CN109321590A - 利用乙酸生产l-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用乙酸生产L‑乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明公开的利用乙酸生产L‑乳酸的基因工程菌，通过对受体菌进行如下改造得到：敲除受体菌的poxB基因、pflB基因、aceEF基因、ldhA基因、lldD基因；增加受体菌中acs基因、pta基因、ackA基因、aceA基因、aceK基因、aceB基因、maeA基因、maeB基因和ldh2基因编码蛋白质的含量。本发明获得的工程菌，在摇瓶培养中利用乙酸获得的L‑乳酸产量能达到理想水平，避免了葡萄糖等碳源的使用，有助于降低L‑乳酸发酵的原料成本，具有较好的应用前景。

Description

利用乙酸生产L-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术、基因工程和发酵工程领域，具体涉及一种利用乙酸生产L-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

人类社会每年消耗大量的石油和煤炭等化石资源，由此排放大量的温室气体引发气候变化的担忧。因此，可再生生物质资源的开发利用成为当前科学界和工业界关注的热点之一。目前，来源于农业与种植业的葡萄糖、木糖、淀粉和纤维素等是发酵工业中微生物普遍利用的碳源和能源物质。我国是一个生物发酵产业大国，许多产品的产量位居世界第一，每年消耗了大量的粮食资源。因此，粮食短缺和农副产品价格持续上涨，已经成为制约生物发酵产业发展的关键因素。为解决“与人争粮、与粮争地”的难题，迫切需要开发来源广泛、价格低廉的新型发酵碳源。甲醇、乙酸和合成气等逐渐成为工业生物技术领域中的研究热点。

乙酸又名醋酸，是一种简单的二碳羧酸，也是食醋的主要成分。乙酸在自然界中分布广泛，主要是以酯类存在于水果和植物油中。在动物的组织内、***物和血液中，乙酸以游离酸的形式存在。许多微生物可以通过厌氧发酵将有机物转化为乙酸。能够利用乙酸作为碳源生长的微生物有细菌、真菌和酵母等，例如大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌等。

乳酸又名2-羟基丙酸，是一种重要的有机酸。乳酸分子中有一个手性碳原子，有D-乳酸和L-乳酸两种构型。与D-乳酸相比，L-乳酸能够被人体降解，被广泛应用于食品、饮料、医药和化妆品等领域。此外，乳酸能够通过化学法聚合为聚乳酸，可作为生物可降解材料使用。2015年，全球乳酸产量约为50万吨，市场需求以L-乳酸为主，用于食品和饮料领域的占比接近50％，用于聚乳酸领域的占比超过30％。

乳酸的常见制备方法有化学法和微生物发酵法。化学法生产乳酸的主要途径包括乳腈法和丙烯腈法，以乳腈法为主。该方法以乙醛与氢氰酸为原料，经碱性催化合成乳腈，再经过蒸馏纯化并用浓酸水解产生乳酸，最后通过酯化精制获得不同等级的产品。化学法利用的原料乙醛和氢氰酸具有较强的毒性，而且产物是D-乳酸和L-乳酸的混合物，由于D-乳酸在人体内的代谢问题，难以应用到食品和饮料等领域。

微生物发酵法具有生产成本低、原料来源广、产物光学纯度高等优点，是工业上生产乳酸的主要方法。发酵法使用的菌种有乳杆菌、芽孢杆菌和米根霉等。虽然利用纤维素、木薯、糖蜜和菊芋等非粮廉价原料发酵生产乳酸已有若干研究，但是玉米淀粉仍是目前大规模发酵中使用的主要原料，由此导致L-乳酸市场价格偏高，限制了其在生物可降解材料和其它领域中的广泛应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何利用乙酸这种潜在的大宗发酵碳源来制备L-乳酸。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组菌的构建方法，所述方法包括对受体菌进行下述A1-A14的改造，得到所述重组菌；

A1、敲除所述受体菌的丙酮酸氧化酶基因(poxB基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：946132)或抑制所述poxB基因的表达或抑制所述poxB基因编码的蛋白质的活性；

A2、敲除所述受体菌的丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：945514)或抑制所述pflB基因的表达或抑制所述pflB基因编码的蛋白质的活性；

A3、敲除所述受体菌的丙酮酸脱氢酶基因(aceE基因和aceF基因，记为aceEF基因；aceE基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：944834；aceF基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：944794)或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性；

A4、敲除所述受体菌的D-乳酸脱氢酶基因(ldhA基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：946315)或抑制所述ldhA基因的表达或抑制所述ldhA基因编码的蛋白质的活性；

A5、敲除所述受体菌的L-乳酸脱氢酶基因(lldD基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：948121)或抑制所述lldD基因的表达或抑制所述lldD基因编码的蛋白质的活性；

A6、增加所述受体菌中乙酰辅酶A合成酶基因(acs基因)编码蛋白质的含量或增强所述acs基因编码蛋白质的活性；

A7、增加所述受体菌中磷酸转乙酰酶基因(pta基因)编码蛋白质的含量或增强所述pta基因编码蛋白质的活性；

A8、增加所述受体菌中乙酸激酶基因(ackA基因)编码蛋白质的含量或增强所述ackA基因编码蛋白质的活性；

A9、增加所述受体菌中异柠檬酸裂解酶基因(aceA基因)编码蛋白质的含量或增强所述aceA基因编码蛋白质的活性；

A10、增加所述受体菌中异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶基因(aceK基因)编码蛋白质的含量或增强所述aceK基因编码蛋白质的活性；

A11、增加所述受体菌中苹果酸合成酶基因(aceB基因)编码蛋白质的含量或增强所述aceB基因编码蛋白质的活性；

A12、增加所述受体菌中NAD-依赖型苹果酸酶基因maeA基因编码蛋白质的含量或增强所述maeA基因编码蛋白质的活性；

A13、增加所述受体菌中NADP-依赖型苹果酸酶基因maeB基因编码蛋白质的含量或增强所述maeB基因编码蛋白质的活性；

A14、增加所述受体菌中L-乳酸脱氢酶基因(ldh2基因)编码蛋白质的含量或增强所述ldh2基因编码蛋白质的活性；

所述受体菌为含有所述poxB基因、所述pflB基因、所述aceEF基因、所述ldhA基因和所述lldD基因的细菌或真菌。

上述方法中，所述受体菌可为1)或2)：

1)大肠杆菌；

2)大肠杆菌MG1655。

上述方法中，所述acs基因编码蛋白质为下述a1)或a2)的蛋白质：

a1)序列表中序列12所示的蛋白质；

a2)将序列表中序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述ackA基因编码蛋白质为下述b1)或b2)的蛋白质：

b1)序列表中序列13所示的蛋白质；

b2)将序列表中序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述pta基因编码蛋白质为下述c1)或c2)的蛋白质：

c1)序列表中序列14所示的蛋白质；

c2)将序列表中序列14的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述aceA基因编码蛋白质为下述d1)或d2)的蛋白质：

d1)序列表中序列15所示的蛋白质；

d2)将序列表中序列15的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述aceK基因编码蛋白质为下述e1)或e2)的蛋白质：

e1)序列表中序列16所示的蛋白质；

e2)将序列表中序列16的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述aceB基因编码蛋白质为下述f1)或f2)的蛋白质：

f1)序列表中序列17所示的蛋白质；

f2)将序列表中序列17的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述maeA基因编码蛋白质为下述g1)或g2)的蛋白质：

g1)序列表中序列18所示的蛋白质；

g2)将序列表中序列18的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述maeB基因编码蛋白质为下述h1)或h2)的蛋白质：

h1)序列表中序列19所示的蛋白质；

h2)将序列表中序列19的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述ldh2基因编码蛋白质为下述i1)或i2)的蛋白质：

i1)序列表中序列20所示的蛋白质；

i2)将序列表中序列20的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

上述方法中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述方法中，A1通过向所述受体菌中导入含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段实现；

