CN113308486A - 一种基因工程菌株生物催化生产l-苯甘氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基因工程菌株生物催化生产L‑苯甘氨酸的方法，该方法包括：将编码L‑α‑氨基酸脱氨酶的基因、编码羟基扁桃酸合成酶的基因和载体通过酶切连接，得到第一重组质粒；将编码扁桃酸脱氢酶的基因、编码亮氨酸脱氢酶的基因和载体通过酶切连接，得到第二重组质粒；将所述第一重组质粒和所述第二重组质粒共同转入宿主细胞中，得到基因工程菌。根据本发明实施例，该方法获得的基因工程菌生物催化L‑苯丙氨酸，可使L‑苯甘氨酸达最大收率，具有广阔的工业化应用前景。

Description

一种基因工程菌株生物催化生产L-苯甘氨酸的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种基因工程菌株生物催化生产L-苯甘氨酸的方法。

背景技术

L-苯甘氨酸是一种手性非天然氨基酸，作为一种重要的原料化合物和药物中间体，可用于合成青霉素、维及霉素、普那霉素I等β-内酰胺类抗生素，也可用于抗肿瘤药物紫衫醇的合成，在医药领域具有广阔的市场前景。L-苯甘氨酸主要通过化学法合成，但化学合成反应条件剧烈、工艺复杂、副产物较多、产品光学纯度较低，需要进一步光学拆分；且合成过程中需要用到大量的有机溶剂和有毒物质，工业污染严重。

相比化学合成，生物合成具有选择性强、反应条件温和、环境友好及对设备要求低等优势，随着环境问题日益突出，绿色、环保的生物合成更受关注和青睐。因此，后续也出现了一些利用苯海因酶转化法、D-苯甘氨酸氨基转移酶法和氨基酸脱氢酶法等生物合成苯甘氨酸的报道。然而，它们仍存在一定的缺陷，例如需要硫酸的辅助、催化活性低或需要额外的辅酶循环***等。因此，目前亟待开发一条转化效率高、对应选择性好、成本低廉并且环境友好的L-苯甘氨酸制备路线。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种基因工程菌生物催化生产L-苯甘氨酸的方法。该方法可实现以L-苯丙氨酸为底物，生物催化高效合成L-苯甘氨酸，具有广阔的工业化应用前景。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种构建生产L-苯甘氨酸的基因工程菌的方法，其包括以下步骤：

将编码L-α-氨基酸脱氨酶的基因、编码羟基扁桃酸合成酶的基因和载体通过酶切连接，得到第一重组质粒；

将编码扁桃酸脱氢酶的基因、编码亮氨酸脱氢酶的基因和载体通过酶切连接，得到第二重组质粒；

将所述第一重组质粒和所述第二重组质粒共同转入宿主细胞中。

根据本发明实施例的构建生产L-苯甘氨酸的基因工程菌的方法，该方法通过构建共表达L-α-氨基酸脱氨酶(L-α-amino acid deaminase,LAAD)和羟基扁桃酸合成酶(hydroxymandelate synthase,HmaS)的质粒，共表达扁桃酸脱氢酶(mandelatedehydrogenase，SMDH)和亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase LeuDH)的质粒，并将两质粒同时转入宿主细胞中，获得重组菌株，该重组菌株以L-苯丙氨酸为底物，级联催化后生产接近100％收率的L-苯甘氨酸。

可选地，所述第一重组质粒是以pET系列载体为表达载体，例如，pETDuet-1；所述第二重组质粒是以pRSF系列载体为表达载体，例如，pRSFDuet-1。

可选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

在本发明的第二个方面，本发明提出了由上述方法构建的生产L-苯甘氨酸的基因工程菌。该基因工程菌以L-苯丙氨酸为底物，级联催化后生产接近100％收率的L-苯甘氨酸。

在本发明的第三个方面，本发明提出一种表达上述基因工程菌的方法，其包括将基因工程菌先接种于LB培养基中，过夜培养，之后按1:100比例将过夜培养物转接入TB培养液中培养2～3h，再加入诱导剂进行诱导培养16～24h。

在本发明的第四个方面，本发明提出一种生产L-苯甘氨酸的方法，其以L-苯丙氨酸为底物，以上述的基因工程菌为生物催化剂。该方法以L-苯丙氨酸为底物生产高得率L-苯甘氨酸，具有广阔的工业化应用前景。

