CN109825538B

CN109825538B - 一种手性2-氨基-1-丁醇的合成方法

Info

Publication number: CN109825538B
Application number: CN201711181396.4A
Authority: CN
Inventors: 孙周通; 赵强; 刘保艳; 曲戈
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2037-11-23
Also published as: CN109825538A

Abstract

本发明公开了一种手性2‑氨基‑1‑丁醇的合成方法。该方法包括如下步骤：以1，2‑丁二醇为底物，经酶A及其辅酶催化反应生成2‑酮‑1‑丁醇；以2‑酮‑1‑丁醇为底物，经酶B及其辅酶催化反应生成手性2‑氨基‑1‑丁醇；所述酶A选自醇脱氢酶、羰基还原酶或这两个酶的突变体；所述酶B选自氨基酸脱氢酶、转氨酶或这两个酶的突变体。本发明提供了一条全新的绿色生物合成路线，以廉价的1,2‑丁二醇为原料，通过多酶共表达或级联或分步催化合成手性2‑氨基‑1‑丁醇，即(S)‑2‑氨基‑1‑丁醇和(R)‑2‑氨基‑1‑丁醇。

Description

一种手性2-氨基-1-丁醇的合成方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种手性2-氨基-1-丁醇的合成方法，特别涉及一种以利用生物酶催化合成手性2-氨基-1-丁醇的方法。

背景技术

近年来以生物催化剂应用为核心的绿色化学工艺受到越来越多的关注，尤其是组合使用天然酶或新型改造酶为多酶分子机器的级联催化反应备受研究者和产业界青睐(Fischereder et al.,ACS Catal.,2016,6(1):23-30；France et al.,ACS Catal.,2016,6(6):3753-3759；Li et al.,2016,J Agr Food Chem.,64(46):8927-8934.)。采用多酶分子机器构建的级联反应新途径，不仅可以减少中间体的损失，还可提高转化效率，大大降低工艺生产成本(Schrittwieser et al.,Curr Opin Chem Biol.,2011,15(2):249-256；Wheeldon et al.,Nat Chem.,2016,8(4):299-309.)。

手性2-氨基-1-丁醇，尤其是(S)-2-氨基-1-丁醇，在有机合成和药物生产中有着广泛的用途，可作为重要的中间体制备具有光学活性的化合物。结构式如图1所示。(S)-2-氨基-1-丁醇((S)-2-Amino-1-butanol)是重要医药中间体，目前的生产方法有化学法，如：以丁醛、偶氮二甲酸二卞酯和D-脯氨酸为原料，在NaBH₄、H₂和镍等催化作用下合成(S)-2-氨基丁醇(Kotkar&Sudalai，Tetrahedron:Asymmetry,2006,17(11):1738-1742)；也有报道用氢化铝锂还原2-氨基丁酸获得相应的手性氨基醇产物(Doherty&Shapira,J Org Chem,1963,28(5):1339-1342)；采用H₂和镍在高压条件下还原L-2-氨基丁酸获得(S)-2-氨基丁醇(CN105481703A)；或者采用NaHB₄在H₂SO₄/THF条件下还原相应的α-氨基酸获得(Li etal.,J Agr Food Chem，2016,64(46):8927-8934)。氨基丁醇化学拆分法，如：联苯甲酰酒石酸拆分法(Periasamy et al.,Synthesis-Stuttgart,2003(13):1965-1967)；L-酒石酸拆分法(Zhao et al.,J Heterocyclic Chem，2012,49(4):943-946)。也有酶法拆分的报道，如：在氨基基团保护的情况下，由脂肪酶选择性水解羟基形成的酯键而获得手性单体(Francalanci et al.,J Org Chem，1987,52(23):5079-5082)；固定化青霉素G酰化酶选择性水解N-苯乙酰衍生2-氨基丁醇外消旋混合物中的(S)-构型获得(S)-2-氨基丁醇，ee值可达99％(Fadnavis et al.,Tetrahedron:Asymmetry,1999,10(23):4495-4500)；最新报道通过将固定化青霉素G酰化固定在固定床上实现连续拆分，转化率达到39.3％，ee值98.2％。

以上所述(S)-2-氨基-1-丁醇的合成方法，化学法需要高温、高压和金属催化剂利用氢化还原而获得，污染大，安全系数低。而化学拆分法也需要用到大量酸碱和其他化学试剂，虽然酶法拆分反应条件温和，立体选择性好，但拆分法的转化率仅50％，且收率低。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种利用生物酶催化合成手性2-氨基-1-丁醇的方法，可包括如下步骤(图2)：

(A)以1，2-丁二醇为底物，经酶A及其辅酶催化反应生成2-酮-1-丁醇；

(B)以步骤(A)生成的2-酮-1-丁醇为底物，经酶B及其辅酶催化反应生成手性2-氨基-1-丁醇；

所述酶A可选自如下任一种：醇脱氢酶、羰基还原酶、所述醇脱氢酶的突变体、所述羰基还原酶的突变体；

所述酶B可选自如下任一种：氨基酸脱氢酶、转氨酶、所述氨基酸脱氢酶的突变体、所述转氨酶的突变体。

本发明所提供的方法通过多酶共表达或级联或分步催化的方法实现。

进一步地，所述醇脱氢酶和所述羰基还原酶均可来源于如下任一微生物：嗜热脂肪芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefiri)、短小乳杆菌(Lactobacillus brevis)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)、赖氏菌属(Leifsonia sp.)、威吉利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii)、赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)。

优选来源于短小乳杆菌(Lactobacillus brevis)的醇脱氢酶LBADH、高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶TbSADH，以及芽胞杆菌科(Bacillaceae)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefiri)、赖氏菌属(Leifsonia sp.)、威吉利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii)来源的的醇脱氢酶和赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)来源的羰基还原酶。

进一步地，所述氨基酸脱氢酶可来源于：嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)。

进一步地，所述转氨酶可来源于如下任一微生物：巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)、土曲霉(Aspergillus terreus)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、玉米赤霉(Gibberella zeae)、分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)，或者为Codexis公司的ATA-117转氨酶。

更进一步地，所述醇脱氢酶具体可为如下(a1)-(a8)中任一：

(a1)来源于短小乳杆菌(Lactobacillus brevis)的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQID No.2；

(a2)来源于嗜热脂肪芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.4；

(a3)来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.6；

(a4)来源于高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.8；

(a5)来源于芽孢杆菌科(Bacillaceae)的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.10；

(a6)来源于赖氏菌属(Leifsonia sp.)的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.12；

(a7)来源于威吉利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii)的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.14；

(a8)在(a1)-(a7)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

更进一步地，所述羰基还原酶具体可为如下(b1)或(b2)：

(b1)来源于赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)的羰基还原酶，氨基酸序列为SEQ ID No.16；

(b2)在(b1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

更进一步地，所述氨基酸脱氢酶具体可为如下(c1)-(c2)中任一：

(c1)来源于嗜热脂肪芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的亮氨酸脱氢酶，SEQ ID No.18；

(c2)在(c1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

更进一步地，所述转氨酶具体可为如下(d1)-(d9)中任一：

(d1)Codexis公司的ATA-117转氨酶，氨基酸序列为SEQ ID No.20；

(d2)来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的转氨酶，氨基酸序列为SEQ IDNo.22；

(d3)来源于烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)的转氨酶，氨基酸序列为SEQ IDNo.24；

(d3)来源于费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)的转氨酶，氨基酸序列为SEQID No.26；

(d5)来源于玉米赤霉(Gibberella zeae)的转氨酶，氨基酸序列为SEQ ID No.28；

(d6)来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)的转氨酶，氨基酸序列为SEQID No.30；

(d7)来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的转氨酶，氨基酸序列为SEQID No.32；

(d8)来源于铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)的转氨酶，氨基酸序列为SEQ IDNo.34；

(d9)在(d1)-(d8)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

进一步地，所述醇脱氢酶的突变体具体可为如下(e1)或(e2)：

(e1)与SEQ ID No.2所示来源于短小乳杆菌(Lactobacillus brevis)的醇脱氢酶相比，存在或仅存在如下突变中的至少一种：I11V、G37D；

(e2)在(e1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

进一步地，所述氨基酸脱氢酶的突变体具体可为如下(f1)-(f2)中任一：

(f1)与SEQ ID No.18所示来源于嗜热脂肪芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的亮氨酸脱氢酶相比，存在或仅存在如下突变中的至少一种：K68X、N261X，其中X代表除野生型氨基酸以外的其他19种氨基酸(以公认的单字母简称呈现，包括F，L，I，V，S，P，T，A，Y，H，Q，N，D，E，C，R，G，M，W)。优选的，所述X为极性氨基酸(如：S，T，Y，H，Q，N，D，E，C，R等)。进一步优选的，所述X为S、Y、L或C。再进一步优选的，所述氨基酸脱氢酶的突变体为与SEQ ID No.18所示来源于嗜热脂肪芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的亮氨酸脱氢酶相比，存在或仅存在如下突变：K68S/N261L

或者K68Y/N261C。

(f2)在(f1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在本发明中，对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸，位置，取代氨基酸。如，在SEQ ID No.2的第11位用缬氨酸(V)取代原有的异亮氨酸(I)命名为“I11V”。包含多重改变的变体由斜杠符号(“/”)分隔。

进一步地，在所述方法中，所述酶A和所述酶B均可以粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞的形式发生催化作用。

进一步，所述粗酶液、粗酶液冻干粉和纯酶可按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述酶A和/或所述酶B，得到重组细胞；裂解所述重组细胞获得所述酶A和/或所述酶B的粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶。所述全细胞可按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述酶A和/或所述酶B，得到的重组细胞即为所述酶A和/或所述酶B的全细胞。

再进一步，所述重组细胞具体可按照包括如下步骤的方法制备获得：向所述宿主细胞中导入能够表达所述酶A和/或所述酶B的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述酶A和/或所述酶B的所述重组细胞。

更进一步，所述“能够表达所述酶A和/或所述酶B的核酸分子”可通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中。其中，所述重组载体可为携带有所述酶A和/或所述酶B的编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，具体如pET-28a等)、噬菌体、酵母质粒(如YEp系列载体等)或逆转录病毒包装质粒。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为将所述酶A或所述酶B的编码基因替换pET22b载体的酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ之间的小片段后得到的重组质粒。

在本发明的另一个实施例中，所述重组载体为将所述酶A的编码基因***到pETDuet-1载体的酶切位点酶切位点EcoRⅠ和Hind III之间，同时将所述酶B的编码基因***到pETDuet-1载体的酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ之间后得到的重组质粒。

进一步地，所述宿主细胞可为原核细胞或低等真核细胞。

更进一步地，所述原核细胞具体可为细菌；所述低等真核细胞具体可为酵母细胞。

在本发明的一个实施例中，所述宿主细胞具体为大肠杆菌，更加具体的为E.coliBL21(DE3)。相应的，所述诱导培养为向培养体系中加IPTG至终浓度0.1-0.5mM(具体如0.1mM)，20-37℃诱导培养12-24h(具体如16h)。

所述来源于短小乳杆菌(Lactobacillus brevis)的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.1或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于嗜热脂肪芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.3或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.5或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiri)的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.7或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于芽孢杆菌科(Bacillaceae)的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ IDNo.9或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于赖氏菌属(Leifsonia sp.)的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ IDNo.11或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于威吉利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii)的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.13或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)的羰基还原酶的编码基因的序列为SEQ ID No.15或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于嗜热脂肪芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的亮氨酸脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.17或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述Codexis公司的ATA-117转氨酶的编码基因的序列为SEQ ID No.19或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的转氨酶的编码基因的序列为SEQ IDNo.21或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)的转氨酶的编码基因的序列为SEQ ID No.23或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)的转氨酶的编码基因的序列为SEQ ID No.25或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于玉米赤霉(Gibberella zeae)的转氨酶的编码基因的序列为SEQ IDNo.27或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于分支杆菌的转氨酶的编码基因的序列为SEQ ID No.29或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的转氨酶的编码基因的序列为SEQ ID No.31或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)的转氨酶的编码基因的序列为SEQID No.33或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于短小乳杆菌(Lactobacillus brevis)的醇脱氢酶的突变体的编码基因的序列为如下(g1)-(g3)中任一：(g1)与SEQ ID No.1相比，存在或仅存在如下突变中的至少一种：A31G/T33G、G110A/C111T；(g2)在(g1)所限定序列的5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；(g3)与(g1)或(g2)所限定的序列相比保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

所述来源于嗜热脂肪芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的亮氨酸脱氢酶的突变体的编码基因的序列为如下(h1)-(h3)中任一：(h1)与SEQ ID No.17相比，存在或仅存在如下突变中的至少一种：A203G/A204C、A202T/A204T、A781C/A782T/C783G、A781T/A782G；(h2)在(h1)所限定序列的5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；(h3)与(h1)或(h2)所限定的序列相比保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

进一步，所述(h1)为：与SEQ ID No.17相比，存在或仅存在如下突变中的任一种：A203G/A204C/A781C/A782T/C783G、A202T/A204T/A781T/A782G。

在本发明中，对于碱基取代，使用下述命名法：原始碱基，位置(即在W1或W2或W3核苷酸序列中的位置)，取代碱基。相应的，在SEQ ID No.1的第31位用A取代原有的G命名为“A31G”。包含多重改变的变体由斜杠符号(“/”)分隔。

在步骤(A)和步骤(B)中，所述催化反应的温度均可为25～37℃，如30～37℃，具体如30℃或37℃。

在步骤(A)和步骤(B)中，所述催化反应的时间均可为4～48h，如24h。

当所述酶A和所述酶B是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式发生催化作用时，步骤(A)中，所述催化反应在如下(k1)所示缓冲液中进行；步骤(B)中，所述催化反应均在如下(k2)-(k3)任一所示缓冲液中进行；当所述酶A和所述酶B以共表达所述酶A和所述酶B的全细胞的形式发生催化作用时，步骤(A)和步骤(B)的所述催化反应均是在如下(k1)所示缓冲液中进行；