和/或，A2通过向所述受体菌中导入含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段实现；

和/或，A3通过向所述受体菌中导入含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段实现；

和/或，A4通过向所述受体菌中导入含有所述ldhA基因上下游同源臂的DNA片段实现；

和/或，A5通过向所述受体菌中导入含有所述lldD基因上下游同源臂的DNA片段实现；

和/或，A6通过向所述受体菌中导入含有所述acs基因的acs基因表达盒实现；

和/或，A7通过向所述受体菌中导入含有所述pta基因的pta基因表达盒实现；

和/或，A8通过向所述受体菌中导入含有所述ackA基因的ackA基因表达盒实现；

和/或，A9通过向所述受体菌中导入含有所述aceA基因的aceA基因表达盒实现；

和/或，A10通过向所述受体菌中导入含有所述aceK基因的aceK基因表达盒实现；

和/或，A11通过向所述受体菌中导入含有所述aceB基因的aceB基因表达盒实现；

和/或，A12通过向所述受体菌中导入含有所述maeA基因的maeA基因表达盒实现；

和/或，A13通过向所述受体菌中导入含有所述maeB基因的maeB基因表达盒实现；

和/或，A14通过向所述受体菌中导入含有所述ldh2基因的ldh2基因表达盒实现。

向所述受体菌中导入各表达盒均可通过将含有相应表达盒的表达载体导入所述受体菌中实现。

所述表达载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为质粒pBBR1MCS-2或质粒pUC19。

上述方法中，各基因的敲除均可通过λ-red同源重组方式实现。

上述方法中，所述含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列8所示的DNA分子；

所述含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列9所示的DNA分子；

所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列7所示的DNA分子；

所述含有所述ldhA基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列10所示的DNA分子；

所述含有所述lldD基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列11所示的DNA分子；

和/或，所述acs基因表达盒、所述pta基因表达盒、所述ackA基因表达盒、所述aceA基因表达盒、所述aceK基因表达盒、所述aceB基因表达盒、所述maeA基因表达盒、所述maeB基因表达盒和所述ldh2基因表达盒中启动子为下述j1)或j2)：

j1)序列表中序列1的第9-51位所示的DNA分子；

j2)与j1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；

和/或，所述acs基因表达盒中所述acs基因为下述k1)或k2)：

k1)序列表中序列1的第70-2028位所示的DNA分子；

k2)与k1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述pta基因表达盒中所述pta基因为下述l1)或l2)：

l1)序列表中序列2的第1347-3491位所示的DNA分子；

l2)与l1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述ackA基因表达盒中所述ackA基因为下述m1)或m2)：

m1)序列表中序列2的第70-1272位所示的DNA分子；

m2)与m1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述aceA基因表达盒中所述aceA基因为下述n1)或n2)：

n1)序列表中序列3的第70-1374位所示的DNA分子；

n2)与n1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述aceK基因表达盒中所述aceK基因为下述o1)或o2)：

o1)序列表中序列3的第1436-3172位所示的DNA分子；

o2)与o1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述aceB基因表达盒中所述aceB基因为下述p1)或p2)：

p1)序列表中序列4的第70-1671位所示的DNA分子；

p2)与p1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述maeA基因表达盒中所述maeA基因为下述q1)或q2)：

q1)序列表中序列5的第70-1767位所示的DNA分子；

q2)与q1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述maeB基因表达盒中所述maeB基因为下述r1)或r2)：

r1)序列表中序列5的第1791-4070位所示的DNA分子；

r2)与r1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述ldh2基因表达盒中所述ldh2基因为下述s1)或s2)：

s1)序列表中序列6的第70-1050位所示的DNA分子；

s2)与s1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

上述方法中，所述75％或75％以上同一性均可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述方法中，所述acs基因表达盒为序列表中序列1的第9-2028位所示的DNA分子；

所述pta基因表达盒和所述ackA基因表达盒为序列中序列2的第9-3491位所示的DNA分子；

所述aceA基因表达盒和所述aceK基因表达盒为序列表中序列3的第9-3172位所示的DNA分子；

所述aceB基因表达盒为序列表中序列4的第9-1671位所示的DNA分子；

所述maeA基因表达盒和所述maeB基因表达盒为序列表中序列5的第9-4070位所示的DNA分子；

所述ldh2基因表达盒为序列表中序列6的第9-1050位所示的DNA分子。

本发明还提供了利用所述方法制备的重组菌。

本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂由所述含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述ldhA基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述lldD基因上下游同源臂的DNA片段、所述acs基因表达盒、所述pta基因表达盒、所述ackA基因表达盒、所述aceA基因表达盒、所述aceK基因表达盒、所述aceB基因表达盒、所述maeA基因表达盒、所述maeB基因表达盒和所述ldh2基因表达盒组成。

所述成套试剂可用于生产L-乳酸和/或降解乙酸。

本发明还提供了所述成套试剂或所述重组菌的下述任一应用：

X1、生产L-乳酸；

X2、制备生产L-乳酸产品；

X3、降解乙酸；

X4、制备降解乙酸产品。

本发明还提供了L-乳酸的制备方法，所述方法包括：以乙酸为碳源，利用所述重组菌进行生物转化，制备得到L-乳酸。

其中，进行所述生物转化可在MM液体培养基中进行。

所述MM液体培养基的组成如下：每升培养基含8g乙酸、2g NH₄Cl、5g(NH₄)₂SO₄、6gKH₂PO₄、8g 3-吗啉丙磺酸、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液，余量为水。

所述微量元素溶液的组成如下：每升微量元素溶液含3.6g FeCl₂·4H₂O、5gCaCl₂·2H₂O、1.3g MnCl₂·2H₂O、0.38g CuCl₂·2H₂O、0.5g CoCl₂·6H₂O、0.94g ZnCl₂、0.03g H₃BO₃、0.4g Na₂EDTA·2H₂O、1g thiamine-HCl，其余为0.5M HCl。

进行所述生物转化的条件可为：30-37℃瓶震荡培养24-72h(如37℃，48h)。摇瓶的转速可为50-200rpm。

本发明的有益效果：本发明通过在大肠杆菌中表达9个代谢途径相关的基因和敲除6个内源基因，获得了能够以乙酸为碳源，发酵获得L-乳酸的工程菌株，并且重组菌在摇瓶培养中的L-乳酸的产量能达到较高水平，避免了葡萄糖等碳源的使用，有助于降低L-乳酸发酵的原料成本，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为pMCS-LA1载体图谱。

图2为pMCS-LA2载体图谱。

图3为pUC19-LA1载体图谱。

图4为pUC19-LA2载体图谱。

图5为pUC19-LA3载体图谱。

图6为pUC19-LA4载体图谱。

图7为pUC19-LA24载体图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中涉及分子生物学操作所用的酶，均为NEB(New England Biolabs，http://www.neb-china.com/)公司产品；质粒提取和DNA片段回收所用的试剂盒，均为北京博迈德基因技术有限公司(http://www.biomed168.com/)产品；实施例中涉及的DNA合成和测序工作，由北京博迈德基因技术有限公司完成。

E.coli MG1655：来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center(http://cgsc2.biology.yale.edu/)，编号CGSC#6300。

E.coli NEB 5-alpha：来源于NEB(New England Biolabs)，货号C2987I。

质粒pKD13：来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center，编号CGSC#7633。