可选地，上述方法的反应条件为30℃，250rpm反应1～12h。

在本发明的第五个方面，本发明提出上述生产L-苯甘氨酸的方法在制备L-苯甘氨酸中的应用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为根据本发明实施例的LAAD、HmaS、SMDH、LeuDH四种酶催化合成L-苯甘氨酸的路径；

图2为根据本发明实施例的大肠杆菌工程菌生产L-苯甘氨酸的时间曲线图；

图3为根据本发明实施例的大肠杆菌工程菌生产L-苯甘氨酸的HPLC验证图；

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以***其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得；涉及的实验如无特别说明，均为常规实验方法。

所用材料来源：大肠杆菌BL21(DE3)和TOP10为市售，大肠杆菌BL21(DE3)用于本发明中所有基因的表达，TOP10用于载体构建。大肠杆菌表达载体pETDuet-1，pRSFDuet-1,来源于Novagen，Phusion高保真DNA聚合酶、限制性内切酶购买自厦门鹭隆生物科技发展有限公司。质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒和细菌基因组DNA提取试剂盒购买自上海生物工程有限公司。

LB培养基为：10g·L^-1蛋白胨、5g·L^-1酵母粉、5g·L^-1NaCl，余量为双蒸水，培养基在0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。

TB培养基为：12g·L^-1蛋白胨、24g·L^-1酵母粉、2.31g·L^-1KH₂PO₄、12.54g·L^{- 1}K₂HPO₄、0.4％甘油，余量为双蒸水，培养基在0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。

本发明实施例的L-苯甘氨酸生物合成路径见图1：

以L-苯丙氨酸为底物，通过L-α-氨基酸脱氨酶LAAD催化合成苯丙酮酸，苯丙酮酸在羟基扁桃酸合酶HmaS的催化作用下合成(S)-扁桃酸，再经扁桃酸脱氢酶SMDH的催化合成苯甲酰甲酸，最后在亮氨酸脱氢酶LeuDH作用下合成L-苯甘氨酸。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1构建重组大肠杆菌

1、构建pET-LAAD-HmaS质粒

以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列为上、下游引物(表1)，PCR扩增L-α-氨基酸脱氨酶基因LAAD(SEQ ID NO:1)，胶回收目的条带；其中，PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。

以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物PCR扩增羟基扁桃酸合成酶基因HmaS(SEQID NO:2)，胶回收目的条带；其中，PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。

将L-α-氨基酸脱氨酶基因LAAD和羟基扁桃酸合成酶基因HmaS分别在37℃，BsaI酶切2小时后，PCR纯化回收酶切片段；其中，酶切体系为：50μL体系含1μL BsaI酶以及1μgPCR产物。

将纯化回收的片段与经过BamHI和XhoI双酶切的表达，载体pETDuet-1连接，16℃连接1小时得连接产物，连接体系为：20μL体系含1μL T4连接酶，以及1μLpETDuet-1载体和分别2μL目的基因酶切产物。

将连接产物转入大肠杆菌TOP10感受态细胞中，之后用T7引物验证获取阳性克隆菌落，获得pET-LAAD-HmaS质粒。

2、构建pRSF-SMDH-LeuDH质粒

以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列为上、下游引物(表1)，以P.PutidaKT2440基因组为模板，PCR扩增扁桃酸脱氢酶基因SMDH(SEQ ID NO:3)，胶回收目的条带；其中，PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。

以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示序列为为上、下游引物(表1)，以Bacilluscereus基因组为模板，扩增亮氨酸脱氢酶基因LeuDH(SEQ ID NO:4)，胶回收目的条带；其中，PCR扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。

将扁桃酸脱氢酶基因SMDH和亮氨酸脱氢酶基因LeuDH分别在37℃，BsaI酶切2小时后，PCR纯化回收酶切片段，其中，酶切体系为：50μL体系含1μL BsaI酶以及1μgPCR产物。

将纯化回收的片段与经过BamHI和XhoI双酶切的表达载体pRSFDuet-1连接，得到pRSF-SMDH-LeuDH质粒。其中，连接体系为：20μL体系含1μL T4连接酶，以及1μLpRSFDuet-1载体和分别2μL目的基因酶切产物。