(k1)浓度为50～100mM，pH值为6.5～8.0的磷酸盐缓冲液；

具体如：浓度为100mM，pH值为8.0的磷酸盐缓冲液。

(k2)浓度为100mM～2M，pH为8.0～9.6的NH₃·H₂O或NH₄Cl缓冲液；

具体如：浓度为1M，pH为8.7的NH₃·H₂O或NH₄Cl缓冲液。

(k3)浓度为50～100mM，异丙胺的浓度为250mM-1M，pH值为7.5～8.5的磷酸盐缓冲液；

具体如：浓度为100mM、异丙胺的浓度为500mM、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液。

当所述酶A和所述酶B是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式发生催化作用时，步骤(A)和步骤(B)中，所述酶A和所述酶B在各自反应体系中的浓度均可为0.1～10g/L，如10g/L。当所述酶A和所述酶B以共表达所述酶A和所述酶B的全细胞的形式发生催化作用时，步骤(A)和步骤(B)在一个反应体系中完成，所述反应体系中所述全细胞(共表达所述酶A和所述酶B)的浓度为100g/L(每升反应体系中含有所述全细胞的湿重为100g)。

在本发明中，所述酶A的辅酶具体为氧化型辅因子II，即NADP⁺，或者为氧化型辅因子I，即NAD⁺。当所述酶B为氨基酸脱氢酶或所述氨基酸脱氢酶的突变体时，所述酶B的辅酶具体为氧化型辅因子I，即NAD⁺；当所述酶B为转氨酶或所述转氨酶的突变体时，所述酶B的辅酶具体为磷酸吡哆醛(PLP)。

在本发明中，当所述酶A和所述酶B是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式发生催化作用时，所述酶A和所述酶B的辅酶在其各自的反应体系中的浓度均可为0.5～3mM(具体如1mM)。

当所述酶A和所述酶B是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式发生催化作用时，在步骤(A)中，所述催化反应的反应体系中除了含有1，2-丁二醇和所述酶A及其辅酶外，还含有丙酮。

具体的，步骤(A)中，所述催化反应的反应体系组成如下：浓度为100mM，pH值为8.0的磷酸盐缓冲，终浓度为20mM的1，2-丁二醇、终浓度为1mM的氧化型辅因子II，即NADP⁺，或者为氧化型辅因子I，即NAD⁺、终浓度为5％的丙酮(v/v)、终浓度为10g/L的所述酶A的粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶。

当所述酶A和所述酶B是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式发生催化作用时，在步骤(B)中，当所述酶B为氨基酸脱氢酶或所述氨基酸脱氢酶的突变体时，所述催化反应的反应体系中除了含有2-酮-1-丁醇和所述酶B及其辅酶外，还含有葡萄糖脱氢酶和葡萄糖。进一步地，所述反应体系中还含有碳酸钙。

具体的，步骤(B)中，当所述酶B为氨基酸脱氢酶或所述氨基酸脱氢酶的突变体时，所述催化反应的反应体系的组成可如下：浓度为1M，pH为8.7的NH₃·H₂O或NH₄Cl缓冲液；终浓度为1mM的氧化型辅因子I，即NAD⁺；终浓度为1g/L的葡萄糖脱氢酶；终浓度为100mM的葡萄糖；终浓度为10g/L的所述酶B的粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶；终浓度为5g/L的碳酸钙。当所述酶B为转氨酶或所述转氨酶的突变体时，所述催化反应的反应体系的组成可如下：浓度为50～100mM，异丙胺的浓度为500mM，pH值为8.0的磷酸盐缓冲液；终浓度为1mM的磷酸吡哆醛(PLP)；终浓度为10g/L的所述酶B的粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶。

当所述酶A和所述酶B以共表达所述酶A和所述酶B的全细胞的形式发生催化作用时，所述反应体系中可以不加入辅酶，进一步地，所述反应体系中还含有葡萄糖。

具体的，所述反应体系的组成可为如下：浓度为100mM、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液；终浓度为50mM的1，2-丁二醇；100mM葡萄糖；终浓度为100g/L的所述全细胞(即每升反应体系中含有所述全细胞的湿重为100g)。

在所述方法中，所述手性2-氨基-1-丁醇为(S)-2-氨基-1-丁醇和/或(R)-2-氨基-1-丁醇。

前文所述的氨基酸脱氢酶及其突变体，以及来源于Codexis公司的ATA-117转氨酶、来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的转氨酶、来源于烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)的转氨酶、来源于费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)的转氨酶、来源于玉米赤霉(Gibberella zeae)的转氨酶、来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)的转氨酶，用于(S)-2-氨基-1-丁醇的合成；前文所述的来源于巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)的转氨酶、来源于铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)的转氨酶用于(R)-2-氨基-1-丁醇的合成。

本发明还提供了一种酶***及其相关产品。

本发明所提供的酶***包括前文所述酶A和所述酶B。当然，也可以包括所述酶A和所述酶B各自的辅酶。

所述相关产品为能够表达所述酶***中各酶的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述酶***或所述相关产品在合成手性2-氨基-1-丁醇中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的合成手性2-氨基-1-丁醇的方法中，存在辅因子再生***。所述辅因子再生***为葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖氧化，或醇脱氢酶催化丙酮还原或异丙醇氧化促进辅因子再生。在本发明合成手性2-氨基-1-丁醇的方法中，醇脱氢酶或羰基还原酶催化1，2-丁二醇氧化成2-酮-1-丁醇，NAD(P)⁺被还原成NAD(P)H，同时，醇脱氢酶催化丙酮还原成异丙醇，NAD(P)H被重新氧化成NAD(P)⁺，生成的NAD(P)⁺重新参与到1，2-丁二醇生成2-酮-1-丁醇的氧化。氨基酸脱氢酶及其突变体催化2-酮-1-丁醇还原成1，2-丁二醇，NADH被氧化成NAD⁺，同时，葡萄糖脱氢酶(GDH)催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，NAD⁺被重新还原成NADH，生成的NADH重新参与到2-酮-1-丁醇生成(S)-2-氨基-1-丁醇的氧化。

本发明提供了一条全新的绿色生物合成路线，以廉价的1,2-丁二醇为原料，通过多酶共表达或级联或分步催化合成手性2-氨基-1-丁醇，即(S)-2-氨基-1-丁醇和/或(R)-2-氨基-1-丁醇。

附图说明

图1为(S)-2-氨基-1-丁醇和(R)-2-氨基-1-丁醇的结构式。

图2为本发明手性2-氨基-1-丁醇的生物制备方法的反应原理图。A：醇脱氢酶或羰基还原酶偶联氨基酸脱氢酶制备(S)-2-氨基-1-丁醇。B：醇脱氢酶或羰基还原酶偶联转氨酶制备(S)-2-氨基-1-丁醇或者(R)-2-氨基-1-丁醇。

图3为2-酮-1-丁醇气相色谱(GC)鉴定结果。

图4为2-氨基-1-丁醇标准品用邻苯二甲醛衍生后分离效果图。A:混旋型2-氨基-1-丁醇；B：(S)-2-氨基-1-丁醇标准品；C：(R)-2-氨基-1-丁醇标准品。

图5为反应液液相色谱图。A：阴性对照组反应液液相色谱结果；B：阴性对照+(S)-2-氨基-1-丁醇标准品液相色谱结果；C：阴性对照+(R)-2-氨基-1-丁醇标准品液相色谱结果；D：实验组1反应液液相色谱结果(产物为(S)-2-氨基-1-丁醇)；E：实验组2反应液液相色谱结果(产物为(R)-2-氨基-1-丁醇)。其中，阴性对照反应体系中只含有空表达载体的表达宿主粗酶粉或酶液或全细胞，其它成分与实验组相同。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、醇脱氢酶或羰基还原酶偶联嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的亮氨酸脱氢酶或其突变体制备(S)-2-氨基-1-丁醇

一、重组醇脱氢酶或其突变体、氨基酸酸脱氢酶或其突变体的工程菌的制备

将相关酶的编码基因分别进行全基因合成(根据需要以大肠杆菌为宿主进行密码子优化)，将合成的基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。本发明所述载体具体为pET22b(+)，将全基因合成后的相关酶的编码基因***到pET22b(+)的酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ之间后，并经测序验证正确后得到重组载体。并利用定点突变方法得到其相关基因突变体。

将上述测序验证正确的重组表达载体转化至合适的微生物宿主中。所述宿主微生物为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的醇脱氢及氨基酸脱氢酶基因可被有效表达即可。其中，较佳的所述宿主微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)，优选大肠杆菌BL21(DE3)，将前述重组表达质粒转化入E.coliBL21(DE3)中，可得到本发明的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为电转法或化学转化法。

本实施例中所涉及的酶及其突变体详见表1。

表1实施例1中所涉及的酶及其突变体

注：W1表示来源于短小乳杆菌(Lactobacillus brevis)的醇脱氢酶LBADH；W2表示来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的醇脱氢酶；W3表示来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶TbSADH；W4表示来源于高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)的醇脱氢酶；W5表示来源于芽孢杆菌科(Bacillaceae)的醇脱氢酶；W6表示来源于赖氏菌属(Leifsonia sp.)的醇脱氢酶；W7表示来源于威吉利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii)的醇脱氢酶；W8表示来源于赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)的羰基还原酶SSCR；W9表示来源于嗜热脂肪芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的亮氨酸脱氢酶。Wn-Mn表示Wn(n为自然数)的突变体。蛋白取代的编号是从Wn(n为自然数)所示野生型氨基酸序列的N端为起始的；基因取代的编号是从Wn(n为自然数)所示野生型核苷酸序列的5’端为起始的。表中，对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸，位置(即在Wn氨基酸序列中的位置)，取代氨基酸。相应地，在SEQ ID No.2的第11位用缬氨酸(V)取代原有的异亮氨酸(I)命名为“I11V”。对于碱基取代，使用下述命名法：原始碱基，位置(即在Wn核苷酸序列中的位置)，取代碱基。相应的，在SEQ ID No.1的第31位用A取代原有的G命名为“A31G”。包含多重改变的变体由斜杠符号(“/”)分隔。

二、重组醇脱氢酶或其突变体、氨基酸脱氢酶或其突变体的表达及粗酶制备

将步骤一构建的重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，37℃培养12-16h，待转化子长出，将单个转化子接种到含有相应抗生素的5mL LB培养基中，37℃，220rmp培养过夜(12-16h)。然后按照1％(体积百分含量)的比例接种到TB培养基中，37℃，220rmp培养到OD600为0.6左右，添加终浓度为0.1mM的IPTG，20-37℃诱导培养16h，然后4000rpm，4℃离心10min收集细胞，用100mM，pH值为8.0的磷酸盐缓冲重悬清洗一次，之后超声破菌并制备酶冻干粉。

三、手性2-氨基-1-丁醇的制备

第一步反应：在反应体系中依次加入浓度为100mM，pH值为8.0的磷酸盐缓冲、终浓度为20mM的1，2-丁二醇、终浓度为1mM的氧化型辅因子II，即NADP⁺，或者为氧化型辅因子I，即NAD⁺、终浓度为5％的丙酮(v/v)、终浓度为10g/L的醇脱氢酶或羰基还原酶冻干粉或酶液组成反应体系。将该反应体系在30℃的条件下反应24h后，对产物进行气相色谱(GC)检测。

气相色谱(GC)的检测条件如下：进样量：2μL；色谱柱：HP-5；分流比：20:1；分流流量：40mL/min；升温程序：40℃，5分钟；5℃/min升温到60℃，2分钟；30℃/min升温到200℃，2.333分钟。运行时间：18分钟。

结果参考图3，证明该步反应得到2-酮-1-丁酮。

第二步反应：以上一步反应生成的2-酮-1-丁醇为底物，在反应体系中依次加入为pH为8.7、终浓度为1M的NH₃·H₂O或NH₄Cl缓冲液、终浓度为1mM的氧化型辅因子I，即NAD⁺、终浓度为1g/L的葡萄糖脱氢酶、终浓度为100mM的葡萄糖、终浓度为10g/L的嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的亮氨酸脱氢酶突变体冻干粉或酶液、终浓度为5g/L的碳酸钙组成反应体系。将该反应体系在30℃的条件下反应24h，即得到(S)-2-氨基-1-丁醇。反应液用邻苯二甲醛衍生后液相色谱检测。

HPLC检测条件如下：Agilent SB-Aq C18柱(4.6mm*250mm,5um)；检测波长334nm；柱温：35℃；流速：1mL/min；梯度洗脱程序如表2所示。

表2 HPLC的梯度洗脱程序

注：(1)表中的％表示体积百分含量。

ee＝(A_S-A_R)/(A_S+A_R)×100％；A_S：液相色谱分析获得的(S)-2-氨基-1-丁醇的峰面积值；A_R：液相色谱分析获得的(R)-2-氨基-1-丁醇的峰面积值。

底物转化效率＝C_转/C_总×100％；C_转：反应体系中转化为(S)或(R)-2-氨基-1-丁醇的底物的摩尔数；C_总：反应体系中底物的总摩尔数。

HPLC检测结果参考图4和图5中D，底物转化效率45-55％，ee值大于99％。具体结果参见表3。

表3醇脱氢酶或羰基还原酶偶联嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的亮氨酸脱氢酶或其突变体制备(S)-2-氨基-1-丁醇的结果

注：表中第一步反应和第二步反应中Wn和Wn-Mn(n为自然数)所代表的含义与表1相同。

实施例2、醇脱氢酶或羰基还原酶偶联转氨酶制备(S)-2-氨基-1-丁醇

一、重组醇脱氢酶或羰基还原酶、转氨酶的工程菌的制备

参照实施例1步骤一进行。

本实施例中所涉及的酶及其突变体详见表4。

表4实施例2中所涉及的酶及其突变体

注：W1-W8所表示的含义同表1。W10表示Codexis公司的ATA-117转氨酶；W11表示来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的转氨酶；W12表示来源于烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)的转氨酶；W13表示来源于费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)的转氨酶；W14表示来源于玉米赤霉(Gibberella zeae)的转氨酶；W15表示来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)的转氨酶。Wn-Mn表示Wn(n为自然数)的突变体。蛋白、基因的取代的编号以及具体命名法均同表1。