质粒pKD46：来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center，编号CGSC#7739。

质粒pCP20：来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center，编号CGSC#7637。

质粒pBBR1MCS-2：公众可根据NCBI accession number U23751.1的序列自行提交基因合成公司获得，该质粒记载在如下文献中：Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistancecassettes,1995,Gene,166:175-176。

质粒pUC19：来源于NEB(New England Biolabs)公司，货号N3041S。

MM液体培养基的组成如下：每升培养基含8g乙酸、2g NH₄Cl、5g(NH₄)₂SO₄、6gKH₂PO₄、8g 3-吗啉丙磺酸、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液，余量为水。

微量元素溶液的组成如下：每升微量元素溶液含3.6g FeCl₂·4H₂O、5g CaCl₂·2H₂O、1.3g MnCl₂·2H₂O、0.38g CuCl₂·2H₂O、0.5g CoCl₂·6H₂O、0.94g ZnCl₂、0.03gH₃BO₃、0.4g Na₂EDTA·2H₂O、1g thiamine-HCl，其余为0.5M HCl。

实施例1、构建重组菌E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)

一、重组表达载体pMCS2-LA1和pMCS2-LA2的构建

1、人工合成序列表中序列1所示的DNA，含有acs表达盒，上游为SacI位点，下游为XbaI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-2028位核苷酸为acs基因序列。

2、人工合成序列表中序列2所示的DNA，含有ackA和pta表达盒，上游为XbaI位点，下游为EcoRI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1272位核苷酸为ackA基因序列，第1347-3491位核苷酸为pta基因序列。

3、用SacI和XbaI双酶切序列1中合成的DNA序列，回收大小约为2022bp的DNA片段；用SacI和XbaI双酶切质粒pBBR1MCS-2，回收大小约为5124bp的DNA片段；将上述约2022bp和5124bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB5-alpha中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用SacI和XbaI进行酶切验证，酶切产物大小约为2022bp和5124bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pMCS-LA1。将重组质粒pMCS-LA1进行测序,结果表明：pMCS-LA1为将质粒pBBR1MCS-2的SacI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1的第9-2028位所示的acs表达盒得到的重组质粒。

4、用XbaI和EcoRI双酶切序列2中合成的DNA序列，回收大小约为3489bp的DNA片段；用XbaI和EcoRI双酶切质粒pMCS-LA1，回收大小约为7116bp的DNA分子；将上述约3489bp和7116bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB5-alpha中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用XbaI和EcoRI进行酶切验证，酶切产物大小约为3489bp和7116bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pMCS-LA2。将重组质粒pMCS-LA2进行测序,结果表明：pMCS-LA2为将质粒pMCS-LA1的XbaI和EcoRI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2的第9-3491位所示的ackA和pta表达盒得到的重组质粒。

二、重组表达载体pUC19-LA1和pUC19-LA2的构建

1、人工合成序列表中序列3所示的DNA，含有aceA和aceK表达盒，上游为SacI位点，下游为SpeI和KpnI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1374位核苷酸为aceA基因序列，第1436-3172位核苷酸为aceK基因序列。

2、人工合成序列表中序列4所示的DNA，含有aceB表达盒，上游为SpeI位点，下游为XhoI和KpnI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1671位核苷酸为aceB基因序列。

3、用SacI和KpnI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小约为3179bp的DNA片段；用SacI和KpnI双酶切质粒pUC19，回收大小约为2680bp的DNA片段；将上述约3179bp和2680bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用SacI和KpnI进行酶切验证，酶切产物大小约为3179bp和2680bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC19-LA1。将得到的重组质粒pUC19-LA1进行测序验证，结果表明：pUC19-LA1为将质粒pUC19的SacI和KpnI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列3的第9-3181位所示的DNA序列得到的重组质粒，该重组质粒含有序列3的第9-3172位所示的aceA和aceK表达盒。

4、用SpeI和KpnI双酶切步骤2中合成的DNA序列，回收大小约为1682bp的DNA片段；用SpeI和KpnI双酶切质粒pUC19-LA1，回收大小约为5846bp的DNA片段；将上述约1682bp和5846bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用SpeI和KpnI进行酶切验证，酶切产物大小约为1682bp和5846bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC19-LA2。将得到的重组质粒pUC19-LA2进行测序验证，结果表明：pUC19-LA2为将质粒pUC19-LA1的SpeI和KpnI的识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列4的第9-1680位所示的DNA序列得到的重组质粒，该重组质粒含有序列4的第9-1671位所示的aceB表达盒。

三、重组表达载体pUC19-LA3的构建

1、人工合成序列表中序列5所示的DNA，含有maeA和maeB表达盒，上游为XhoI位点，下游为KpnI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1767位核苷酸为maeA基因序列，第1791-4070位核苷酸为maeB基因序列。

2、用XhoI和KpnI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小约为4072bp的DNA片段；用XhoI和KpnI双酶切质粒pUC19-LA2，回收大小约为7515bp的DNA片段；将上述约4072bp和7515bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用XhoI和KpnI进行酶切验证，酶切产物大小约为4072bp和7515bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC19-LA3。将得到的重组质粒pUC19-LA3进行测序验证，结果表明：pUC19-LA3为将质粒pUC19-LA2的XhoI和KpnI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列5的第9-4070位所示的maeA和maeB表达盒得到的重组质粒。

四、重组表达载体pUC19-LA4的构建

1、人工合成序列表中序列6所示的DNA，含有ldh2表达盒，上游为KpnI位点，下游为XbaI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1050位核苷酸为ldh2基因序列。

2、用KpnI和XbaI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小约为1044bp的DNA片段；用KpnI和XbaI双酶切质粒pUC19-LA3，回收大小约为11576bp的DNA片段；将上述约1044bp和11576bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB5-alpha中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用KpnI和XbaI进行酶切验证，酶切产物大小约为1044bp和11576bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC19-LA4。将得到的重组质粒pUC19-LA4进行测序验证，结果表明：pUC19-LA4为将质粒pUC19-LA3的KpnI和XbaI的识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列6的第9-1050位所示的ldh2表达盒得到的重组质粒。

五、重组表达载体pUC19-LA24的构建

1、人工合成序列表中序列6所示的DNA，含有ldh2表达盒，上游为KpnI位点，下游为XbaI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1050位核苷酸为ldh2基因序列。

2、用KpnI和XbaI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小约为1044bp的DNA片段；用KpnI和XbaI双酶切质粒pUC19-LA2，回收大小约为7517bp的DNA片段；将上述1044bp和7517bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用KpnI和XbaI进行酶切验证，酶切产物大小约为1044bp和7517bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC19-LA24。将得到的重组质粒pUC19-LA24进行测序验证，结果表明：pUC19-LA24为将质粒pUC19-LA2的KpnI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列6的第9-1050位所示的ldh2表达盒得到的重组质粒。

六、大肠杆菌E.coli LA5的构建

1、敲除poxB基因

1)合成poxB基因敲除所用的引物poxBF和poxBR，序列如下：

poxBF：

5’-ATGAAACAAACGGTTGCAGCTTATATCGCCAAAACACTCGAATCGGCAGGGGTGAAACGCGTGTAGGCTGGAGC TGCTTCG-3’；

poxBR：

5’-GGGCGTCGCGGTAATCTTCCAGCGCTTTATCCAGAAACTTGCGATCGGCTTTTTCTTCCAATTCCGGGGATCCG TCGACC-3’。

2)以质粒pKD13为模板，采用引物poxBF和poxBR进行PCR扩增得到1500bp左右的DNA片段，命名为poxB同源重组片段，琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化。经过测序，poxB同源重组片段的核苷酸序列为序列8，其中，第1-60位为poxB基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为poxB基因下游同源臂。

