见表9。

表9两种提取方法比较洗脱率

结果表明，用浓氨水碱化后，以乙醇提取时，盐酸巴马汀成分的洗脱率也较低。

1.5小结

根据上述洗脱方式的考察结果可知，巴马汀成分与强酸性阳离子交换树脂(001×7)吸附后，不易解析下来。

2、大孔吸附树脂纯化工艺

D₁₀₁型和AB-8型两种树脂对原小檗碱型生物碱具有较好的吸附和解析作用，且这两种树脂型号在工业产生中较为常用；所以，本实验选用这两种大孔吸附树脂为考察对象，对纯化黄藤生物碱进行了研究。

2.1药材提取液

称取黄藤药材1Kg，按实施例4方法制备得提取液20L；HPLC法测定提取液中盐酸巴马汀含量为1.67mg/ml。

2.2树脂的预处理与再生

用95％乙醇浸泡，不少于12小时，装柱，95％乙醇洗脱至流出液与水(2∶1)混合不呈白色混浊时即可，再以蒸馏水洗至无醇味，备用。

再生时可先用10％氢氧化钠溶液或10％盐酸洗脱后，再按预处理的方法进行处理。

2.3D₁₀₁型和AB-8型两种树脂的物理性能

大孔吸附树脂的型号不同，其比表面积、孔径、极性有差异，对纯化中药有效成分有重要影响。本实验考察的两种大孔吸附树脂物理性质见表10。

表10D₁₀₁型和AB-8型两种树脂物理性质

树脂含水量及沉降密度影响到装柱体积，测定方法：将各型树脂在70℃烘干至恒重，取适量称重(W)，用95％乙醉浸泡充分溶胀，再用蒸馏水洗净乙醇，待树脂在水中沉降完全后测定其体积(V)，按公式p＝W/V计算树脂沉降密度。测定结果见表11。

表11 D₁₀₁型和AB-8型两种树脂物理性质

2.4树脂类型的选择

(1)静态吸附容量的考察取经预处理的D₁₀₁型和AB-8型树脂10ml，置具塞磨口锥形瓶中，精密加入提取液250ml，置恒温水浴振荡器上振荡24小时，使其充分吸附后，过滤，再用少量水洗树脂，合并滤液并定容至250ml，HPLC法测定滤液中盐酸巴马汀的含量。按下式计算两种树脂在室温下的静态吸附容量(mg/g)。结果见表12。

表12D₁₀₁型和AB-8型两种树脂静态吸附容量

(2)静态洗脱性能的考察取上述吸附饱和的两种树脂，用水洗至Mollish反应呈阴性，再加入95％乙醇250ml，置恒温水浴振荡器上振荡24小时，过滤，再用少量乙醇洗树脂，合并滤液并定容至250ml，HPLC法测定滤液中盐酸巴马汀的含量。按下式计算各树脂在室温下的静态解吸率(％)。结果见表13。

表13D₁₀₁型和AB-8型两种树脂静态解吸率

根据静态吸附性能的考察结果，D₁₀₁型和AB-8型两种树脂对巴马汀成分都具有良好的吸附和解吸性能，见图3。

D₁₀₁型树脂的静态吸附容量和静态解吸率分别为75.25mg/g和97.96％，其吸附解吸性能稍优于AB-8型树脂，因此，本实验选用D₁₀₁型大孔吸附树脂纯化黄藤中生物碱部位。

2.5吸附流速的考察

平行取药材提取液4等份，每份600ml，上样于经预处理的树脂柱(D₁₀₁型树脂60ml，柱径∶柱高＝20mm×200mm)，吸附流速分别控制为1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h(BV为柱床沉降体积)，收集流出液，HPLC法测定流出液中盐酸巴马汀含量，按下式计算树脂的动态吸附容量，结果见表14。

表14吸附流速对动态吸附容量的影响

结果表明，吸附流速增至3BV/h以上时，树脂吸附容量明显下降，见图4。对同一上样溶液，随着吸附流速的增加，树脂的吸附容量会下降，但吸附流速过小，吸附时间就会增加；考虑实际应用，又要保证工作效率，本实验确定较佳的吸附流速控制为2BV/h，此时1g干树脂能吸附盐酸巴马汀83.11mg，相当于1ml湿树脂能吸附8.1ml提取液中盐酸巴马汀量。

2.6洗脱溶媒的选择

平行取同药材提取液7等份，每份700ml，依法上柱，分别用蒸馏水、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、40％乙醇、50％乙醇、60％乙醇洗脱，洗脱速度控制在1～2BV/h之间，收集洗脱液至5BV，HPLC法测定各洗脱液中盐酸巴马汀的含量，计算洗脱率，结果见表15。