二、重组醇脱氢酶或羰基还原酶、转氨酶的表达及粗酶制备

参照实施例1步骤二进行。

三、手性2-氨基-1-丁醇的制备

第一步反应：在反应体系中依次加入浓度为100mM，pH值为8.0的磷酸盐缓冲、终浓度为20mM的1，2-丁二醇、终浓度为1mM的氧化型辅因子II，即NADP⁺，或者为氧化型辅因子I，即NAD⁺、终浓度为5％的丙酮(v/v)、终浓度为10g/L的醇脱氢酶或羰基还原酶酶冻干粉或酶液组成反应体系；将该反应体系在30℃的条件下反应24h后，对产物进行气相色谱(GC)检测。气相色谱(GC)的检测条件如实施例1步骤三所示。结果参考图3，证明该步反应得到2-酮-1-丁酮。

第二步反应：以上一步反应生成的2-酮-1-丁醇为底物，在反应体系中依次加入浓度为50～100mM、异丙胺的浓度为500mM、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液，终浓度为1mM的磷酸吡哆醛(PLP)，终浓度为10g/L的Codexis公司的ATA-117转氨酶，或土曲霉(Aspergillusterreus)的转氨酶，或烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)的转氨酶，或费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)的转氨酶，或玉米赤霉(Gibberella zeae)的转氨酶，或分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)的转氨酶酶冻干粉或酶液组成反应体系，将该反应体系在30℃的条件下反应24h，即得到(S)-2-氨基-1-丁醇。反应液用邻苯二甲醛衍生后液相色谱检测。HPLC检测条件如实施例1步骤三所示。

ee值和底物转化效率的具体计算方法同实施例1步骤三。

HPLC检测结果参考图4和图5中D，底物转化效率45-55％，ee值大于99％。具体结果参见表5。

表5醇脱氢酶或其突变体偶联转氨酶制备(S)-2-氨基-1-丁醇的结果

注：表中第一步反应和第二步反应中Wn和Wn-Mn(n为自然数)所代表的含义与表4相同。

实施例3、醇脱氢酶或羰基还原酶偶联转氨酶制备(R)-2-氨基-1-丁醇

一、重组醇脱氢酶、转氨酶的工程菌的制备

参照实施例1步骤一进行。

本实施例中所涉及的酶及其突变体详见表6。

表6实施例3中所涉及的酶及其突变体

注：W1-W8所表示的含义同表1。W16表示来源于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的转氨酶；W17表示来源于铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)的转氨酶。Wn-Mn表示Wn(n为自然数)的突变体。蛋白、基因的取代的编号以及具体命名法均同表1。

二、重组醇脱氢酶、转氨酶的表达及粗酶制备

参照实施例1步骤二进行。

三、手性2-氨基-1-丁醇的制备

第一步反应：在反应体系中依次加入浓度为100mM，pH值为8.0的磷酸盐缓冲液、终浓度为20mM的1，2-丁二醇、终浓度为1mM的氧化型辅因子II，即NADP⁺，或者为氧化型辅因子I，即NAD⁺、终浓度为5％的丙酮(v/v)、终浓度为10g/L的醇脱氢酶或羰基还原酶冻干粉或酶液组成反应体系；将该反应体系在30℃的条件下反应24h后，对产物进行气相色谱(GC)检测。气相色谱(GC)的检测条件如实施例1步骤三所示。结果参考图3，证明该步反应得到2-酮-1-丁酮。

第二步反应：以上一步反应生成的2-酮-1-丁醇为底物，在反应体系中依次加入浓度为100mM、异丙胺的浓度为500mM、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液，终浓度为1mM的磷酸吡哆醛(PLP)，终浓度为10g/L的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)的转氨酶，或铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa PAO2)的转氨酶冻干粉或酶液组成反应体系，将该反应体系在30℃的条件下反应24h，即得到(S)-2-氨基-1-丁醇。反应液用邻苯二甲醛衍生后液相色谱检测。HPLC检测条件如如实施例一步骤三所示。

HPLC检测结果参考图4和图5中E，底物转化效率45-50％，ee值大于99％。具体结果参见表7。

表7醇脱氢酶偶联转氨酶制备(R)-2-氨基-1-丁醇的结果

注：表中第一步反应和第二步反应中Wn和Wn-Mn(n为自然数)所代表的含义与表6相同。

实施例4、酶A和酶B共表达全细胞制备(S)-2-氨基-1-丁醇和(R)-2-氨基-1-丁醇

一、酶A和酶B共表达工程菌的制备

将相关酶的编码基因分别进行全基因合成(根据需要以大肠杆菌为宿主进行密码子优化)，将合成的基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。本发明所述载体具体pETDuet-1，将全基因合成后酶A的DNA片段***到pETDuet-1的酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ之间,将全基因合成后酶B的DNA片段***到pETDuet-1的酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ之间。将重组载体转入大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到正确的重组表达载体。

将上述测序验证正确的重组表达载体转化至合适的微生物宿主中。所述宿主微生物为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的醇脱氢及氨基酸脱氢酶基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠杆菌(Escherichia coli)，优选地为大肠杆菌BL21(DE3)，将前述重组表达质粒转化入E.coli BL21(DE3)中，可得到本发明的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为电转法或化学转化法。

本实施例中所涉及的酶及其突变体详见表8。

表8实施例4中所涉及的酶及其突变体

注：W1-W17所表示的含义同表1、4、6。Wn-Mn表示Wn(n为自然数)的突变体。蛋白、基因的取代的编号以及具体命名法均同表1。

二、酶A和酶B的共表达

将步骤一构建的重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，37℃培养12-16h，待转化子长出，将单个转化子接种到含有相应抗生素的5mL LB培养基中，37℃，220rmp培养过夜(12-16h)。然后按照1％(体积百分含量)的比例接种到TB培养基中，37℃，220rmp培养到OD600为0.6左右，添加终浓度为0.1mM的IPTG，20-37℃诱导培养16h，然后4000rpm，4℃离心10min收集细胞。

三、手性2-氨基-1-丁醇的制备

在反应体系中依次加入浓度为100mM、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液，终浓度为50mM的1，2-丁二醇，100mM葡萄糖，终浓度为100g/L的能够共表达酶A和酶B的全细胞(湿菌重)组成反应体系。将该反应体系在30℃的条件下反应24h后，即得到或(R)或(S)-2-氨基-1-丁醇。发酵液用邻苯二甲醛衍生后液相色谱检测。HPLC检测条件如实施例1步骤三所示。

ee值和底物转化效率的具体计算方法同实施例1步骤三。

HPLC检测结果参考图4和图5中D-E，底物转化效率15-30％，ee值大于99％。具体结果参见表9。

表9酶A和B共表达全细胞催化制备手性2-氨基-1-丁醇的结果

注：表中Wn和Wn-Mn(n为自然数)所代表的含义与表8相同。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种手性2-氨基-1-丁醇的合成方法

<130> GNCLN171921

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

agcaatcgcc tggatggcaa agtggcgatt attaccggcg gtaccctggg tattggctta 60

gcgattgcga ccaaatttgt ggaagaaggc gcgaaagtga tgattaccgg ccgccatagc 120

gatgttggcg aaaaagcggc gaaaagcgtt ggtaccccgg atcagattca gttttttcag 180

cacgatagca gcgatgaaga tggctggacc aaactgtttg atgcgaccga aaaagcgttt 240

ggcccggtga gcaccttagt taacaatgcg ggcatcgcgg tgaacaaaag cgtggaagaa 300

accaccacag cggaatggcg caaattactg gcggtgaacc tggatggcgt gttttttggt 360

acccgcctgg gcattcagcg catgaaaaac aaaggcctgg gcgcgagcat tattaacatg 420

agcagcattg aaggctttgt gggcgatcct agcttaggtg cgtataacgc gagcaaaggc 480

gcggttcgca ttatgagcaa aagcgcggcg ttagattgtg cgctgaagga ttatgatgtg 540

cgcgtgaaca ctgttcatcc gggctatatt aaaaccccgc tggtggatga tttaccgggt 600

gcggaagaag ctatgagcca gcgtaccaaa accccgatgg gccatattgg cgaaccgaac 660

gatattgcgt atatctgcgt gtatctggcg agcaacgaaa gcaaatttgc gaccggcagc 720

gaatttgttg tggatggcgg ctataccgcg caataa 756

<210> 2

<211> 251

<212> PRT

<213> 短小乳杆菌（Lactobacillus brevis）

<400> 2

Ser Asn Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Thr Leu

1 5 10 15

Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Thr Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala Lys

20 25 30

Val Met Ile Thr Gly Arg His Ser Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala Lys

35 40 45

Ser Val Gly Thr Pro Asp Gln Ile Gln Phe Phe Gln His Asp Ser Ser

50 55 60

Asp Glu Asp Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Ala Thr Glu Lys Ala Phe

65 70 75 80

Gly Pro Val Ser Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Asn Lys

85 90 95

Ser Val Glu Glu Thr Thr Thr Ala Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ala Val

100 105 110

Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg Met

115 120 125

Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile Glu

130 135 140

Gly Phe Val Gly Asp Pro Ser Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys Gly

145 150 155 160

Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu Lys

165 170 175

Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys Thr

180 185 190

Pro Leu Val Asp Asp Leu Pro Gly Ala Glu Glu Ala Met Ser Gln Arg

195 200 205

Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala Tyr

210 215 220

Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asn Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly Ser