3)利用电转化的方法将pKD46转化至受体菌株E.coli MG1655中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，30℃培养24h，得到转化子，提质粒验证，获得含有pKD46的重组菌，记为E.coli MG1655(pKD46)。

4)将E.coli MG1655(pKD46)接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃培养1h，加入***糖至终浓度5g/L，继续培养1.5h，接下来制备E.coli MG1655(pKD46)的感受态细胞，将步骤2)中获得的DNA片段转入E.coli MG1655(pKD46)的感受态细胞中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h，得到转化子。

5)利用菌落PCR的方法，以poxBF和poxBR为引物进行PCR，将PCR产物纯化之后测序，筛选正确的poxB基因已经被替换为Kan抗性基因的克隆，记为E.coli MG1655poxB-K(pKD46)。

6)将E.coli MG1655poxB-K(pKD46)接种于LB液体培养基中，42℃培养传代三次，除去pKD46质粒，得到E.coli MG1655poxB-K；E.coli MG1655poxB-K是poxB基因被Kan基因替换了的E.coli MG1655。

7)将E.coli MG1655poxB-K接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养24h，转接到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h，制备E.coli MG1655poxB-K感受态细胞。

8)利用电转化的方法将质粒pCP20转化到E.coli MG1655poxB-K感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB固体培养基，30℃培养48h，得到转化子。利用菌落PCR的方法验证转化子，以poxBF和poxBR为引物，得到202bp片段的为阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli MG1655基因组上的poxB基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli LA1。

2、敲除pflB基因

与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：

pflB基因敲除引物序列如下：

pflBF：

5’-

ATGTCCGAGCTTAATGAAAAGTTAGCCACAGCCTGGGAAGGTTTTACCAAAGGTGACTGGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；

pflBR：

5’

-TTACATAGATTGAGTGAAGGTACGAGTAATAACGTCCTGCTGCTGTTCTTTAGTCAGCGAATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；

利用pflB基因敲除引物得到的pflB同源重组片段的核苷酸序列为序列9，其中，第1-60位为pflB基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为pflB基因下游同源臂。所用转化受体菌株为上述步骤1得到的突变体E.coli LA1。利用菌落PCR的方法验证转化子，以pflBF和pflBR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli LA1基因组上的pflB基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli LA2。

3、敲除aceEF基因

与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：

aceEF基因敲除引物序列如下：

aceEFF：

5’-ATGTCAGAACGTTTCCCAAATGACGTGGATCCGATCGAAACTCGCGACTGGCTCCAGGCGGTGTAGGCTGGA GCTGCTTCG-3’；

aceEFR：

5’-TTACATCACCAGACGGCGAATGTCAGACAGCGTGTTGTTAATGATGGTAATGAAACGGGCATTCCGGGGATC CGTCGACC-3’；

利用aceEF基因敲除引物得到的aceEF同源重组片段的核苷酸序列为序列7，其中，第1-60位为aceEF基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为aceEF基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤2得到的突变体E.coli LA2。利用菌落PCR的方法验证转化子，以aceEFF和aceEFR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli LA2基因组上的aceEF基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli LA3。

4、敲除ldhA基因

与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：

ldhA基因敲除引物序列如下：

ldhAF：

5’-

ATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTACGACAAGAAGTACCTGCAACAGGTGAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；

ldhAR：

5’-

TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTCGCCTTTTTCCAGATTGCTTAAGTTTTGCAGCGTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；

利用ldhA基因敲除引物得到的ldhA同源重组片段的核苷酸序列为序列10，其中，第1-60位为ldhA基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为ldhA基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤3得到的突变体E.coli LA3。利用菌落PCR的方法验证转化子，以ldhAF和ldhAR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli LA3基因组上的ldhA基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli LA4。

5、敲除lldD基因

与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：

lldD基因敲除引物序列如下：

lldDF：

5’-

ATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCGCGCCGCAGCGCAACGCATTCTGCCGCCGTTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；

lldDR：

5’-

CTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATGGGAGCCAGTGCCGCAGGCAACTCTTTACCCAGCCCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；

利用lldD基因敲除引物得到的lldD同源重组片段的核苷酸序列为序列11，其中，第1-60位为lldD基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为lldD基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤4得到的突变体E.coli LA4。利用菌落PCR的方法验证转化子，以lldDF和lldDR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli LA4基因组上的lldD基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli LA5。

七、重组菌E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)的构建

1、将上述步骤一得到的重组质粒pMCS-LA2和上述步骤四得到的重组质粒pUC19-LA4通过电转化的方法转化到上述步骤六得到的大肠杆菌E.coli LA5，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。

2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。

3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有两个质粒(pMCS-LA2与pUC19-LA4)的重组菌记为E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)。

E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)为敲除E.coli MG1655染色体基因poxB、pflB、aceEF、ldhA和lldD，并且含有基因acs、pta、ackA、aceA、aceK、aceB、maeA、maeB和ldh2的外源表达盒的重组菌。

八、对照菌E.coli LA5(pUC19-LA4)的构建

1、将上述步骤四得到的重组质粒pUC19-LA4通过电转化的方法转化到上述步骤六得到的大肠杆菌E.coli LA5，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。

2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。

3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有质粒pUC19-LA4的重组菌记为E.coli LA5(pUC19-LA4)。

E.coli LA5(pUC19-LA4)为敲除E.coli MG1655染色体基因poxB、pflB、aceEF、ldhA和lldD，并且含有基因aceA、aceK、aceB、maeA、maeB和ldh2的外源表达盒的重组菌。

九、对照菌E.coli LA5(pUC19-LA24)的构建

1、将上述步骤五得到的重组质粒pUC19-LA24通过电转化的方法转化到上述步骤六得到的大肠杆菌E.coli LA5，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。

2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。

3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有质粒pUC19-LA24的重组菌记为E.coli LA5(pUC19-LA24)。

E.coli LA5(pUC19-LA24)为敲除E.coli MG1655染色体基因poxB、pflB、aceEF、ldhA和lldD，并且含有基因aceA、aceK、aceB和ldh2的外源表达盒的重组菌。

实施例2、重组菌E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)在生产L-乳酸中的应用

一、重组菌E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)的摇瓶培养实验

1、将实施例1中步骤七制备的E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。

2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到含有氨苄青霉素和卡那霉素的MM液体培养基中，250ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速100rpm条件下培养24h，分别在培养12h和24h收集发酵液。

3、通过高效液相色谱对基因工程菌产生的L-乳酸和消耗的乙酸进行定量检测。具体条件如下：

仪器：岛津公司Essentia LC系列HPLC仪，配有DGU-20A脱气机，LC-16送液泵，SIL-16型自动进样器，RID-20A检测器。

色谱条件：Bio-RadHPX-87H(7.8×300mm)；流速0.50mL/min；柱温55℃；流动相为7mM硫酸水溶液。

检测方法：

取L-乳酸浓度分别为0、1、2、3、4、5g/L的L-乳酸标准品水溶液(L-乳酸，Sigma-Aldrich，产品编号L1875)，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测，用不同浓度的L-乳酸标准溶液的色谱峰面积为纵坐标，不同浓度为横坐标，绘制标准曲线。取乙酸浓度分别为0、2、4、6、8、10g/L的乙酸标准品水溶液(乙酸，Sigma-Aldrich，产品编号A6283)，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测，用不同浓度的乙酸标准溶液的色谱峰面积为纵坐标，不同物质的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