表15各洗脱溶媒的洗脱效果比较

结果表明：①蒸馏水对巴马汀成分有洗脱作用，用蒸馏水洗脱时，收集洗脱液至1BV时颜色逐渐变为黄色，至1.5BV时用改良碘化泌钾试液检测出含有生物碱，说明用蒸馏水洗脱除去部分水溶性杂质时，蒸馏水的用量最好控制在1BV左右。

②乙醇浓度达到40％以上，盐酸巴马汀的洗脱率达到了90％以上，说明解吸效果良好。

由图5可知，当乙醇浓度为40％以上时，洗脱效果无明显差异。本实验再以洗脱物中盐酸巴马汀含量为评价指标进行考察，将40％、50％、60％乙醇的洗脱液，回收乙醇，浓缩，蒸干，得干膏，HPLC法测定干膏中盐酸巴马汀含量。结果见表16。

表16洗脱物中盐酸巴马汀含量比较

由上述结果可知，40％乙醇的洗脱物，盐酸巴马汀含量最高；所以本实验以盐酸巴马汀的洗脱率和洗脱物中含量综合考虑，选择40％乙醇为洗脱溶媒。

2.7洗脱溶媒用量的考察

取药材提取液3000ml，依法上柱，洗脱速度控制在1BV/h～2BV/h，先用1BV的蒸馏水洗脱，用改良碘化泌钾试液检测无生物碱反应；再用40％乙醇洗脱，以0.5BV份收集洗脱液，HPLC法测定各流份中盐酸巴马汀含量，计算其洗脱率，结果见表17。

表17洗脱溶媒用量的考察

※洗脱率(％)＝[洗脱液中盐酸巴马汀含量×体积/提取液中盐酸巴马汀量]×100％

以收集流份数为横坐标，以洗脱率为纵坐标，绘制洗脱曲线，如图6。

由上述结果可知，40％乙醇洗脱液收集至2BV，盐酸巴马汀的洗脱率已达80％以上，继续洗脱，洗脱率增加不大，所以，确定用40％乙醇进行洗脱，收集洗脱液至2BV。

2.8洗脱液处理方法的考察

取提取液4000ml(相当于200g药材)，依法上柱，洗脱速度控制在1BV/h～2BV/h，先用500ml(1BV)的蒸馏水洗脱，弃去；再用40％乙醇洗脱，收集洗脱液至1000ml(2BV)，分为同等体积两份。

(1)处理方法一取其中一份40％乙醇洗脱液500ml，回收乙醇，浓缩，蒸干，得干膏，HPLC法测定干膏中盐酸巴马汀含量，结果见表18；HPLC梯度洗脱法比较干膏与黄藤药材中生物碱成分的相关性，色谱图见图7。

从图7可知，药材色谱图中生物碱各峰均可在树脂洗脱物中得到追踪，说明药材中的生物碱成分都能D₁₀₁型树脂上洗脱下来，此种洗脱液处理方法能得到黄藤总生物碱。

(2)处理方法二取另一份40％乙醇洗脱液500ml，回收乙醇，继续浓缩至100ml(约原洗脱液的1/5)，用盐酸调pH2，静置，过滤，沉淀在70℃以下烘干，粉碎；HPLC法测定沉淀中盐酸巴马汀含量，结果见表18。

表18洗脱液处理方法比较

※盐酸巴马汀转移率(％)＝[产物中盐酸巴马汀量/上样液中盐酸巴马汀量]×100％

结果表明，①洗脱液处理方法一，使药材中生物碱成分得到了有效地富集，产物为总生物碱；②方法二的盐酸巴马汀纯化效果较好，产物中盐酸巴马汀含量达到80％以上。

故确定按洗脱液的处理方法为：40％乙醇洗脱液，回收乙醇，继续浓缩至原洗脱液的1/5，用盐酸调pH2，静置，过滤，得黄藤素粗品，在70℃以下烘干。

(3)滤液中药根碱的利用

①药根碱含量测定HPLC梯度洗脱法测定上述洗脱液两种处理方法所得产物中药根碱含量，结果见表19。

表19黄藤总生物碱和黄藤素粗品中药根碱含量

结果表明，40％乙醇洗脱液，回收乙醇，继续浓缩至原洗脱液的1/5，用盐酸调pH为2，过滤，得黄藤素粗品，滤液中还含有较多的药根碱成分。

②滤液中药根碱的利用研究

根据药根碱的碘酸盐溶解度较小的性质，采用碘化钾盐对此滤液进行沉淀，具体方法为：取滤液，加15％KI(W/V)，静置，使沉淀完全，过滤，沉淀在70℃以下烘干，粉碎，沉重，按HPLC法测沉淀中盐酸巴马汀和盐酸药根碱含量，结果见表20。