225 230 235 240

Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 3

<211> 1014

<212> DNA

<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）

<400> 3

atgaaagctg cagttgtgga acaatttaaa aagccgttac aagtgaaaga agtggaaaaa 60

cctaagatct catacgggga agtattagtg cgcatcaaag cgtgtggggt atgccataca 120

gacttgcatg ccgcacatgg cgactggcct gtaaagccta aactgcctct cattcctggc 180

catgaaggcg tcggtgtaat tgaagaagta ggtcctgggg taacacattt aaaagttgga 240

gatcgcgtag gtatcccttg gctttattcg gcgtgcggtc attgtgacta ttgcttaagc 300

ggacaagaaa cattatgcga acgtcaacaa aacgctggct attccgtcga tggtggttat 360

gctgaatatt gccgtgctgc agccgattat gtcgtaaaaa ttcctgataa cttatcgttt 420

gaagaagccg ctccaatctt ttgcgctggt gtaacaacat ataaagcgct caaagtaaca 480

ggcgcaaaac caggtgaatg ggtagccatt tacggtatcg gcgggcttgg acatgtcgca 540

gtccaatacg caaaggcgat ggggttaaac gtcgttgctg tcgatttagg tgatgaaaaa 600

cttgagcttg ctaaacaact tggtgcagat cttgtcgtca atccgaaaca tgatgatgca 660

gcacaatgga taaaagaaaa agtgggcggt gtgcatgcga ctgtcgtcac agctgtttca 720

aaagccgcgt tcgaatcagc ctacaaatcc attcgtcgcg gtggtgcttg cgtactcgtc 780

ggattaccgc cggaagaaat acctattcca attttcgata cagtattaaa tggagtaaaa 840

attattggtt ctatcgttgg tacgcgcaaa gacttacaag aggcacttca atttgcagca 900

gaaggaaaag taaaaacaat tgtcgaagtg caaccgcttg aaaacattaa cgacgtattc 960

gatcgtatgt taaaagggca aattaacggc cgcgtcgtgt taaaagtaga ttaa 1014

<210> 4

<211> 337

<212> PRT

<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）

<400> 4

Met Lys Ala Ala Val Val Glu Gln Phe Lys Lys Pro Leu Gln Val Lys

1 5 10 15

Glu Val Glu Lys Pro Lys Ile Ser Tyr Gly Glu Val Leu Val Arg Ile

20 25 30

Lys Ala Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala Ala His Gly Asp

35 40 45

Trp Pro Val Lys Pro Lys Leu Pro Leu Ile Pro Gly His Glu Gly Val

50 55 60

Gly Val Ile Glu Glu Val Gly Pro Gly Val Thr His Leu Lys Val Gly

65 70 75 80

Asp Arg Val Gly Ile Pro Trp Leu Tyr Ser Ala Cys Gly His Cys Asp

85 90 95

Tyr Cys Leu Ser Gly Gln Glu Thr Leu Cys Glu Arg Gln Gln Asn Ala

100 105 110

Gly Tyr Ser Val Asp Gly Gly Tyr Ala Glu Tyr Cys Arg Ala Ala Ala

115 120 125

Asp Tyr Val Val Lys Ile Pro Asp Asn Leu Ser Phe Glu Glu Ala Ala

130 135 140

Pro Ile Phe Cys Ala Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Val Thr

145 150 155 160

Gly Ala Lys Pro Gly Glu Trp Val Ala Ile Tyr Gly Ile Gly Gly Leu

165 170 175

Gly His Val Ala Val Gln Tyr Ala Lys Ala Met Gly Leu Asn Val Val

180 185 190

Ala Val Asp Leu Gly Asp Glu Lys Leu Glu Leu Ala Lys Gln Leu Gly

195 200 205

Ala Asp Leu Val Val Asn Pro Lys His Asp Asp Ala Ala Gln Trp Ile

210 215 220

Lys Glu Lys Val Gly Gly Val His Ala Thr Val Val Thr Ala Val Ser

225 230 235 240

Lys Ala Ala Phe Glu Ser Ala Tyr Lys Ser Ile Arg Arg Gly Gly Ala

245 250 255

Cys Val Leu Val Gly Leu Pro Pro Glu Glu Ile Pro Ile Pro Ile Phe

260 265 270

Asp Thr Val Leu Asn Gly Val Lys Ile Ile Gly Ser Ile Val Gly Thr

275 280 285

Arg Lys Asp Leu Gln Glu Ala Leu Gln Phe Ala Ala Glu Gly Lys Val

290 295 300

Lys Thr Ile Val Glu Val Gln Pro Leu Glu Asn Ile Asn Asp Val Phe

305 310 315 320

Asp Arg Met Leu Lys Gly Gln Ile Asn Gly Arg Val Val Leu Lys Val

325 330 335

Asp

<210> 5

<211> 1059

<212> DNA

<213> 高温厌氧杆菌（Thermoanaerobacter brockii）

<400> 5

atgaaaggtt ttgcaatgct cagtatcggt aaagttggct ggattgagaa ggaaaagcct 60

gctcctggcc catttgatgc tattgtaaga cctctagctg tggccccttg cacttcggac 120

attcataccg tttttgaagg agccattggc gaaagacata acatgatact cggtcacgaa 180

gctgtaggtg aagtagttga agtaggtagt gaggtaaaag attttaaacc tggtgatcgc 240

gttgttgtgc cagctattac ccctgattgg cggacctctg aagtacaaag aggatatcac 300

cagcactccg gtggaatgct ggcaggctgg aaattttcga atgtaaaaga tggtgttttt 360

ggtgaatttt ttcatgtgaa tgatgctgat atgaatttag cacatctgcc taaagaaatt 420

ccattggaag ctgcagttat gattcccgat atgatgacca ctggttttca cggagctgaa 480

ctggcagata tagaattagg tgcgacggta gcagttttgg gtattggccc agtaggtctt 540

atggcagtcg ctggtgccaa attgcgtgga gccggaagaa ttattgccgt aggcagtaga 600

ccagtttgtg tagatgctgc aaaatactat ggagctactg atattgtaaa ctataaagat 660

ggtcctatcg aaagtcagat tatgaatcta actgaaggca aaggtgtcga tgctgccatc 720

atcgctggag gaaatgctga cattatggct acagcagtta agattgttaa acctggtggc 780

accatcgcta atgtaaatta ttttggcgaa ggagaggttt tgcctgttcc tcgtcttgaa 840

tggggttgcg gcatggctca taaaactata aaaggcgggc tatgccccgg tggacgtcta 900

agaatggaaa gactgattga ccttgttttt tataagcgtg tcgatccttc taagctcgtc 960

actcacgttt tccggggatt tgacaatatt gaaaaagcct ttatgttgat gaaagacaaa 1020

ccaaaagacc taatcaaacc tgttgtaata ttagcataa 1059

<210> 6

<211> 352

<212> PRT

<213> 高温厌氧杆菌（Thermoanaerobacter brockii）

<400> 6

Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Ser Ile Gly Lys Val Gly Trp Ile Glu

1 5 10 15

Lys Glu Lys Pro Ala Pro Gly Pro Phe Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu

20 25 30

Ala Val Ala Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala

35 40 45

Ile Gly Glu Arg His Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu

50 55 60

Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Arg

65 70 75 80

Val Val Val Pro Ala Ile Thr Pro Asp Trp Arg Thr Ser Glu Val Gln

85 90 95

Arg Gly Tyr His Gln His Ser Gly Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe

100 105 110

Ser Asn Val Lys Asp Gly Val Phe Gly Glu Phe Phe His Val Asn Asp

115 120 125

Ala Asp Met Asn Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Ile Pro Leu Glu Ala

130 135 140

Ala Val Met Ile Pro Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu

145 150 155 160

Leu Ala Asp Ile Glu Leu Gly Ala Thr Val Ala Val Leu Gly Ile Gly

165 170 175

Pro Val Gly Leu Met Ala Val Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly

180 185 190

Arg Ile Ile Ala Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Asp Ala Ala Lys

195 200 205

Tyr Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asp Gly Pro Ile Glu

210 215 220

Ser Gln Ile Met Asn Leu Thr Glu Gly Lys Gly Val Asp Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ile Ala Gly Gly Asn Ala Asp Ile Met Ala Thr Ala Val Lys Ile Val

245 250 255

Lys Pro Gly Gly Thr Ile Ala Asn Val Asn Tyr Phe Gly Glu Gly Glu

260 265 270

Val Leu Pro Val Pro Arg Leu Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys

275 280 285

Thr Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Arg

290 295 300

Leu Ile Asp Leu Val Phe Tyr Lys Arg Val Asp Pro Ser Lys Leu Val

305 310 315 320

Thr His Val Phe Arg Gly Phe Asp Asn Ile Glu Lys Ala Phe Met Leu

325 330 335

Met Lys Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Pro Val Val Ile Leu Ala

340 345 350

<210> 7

<211> 759

<212> DNA

<213> 高加索酸奶乳杆菌（Lactobacillus kefiri）

<400> 7

atgactgatc gtttaaaagg caaagtagca attgtaactg gcggtacctt gggaattggc 60

ttggcaatcg ctgataagtt tgttgaagaa ggcgcaaagg ttgttattac cggccgtcac 120

gctgatgtag gtgaaaaagc tgccaaatca atcggcggca cagacgttat ccgttttgtc 180

caacacgatg cttctgatga agccggctgg actaagttgt ttgatacgac tgaagaagca 240

tttggcccag ttaccacggt tgtcaacaat gccggaattg cggtcagcaa gagtgttgaa 300

gataccacaa ctgaagaatg gcgcaagctg ctctcagtta acttggatgg tgtcttcttc 360

ggtacccgtc ttggaatcca acgtatgaag aataaaggac tcggagcatc aatcatcaat 420

atgtcatcta tcgaaggttt tgttggtgat ccaactctgg gtgcatacaa cgcttcaaaa 480

ggtgctgtca gaattatgtc taaatcagct gccttggatt gcgctttgaa ggactacgat 540

gttcgggtta acactgttca tccaggttat atcaagacac cattggttga cgatcttgaa 600

ggggcagaag aaatgatgtc acagcggacc aagacaccaa tgggtcatat cggtgaacct 660

aacgatatcg cttggatctg tgtttacctg gcatctgacg aatctaaatt tgccactggt 720

gcagaattcg ttgtcgatgg tggatacact gctcaataa 759

<210> 8

<211> 252

<212> PRT

<213> 高加索酸奶乳杆菌（Lactobacillus kefiri）

<400> 8

Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala

50 55 60

Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Ser

85 90 95

Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala

210 215 220

Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 9

<211> 1023

<212> DNA

<213> 芽胞杆菌科（Bacillaceae）

<400> 9

atgaaagctg cagtagtaga gcaatttaag gaaccattaa aaattaaaga agtggaaaag 60

ccatccattt catatggcga agtattagtc cgcattaaag catgcggtgt atgccatacg 120

gacttgcacg ccgctcatgg cgattggcca gtaaaaccaa aacttccttt aatccctggc 180

catgaaggag tcggaattgt tgaagaagtc ggtccggggg taacccattt aaaagtggga 240

gaccgcgttg gaattccttg gttatattct gcttgcggcc attgcgaata ttgtttaagc 300

ggacaagaga cattatgtga acatcaagaa aacgccggct actcagtcga cgggggttat 360

gcagaatatt gcagagctgc ggcagactat gtggtgaaaa ttcctgacaa cttgtcgttt 420

gaagaagctg ctcctatttt ctgcgccgga gttactactt ataaagcgtt aaaagtcaca 480

ggtacaaaac cgggagaatg ggtagcgatc tatggcatcg gcggccttgg acatgttgcc 540

gtccagtatg cgaaagcgat ggggcttcat gttgttgcag tggatatcgg cgatgagaaa 600

ctggaacttg caaaagagct tggcgccgat cttgttgtaa atcctgcaaa agaaaatgcg 660

gcacaattta tgaaagagaa agtcggcgga gtacacgcgg ctgttgtgac agctgtatct 720

aaacctgctt ttcaatctgc gtacaattct atccgcagag gcggcacgtg cgtgcttgtc 780

ggattaccgc cggaagaaat gcctattcca atctttgata cggtattaaa cggaattaaa 840

attatcggtt ccattgtcgg cacgcggaaa gacttgcaag aagcgcttca gttcgctgca 900

gaaggtaaag taaaaaccat tattgaagtg caacctcttg aaaaaattaa cgaagtattt 960

gacagaatgc taaaaggaga aattaacgga cgggttgttt taacgttaga aaataataat 1020

taa 1023

<210> 10

<211> 340

<212> PRT

<213> 芽胞杆菌科（Bacillaceae）

<400> 10

Met Lys Ala Ala Val Val Glu Gln Phe Lys Glu Pro Leu Lys Ile Lys

1 5 10 15

Glu Val Glu Lys Pro Ser Ile Ser Tyr Gly Glu Val Leu Val Arg Ile

20 25 30

Lys Ala Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala Ala His Gly Asp

35 40 45

Trp Pro Val Lys Pro Lys Leu Pro Leu Ile Pro Gly His Glu Gly Val

50 55 60

Gly Ile Val Glu Glu Val Gly Pro Gly Val Thr His Leu Lys Val Gly

65 70 75 80

Asp Arg Val Gly Ile Pro Trp Leu Tyr Ser Ala Cys Gly His Cys Glu

85 90 95

Tyr Cys Leu Ser Gly Gln Glu Thr Leu Cys Glu His Gln Glu Asn Ala

100 105 110

Gly Tyr Ser Val Asp Gly Gly Tyr Ala Glu Tyr Cys Arg Ala Ala Ala

115 120 125

Asp Tyr Val Val Lys Ile Pro Asp Asn Leu Ser Phe Glu Glu Ala Ala

130 135 140

Pro Ile Phe Cys Ala Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Val Thr

145 150 155 160

Gly Thr Lys Pro Gly Glu Trp Val Ala Ile Tyr Gly Ile Gly Gly Leu

165 170 175

Gly His Val Ala Val Gln Tyr Ala Lys Ala Met Gly Leu His Val Val

180 185 190

Ala Val Asp Ile Gly Asp Glu Lys Leu Glu Leu Ala Lys Glu Leu Gly

195 200 205

Ala Asp Leu Val Val Asn Pro Ala Lys Glu Asn Ala Ala Gln Phe Met

210 215 220

Lys Glu Lys Val Gly Gly Val His Ala Ala Val Val Thr Ala Val Ser

225 230 235 240

Lys Pro Ala Phe Gln Ser Ala Tyr Asn Ser Ile Arg Arg Gly Gly Thr

245 250 255

Cys Val Leu Val Gly Leu Pro Pro Glu Glu Met Pro Ile Pro Ile Phe

260 265 270

Asp Thr Val Leu Asn Gly Ile Lys Ile Ile Gly Ser Ile Val Gly Thr

275 280 285

Arg Lys Asp Leu Gln Glu Ala Leu Gln Phe Ala Ala Glu Gly Lys Val

290 295 300

Lys Thr Ile Ile Glu Val Gln Pro Leu Glu Lys Ile Asn Glu Val Phe

305 310 315 320

Asp Arg Met Leu Lys Gly Glu Ile Asn Gly Arg Val Val Leu Thr Leu

325 330 335

Glu Asn Asn Asn

340

<210> 11

<211> 747

<212> DNA

<213> 赖氏菌属（Leifsonia sp.）

<400> 11

atggctcagt acgacgtcgc cgaccggtcc gcgatcgtga ccggaggcgg ctcgggcatc 60

gggcgcgccg tggcgctcac tctcgcggcg agcggcgcag ccgtcctcgt caccgacctg 120

aacgaggagc acgcgcaggc cgtcgtggcc gagatcgagg ccgcgggcgg taaggccgcc 180

gcgctcgcgg gcgacgtgac cgaccccgcg ttcggcgagg cgagcgtcgc cggggcgaac 240

gctctcgcgc ccctcaagat cgcggtcaac aacgcgggca tcggcggcga ggccgccacg 300

gtcggcgact actcgctcga cagctggcgc acggtgatcg aggtcaacct caacgccgtg 360

ttctacggga tgcagccgca gctgaaggcc atggccgcca acggcggcgg tgcgatcgtc 420

aacatggcgt ccatcctggg aagcgtcggc ttcgccaact cgtcggccta cgtcacggcc 480

aagcacgcgc tgctcggtct cacccagaac gccgcgctcg agtacgccgc cgacaaggtg 540

cgcgtcgtcg cggtcggccc cggcttcatc cgcaccccgc tcgtggaggc caacctctcc 600

gccgacgcgc tggcgttcct cgagggcaag cacgccctcg gccgcctggg cgagccggaa 660

gaggtcgcct cgctggtcgc gttcctcgcc tccgacgccg cgagcttcat caccggcagc 720

taccacctgg tggacggcgg ctacacc 747

<210> 12

<211> 249

<212> PRT

<213> 赖氏菌属（Leifsonia sp.）

<400> 12

Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val

35 40 45

Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly

50 55 60

Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly

85 90 95

Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val

100 105 110

Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu

115 120 125

Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser

130 135 140

Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Ser Ser Ala Tyr Val Thr Ala

145 150 155 160

Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala

165 170 175

Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr

180 185 190

Pro Leu Val Glu Ala Asn Leu Ser Ala Asp Ala Leu Ala Phe Leu Glu

195 200 205

Gly Lys His Ala Leu Gly Arg Leu Gly Glu Pro Glu Glu Val Ala Ser

210 215 220

Leu Val Ala Phe Leu Ala Ser Asp Ala Ala Ser Phe Ile Thr Gly Ser

225 230 235 240

Tyr His Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr

245

<210> 13

<211> 1059

<212> DNA

<213> 威吉利热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter wiegelii）

<400> 13

atgaaaggtt ttgcaatgct cagtatcggt aaggttggct ggattgaggt agaaaagcct 60

aatccaggac cctttgatgc tatcgtaaga cccctagctg tggccccttg ctcttcggac 120

attcacactg tttttgaagg aggccttggt gaacttcaca acgcagtgct aggtcacgaa 180

gctgtaggtg aagtagtcga agtcggtagt gaagtaaaag actttaaacc tggtgataag 240

gtggtcattc ctgctatcac tcctgattgg agaacgttag atgttcaacg tggttatcat 300

cagcagtccg gaggtatgct tgctggttac aagttcacag cccagaaacc tggtgtgttc 360

gccgagtaca tctacgttaa cgatgcagac atgaatcttg ctcatttacc tgacggcatc 420

tctttagaag cggccgtcat gatcacagat atgatgacta ccggttttca cggagccgaa 480

ctggcagaaa tagaattagg tgcaacagta gcggttttgg gtattggtcc agtaggtctt 540

atggcagtcg ctggtgccaa attgcggggt gctggaagaa ttattgcagt aggcagtaga 600

cctgtttgtg tagatgctgc aaaatactat ggagctactg atattgtaaa ctataaaaat 660

ggtcctatcg acagtcagat tatggattta acgaaaggca aaggtgttga tgctgccatc 720

atcgctggag gaaatgttga catcatggct acagcagtta agattgttaa acctggtggc 780

accattgcta atgtaaatta ctttggcgaa ggagatgttt tgcctgttcc tcgtcttgaa 840

tggggttgcg gcatggctca taaagctata aaaggcggtt tatgccctgg tggacgtcta 900

agaatggaaa gactgattga ccttgttttt tataagcgtg tcgatccttc caaactcgtc 960

actcatgttt ttcaaggatt tgataatatt gaaaaagctc taatgctgat gaaagataaa 1020

ccaaaggacc taatcaaacc tgttgtaata ttagcataa 1059

<210> 14

<211> 352

<212> PRT

<213> 威吉利热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter wiegelii）

<400> 14

Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Ser Ile Gly Lys Val Gly Trp Ile Glu