取2mL的发酵液，先用紫外分光光度计测定菌液在600nm的OD值，再于12000rpm离心10min，将其发酵上清液转移到新的离心管内，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测。

将待测样品发酵上清液的L-乳酸色谱峰面积代入上述标准曲线中，计算得到待测样品发酵上清液的L-乳酸含量。将待测样品发酵上清液的乙酸色谱峰面积代入上述标准曲线中，计算得到待测样品发酵上清液的残留乙酸含量，将接种后初始的乙酸含量减去发酵上清液中的残留乙酸含量得到重组菌消耗的乙酸量。

E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)在摇瓶培养中的L-乳酸产量和乙酸消耗如表1所示：

表1 E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)的L-乳酸产量和乙酸消耗

注：表中数据为三次重复实验所得的均值。

由表1中的结果可以看出，本发明构建的重组菌株E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)能够在添加乙酸为碳源的培养基中，发酵获得L-乳酸，最终L-乳酸产量为2.46g/L，得率为0.40g/g，约为理论得率的53％。

二、对照菌E.coli LA5(pUC19-LA4)的摇瓶培养实验

1、将实施例1中步骤八制备的E.coli LA5(pUC19-LA4)在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。

2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到含有氨苄青霉素的MM液体培养基中，250ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速100rpm条件下培养24h，分别在培养12h和24h收集发酵液。

3、通过高效液相色谱对基因工程菌产生的L-乳酸和消耗的乙酸进行定量检测，具体条件上述步骤一中步骤3所述，E.coli LA5(pUC19-LA4)在摇瓶培养中的L-乳酸产量和乙酸消耗如表2所示：

表2 E.coli LA5(pUC19-LA4)的L-乳酸产量和乙酸消耗

注：表中数据为三次重复实验所得的均值。

与E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)相比，对照菌E.coli LA5(pUC19-LA4)没有过表达乙酸利用相关的acs、pta和ackA基因，尽管E.coli LA5(pUC19-LA4)经过24h发酵的L-乳酸产量为1.69g/L，但L-乳酸产量和乙酸消耗相对E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)较低。由此可见，基因acs、pta和ackA的过表达对于增加细菌的乙酸利用和L-乳酸合成有重要作用。

三、对照菌E.coli LA5(pUC19-LA24)的摇瓶培养实验

1、将实施例1中步骤九制备的E.coli LA5(pUC19-LA24)在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。

2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到含有氨苄青霉素的MM液体培养基中，250ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速100rpm条件下培养24h，分别在培养12h和24h收集发酵液。

3、通过高效液相色谱对基因工程菌产生的L-乳酸和消耗的乙酸进行定量检测，具体条件上述步骤一中步骤3所述，E.coli LA5(pUC19-LA24)在摇瓶培养中的L-乳酸产量和乙酸消耗如表3所示：

表3 E.coli LA5(pUC19-LA24)的L-乳酸产量和乙酸消耗

注：表中数据为三次重复实验所得的均值。与E.coli LA5(pUC19-LA4)相比，对照菌E.coli LA5(pUC19-LA24)没有过表达NAD-依赖型苹果酸酶基因maeA和NADP-依赖型苹果酸酶基因maeB，尽管细菌能够消耗乙酸并生长，但不能够积累L-乳酸作为发酵产物。由此可见，基因maeA和maeB的过表达能够促进三羧酸循环中苹果酸代谢流溢出从而合成丙酮酸，再由L-乳酸脱氢酶催化合成L-乳酸，基因maeA和maeB对于L-乳酸的合成起到关键作用。

<110> 北京化工大学

<120> 利用乙酸生产L-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2036

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagagctctt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60

aaatatacca tgagccaaat tcacaaacac accattcctg ccaacatcgc agaccgttgc 120

ctgataaacc ctcagcagta cgaggcgatg tatcaacaat ctattaacgt acctgatacc 180

ttctggggcg aacagggaaa aattcttgac tggatcaaac cttaccagaa ggtgaaaaac 240

acctcctttg cccccggtaa tgtgtccatt aaatggtacg aggacggcac gctgaatctg 300

gcggcaaact gccttgaccg ccatctgcaa gaaaacggcg atcgtaccgc catcatctgg 360

gaaggcgacg acgccagcca gagcaaacat atcagctata aagagctgca ccgcgacgtc 420

tgccgcttcg ccaataccct gctcgagctg ggcattaaaa aaggtgatgt ggtggcgatt 480

tatatgccga tggtgccgga agccgcggtt gcgatgctgg cctgcgcccg cattggcgcg 540

gtgcattcgg tgattttcgg cggcttctcg ccggaagccg ttgccgggcg cattattgat 600

tccaactcac gactggtgat cacttccgac gaaggtgtgc gtgccgggcg cagtattccg 660

ctgaagaaaa acgttgatga cgcgctgaaa aacccgaacg tcaccagcgt agagcatgtg 720

gtggtactga agcgtactgg cgggaaaatt gactggcagg aagggcgcga cctgtggtgg 780

cacgacctgg ttgagcaagc gagcgatcag caccaggcgg aagagatgaa cgccgaagat 840

ccgctgttta ttctctacac ctccggttct accggtaagc caaaaggtgt gctgcatact 900

accggcggtt atctggtgta cgcggcgctg acctttaaat atgtctttga ttatcatccg 960

ggtgatatct actggtgcac cgccgatgtg ggctgggtga ccggacacag ttacttgctg 1020

tacggcccgc tggcctgcgg tgcgaccacg ctgatgtttg aaggcgtacc caactggccg 1080

acgcctgccc gtatggcgca ggtggtggac aagcatcagg tcaatattct ctataccgca 1140

cccacggcga tccgcgcgct gatggcggaa ggcgataaag cgatcgaagg caccgaccgt 1200

tcgtcgctgc gcattctcgg ttccgtgggc gagccaatta acccggaagc gtgggagtgg 1260

tactggaaaa aaatcggcaa cgagaaatgt ccggtggtcg atacctggtg gcagaccgaa 1320

accggcggtt tcatgatcac cccgctgcct ggcgctaccg agctgaaagc cggttcggca 1380

acacgtccgt tcttcggcgt gcaaccggcg ctggtcgata acgaaggtaa cccgctggag 1440

ggggccaccg aaggtagcct ggtaatcacc gactcctggc cgggtcaggc gcgtacgctg 1500

tttggcgatc acgaacgttt tgaacagacc tacttctcca ccttcaaaaa tatgtatttc 1560

agcggcgacg gcgcgcgtcg cgatgaagat ggctattact ggataaccgg gcgtgtggac 1620

gacgtgctga acgtctccgg tcaccgtctg gggacggcag agattgagtc ggcgctggtg 1680

gcgcatccga agattgccga agccgccgta gtaggtattc cgcacaatat taaaggtcag 1740

gcgatctacg cctacgtcac gcttaatcac ggggaggaac cgtcaccaga actgtacgca 1800

gaagtccgca actgggtgcg taaagagatt ggcccgctgg cgacgccaga cgtgctgcac 1860

tggaccgact ccctgcctaa aacccgctcc ggcaaaatta tgcgccgtat tctgcgcaaa 1920

attgcggcgg gcgataccag caacctgggc gatacctcga cgcttgccga tcctggcgta 1980

gtcgagaagc tgcttgaaga gaagcaggct atcgcgatgc catcgtaatc tagaaa 2036

<210> 2

<211> 3499

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aatctagatt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60