表20沉淀中盐酸巴马汀和盐酸药根碱含量

结果表明，利用碘化钾盐对滤液进行沉淀，可得到含药根碱成分的棕黄色粉末，说明利用这种方法可得到药根碱提取物。

2.10小试工艺验证

取黄藤药材2Kg，依上述确定的D₁₀₁大孔吸附树脂纯化工艺条件进行验证试验，结果见表21、22。

表21黄藤素粗品小试工艺验证结果

表22药根碱提取物小试工艺验证结果

2.11小结

(1)综上，确定D₁₀₁大孔吸附树脂纯化黄藤生物碱工艺条件为：上样药液生药浓度为0.5g/ml，吸附流速控制在2BV/h之间；先用以蒸馏水1BV洗脱，弃去；再以40％乙醇洗脱，收集洗脱液至2BV；①将洗脱液回收乙醇，浓缩，蒸干，得黄藤总生物碱，或②将洗脱液回收乙醇，继续浓缩至一定体积(约洗脱液的1/5)，用盐酸调pH为2，静置，过滤，沉淀在70℃以下烘干，粉碎，即为黄藤素粗品；滤液，加15％KI(W/V)进行再次沉淀，静置，过滤，沉淀在70℃以下烘干，粉碎，得药根碱提取物。

(2)D₁₀₁大孔吸附树脂为目前国内最常用的树脂之一，是非极性、聚苯乙烯骨架的树脂；巴马汀、药根碱等为季胺型生物碱，极性较大，选用非极性树脂进行纯化，易于解吸附。

从本实验考察的结果看，D₁₀₁树脂对盐酸巴马汀成分具有较好的吸附和解吸附性能，其静态吸附率和静态解吸率分别为75.25mg/g和97.96％；40％乙醇动态洗脱率高达80％以上；经D₁₀₁树脂纯化后，黄藤药材中生物碱得到了有效富集。

(3)所建立的D₁₀₁大孔吸附树脂法工艺流程简单、可行，盐酸巴马汀成分的转移率可达55％，并且能得到了药根碱提取物。所以，采用D₁₀₁大孔吸附树脂富集纯化黄藤药材生物碱的方法，具有潜在的工业价值。

实施例6吸附色谱法分离黄藤素、药根碱

1、氧化铝柱分离黄藤素

1.1碱性氧化铝的预处理

一般氧化铝用前要经过100～150℃活化处理，降低含水量，提高活性，但活性太高，产品会被吸附在上面下不来，所以应该选择合适的氧化铝活性，一般为IV级，含水量为10％左右。本实验中层析用碱性氧化铝(100～200目)在烘箱中105℃下干燥2h，保鲜膜密封自然冷却后上柱。

1.2湿法装柱、干法上样

用流动相充分浸泡氧化铝，搅拌排气泡，用普通漏斗缓缓倒入玻璃柱，边倒边轻轻敲打柱子，减少柱内空隙。

将黄藤素粗品(过三号筛)平铺于氧化铝上端，上面再铺一层氧化铝做保护。

1.3洗脱溶剂的选择

盐酸巴马汀等化合物为季铵型生物碱，极性较大，需选用极性较大的溶剂进行洗脱。本实验用不同配比的乙醇-水、乙醇-水-氨水溶剂体系进行考察。

在试验过程中发现，(1)氨水能明显降低氧化铝活性，在洗脱液中加入氨水后，洗脱速度快，但色谱效果差。

(2)以乙醇-水溶剂体系进行洗脱时，乙醇浓度逐步从95％变化至80％时，随着水的比例加大，洗脱溶液极性增加，但色谱柱上的色谱带无法分开，色谱效果不好。

当以95％乙醇为洗脱溶剂，控制一定的流速，经一段时间后可以清晰看到柱子上分成两个色谱带区，前面为黄色谱带区，后面为棕色谱带区，先后收集黄色谱带区、中间区、棕色谱带区的洗脱液，HPLC法检测洗脱液，色谱图见图8。