1 5 10 15

Val Glu Lys Pro Asn Pro Gly Pro Phe Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu

20 25 30

Ala Val Ala Pro Cys Ser Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Gly

35 40 45

Leu Gly Glu Leu His Asn Ala Val Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu

50 55 60

Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Lys

65 70 75 80

Val Val Ile Pro Ala Ile Thr Pro Asp Trp Arg Thr Leu Asp Val Gln

85 90 95

Arg Gly Tyr His Gln Gln Ser Gly Gly Met Leu Ala Gly Tyr Lys Phe

100 105 110

Thr Ala Gln Lys Pro Gly Val Phe Ala Glu Tyr Ile Tyr Val Asn Asp

115 120 125

Ala Asp Met Asn Leu Ala His Leu Pro Asp Gly Ile Ser Leu Glu Ala

130 135 140

Ala Val Met Ile Thr Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu

145 150 155 160

Leu Ala Glu Ile Glu Leu Gly Ala Thr Val Ala Val Leu Gly Ile Gly

165 170 175

Pro Val Gly Leu Met Ala Val Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly

180 185 190

Arg Ile Ile Ala Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Asp Ala Ala Lys

195 200 205

Tyr Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asn Gly Pro Ile Asp

210 215 220

Ser Gln Ile Met Asp Leu Thr Lys Gly Lys Gly Val Asp Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ile Ala Gly Gly Asn Val Asp Ile Met Ala Thr Ala Val Lys Ile Val

245 250 255

Lys Pro Gly Gly Thr Ile Ala Asn Val Asn Tyr Phe Gly Glu Gly Asp

260 265 270

Val Leu Pro Val Pro Arg Leu Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys

275 280 285

Ala Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Arg

290 295 300

Leu Ile Asp Leu Val Phe Tyr Lys Arg Val Asp Pro Ser Lys Leu Val

305 310 315 320

Thr His Val Phe Gln Gly Phe Asp Asn Ile Glu Lys Ala Leu Met Leu

325 330 335

Met Lys Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Pro Val Val Ile Leu Ala

340 345 350

<210> 15

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

atggcgaaga tcgacaacgc ggtgctgccg gaaggtagcc tggtgctggt taccggtgcg 60

aacggtttcg tggcgagcca cgtggttgag cagctgctgg aacacggtta caaggttcgt 120

ggcaccgcgc gtagcgcgag caaactggcg aacctgcaaa agcgttggga cgcgaaatac 180

ccgggtcgtt ttgagaccgc ggtggttgaa gacatgctga agcagggcgc gtatgatgaa 240

gtgatcaagg gtgcggcggg cgttgcgcac attgcgagcg tggttagctt cagcaacaag 300

tatgatgagg tggttacccc ggcgatcggt ggcaccctga acgcgctgcg tgctgcggcg 360

gcgaccccga gcgtgaaacg ttttgttctg accagcagca ccgtgagcgc gctgatcccg 420

aagccgaacg ttgagggtat ttacctggat gagaagagct ggaacctgga gagcattgac 480

aaggcgaaaa ccctgccgga aagcgatccg caaaagagcc tgtgggtgta tgcggcgagc 540

aaaaccgagg cggaactggc ggcgtggaag ttcatggacg agaacaaacc gcactttacc 600

ctgaacgcgg ttctgccgaa ctacaccatc ggcaccattt tcgatccgga aacccagagc 660

ggtagcacca gcggctggat gatgagcctg tttaacggcg aggtgtctcc ggcgctggcg 720

ctgatgccgc cgcagtacta tgtgagcgcg gttgacatcg gtctgctgca cctgggttgc 780

ctggtgctgc cgcaaattga gcgtcgtcgt gtttacggca ccgcgggcac cttcgattgg 840

aacaccgttc tggcgacctt tcgtaagctg tatccgagca aaaccttccc ggcggacttt 900

ccggatcagg gtcaagacct gagcaagttc gataccgcgc cgagcctgga aattctgaaa 960

agcctgggtc gtccgggttg gcgtagcatc gaggaaagca ttaaagacct ggttggcagc 1020

gagaccgcgc actaa 1035

<210> 16

<211> 344

<212> PRT

<213> 赭色掷孢酵母（Sporobolomyces salmonicolor）

<400> 16

Met Ala Lys Ile Asp Asn Ala Val Leu Pro Glu Gly Ser Leu Val Leu

1 5 10 15

Val Thr Gly Ala Asn Gly Phe Val Ala Ser His Val Val Glu Gln Leu

20 25 30

Leu Glu His Gly Tyr Lys Val Arg Gly Thr Ala Arg Ser Ala Ser Lys

35 40 45

Leu Ala Asn Leu Gln Lys Arg Trp Asp Ala Lys Tyr Pro Gly Arg Phe

50 55 60

Glu Thr Ala Val Val Glu Asp Met Leu Lys Gln Gly Ala Tyr Asp Glu

65 70 75 80

Val Ile Lys Gly Ala Ala Gly Val Ala His Ile Ala Ser Val Val Ser

85 90 95

Phe Ser Asn Lys Tyr Asp Glu Val Val Thr Pro Ala Ile Gly Gly Thr

100 105 110

Leu Asn Ala Leu Arg Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ser Val Lys Arg Phe

115 120 125

Val Leu Thr Ser Ser Thr Val Ser Ala Leu Ile Pro Lys Pro Asn Val

130 135 140

Glu Gly Ile Tyr Leu Asp Glu Lys Ser Trp Asn Leu Glu Ser Ile Asp

145 150 155 160

Lys Ala Lys Thr Leu Pro Glu Ser Asp Pro Gln Lys Ser Leu Trp Val

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Lys Thr Glu Ala Glu Leu Ala Ala Trp Lys Phe Met

180 185 190

Asp Glu Asn Lys Pro His Phe Thr Leu Asn Ala Val Leu Pro Asn Tyr

195 200 205

Thr Ile Gly Thr Ile Phe Asp Pro Glu Thr Gln Ser Gly Ser Thr Ser

210 215 220

Gly Trp Met Met Ser Leu Phe Asn Gly Glu Val Ser Pro Ala Leu Ala

225 230 235 240

Leu Met Pro Pro Gln Tyr Tyr Val Ser Ala Val Asp Ile Gly Leu Leu

245 250 255

His Leu Gly Cys Leu Val Leu Pro Gln Ile Glu Arg Arg Arg Val Tyr

260 265 270

Gly Thr Ala Gly Thr Phe Asp Trp Asn Thr Val Leu Ala Thr Phe Arg

275 280 285

Lys Leu Tyr Pro Ser Lys Thr Phe Pro Ala Asp Phe Pro Asp Gln Gly

290 295 300

Gln Asp Leu Ser Lys Phe Asp Thr Ala Pro Ser Leu Glu Ile Leu Lys

305 310 315 320

Ser Leu Gly Arg Pro Gly Trp Arg Ser Ile Glu Glu Ser Ile Lys Asp

325 330 335

Leu Val Gly Ser Glu Thr Ala His

340

<210> 17

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 17

atggaactgt ttaagtatat ggaaacctat gattatgaac aagtgctgtt ttgccaggac 60

aaggaaagcg gtctgaaggc gattattgcc attcatgata ccacgctggg tccggcactg 120

ggcggtaccc gtatgtggat gtataacagc gaagaagaag cgctggaaga tgccctgcgt 180

ctggcacgcg gtatgaccta caaaaacgca gcagcaggtc tgaatctggg cggtggcaag 240

acggtgatta tcggtgatcc gcgcaaagac aagaacgaag ctatgtttcg tgcgttcggc 300

cgctttatcc agggtctgaa tggccgttat attaccgcgg aagatgtggg taccacggtt 360

gccgatatgg acattatcta tcaagaaacc gactacgtga cgggcatttc accggaattt 420

ggtagctctg gtaacccgtc gccggcaacg gcctatggtg tttaccgtgg catgaaagct 480

gcggccaagg aagcatttgg tagtgattcc ctggaaggca aagtggttgc agttcagggt 540

gtcggcaatg tggcttatca cctgtgccgc catctgcacg aagaaggcgc caaactgatt 600

gtgaccgata tcaacaagga agtcgtggca cgtgctgttg aagaatttgg tgcgaaagcc 660

gtcgatccga atgacatcta cggcgtggaa tgcgatattt ttgcgccgtg tgccctgggt 720

ggcattatca acgaccagac catcccgcaa ctgaaagcga aggttattgc aggtagtgct 780

aacaatcagc tgaaagaacc gcgtcatggc gatattatcc acgaaatggg catcgtctat 840

gccccggact acgtgattaa cgcaggtggc gttatcaatg tcgctgatga actgtatggc 900

tacaatcgtg aacgcgcgat gaaaaagatt gaacaaatct atgacaacat cgaaaaagtt 960

ttcgcaatcg ctaagcgtga taatattccg acctacgtcg cagctgaccg tatggccgaa 1020

gaacgcattg aaacgatgcg taaagcccgt tcccagttcc tgcaaaatgg tcatcatatt 1080

ctgagccgcc gtcgtgcccg ctaa 1104

<210> 18

<211> 367

<212> PRT

<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）

<400> 18

Met Glu Leu Phe Lys Tyr Met Glu Thr Tyr Asp Tyr Glu Gln Val Leu

1 5 10 15

Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His

20 25 30

Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp Met Tyr

35 40 45

Asn Ser Glu Glu Glu Ala Leu Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly

50 55 60

Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys

65 70 75 80

Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Asn Glu Ala Met Phe

85 90 95

Arg Ala Phe Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr

100 105 110

Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Ala Asp Met Asp Ile Ile Tyr Gln

115 120 125

Glu Thr Asp Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Glu Phe Gly Ser Ser Gly

130 135 140

Asn Pro Ser Pro Ala Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala

145 150 155 160

Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Ser Asp Ser Leu Glu Gly Lys Val Val

165 170 175

Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Arg His Leu

180 185 190

His Glu Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys Glu Val

195 200 205

Val Ala Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Lys Ala Val Asp Pro Asn

210 215 220

Asp Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly

225 230 235 240

Gly Ile Ile Asn Asp Gln Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile

245 250 255

Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Lys Glu Pro Arg His Gly Asp Ile

260 265 270

Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala

275 280 285

Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu

290 295 300

Arg Ala Met Lys Lys Ile Glu Gln Ile Tyr Asp Asn Ile Glu Lys Val

305 310 315 320

Phe Ala Ile Ala Lys Arg Asp Asn Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asp

325 330 335

Arg Met Ala Glu Glu Arg Ile Glu Thr Met Arg Lys Ala Arg Ser Gln

340 345 350

Phe Leu Gln Asn Gly His His Ile Leu Ser Arg Arg Arg Ala Arg

355 360 365

<210> 19

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 19

atggcatttt ctgcagatac cagcgaaatt gtttataccc atgataccgg tctggattat 60

attacctata gcgattatga actggaccct gccaatccgc tggccggcgg tgctgcttgg 120

attgaaggtg cctttgtgcc gccgagtgaa gcacgcatta gtatttttga tcagggttat 180

ctgcatagtg atgtgaccta taccgtgttt catgtttgga atggtaatgc ctttcgtctg 240

gatgatcata ttgaacgtct gtttagcaat gccgaaagca tgcgcattat tccgccgctg 300

acccaggatg aagttaaaga aattgcactg gaactggttg caaaaaccga actgcgtgaa 360

gcatttgtta gtgttagcat tacccgtggc tatagcagca ccccgggtga acgtgatatt 420

accaaacatc gcccgcaggt ttatatgtat gcagttccgt atcagtggat tgttccgttt 480

gatcgcattc gtgatggtgt gcatgcaatg gttgcacaga gtgttcgtcg caccccgcgt 540

agcagcattg atccgcaggt taaaaatttt cagtggggcg atctgattcg cgccgttcag 600

gaaacccatg atcgcggctt tgaagcaccg ctgctgctgg atggcgatgg tctgctggcc 660

gaaggtagcg gctttaatgt ggtggttatt aaggatggcg ttgttcgcag cccgggtcgt 720

gcagcactgc cgggtattac ccgcaaaacc gtgctggaaa ttgcagaaag cctgggccat 780

gaagccattc tggcagatat taccctggca gaactgctgg atgcagatga agttctgggt 840

tgtaccaccg ccggtggcgt gtggccgttt gttagtgtgg atggtaatcc gattagcgat 900

ggcgtgccgg gtccggttac ccagagtatt attcgccgtt attgggaact gaatgtggaa 960

agcagcagtc tgctgacccc ggttcagtat taa 993

<210> 20

<211> 330

<212> PRT

<213> ATA-117

<400> 20

Met Ala Phe Ser Ala Asp Thr Ser Glu Ile Val Tyr Thr His Asp Thr

1 5 10 15

Gly Leu Asp Tyr Ile Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Leu Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Glu Gly Ala Phe Val Pro Pro

35 40 45

Ser Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe Asp Gln Gly Tyr Leu His Ser Asp