aaatatacca tgtcgagtaa gttagtactg gttctgaact gcggtagttc ttcactgaaa 120

tttgccatca tcgatgcagt aaatggtgaa gagtaccttt ctggtttagc cgaatgtttc 180

cacctgcccg aagcacgtat caaatggaaa atggacggca ataaacagga agcggcttta 240

ggtgcaggcg ccgctcacag cgaagcgctc aactttatcg ttaatactat tctggcacaa 300

aaaccagaac tgtctgcgca gctgactgct atcggtcacc gtatcgtaca cggcggcgaa 360

aagtatacca gctccgtagt gatcgatgag tctgttattc agggtatcaa agatgcagct 420

tcttttgcac cgctgcacaa cccggctcac ctgatcggta tcgaagaagc tctgaaatct 480

ttcccacagc tgaaagacaa aaacgttgct gtatttgaca ccgcgttcca ccagactatg 540

ccggaagagt cttacctcta cgccctgcct tacaacctgt acaaagagca cggcatccgt 600

cgttacggcg cgcacggcac cagccacttc tatgtaaccc aggaagcggc aaaaatgctg 660

aacaaaccgg tagaagaact gaacatcatc acctgccacc tgggcaacgg tggttccgtt 720

tctgctatcc gcaacggtaa atgcgttgac acctctatgg gcctgacccc gctggaaggt 780

ctggtcatgg gtacacgttc tggtgatatc gatccggcga tcatcttcca cctgcacgac 840

accctgggca tgagcgttga cgcaatcaac aaactgctga ccaaagagtc tggcctgctg 900

ggtctgaccg aagtgaccag cgactgccgc tatgttgaag acaactacgc gacgaaagaa 960

gacgcgaagc gcgcaatgga cgtttactgc caccgcctgg cgaaatacat cggtgcctac 1020

actgcgctga tggatggtcg tctggacgct gttgtattca ctggtggtat cggtgaaaat 1080

gccgcaatgg ttcgtgaact gtctctgggc aaactgggcg tgctgggctt tgaagttgat 1140

catgaacgca acctggctgc acgtttcggc aaatctggtt tcatcaacaa agaaggaacc 1200

cgtcctgcgg tggttatccc aaccaacgaa gaactggtta tcgcgcaaga cgcgagccgc 1260

ctgactgcct gatttcacac cgccagctca gctggcggtg ctgttttgta acccgccaaa 1320

tcggcggtaa cgaaagagga taaaccgtgt cccgtattat tatgctgatc cctaccggaa 1380

ccagcgtcgg tctgaccagc gtcagccttg gcgtgatccg tgcaatggaa cgcaaaggcg 1440

ttcgtctgag cgttttcaaa cctatcgctc agccgcgtac cggtggcgat gcgcccgatc 1500

agactacgac tatcgtgcgt gcgaactctt ccaccacgac ggccgctgaa ccgctgaaaa 1560

tgagctacgt tgaaggtctg ctttccagca atcagaaaga tgtgctgatg gaagagatcg 1620

tcgcaaacta ccacgctaac accaaagacg ctgaagtcgt tctggttgaa ggtctggtcc 1680

cgacacgtaa gcaccagttt gcccagtctc tgaactacga aatcgctaaa acgctgaatg 1740

cggaaatcgt cttcgttatg tctcagggca ctgacacccc ggaacagctg aaagagcgta 1800

tcgaactgac ccgcaacagc ttcggcggtg ccaaaaacac caacatcacc ggcgttatcg 1860

ttaacaaact gaacgcaccg gttgatgaac agggtcgtac tcgcccggat ctgtccgaga 1920

ttttcgacga ctcttccaaa gctaaagtaa acaatgttga tccggcgaag ctgcaagaat 1980

ccagcccgct gccggttctc ggcgctgtgc cgtggagctt tgacctgatc gcgactcgtg 2040

cgatcgatat ggctcgccac ctgaatgcga ccatcatcaa cgaaggcgac atcaatactc 2100

gccgcgttaa atccgtcact ttctgcgcac gcagcattcc gcacatgctg gagcacttcc 2160

gtgccggttc tctgctggtg acttccgcag accgtcctga cgtgctggtg gccgcttgcc 2220

tggcagccat gaacggcgta gaaatcggtg ccctgctgct gactggcggt tacgaaatgg 2280

acgcgcgcat ttctaaactg tgcgaacgtg ctttcgctac cggcctgccg gtatttatgg 2340

tgaacaccaa cacctggcag acctctctga gcctgcagag cttcaacctg gaagttccgg 2400

ttgacgatca cgaacgtatc gagaaagttc aggaatacgt tgctaactac atcaacgctg 2460

actggatcga atctctgact gccacttctg agcgcagccg tcgtctgtct ccgcctgcgt 2520

tccgttatca gctgactgaa cttgcgcgca aagcgggcaa acgtatcgta ctgccggaag 2580

gtgacgaacc gcgtaccgtt aaagcagccg ctatctgtgc tgaacgtggt atcgcaactt 2640

gcgtactgct gggtaatccg gcagagatca accgtgttgc agcgtctcag ggtgtagaac 2700

tgggtgcagg gattgaaatc gttgatccag aagtggttcg cgaaagctat gttggtcgtc 2760

tggtcgaact gcgtaagaac aaaggcatga ccgaaaccgt tgcccgcgaa cagctggaag 2820

acaacgtggt gctcggtacg ctgatgctgg aacaggatga agttgatggt ctggtttccg 2880

gtgctgttca cactaccgca aacaccatcc gtccgccgct gcagctgatc aaaactgcac 2940

cgggcagctc cctggtatct tccgtgttct tcatgctgct gccggaacag gtttacgttt 3000

acggtgactg tgcgatcaac ccggatccga ccgctgaaca gctggcagaa atcgcgattc 3060

agtccgctga ttccgctgcg gccttcggta tcgaaccgcg cgttgctatg ctctcctact 3120

ccaccggtac ttctggtgca ggtagcgacg tagaaaaagt tcgcgaagca actcgtctgg 3180

cgcaggaaaa acgtcctgac ctgatgatcg acggtccgct gcagtacgac gctgcggtaa 3240

tggctgacgt tgcgaaatcc aaagcgccga actctccggt tgcaggtcgc gctaccgtgt 3300

tcatcttccc ggatctgaac accggtaaca ccacctacaa agcggtacag cgttctgccg 3360

acctgatctc catcgggccg atgctgcagg gtatgcgcaa gccggttaac gacctgtccc 3420

gtggcgcact ggttgacgat atcgtctaca ccatcgcgct gactgcgatt cagtctgcac 3480

agcagcagta agaattctt 3499

<210> 3

<211> 3189

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagagctctt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60