从上述图可知，以95％乙醇为洗脱溶剂，盐酸巴马汀成分先从碱性氧化铝柱上洗脱下来，且洗脱浓度较集中，能与药根碱较好地分离，故确定以95％乙醇为洗脱溶剂。

1.4上样量的选择

上样量对柱色谱纯化效果有很大的影响，且对柱色谱实验的工业放大及找到最大上样量有重要的参考意义。

平行取黄藤素粗品3份，每份1.0g，精密称定，吸附剂用量分别为上样量的50倍、80倍、100倍，用95％乙醇洗脱，流速控制在3～5ml/min，收集黄色谱带，回收乙醇至一定体积，在室温下冷却，过滤，得黄藤素精品。观察试验过程中两谱带的分离情况，测定黄藤素精品的重量以及含量，结果见表23。

表23上样量对柱色谱分离效果影响

结果表明，①随着氧化铝用量的增加，产品的收率逐渐下降，这说明氧化铝对盐酸巴马汀成分具有一定的不可逆吸附作用；②当氧化铝用量为上样量的80倍，黄色谱带区和棕色谱带区能完全分离，产品的含量达到≥98％。所以确定上样量与氧化铝用量之比为1∶80。

1.5小试工艺验证

取黄藤素粗品9g，依法上柱(氧化铝720g，60mm×450mm)，用95％乙醇洗脱，流速控制在5ml/min左右，收集黄色谱带，回收乙醇至一定体积，在室温下冷却，过滤，得黄藤素精品。测定精品重量及含量，结果见表24。

表24小试工艺验证

1.6小结

(1)本实验采用氧化铝柱精制D₁₀₁大孔吸附树脂法制得的黄藤素粗品，得到了高含量的产品，其工艺方法为：黄藤素粗品(含量≥80％)与碱性氧化铝用量之比为1∶80，以95％乙醇洗脱，收集黄色谱带，回收乙醇至一定体积，在室温下冷却，过滤，得黄藤素精品。

(2)以大孔吸附树脂法和色谱法建立的纯化工艺，黄藤素收率：从黄藤药材经大孔吸附树脂法制得黄藤素粗品(含量＞80％)，收率为2.5％；黄藤素粗品再经吸附色谱氧化铝柱制得黄藤素精品，含量达98％以上，收率为40％；所以，该工艺的黄藤素收率为：2.5％×40％＝1.0％。

2、硅胶柱分离药根碱

2.1实验材料

药根碱提取物：经D101大孔吸附树脂纯化，碘化钾沉淀制得，盐酸药根碱含量≥20％。

2.2湿法装柱、干法上样

用流动相充分浸泡硅胶，搅拌排气泡，用普通漏斗缓缓倒入玻璃柱，边倒边轻轻敲打柱子，减少柱内空隙。

将药根碱提取物(过三号筛)平铺于硅胶上端，上面再铺一层硅胶做保护。

2.3硅胶粒度范围的选择

药根碱是一种碱性较强的生物碱，而硅胶是一种弱酸，其表面的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，是一种弱酸性阳离子交换剂，当遇到较强的碱性化合物时，则可因离子交换作用而发生强吸附。所以，以极性较大的90％乙醇为流动相，同时流动相中的水分能降低硅胶的吸附力。

分别取100～200目和200～300目的两种硅胶100g，以90％乙醇为流动相，观察1g药根碱提取物在硅胶柱上的色谱情况，并按色谱带区收集洗脱流份。

试验过程发现，硅胶粒度范围为200～300目时，色谱效果较好，硅胶柱上分成两个色谱带区，前面为棕红色谱带区，后面为黄色谱带区，先后收集棕红色谱带区、中间区、黄色谱带区的洗脱流份，采用HPLC法检测洗脱流份，色谱图见图9。

从上述色谱图可知，药根碱成分先从硅胶柱上洗脱下来，能与巴马汀成分较好地分离；而药根碱成分的极性比巴马汀大，所以硅胶柱(200～300目)以90％乙醇洗脱时表现出“反相”性质，极性大的化合物先从色谱柱上洗脱出来；因此，可选用硅胶柱(200～300目)对药根碱提取物进行纯化。

2.4洗脱溶剂的选择

硅胶柱(200～300目)由于粒度较小，以90％乙醇洗脱时速度很慢，所以在进行半制备型硅胶柱层析前，必须筛选较为合适的洗脱溶剂范围。

鉴于薄层色谱对硅胶柱层析的先导性作用，以薄层层析的比移值(Rf)为考察指标，比较乙酸乙酯-甲醇-浓氨、乙醇-水-浓氨、正丁醇-冰醋酸-水等几种洗脱溶剂的优劣。

结果表明，正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂时，薄层层析效果较好，所以，选用正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为硅胶柱(200～300目)的洗脱溶剂。