50 55 60

Val Thr Tyr Thr Val Phe His Val Trp Asn Gly Asn Ala Phe Arg Leu

65 70 75 80

Asp Asp His Ile Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ala Glu Ser Met Arg Ile

85 90 95

Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu

100 105 110

Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Phe Val Ser Val Ser Ile Thr

115 120 125

Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Pro Gly Glu Arg Asp Ile Thr Lys His Arg

130 135 140

Pro Gln Val Tyr Met Tyr Ala Val Pro Tyr Gln Trp Ile Val Pro Phe

145 150 155 160

Asp Arg Ile Arg Asp Gly Val His Ala Met Val Ala Gln Ser Val Arg

165 170 175

Arg Thr Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp

180 185 190

Gly Asp Leu Ile Arg Ala Val Gln Glu Thr His Asp Arg Gly Phe Glu

195 200 205

Ala Pro Leu Leu Leu Asp Gly Asp Gly Leu Leu Ala Glu Gly Ser Gly

210 215 220

Phe Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg

225 230 235 240

Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu

245 250 255

Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Thr Leu Ala Glu Leu

260 265 270

Leu Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Thr Thr Ala Gly Gly Val Trp

275 280 285

Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Pro Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly

290 295 300

Pro Val Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu

305 310 315 320

Ser Ser Ser Leu Leu Thr Pro Val Gln Tyr

325 330

<210> 21

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 21

atggctagta tggataaggt gttcgccggc tatgccgcac gtcaagcaat tctggaaagt 60

accgaaacca ccaatccgtt tgcaaaaggt attgcctggg ttgaaggtga actggtgccg 120

ttagccgaag cacgtattcc gctgctggat cagggcttta tgcatagtga tctgacctat 180

gatgtgccga gtgtttggga tggtcgcttt ttccgcctgg atgatcatat tacccgcctg 240

gaagcaagct gcaccaaact gcgtctgcgc ttaccgctgc ctcgtgacca ggtgaaacag 300

attctggtgg aaatggttgc aaagagcggt attcgcgatg cctttgtgga actgattgtt 360

acccgcggcc tgaaaggtgt gcgcggtacg cgtcctgaag atattgtgaa taatctgtac 420

atgttcgtgc agccgtatgt ttgggttatg gaaccggata tgcagcgtgt gggtggcagt 480

gcagtggttg caagaaccgt gcgtcgcgtt cctcctggtg caattgatcc gaccgttaaa 540

aatctgcagt ggggtgacct ggttcgcggt atgtttgaag ccgccgatcg tggtgccacc 600

tatccttttc tgaccgatgg tgacgcacat ctgaccgaag gcagcggttt taatattgtg 660

ctggttaaag acggcgtgct gtataccccg gatcgcggtg tgttacaggg cgtgaccaga 720

aaaagtgtta ttaatgcagc cgaggccttt ggcattgaag tgcgtgtgga atttgtgccg 780

gtggaactgg cctatcgctg cgacgagatt tttatgtgca ccaccgccgg tggtattatg 840

ccgattacca ccctggatgg tatgccggtg aatggcggtc agattggccc tattaccaaa 900

aagatttggg acggttactg ggccatgcat tatgatgcag catatagctt tgagatcgac 960

tataacgagc gtaat 975

<210> 22

<211> 325

<212> PRT

<213> 土曲霉（Aspergillus terreus）

<400> 22

Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala

1 5 10 15

Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala

20 25 30

Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu

35 40 45

Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser

50 55 60

Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu

65 70 75 80

Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp

85 90 95

Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg

100 105 110

Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg

115 120 125

Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln

130 135 140

Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser

145 150 155 160

Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp

165 170 175

Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe

180 185 190

Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp

195 200 205

Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp

210 215 220

Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg

225 230 235 240

Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val

245 250 255

Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met

260 265 270

Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met

275 280 285

Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp

290 295 300

Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp

305 310 315 320

Tyr Asn Glu Arg Asn

325

<210> 23

<211> 969

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 23

atggcaagta tggataaggt gttcagtggt tattacgccc gccagaaact gctggaacgt 60

agcgataatc cgtttagcaa aggtattgca tacgtggaag gcaaactggt tctgccgagc 120

gatgcacgta ttccgctgtt agatgaaggt tttatgcaca gtgacctgac ctatgatgtt 180

attagcgtgt gggatggtcg ctttttccgc ctggatgatc atctgcagcg tattctggaa 240

agttgtgata aaatgcgcct gaaattcccg ctggccctgt caagtgttaa aaatattctg 300

gcagagatgg tggccaaaag tggcattcgt gatgcatttg ttgaggttat tgtgacccgc 360

ggtctgaccg gtgtgagagg tagcaaaccg gaagatttgt ataacaacaa catctacctg 420

ctggtgctgc cgtatatttg ggttatggca ccggaaaatc agctgcatgg tggtgaagcc 480

attattaccc gcaccgtgcg ccgtacaccg cctggtgcat tcgaccctac aattaagaat 540

ctgcagtggg gtgacctgac caaaggtctg tttgaagcaa tggatcgcgg cgccacctat 600

ccttttctga ccgatggtga caccaatctg accgaaggta gcggttttaa tatcgttctg 660

gttaagaacg gcatcatcta taccccggat cgtggtgtgc tgcgtggtat tacccgcaaa 720

agtgtgattg atgttgcacg tgcaaacagt attgacattc gtctggaagt tgtgccggtt 780

gaacaggcct atcatagcga tgaaattttc atgtgcacca ccgccggtgg cattatgcct 840

attaccctgc tggatggcca gccggttaat gatggtcagg tgggtccgat taccaaaaag 900

atttgggatg gttactggga aatgcattac aatccggcat atagcttccc ggtggattat 960

ggtagtggt 969

<210> 24

<211> 323

<212> PRT

<213> 烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）

<400> 24

Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ser Gly Tyr Tyr Ala Arg Gln Lys

1 5 10 15

Leu Leu Glu Arg Ser Asp Asn Pro Phe Ser Lys Gly Ile Ala Tyr Val

20 25 30

Glu Gly Lys Leu Val Leu Pro Ser Asp Ala Arg Ile Pro Leu Leu Asp

35 40 45

Glu Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Ile Ser Val Trp

50 55 60

Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Leu Gln Arg Ile Leu Glu

65 70 75 80

Ser Cys Asp Lys Met Arg Leu Lys Phe Pro Leu Ala Leu Ser Ser Val

85 90 95

Lys Asn Ile Leu Ala Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg Asp Ala

100 105 110

Phe Val Glu Val Ile Val Thr Arg Gly Leu Thr Gly Val Arg Gly Ser

115 120 125

Lys Pro Glu Asp Leu Tyr Asn Asn Asn Ile Tyr Leu Leu Val Leu Pro

130 135 140

Tyr Ile Trp Val Met Ala Pro Glu Asn Gln Leu His Gly Gly Glu Ala

145 150 155 160

Ile Ile Thr Arg Thr Val Arg Arg Thr Pro Pro Gly Ala Phe Asp Pro

165 170 175

Thr Ile Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Thr Lys Gly Leu Phe Glu

180 185 190

Ala Met Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp Thr

195 200 205

Asn Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asn Gly

210 215 220

Ile Ile Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Arg Gly Ile Thr Arg Lys

225 230 235 240

Ser Val Ile Asp Val Ala Arg Ala Asn Ser Ile Asp Ile Arg Leu Glu

245 250 255

Val Val Pro Val Glu Gln Ala Tyr His Ser Asp Glu Ile Phe Met Cys

260 265 270

Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Leu Leu Asp Gly Gln Pro

275 280 285

Val Asn Asp Gly Gln Val Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp Gly

290 295 300

Tyr Trp Glu Met His Tyr Asn Pro Ala Tyr Ser Phe Pro Val Asp Tyr

305 310 315 320

Gly Ser Gly

<210> 25

<211> 969

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 25

atggctagta tggataaggt gttcagcggc tatcatgccc gccagaaact gctggaacgt 60

agtgataatc cgtttagtaa gggcattgcc tatgtggaag gtaaactggt gctgccgagt 120

gatgcccgta ttcctctgct ggatgaaggc tttatgcatg gtgacctgac ctatgatgtt 180

accaccgtgt gggatggtcg ctttttccgt ctggatgatc acatgcagcg tattctggaa 240

agctgcgata aaatgcgtct gaaattcccg ctggccccga gtacagttaa aaatattctg 300

gcagagatgg tggcaaagag cggcattcgc gatgcctttg ttgaagtgat tgttacccgt 360

ggtctgaccg gtgttcgtgg tagtaaaccg gaagatttgt ataacaacaa catctacctg 420

ctggtgctgc cttatgtgtg ggttatggca ccggaaaatc agctgctggg cggttcagca 480

attattaccc gcaccgtgcg ccgtacccct cctggtgcat tcgaccctac aattaagaat 540

ctgcagtggg gcgatctgac caaaggctta tttgaagcaa tggatcgcgg cgccacctat 600

ccttttctga ccgatggtga caccaatctg accgaaggta gcggctttaa tattgttctg 660

gtgaaaaacg gcatcatcta caccccggat cgcggtgttc tgcgtggtat tacccgcaaa 720

agtgttattg atgtggcccg cgcaaataat attgatattc gtctggaggt ggtgccggtt 780

gaacaggttt atcatagtga tgaaatcttc atgtgcacca ccgccggcgg tattatgcct 840

attaccctgc tggatggtca gccggttaat gatggtcagg ttggcccgat taccaaaaag 900

atttgggatg gctattggga aatgcattac aatccggcat acagctttcc ggttgattat 960

ggtagcggc 969

<210> 26

<211> 323

<212> PRT

<213> 费希新萨托菌（Neosartorya fischeri）

<400> 26

Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ser Gly Tyr His Ala Arg Gln Lys

1 5 10 15

Leu Leu Glu Arg Ser Asp Asn Pro Phe Ser Lys Gly Ile Ala Tyr Val

20 25 30

Glu Gly Lys Leu Val Leu Pro Ser Asp Ala Arg Ile Pro Leu Leu Asp

35 40 45

Glu Gly Phe Met His Gly Asp Leu Thr Tyr Asp Val Thr Thr Val Trp

50 55 60

Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Met Gln Arg Ile Leu Glu

65 70 75 80

Ser Cys Asp Lys Met Arg Leu Lys Phe Pro Leu Ala Pro Ser Thr Val

85 90 95

Lys Asn Ile Leu Ala Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg Asp Ala

100 105 110

Phe Val Glu Val Ile Val Thr Arg Gly Leu Thr Gly Val Arg Gly Ser

115 120 125

Lys Pro Glu Asp Leu Tyr Asn Asn Asn Ile Tyr Leu Leu Val Leu Pro

130 135 140

Tyr Val Trp Val Met Ala Pro Glu Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ala

145 150 155 160

Ile Ile Thr Arg Thr Val Arg Arg Thr Pro Pro Gly Ala Phe Asp Pro

165 170 175

Thr Ile Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Thr Lys Gly Leu Phe Glu

180 185 190

Ala Met Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp Thr

195 200 205

Asn Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asn Gly

210 215 220

Ile Ile Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Arg Gly Ile Thr Arg Lys

225 230 235 240

Ser Val Ile Asp Val Ala Arg Ala Asn Asn Ile Asp Ile Arg Leu Glu

245 250 255

Val Val Pro Val Glu Gln Val Tyr His Ser Asp Glu Ile Phe Met Cys

260 265 270

Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Leu Leu Asp Gly Gln Pro

275 280 285

Val Asn Asp Gly Gln Val Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp Gly

290 295 300

Tyr Trp Glu Met His Tyr Asn Pro Ala Tyr Ser Phe Pro Val Asp Tyr

305 310 315 320

Gly Ser Gly

<210> 27

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 27

atgagcacaa tggataagat ttttgcaggc catgcacagc gccaggcaac attagtggcc 60

agtgataata ttttcgcgaa cggcattgca tggattcagg gtgaactggt tccgctgaat 120

gaagcacgta ttccgctgat ggatcagggc tttatgcatg gtgacctgac ctatgatgtt 180

ccggcagttt gggatggccg ctttttccgt ctggatgatc atctggatcg cctggaagca 240

agtgttaaaa agatgcgtat gcagttcccg attccgcgtg atgaaattcg catgaccctg 300

ctggatatgc tggcaaaaag tggcattaag gatgcctttg tggaactgat tgtgacccgc 360

ggtctgaaac cggtgcgtga ggcaaaaccg ggtgaagttc tgaataatca tctgtatctg 420

atcgtgcagc cgtatgtttg ggttatgagc ccggaagccc agtatgttgg cggtaatgcc 480

gtgattgcac gcaccgttcg tcgtattccg ccgggtagca tggaccctac aattaagaat 540

ctgcagtgga gcgatttcac ccgcggcatg tttgaagcct atgatcgcgg cgcccagtat 600

ccttttctga ccgatggcga taccaatatt accgaaggta gcggttttaa cgtggttttt 660

gttaagaaca acgtgatcta caccccgaat cgtggtgttc tgcagggtat tacccgtaaa 720

agtgttattg acgccgcaaa atggtgtggt catgaagtgc gtgtggaata tgttccggtt 780

gaaatggcct atgaagcaga tgaaatcttc atgtgcacca ccgcaggcgg cattatgcct 840

attaccacaa tggatggtaa accggtgaaa gatggtaaag tgggtccggt taccaaagca 900

atttgggatc gttattgggc catgcattgg gaagatgaat tttcattcaa gatcgactac 960

cagaagctga aactg 975

<210> 28

<211> 325

<212> PRT

<213> 玉米赤霉（Gibberella zeae）

<400> 28

Met Ser Thr Met Asp Lys Ile Phe Ala Gly His Ala Gln Arg Gln Ala

1 5 10 15

Thr Leu Val Ala Ser Asp Asn Ile Phe Ala Asn Gly Ile Ala Trp Ile

20 25 30

Gln Gly Glu Leu Val Pro Leu Asn Glu Ala Arg Ile Pro Leu Met Asp

35 40 45

Gln Gly Phe Met His Gly Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ala Val Trp