aaatatacca tgaaaacccg tacacaacaa attgaagaat tacagaaaga gtggactcaa 120

ccgcgttggg aaggcattac tcgcccatac agtgcggaag atgtggtgaa attacgcggt 180

tcagtcaatc ctgaatgcac gctggcgcaa ctgggcgcag cgaaaatgtg gcgtctgctg 240

cacggtgagt cgaaaaaagg ctacatcaac agcctcggcg cactgactgg cggtcaggcg 300

ctgcaacagg cgaaagcggg tattgaagca gtctatctgt cgggatggca ggtagcggcg 360

gacgctaacc tggcggccag catgtatccg gatcagtcgc tctatccggc aaactcggtg 420

ccagctgtgg tggagcggat caacaacacc ttccgtcgtg ccgatcagat ccaatggtcc 480

gcgggcattg agccgggcga tccgcgctat gtcgattact tcctgccgat cgttgccgat 540

gcggaagccg gttttggcgg tgtcctgaat gcctttgaac tgatgaaagc gatgattgaa 600

gccggtgcag cggcagttca cttcgaagat cagctggcgt cagtgaagaa atgcggtcac 660

atgggcggca aagttttagt gccaactcag gaagctattc agaaactggt cgcggcgcgt 720

ctggcagctg acgtgacggg cgttccaacc ctgctggttg cccgtaccga tgctgatgcg 780

gcggatctga tcacctccga ttgcgacccg tatgacagcg aatttattac cggcgagcgt 840

accagtgaag gcttcttccg tactcatgcg ggcattgagc aagcgatcag ccgtggcctg 900

gcgtatgcgc catatgctga cctggtctgg tgtgaaacct ccacgccgga tctggaactg 960

gcgcgtcgct ttgcacaagc tatccacgcg aaatatccgg gcaaactgct ggcttataac 1020

tgctcgccgt cgttcaactg gcagaaaaac ctcgacgaca aaactattgc cagcttccag 1080

cagcagctgt cggatatggg ctacaagttc cagttcatca ccctggcagg tatccacagc 1140

atgtggttca acatgtttga cctggcaaac gcctatgccc agggcgaggg tatgaagcac 1200

tacgttgaga aagtgcagca gccggaattt gccgccgcga aagatggcta taccttcgta 1260

tctcaccagc aggaagtggg tacaggttac ttcgataaag tgacgactat tattcagggc 1320

ggcacgtctt cagtcaccgc gctgaccggc tccactgaag aatcgcagtt ctaattgaca 1380

gctagctcag tcctaggtat aatgctagct actagagaaa gaggagaaat ataccatgcc 1440

gcgtggcctg gaattattga ttgctcaaac cattttgcaa ggcttcgatg ctcagtatgg 1500

tcgattcctc gaagtgacct ccggtgcgca gcagcgtttc gaacaggccg actggcatgc 1560

tgtccagcag gcgatgaaaa accgtatcca tctttacgat catcacgttg gtctggtcgt 1620

ggagcaactg cgctgcatta ctaacggcca aagtacggac gcggcatttt tactacgtgt 1680

taaagagcat tacacccggc tgttgccgga ttacccgcgc ttcgagattg cggagagctt 1740

ttttaactcc gtgtactgtc ggttatttga ccaccgctcg cttactcccg agcggctttt 1800

tatctttagc tctcagccag agcgccgctt tcgtaccatt ccccgcccgc tggcgaaaga 1860

ctttcacccc gatcacggct gggaatctct actgatgcgc gttatcagcg acctaccgct 1920

gcgcctgcgc tggcagaata aaagccgtga catccattac attattcgcc atctgacgga 1980

aacgctgggg acagacaacc tcgcggaaag tcatttacag gtggcgaacg aactgtttta 2040

ccgcaataaa gccgcctggc tggtaggcaa actgatcaca ccttccggca cattgccatt 2100

tttgctgccg atccaccaga cggacgacgg cgagttattt attgatacct gcctgacgac 2160

gaccgccgaa gcgagcattg tttttggctt tgcgcgttct tattttatgg tttatgcgcc 2220

gctgcccgca gcgctggtcg agtggctacg ggaaattctg ccaggtaaaa ccaccgctga 2280

attgtatatg gctatcggct gccagaagca cgccaaaacc gaaagctacc gcgaatatct 2340

cgtttatcta cagggctgta atgagcagtt cattgaagcg ccgggtattc gtggaatggt 2400

gatgttggtg tttacgctgc cgggctttga tcgggtattc aaagtcatca aagacaggtt 2460

cgcgccgcag aaagagatgt ctgccgctca cgttcgtgcc tgctatcaac tggtgaaaga 2520

gcacgatcgc gtgggccgaa tggcggacac ccaggagttt gaaaactttg tgctggagaa 2580

gcggcatatt tccccggcat taatggaatt actgcttcag gaagcagcgg aaaaaatcac 2640

cgatctcggc gaacaaattg tgattcgcca tctttatatt gagcggcgga tggtgccgct 2700

caatatctgg ctggaacaag tggaaggtca gcagttgcgc gacgccattg aagaatacgg 2760

taacgctatt cgccagcttg ccgctgctaa cattttccct ggcgacatgc tgtttaaaaa 2820

cttcggtgtc acccgtcacg ggcgtgtggt tttttatgat tacgatgaaa tttgctacat 2880

gacggaagtg aatttccgcg acatcccgcc gccgcgctat ccggaagacg aacttgccag 2940

cgaaccgtgg tacagcgtct cgccgggcga tgttttcccg gaagagtttc gccactggct 3000

atgcgccgac ccgcgtattg gtccgctgtt tgaagagatg cacgccgacc tgttccgcgc 3060

tgattactgg cgcgcactac aaaaccgcat acgtgaaggg catgtggaag atgtttatgc 3120

gtatcggcgc aggcaaagat ttagcgtacg gtatggggag atgctttttt gaactagtaa 3180

aggtaccaa 3189

<210> 4

<211> 1688

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaactagttt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60

aaatatacca tgactgaaca ggcaacaaca accgatgaac tggctttcac aaggccgtat 120

ggcgagcagg agaagcaaat tcttactgcc gaagcggtag aatttctgac tgagctggtg 180

acgcatttta cgccacaacg caataaactt ctggcagcgc gcattcagca gcagcaagat 240

attgataacg gaacgttgcc tgattttatt tcggaaacag cttccattcg cgatgctgat 300

tggaaaattc gcgggattcc tgcggactta gaagaccgcc gcgtagagat aactggcccg 360

gtagagcgca agatggtgat caacgcgctc aacgccaatg tgaaagtctt tatggccgat 420

ttcgaagatt cactggcacc agactggaac aaagtgatcg acgggcaaat taacctgcgt 480

gatgcggtta acggcaccat cagttacacc aatgaagcag gcaaaattta ccagctcaag 540

cccaatccag cggttttgat ttgtcgggta cgcggtctgc acttgccgga aaaacatgtc 600

acctggcgtg gtgaggcaat ccccggcagc ctgtttgatt ttgcgctcta tttcttccac 660

aactatcagg cactgttggc aaagggcagt ggtccctatt tctatctgcc gaaaacccag 720

tcctggcagg aagcggcctg gtggagcgaa gtcttcagct atgcagaaga tcgctttaat 780

ctgccgcgcg gcaccatcaa ggcgacgttg ctgattgaaa cgctgcccgc cgtgttccag 840

atggatgaaa tccttcacgc gctgcgtgac catattgttg gtctgaactg cggtcgttgg 900

gattacatct tcagctatat caaaacgttg aaaaactatc ccgatcgcgt cctgccagac 960

agacaggcag tgacgatgga taaaccattc ctgaatgctt actcacgcct gttgattaaa 1020

acctgccata aacgcggtgc ttttgcgatg ggcggcatgg cggcgtttat tccgagcaaa 1080

gatgaagagc acaataacca ggtgctcaac aaagtaaaag cggataaatc gctggaagcc 1140

aataacggtc acgatggcac atggatcgct cacccaggcc ttgcggacac ggcaatggcg 1200

gtattcaacg acattctcgg ctcccgtaaa aatcagcttg aagtgatgcg cgaacaagac 1260

gcgccgatta ctgccgatca gctgctggca ccttgtgatg gtgaacgcac cgaagaaggt 1320

atgcgcgcca acattcgcgt ggctgtgcag tacatcgaag cgtggatctc tggcaacggc 1380

tgtgtgccga tttatggcct gatggaagat gcggcgacgg ctgaaatttc ccgtacctcg 1440

atctggcagt ggatccatca tcaaaaaacg ttgagcaatg gcaaaccggt gaccaaagcc 1500

ttgttccgcc agatgctggg cgaagagatg aaagtcattg ccagcgaact gggcgaagaa 1560

cgtttctccc aggggcgttt tgacgatgcc gcacgcttga tggaacagat caccacttcc 1620

gatgagttaa ttgatttcct gaccctgcca ggctaccgcc tgttagcgta actcgagaaa 1680

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<210> 5

<211> 4078

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aactcgagtt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60