2.5色谱过程

方法：取药根碱提取物1g，精密称定，平铺于硅胶柱上(100g，25×300mm)，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为洗脱溶剂，观察柱上谱带分离情况，待棕红色谱带区流出开始收集，分时段收集流出液，收集液做薄层分析，合并薄板层析结果相同的液体，标号；待360mn下点样出现盐酸巴马汀色谱斑点时，停泵，液体收集结束。整个过程约1～2天。

将收集液旋转蒸发仪减压回收溶剂，加盐酸调pH为2后，蒸干，精密称重，采用HPLC测定盐酸药根碱含量，具体测定方法为：

盐酸药根碱含量测定

1.色谱条件

色谱柱为Hypersil BDS C₁₈(5μm，4.6mm×250mm)，检测波长(345nm)，柱温(25℃)，流速(1.0ml/分钟)等条件；以乙腈∶水∶磷酸∶二乙胺***为流动相，梯度洗脱条件，见下表

表25流动相的梯度洗脱条件

2、供试品溶液的制备

取药根碱提取物约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇置刻度，摇匀；精密吸取储备液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇置刻度，摇匀，作为供试品溶液。注入液相色谱仪，测定。

3、对照品溶液的制备

精密称取盐酸药根碱对照品适量，置50ml量瓶中，加1％盐酸甲醇置刻度，摇匀，作为对照品储备液(207.60μg/ml)。精密吸取储备液2ml，置10ml量瓶中，加1％盐酸甲醇置刻度，摇匀，作为对照品溶液(41.52μg/ml)。

4、样品测定

精密吸取供试品和对照品溶液各10ul，注入液相色谱仪。

结果见表26，色谱图见图10。

表26硅胶柱分离效果

结果表明，药根碱提取物经硅胶柱纯化后，得到红色粉末，盐酸药根碱含量在80％以上；说明利用硅胶柱分离药根碱成分具有可行性。

2.6小结

本实验采用硅胶柱(200～300目)分离药根碱提取物，结果：以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为洗脱溶剂，收集棕红色谱带，加盐酸调pH为2后，蒸干，得药根碱盐酸盐，含量达80％以上。

Claims (10)

1.一种黄藤总生物碱，其特征在于：它含有盐酸巴马汀的重量百分含量大于60％，盐酸药根碱的重量百分含量大于10％。

2.一种制备权利要求1所述的黄藤总生物碱的提取方法，它包括如下步骤：

a、取防己科植物黄藤Fibraurea recisa Pierre.的干燥藤茎，加0.1％-1.0％硫酸溶液，浸渍，过滤，得滤液；

b、将滤液过大孔吸附树脂，分别用蒸馏水和10％-60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；

c、将乙醇洗脱液回收乙醇，浓缩，蒸干，得黄藤总生物碱。

3.根据权利要求2所述的黄藤总生物碱的提取方法，其特征在于：步骤a所述的硫酸浓度为0.2％。

4.根据权利要求2所述的黄藤总生物碱的提取方法，其特征在于：步骤b所述的乙醇浓度为：40％乙醇；所述的洗脱液的的流速为1-3BV/h；所述的大孔吸附树脂为：D101型或AB-8型大孔吸附树脂。

5.根据权利要求4所述的黄藤总生物碱的提取方法，其特征在于：所述的洗脱液的流速为1-2BV/h。

6.一种黄藤素的提取分离方法，它包括下述步骤：

①权利要求2-5任意一项中步骤b所述的乙醇洗脱液回收乙醇，浓缩，加入盐酸调pH为2，静置，过滤，得滤液和沉淀；

②取步骤①所述的沉淀，干燥、粉碎，得黄藤素粗品，再精制，得黄藤素精品。

7.根据权利要求6所述的黄藤素的提取分离方法，其特征在于：所述步骤②的精制方法为：将黄藤素粗品与碱性氧化铝按重量配比为1∶(50-100)混合，上氧化铝柱，以95％乙醇洗脱，收集黄色谱带，回收乙醇，在室温下冷却，过滤，得黄藤素精品。

8.根据权利要求7所述的黄藤素的提取分离方法，其特征在于：黄藤素粗品与碱性氧化铝按重量配比为1∶80。

9.一种药根碱的提取分离方法，它是由权利要求6中步骤①所述的滤液，加15％w/vKI，静置，沉淀完全，取沉淀烘干，得药根碱提取物，精制，得药根碱。

10.根据权利要求9所述的药根碱的提取分离方法，其特征在于：所述的精制方法为：上硅胶柱，以正丁醇-冰醋酸-水(体积比为7∶1∶2)为洗脱溶剂，收集棕红色谱带，加盐酸调pH为2后，蒸干，得药根碱盐酸盐。

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