3、获取大肠杆菌重组菌株

将上述1、2获取的pET-LAAD-HmaS质粒和pRSF-SMDH-LeuDH质粒电击法导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，之后，将菌株接种到LB(含有50μg/mL氨苄霉素和50μg/mL卡纳霉素两种抗生素)培养基中筛选，在37℃培养过夜，获得大肠杆菌工程菌株。

表1：PCR扩增所用引物

实施例2全细胞生物转化重组菌株

将实施例1制备的大肠杆菌工程菌接种在2mL LB培养液中，之后按1:100比例接入100mL TB培养液中扩大培养2～3h，OD₆₀₀达0.6后，加入0.5mM IPTG后22℃诱导蛋白表达20h，离心获取菌体。

全细胞转化体系(2mL)：10g/L细胞干重，L-苯丙氨酸(10mM或40mM)，最后加入磷酸缓冲液补齐(200mM，pH＝8.0)。该体系在30℃，250rpm下反应1～12h。然后，将样品离心，取上清，液相色谱检测L-苯甘氨酸产量。

产品定量分析：转化液采用Shimadzu高效液相色谱仪检测分析，采用光电二极管阵列检测器(工作波长210nm)、Shimadzu C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温40℃、进样量10μL；流动相：90％双蒸水，0.1％三氟乙酸，10％乙腈。

结果如图2所示，以10mM或40mM L-苯丙氨酸经由全细胞催化12小时后，接近100％摩尔收率的L-苯甘氨酸。

结果如图3所示，以10mM或40mM L-苯丙氨酸经由全细胞催化12小时后，HPLC检测结果显示的L-苯丙氨酸完全转变为L-苯甘氨酸，且无明显反应中间体积累。

综上，根据本发明的实施例，通过构建共表达L-α-氨基酸脱氨酶(L-α-amino aciddeaminase,LAAD)和羟基扁桃酸合成酶(hydroxymandelate synthase,HmaS)的质粒，共表达扁桃酸脱氢酶(mandelate dehydrogenase，SMDH)和亮氨酸脱氢酶(leucinedehydrogenase LeuDH)的质粒，并将两质粒同时转入宿主细胞中，获得重组菌株，重组菌株以L-苯丙氨酸为底物，级联催化后生产接近100％收率的L-苯甘氨酸；相比已公开或公布的其他发明无需辅酶循环***，降低了生产成本，并且环境友好，具有广阔的工业化应用前景。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门大学

<120> 一种基因工程菌株生物催化生产L-苯甘氨酸的方法

<130> 无

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1422

<212> DNA

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<400> 1

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ggtgctggta ttcagggtat catgaccgct attaatctgg cagaacgtgg tatgagcgtt 240

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atcagctatc agaccagccc ggaaattttt ccgctgcatc actacggtaa aatcctgtgg 360

cgtggtatga acgaaaagat tggtgcggat accagctatc gtacccaagg tcgtgttgaa 420

gctctggcag atgaaaaagc actggacaag gcgcaggctt ggatcaaaac cgcgaaggaa 480

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attgatccga ccccgtttag tttggatcgt tttaagaagt aa 1422

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<212> DNA

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<400> 12

ttggtctcct cgagttagcg acggctaata atatcg 36

Claims (8)

1.一种构建生产L-苯甘氨酸的基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将编码L-α-氨基酸脱氨酶的基因、编码羟基扁桃酸合成酶的基因和载体通过酶切连接，得到第一重组质粒；

将编码扁桃酸脱氢酶的基因、编码亮氨酸脱氢酶的基因和载体通过酶切连接，得到第二重组质粒；

将所述第一重组质粒和所述第二重组质粒共同转入宿主细胞中。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一重组质粒是以pET系列载体为表达载体；所述第二重组质粒是以pRSF系列载体为表达载体。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法构建的生产L-苯甘氨酸的基因工程菌。

5.一种表达权利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，

将基因工程菌先接种于LB培养基中，过夜培养，之后按1:100比例将过夜培养物转接入TB培养液中培养2～3h，再加入诱导剂进行诱导培养16～24h。

6.一种生产L-苯甘氨酸的方法，其特征在于，以L-苯丙氨酸为底物，以权利要求4所述的基因工程菌为生物催化剂。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，反应条件为30℃，250rpm反应1～12h。

8.如权利要求6-7所述的方法在制备L-苯甘氨酸中的应用。

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