50 55 60

Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Leu Asp Arg Leu Glu Ala

65 70 75 80

Ser Val Lys Lys Met Arg Met Gln Phe Pro Ile Pro Arg Asp Glu Ile

85 90 95

Arg Met Thr Leu Leu Asp Met Leu Ala Lys Ser Gly Ile Lys Asp Ala

100 105 110

Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Pro Val Arg Glu Ala

115 120 125

Lys Pro Gly Glu Val Leu Asn Asn His Leu Tyr Leu Ile Val Gln Pro

130 135 140

Tyr Val Trp Val Met Ser Pro Glu Ala Gln Tyr Val Gly Gly Asn Ala

145 150 155 160

Val Ile Ala Arg Thr Val Arg Arg Ile Pro Pro Gly Ser Met Asp Pro

165 170 175

Thr Ile Lys Asn Leu Gln Trp Ser Asp Phe Thr Arg Gly Met Phe Glu

180 185 190

Ala Tyr Asp Arg Gly Ala Gln Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp Thr

195 200 205

Asn Ile Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Val Val Phe Val Lys Asn Asn

210 215 220

Val Ile Tyr Thr Pro Asn Arg Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Arg Lys

225 230 235 240

Ser Val Ile Asp Ala Ala Lys Trp Cys Gly His Glu Val Arg Val Glu

245 250 255

Tyr Val Pro Val Glu Met Ala Tyr Glu Ala Asp Glu Ile Phe Met Cys

260 265 270

Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Met Asp Gly Lys Pro

275 280 285

Val Lys Asp Gly Lys Val Gly Pro Val Thr Lys Ala Ile Trp Asp Arg

290 295 300

Tyr Trp Ala Met His Trp Glu Asp Glu Phe Ser Phe Lys Ile Asp Tyr

305 310 315 320

Gln Lys Leu Lys Leu

325

<210> 29

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 29

atgggtatcg acaccggtac aagcaatctg gtggccgtgg aaccgggtgc aattagagaa 60

gataccccgg ccggtagcgt gattcagtat agcgattatg aaatcgacta cagcagcccg 120

tttgcaggtg gtgtggcttg gattgaaggc gaatatctgc cggccgaaga tgccaaaatt 180

agcatttttg acaccggttt cggccatagc gatctgacct ataccgttgc acatgtttgg 240

catggcaata ttttccgcct gggcgatcat ctggatcgtc tgttagatgg cgcacgtaaa 300

ctgcgtctgg atagtggcta taccaaagat gaactggcag atattaccaa gaagtgcgtg 360

agcctgagcc agctgcgtga atcatttgtg aatctgacca ttacccgcgg ttatggtaaa 420

cgcaaaggtg aaaaagacct gagtaagctg acccatcagg tgtatatcta tgccattccg 480

tatctgtggg cctttccgcc tgccgagcaa atttttggca ccaccgccgt tgtgccgcgt 540

cacgtgcgtc gtgcaggtcg taacacagtt gatccgacca ttaagaatta ccagtggggt 600

gacctgaccg cagccagctt cgaggcaaaa gatcgcggtg ctcgcaccgc aattctgatg 660

gatgccgata attgtgtggc agaaggcccg ggttttaatg tgtgcattgt taaagacggc 720

aagctggcaa gcccgagtcg taatgcactg cctggtatta cccgtaaaac cgtgtttgaa 780

atcgccggtg caatgggcat tgaagccgca ttacgtgatg ttaccagtca tgaactgtac 840

gatgcagatg aaatcatggc agttaccacc gccggcggtg ttacacctat taataccctg 900

gatggcgttc cgattggtga cggtgaaccg ggtcctgtta ccgttgctat tcgtgatcgc 960

ttttgggcac tgatggatga accgggtccg ttaattgaag ccattcagta t 1011

<210> 30

<211> 337

<212> PRT

<213> 分支杆菌（Mycobacterium vanbaalenii）

<400>30

Met Gly Ile Asp Thr Gly Thr Ser Asn Leu Val Ala Val Glu Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ile Arg Glu Asp Thr Pro Ala Gly Ser Val Ile Gln Tyr Ser Asp

20 25 30

Tyr Glu Ile Asp Tyr Ser Ser Pro Phe Ala Gly Gly Val Ala Trp Ile

35 40 45

Glu Gly Glu Tyr Leu Pro Ala Glu Asp Ala Lys Ile Ser Ile Phe Asp

50 55 60

Thr Gly Phe Gly His Ser Asp Leu Thr Tyr Thr Val Ala His Val Trp

65 70 75 80

His Gly Asn Ile Phe Arg Leu Gly Asp His Leu Asp Arg Leu Leu Asp

85 90 95

Gly Ala Arg Lys Leu Arg Leu Asp Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Glu Leu

100 105 110

Ala Asp Ile Thr Lys Lys Cys Val Ser Leu Ser Gln Leu Arg Glu Ser

115 120 125

Phe Val Asn Leu Thr Ile Thr Arg Gly Tyr Gly Lys Arg Lys Gly Glu

130 135 140

Lys Asp Leu Ser Lys Leu Thr His Gln Val Tyr Ile Tyr Ala Ile Pro

145 150 155 160

Tyr Leu Trp Ala Phe Pro Pro Ala Glu Gln Ile Phe Gly Thr Thr Ala

165 170 175

Val Val Pro Arg His Val Arg Arg Ala Gly Arg Asn Thr Val Asp Pro

180 185 190

Thr Ile Lys Asn Tyr Gln Trp Gly Asp Leu Thr Ala Ala Ser Phe Glu

195 200 205

Ala Lys Asp Arg Gly Ala Arg Thr Ala Ile Leu Met Asp Ala Asp Asn

210 215 220

Cys Val Ala Glu Gly Pro Gly Phe Asn Val Cys Ile Val Lys Asp Gly

225 230 235 240

Lys Leu Ala Ser Pro Ser Arg Asn Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys

245 250 255

Thr Val Phe Glu Ile Ala Gly Ala Met Gly Ile Glu Ala Ala Leu Arg

260 265 270

Asp Val Thr Ser His Glu Leu Tyr Asp Ala Asp Glu Ile Met Ala Val

275 280 285

Thr Thr Ala Gly Gly Val Thr Pro Ile Asn Thr Leu Asp Gly Val Pro

290 295 300

Ile Gly Asp Gly Glu Pro Gly Pro Val Thr Val Ala Ile Arg Asp Arg

305 310 315 320

Phe Trp Ala Leu Met Asp Glu Pro Gly Pro Leu Ile Glu Ala Ile Gln

325 330 335

Tyr

<210> 31

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 31

atgagcctga ccgtgcaaaa aattaactgg gaacaggtta aggagtggga tcgtaaatat 60

ctgatgcgta cctttagcac ccagaatgaa tatcagccgg ttccgattga aagtaccgaa 120

ggcgattatc tgatcatgcc ggatggtaca cgcctgctgg atttctttaa tcagctgtat 180

tgcgtgaacc tgggtcagaa aaatcagaaa gttaacgcag ccatcaagga agcactggat 240

cgctatggct ttgtttggga tacctatgcc accgattata aagccaaagc agcaaaaatc 300

atcatcgagg atattctggg tgacgaagat tggccgggca aagtgcgttt tgtgagtacc 360

ggcagcgaag ccgtggaaac agctttaaat attgcacgcc tgtacaccaa tcgcccgctg 420

gtggtgacac gtgaacatga ttatcatggc tggaccggcg gcgcagcaac cgtgacccgt 480

ctgcgtagct atcgtagcgg tctggtgggt gaaaatagcg aaagttttag tgcccagatc 540

ccgggcagta gctataatag cgcagtgctg atggccccga gccctaacat gtttcaggat 600

agcgatggta atctgctgaa agatgaaaac ggcgaactgc tgagcgttaa atatacccgc 660

cgcatgattg aaaactacgg tccggaacag gtggcagcag ttattaccga agttagccag 720

ggtgccggta gtgctatgcc tccttatgaa tatatcccgc agattcgcaa aatgaccaaa 780

gaactgggcg tgctgtggat taatgatgaa gtgctgaccg gttttggccg caccggtaaa 840

tggtttggtt atcagcatta cggtgtgcag ccggatatta ttacaatggg taaaggtctg 900

agcagcagca gtctgccggc tggtgcagtg ttagtgagca aagaaattgc agcattcatg 960

gataagcacc gttgggaaag cgtgagtacc tatgccggtc atccggttgc aatggctgcc 1020

gtgtgtgcaa atctggaagt gatgatggaa gaaaacttcg ttgagcaggc aaaagatagt 1080

ggtgaatata tccgtagcaa gctggaactg ctgcaggaaa aacataaaag catcggtaac 1140

ttcgacggct atggcctgct gtggattgtt gatattgtta atgccaagac caagaccccg 1200

tatgttaaac tggatcgcaa ttttacccac ggtatgaatc cgaatcagat tccgacccag 1260

attattatga agaaggccct ggaaaagggc gtgctgattg gtggtgtgat gccgaatacc 1320

atgcgcattg gtgcaagcct gaatgtgagt cgcggcgata ttgataaagc aatggatgca 1380

ctggactacg ccctggatta tctggaaagt ggtgaatggc agcagagc 1428

<210> 32

<211> 476

<212> PRT

<213> 巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）

<400> 32

Met Ser Leu Thr Val Gln Lys Ile Asn Trp Glu Gln Val Lys Glu Trp

1 5 10 15

Asp Arg Lys Tyr Leu Met Arg Thr Phe Ser Thr Gln Asn Glu Tyr Gln

20 25 30

Pro Val Pro Ile Glu Ser Thr Glu Gly Asp Tyr Leu Ile Met Pro Asp

35 40 45

Gly Thr Arg Leu Leu Asp Phe Phe Asn Gln Leu Tyr Cys Val Asn Leu

50 55 60

Gly Gln Lys Asn Gln Lys Val Asn Ala Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asp

65 70 75 80

Arg Tyr Gly Phe Val Trp Asp Thr Tyr Ala Thr Asp Tyr Lys Ala Lys

85 90 95

Ala Ala Lys Ile Ile Ile Glu Asp Ile Leu Gly Asp Glu Asp Trp Pro

100 105 110

Gly Lys Val Arg Phe Val Ser Thr Gly Ser Glu Ala Val Glu Thr Ala

115 120 125

Leu Asn Ile Ala Arg Leu Tyr Thr Asn Arg Pro Leu Val Val Thr Arg

130 135 140

Glu His Asp Tyr His Gly Trp Thr Gly Gly Ala Ala Thr Val Thr Arg

145 150 155 160

Leu Arg Ser Tyr Arg Ser Gly Leu Val Gly Glu Asn Ser Glu Ser Phe

165 170 175

Ser Ala Gln Ile Pro Gly Ser Ser Tyr Asn Ser Ala Val Leu Met Ala

180 185 190

Pro Ser Pro Asn Met Phe Gln Asp Ser Asp Gly Asn Leu Leu Lys Asp

195 200 205

Glu Asn Gly Glu Leu Leu Ser Val Lys Tyr Thr Arg Arg Met Ile Glu

210 215 220

Asn Tyr Gly Pro Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln

225 230 235 240

Gly Ala Gly Ser Ala Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Ile Pro Gln Ile Arg

245 250 255

Lys Met Thr Lys Glu Leu Gly Val Leu Trp Ile Asn Asp Glu Val Leu

260 265 270

Thr Gly Phe Gly Arg Thr Gly Lys Trp Phe Gly Tyr Gln His Tyr Gly

275 280 285

Val Gln Pro Asp Ile Ile Thr Met Gly Lys Gly Leu Ser Ser Ser Ser

290 295 300

Leu Pro Ala Gly Ala Val Leu Val Ser Lys Glu Ile Ala Ala Phe Met

305 310 315 320

Asp Lys His Arg Trp Glu Ser Val Ser Thr Tyr Ala Gly His Pro Val

325 330 335

Ala Met Ala Ala Val Cys Ala Asn Leu Glu Val Met Met Glu Glu Asn

340 345 350

Phe Val Glu Gln Ala Lys Asp Ser Gly Glu Tyr Ile Arg Ser Lys Leu

355 360 365

Glu Leu Leu Gln Glu Lys His Lys Ser Ile Gly Asn Phe Asp Gly Tyr

370 375 380

Gly Leu Leu Trp Ile Val Asp Ile Val Asn Ala Lys Thr Lys Thr Pro

385 390 395 400

Tyr Val Lys Leu Asp Arg Asn Phe Thr His Gly Met Asn Pro Asn Gln

405 410 415

Ile Pro Thr Gln Ile Ile Met Lys Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val Leu

420 425 430

Ile Gly Gly Val Met Pro Asn Thr Met Arg Ile Gly Ala Ser Leu Asn

435 440 445

Val Ser Arg Gly Asp Ile Asp Lys Ala Met Asp Ala Leu Asp Tyr Ala

450 455 460

Leu Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Glu Trp Gln Gln Ser

465 470 475

<210> 33

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 33

atgaaccagc cgctgaatgt ggccccgccg gttagcagcg aactgaatct gcgtgcccat 60

tggatgccgt ttagcgcaaa tcgtaatttt cagaaagatc cgcgtattat tgttgccgca 120

gaaggtagtt ggctgaccga tgataaaggc cgcaaagtgt atgatagtct gagtggcctg 180

tggacctgcg gtgcaggcca tagccgtaaa gaaattcagg aagcagtggc acgccagctg 240

ggcaccctgg attatagccc gggttttcag tatggccatc cgctgagttt tcagctggca 300

gaaaaaattg ccggtctgct gccgggtgaa ctgaatcatg ttttctttac cggtagtggc 360

agcgaatgcg ccgataccag cattaagatg gcccgtgcat attggcgcct gaaaggtcag 420

ccgcagaaaa ccaaactgat tggccgtgca cgcggttatc atggcgtgaa tgttgccggc 480

accagcctgg gcggcattgg tggtaatcgc aaaatgtttg gtcagctgat ggatgtggat 540

catctgccgc ataccctgca gccgggcatg gcattcactc gtggtatggc acagaccggc 600

ggcgttgaac tggcaaatga actgctgaaa ctgattgaac tgcatgatgc cagtaatatt 660

gccgcagtga ttgtggaacc gatgagtggc agtgcaggtg ttctggtgcc gccggtgggt 720

tatctgcagc gtctgcgtga aatttgtgat cagcataata ttctgctgat ttttgatgaa 780

gtgatcaccg catttggccg tctgggtaca tatagcggtg ccgaatattt tggtgtgacc 840

ccggatctga tgaatgtggc aaaacaggtg accaatggtg ccgtgccgat gggcgcagtt 900

attgcaagca gcgaaatcta tgataccttt atgaatcagg ccctgccgga acatgccgtg 960

gaattttctc atggttatac ctatagtgca catccggttg cctgtgccgc cggcctggca 1020

gcactggata ttctggcccg tgataatctg gtgcagcaga gtgcagaact ggcaccgcat 1080

tttgaaaaag gtctgcatgg tctgcagggc gccaaaaatg ttattgatat tcgtaattgc 1140

ggcctggccg gcgccattca gattgcaccg cgtgatggtg acccgaccgt tcgcccgttt 1200

gaagccggca tgaaactgtg gcagcagggt ttttatgtgc gctttggcgg cgataccctg 1260

cagtttggtc cgacctttaa tgcacgcccg gaagaactgg atcgcctgtt tgatgcagtg 1320

ggtgaagcac tgaatggtat tgcc 1344

<210> 34

<211> 448

<212> PRT

<213> 铜绿色假单胞菌（P. aeruginosa）

<400> 34

Met Asn Gln Pro Leu Asn Val Ala Pro Pro Val Ser Ser Glu Leu Asn

1 5 10 15

Leu Arg Ala His Trp Met Pro Phe Ser Ala Asn Arg Asn Phe Gln Lys

20 25 30

Asp Pro Arg Ile Ile Val Ala Ala Glu Gly Ser Trp Leu Thr Asp Asp

35 40 45

Lys Gly Arg Lys Val Tyr Asp Ser Leu Ser Gly Leu Trp Thr Cys Gly

50 55 60

Ala Gly His Ser Arg Lys Glu Ile Gln Glu Ala Val Ala Arg Gln Leu

65 70 75 80

Gly Thr Leu Asp Tyr Ser Pro Gly Phe Gln Tyr Gly His Pro Leu Ser

85 90 95

Phe Gln Leu Ala Glu Lys Ile Ala Gly Leu Leu Pro Gly Glu Leu Asn

100 105 110

His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Cys Ala Asp Thr Ser Ile

115 120 125

Lys Met Ala Arg Ala Tyr Trp Arg Leu Lys Gly Gln Pro Gln Lys Thr

130 135 140

Lys Leu Ile Gly Arg Ala Arg Gly Tyr His Gly Val Asn Val Ala Gly

145 150 155 160

Thr Ser Leu Gly Gly Ile Gly Gly Asn Arg Lys Met Phe Gly Gln Leu

165 170 175

Met Asp Val Asp His Leu Pro His Thr Leu Gln Pro Gly Met Ala Phe

180 185 190

Thr Arg Gly Met Ala Gln Thr Gly Gly Val Glu Leu Ala Asn Glu Leu

195 200 205

Leu Lys Leu Ile Glu Leu His Asp Ala Ser Asn Ile Ala Ala Val Ile

210 215 220

Val Glu Pro Met Ser Gly Ser Ala Gly Val Leu Val Pro Pro Val Gly

225 230 235 240

Tyr Leu Gln Arg Leu Arg Glu Ile Cys Asp Gln His Asn Ile Leu Leu

245 250 255

Ile Phe Asp Glu Val Ile Thr Ala Phe Gly Arg Leu Gly Thr Tyr Ser

260 265 270

Gly Ala Glu Tyr Phe Gly Val Thr Pro Asp Leu Met Asn Val Ala Lys

275 280 285

Gln Val Thr Asn Gly Ala Val Pro Met Gly Ala Val Ile Ala Ser Ser

290 295 300

Glu Ile Tyr Asp Thr Phe Met Asn Gln Ala Leu Pro Glu His Ala Val

305 310 315 320

Glu Phe Ser His Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala His Pro Val Ala Cys Ala

325 330 335

Ala Gly Leu Ala Ala Leu Asp Ile Leu Ala Arg Asp Asn Leu Val Gln

340 345 350

Gln Ser Ala Glu Leu Ala Pro His Phe Glu Lys Gly Leu His Gly Leu

355 360 365

Gln Gly Ala Lys Asn Val Ile Asp Ile Arg Asn Cys Gly Leu Ala Gly

370 375 380

Ala Ile Gln Ile Ala Pro Arg Asp Gly Asp Pro Thr Val Arg Pro Phe

385 390 395 400

Glu Ala Gly Met Lys Leu Trp Gln Gln Gly Phe Tyr Val Arg Phe Gly

405 410 415

Gly Asp Thr Leu Gln Phe Gly Pro Thr Phe Asn Ala Arg Pro Glu Glu

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Phe Asp Ala Val Gly Glu Ala Leu Asn Gly Ile Ala

435 440 445

Claims

1.一种手性2-氨基-1-丁醇的合成方法，包括如下步骤：

（A）以1，2-丁二醇为底物，经酶A及其辅酶催化反应生成2-酮-1-丁醇；

（B）以步骤（A）生成的2-酮-1-丁醇为底物，经酶B及其辅酶催化反应生成手性2-氨基-1-丁醇；

所述酶A和所述酶B为如下三种组合中的任一种：

第一种组合：

所述酶A选自如下任一种：

（a1）来源于短小乳杆菌（Lactobacillus brevis）的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQ IDNo.2；

（a2）来源于嗜热脂肪芽胞杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.4；

（a3）来源于高温厌氧杆菌（Thermoanaerobacter brockii）的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.6；

（a4）来源于高加索酸奶乳杆菌（Lactobacillus kefiri）的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.8；

（a5）来源于芽孢杆菌科（Bacillaceae）的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.10；

（a6）来源于赖氏菌属（Leifsonia sp.）的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.12；

（a7）来源于威吉利热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter wiegelii）的醇脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.14；

（a8）与SEQ ID No.2所示来源于短小乳杆菌的醇脱氢酶相比，仅存在如下突变I11V；

（a9）与SEQ ID No.2所示来源于短小乳杆菌的醇脱氢酶相比，仅存在如下突变： G37D；

（a10）来源于赭色掷孢酵母的羰基还原酶，氨基酸序列为SEQ ID No.16；

（a11）在（a1）-（a10）中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述酶B选自如下任一种：

（b1）来源于嗜热脂肪芽胞杆菌的亮氨酸脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.18；

（b2）与SEQ ID No.18所示来源于嗜热脂肪芽胞杆菌的亮氨酸脱氢酶相比，仅存在如下突变：K68S/N261L；

（b3）与SEQ ID No.18所示来源于嗜热脂肪芽胞杆菌的亮氨酸脱氢酶相比，仅存在如下突变：K68Y/N261C；

（b4）Codexis公司的ATA-117转氨酶，氨基酸序列为SEQ ID No.20；

（b5）来源于土曲霉（Aspergillus terreus）的转氨酶，氨基酸序列为SEQ ID No.22；

（b6）来源于烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）的转氨酶，氨基酸序列为SEQ IDNo.24；

（b7）来源于费希新萨托菌（Neosartorya fischeri）的转氨酶，氨基酸序列为SEQ IDNo.26；

（b8）来源于玉米赤霉（Gibberella zeae）的转氨酶，氨基酸序列为SEQ ID No.28；

（b9）来源于分支杆菌（Mycobacterium vanbaalenii）的转氨酶，氨基酸序列为SEQ IDNo.30；

（b10）在（b1）-（b9）中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

第二种组合：

所述酶A选自如下任一种：

（a12）在（a1）-（a6）和（a8）-（a9）中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述酶B选自如下任一种：

（b11）来源于巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的转氨酶，氨基酸序列为SEQ IDNo.32；

（b12）在（b9）或（b11）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

第三种组合：

所述酶A选自如下任一种：

（a13）在（a7）或（a10）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述酶B选自如下任一种：

（b13）来源于铜绿色假单胞菌（P. aeruginosa）的转氨酶，氨基酸序列为SEQ IDNo.34；

（b14）在（b11）或（b13）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述第一种组合中的酶用于合成的所述手性2-氨基-1-丁醇为(S)-2-氨基-1-丁醇；所述第二种组合和所述第三种组合中的酶用于合成的所述手性2-氨基-1-丁醇为(R)-2-氨基-1-丁醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述方法中，所述酶A和所述酶B均是以粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞的形式发生催化作用的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述粗酶液、所述粗酶液冻干粉和所述纯酶均按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述酶A和/或所述酶B，得到重组细胞；裂解所述重组细胞获得所述粗酶液、所述粗酶液冻干粉或所述纯酶。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述全细胞均按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述酶A和所述酶B，得到的重组细胞即为所述全细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组细胞是按照包括如下步骤的方法制备获得的：向所述宿主细胞中导入能够表达所述酶A和所述酶B的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述酶A和所述酶B的所述重组细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：能够表达所述酶A和所述酶B的核酸分子是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的；所述重组载体为携带有所述酶A和所述酶B的编码基因的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为原核细胞或低等真核细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述原核细胞为细菌；所述低等真核细胞为酵母细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述来源于短小乳杆菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.1或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于嗜热脂肪芽胞杆菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.3或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于高温厌氧杆菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.5或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于高加索酸奶乳杆菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.7或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于芽孢杆菌科的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.9或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于赖氏菌属的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.11或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于威吉利热厌氧杆菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.13或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于赭色掷孢酵母的羰基还原酶的编码基因的序列为SEQ ID No.15或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于嗜热脂肪芽胞杆菌的亮氨酸脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.17或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述Codexis公司的ATA-117转氨酶的编码基因的序列为SEQ ID No.19或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于土曲霉的转氨酶的编码基因的序列为SEQ ID No.21或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于烟曲霉菌的转氨酶的编码基因的序列为SEQ ID No.23或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于费希新萨托菌的转氨酶的编码基因的序列为SEQ ID No.25或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于玉米赤霉的转氨酶的编码基因的序列为SEQ ID No.27或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于分支杆菌的转氨酶的编码基因的序列为SEQ ID No.29或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于巨大芽孢杆菌的转氨酶的编码基因的序列为SEQ ID No.31或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于铜绿色假单胞菌的转氨酶的编码基因的序列为SEQ ID No.33或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于短小乳杆菌的醇脱氢酶的突变体的编码基因的序列为如下（g1）-（g3）中任一：（g1）与SEQ ID No.1相比，仅存在如下突变：A31G/T33G；（g2）与SEQ ID No.1相比，仅存在如下突变： G110A/C111T；（g3）在（g1）或（g2）所限定序列的5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；

所述来源于嗜热脂肪芽胞杆菌的亮氨酸脱氢酶的突变体的编码基因的序列为如下（h1）-（h3）中任一：（h1）与SEQ ID No.17相比，仅存在如下突变：A203G/A204C/A781C/A782T/C783G；（h2）与SEQ ID No.17相比，仅存在如下突变：A202T/A204T/A781T/ A782G；（h3）在（h1）或（h2）所限定序列的5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列。

11.根据权利要求1-10中任一所述的方法，其特征在于：步骤（A）和步骤（B）中，所述催化反应的温度均为25～37℃；所述催化反应的时间均为4～48 h。

12.根据权利要求1-10中任一所述的方法，其特征在于：当所述酶A和所述酶B是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式发生催化作用时，步骤（A）和步骤（B）中，所述酶A和所述酶B在各自反应体系中的浓度均为0.1 g/L～10 g/L；当所述酶A和所述酶B以共表达所述酶A和所述酶B的全细胞的形式发生催化作用时，每升反应体系中含有所述全细胞的湿重为100g。

13.根据权利要求1-10中任一所述的方法，其特征在于：当所述酶A和所述酶B是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式发生催化作用时，步骤（A）中，所述催化反应在如下（k1）所示缓冲液中进行；步骤（B）中，所述催化反应在如下（k2）-（k3）任一所示缓冲液中进行；当所述酶A和所述酶B以共表达所述酶A和所述酶B的全细胞的形式发生催化作用时，步骤（A）和步骤（B）的所述催化反应均是在如下（k1）所示缓冲液中进行；

（k1）浓度为50～100 mM，pH值为6.5～8.0的磷酸盐缓冲液；（k2）浓度为100 mM～2 M，pH为8.0～9.6的NH₃·H₂O或NH₄Cl缓冲液；（k3）浓度为50～100 mM，异丙胺的浓度为250 mM-1 M，pH值为7.5～8.5的磷酸盐缓冲液。

14.根据权利要求1-10中任一所述的方法，其特征在于：当所述酶A和所述酶B是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式发生催化作用时，步骤（A）中，所述催化反应的反应体系中除了含有1，2-丁二醇和所述酶A及其辅酶外，还含有丙酮。

15.根据权利要求1-10中任一所述的方法，其特征在于：当所述酶A和所述酶B是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式发生催化作用时，步骤（B）中，当所述酶B为氨基酸脱氢酶或所述氨基酸脱氢酶的突变体时，所述催化反应的反应体系中除了含有2-酮-1-丁醇和所述酶B及其辅酶外，还含有葡萄糖脱氢酶和葡萄糖。

16.酶***或其相关产品在合成手性2-氨基-1-丁醇中的应用；

所述手性2-氨基-1-丁醇为(S)-2-氨基-1-丁醇或(R)-2-氨基-1-丁醇；

当所述手性2-氨基-1-丁醇为(S)-2-氨基-1-丁醇时，所述酶***记为酶***I，所述相关产品记为相关产品I；所述酶***I包括权利要求1中的所述第一种组合中的所述酶A和所述酶B；所述相关产品I为能够表达所述酶***I中各酶的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

当所述手性2-氨基-1-丁醇为(R)-2-氨基-1-丁醇时，所述酶***记为酶***II，所述相关产品记为相关产品II；所述酶***II包括权利要求1中的所述第二种组合或所述第三种组合中的所述酶A和所述酶B；所述相关产品II为能够表达所述酶***II中各酶的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。