aaatatacca tggaaccaaa aacaaaaaaa cagcgttcgc tttatatccc ttacgctggc 120

cctgtactgc tggaatttcc gttgttgaat aaaggcagtg ccttcagcat ggaagaacgc 180

cgtaacttca acctgctggg gttactgccg gaagtggtcg aaaccatcga agaacaagcg 240

gaacgagcat ggatccagta tcagggattc aaaaccgaaa tcgacaaaca catctacctg 300

cgtaacatcc aggacactaa cgaaaccctc ttctaccgtc tggtaaacaa tcatcttgat 360

gagatgatgc ctgttattta taccccaacc gtcggcgcag cctgtgagcg tttttctgag 420

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attctgcaaa acgtgccgaa ccataatatt aaagtgattg tggtgactga cggtgaacgc 540

attctggggc ttggtgacca gggcatcggc gggatgggca ttccgatcgg taaactgtcg 600

ctctataccg cctgtggcgg catcagcccg gcgtataccc ttccggtggt gctggatgtc 660

ggaacgaaca accaacagct gcttaacgat ccgctgtata tgggctggcg taatccgcgt 720

atcactgacg acgaatacta tgaattcgtt gatgaattta tccaggctgt gaaacaacgc 780

tggccagacg tgctgttgca gtttgaagac tttgctcaaa aaaatgcgat gccgttactt 840

aaccgctatc gcaatgaaat ttgttctttt aacgatgaca ttcagggcac tgcggcggta 900

acagtcggca cactgatcgc agcaagccgc gcggcaggtg gtcagttaag cgagaaaaaa 960

atcgtcttcc ttggcgcagg ttcagcggga tgcggcattg ccgaaatgat catctcccag 1020

acccagcgcg aaggattaag cgaggaagcg gcgcggcaga aagtctttat ggtcgatcgc 1080

tttggcttgc tgactgacaa gatgccgaac ctgctgcctt tccagaccaa actggtgcag 1140

aagcgcgaaa acctcagtga ctgggatacc gacagcgatg tgctgtcact gctggatgtg 1200

gtgcgcaatg taaaaccaga tattctgatt ggcgtctcag gacagaccgg gctgtttacg 1260

gaagagatca tccgtgagat gcataaacac tgtccgcgtc cgatcgtgat gccgctgtct 1320

aacccgacgt cacgcgtgga agccacaccg caggacatta tcgcctggac cgaaggtaac 1380

gcgctggtcg ccacgggcag cccgtttaat ccagtggtat ggaaagataa aatctaccct 1440

atcgcccagt gtaacaacgc ctttattttc ccgggcatcg gcctgggtgt tattgcttcc 1500

ggcgcgtcac gtatcaccga tgagatgctg atgtcggcaa gtgaaacgct ggcgcagtat 1560

tcaccattgg tgctgaacgg cgaaggtatg gtactgccgg aactgaaaga tattcagaaa 1620

gtctcccgcg caattgcgtt tgcggttggc aaaatggcgc agcagcaagg cgtggcggtg 1680

aaaacctctg ccgaagccct gcaacaggcc attgacgata atttctggca agccgaatac 1740

cgcgactacc gccgtacctc catctaatag agaaagagga gaaatatacc atggatgacc 1800

agttaaaaca aagtgcactt gatttccatg aatttccagt tccagggaaa atccaggttt 1860

ctccaaccaa gcctctggca acacagcgcg atctggcgct ggcctactca ccaggcgttg 1920

ccgcaccttg tcttgaaatc gaaaaagacc cgttaaaagc ctacaaatat accgcccgag 1980

gtaacctggt ggcggtgatc tctaacggta cggcggtgct ggggttaggc aacattggcg 2040

cgctggcagg caaaccggtg atggaaggca agggcgttct gtttaagaaa ttcgccggga 2100

ttgatgtatt tgacattgaa gttgacgaac tcgacccgga caaatttatt gaagttgtcg 2160

ccgcgctcga accaaccttc ggcggcatca acctcgaaga cattaaagcg ccagaatgtt 2220

tctatattga acagaaactg cgcgagcgga tgaatattcc ggtattccac gacgatcagc 2280

acggcacggc aattatcagc actgccgcca tcctcaacgg cttgcgcgtg gtggagaaaa 2340

acatctccga cgtgcggatg gtggtttccg gcgcgggtgc cgcagcaatc gcctgtatga 2400

acctgctggt agcgctgggt ctgcaaaaac ataacatcgt ggtttgcgat tcaaaaggcg 2460

ttatctatca gggccgtgag ccaaacatgg cggaaaccaa agccgcatat gcggtggtgg 2520

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ccggcccgaa agtgctgacc caggaaatgg tgaagaaaat ggctcgtgcg ccaatgatcc 2640

tggcgctggc gaacccggaa ccggaaattc tgccgccgct ggcgaaagaa gtgcgtccgg 2700

atgccatcat ttgcaccggt cgttctgact atccgaacca ggtgaacaac gtcctgtgct 2760

tcccgttcat cttccgtggc gcgctggacg ttggcgcaac cgccatcaac gaagagatga 2820

aactggcggc ggtacgtgcg attgcagaac tcgcccatgc ggaacagagc gaagtggtgg 2880

cttcagcgta tggcgatcag gatctgagct ttggtccgga atacatcatt ccaaaaccgt 2940

ttgatccgcg cttgatcgtt aagatcgctc ctgcggtcgc taaagccgcg atggagtcgg 3000

gcgtggcgac tcgtccgatt gctgatttcg acgtctacat cgacaagctg actgagttcg 3060

tttacaaaac caacctgttt atgaagccga ttttctccca ggctcgcaaa gcgccgaagc 3120

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cgctgggact ggcgaaaccg atccttatcg gtcgtccgaa cgtgatcgaa atgcgcattc 3240

agaaactggg cttgcagatc aaagcgggcg ttgattttga gatcgtcaat aacgaatccg 3300

atccgcgctt taaagagtac tggaccgaat acttccagat catgaagcgt cgcggcgtca 3360

ctcaggaaca ggcgcagcgg gcgctgatca gtaacccgac agtgatcggc gcgatcatgg 3420

ttcagcgtgg ggaagccgat gcaatgattt gcggtacggt gggtgattat catgaacatt 3480

ttagcgtggt gaaaaatgtc tttggttatc gcgatggcgt tcacaccgca ggtgccatga 3540

acgcgctgct gctgccgagt ggtaacacct ttattgccga tacatatgtt aatgatgaac 3600

cggatgcaga agagctggcg gagatcacct tgatggcggc agaaactgtc cgtcgttttg 3660

gtattgagcc gcgcgttgct ttgttgtcgc actccaactt tggttcttct gactgcccgt 3720

cgtcgagcaa aatgcgtcag gcgctggaac tggtcaggga acgtgcacca gaactgatga 3780

ttgatggtga aatgcacggc gatgcagcgc tggtggaagc gattcgcaac gaccgtatgc 3840

cggacagctc tttgaaaggt tccgccaata ttctggtgat gccgaacatg gaagctgccc 3900

gcattagtta caacttactg cgtgtttcca gctcggaagg tgtgactgtc ggcccggtgc 3960

tgatgggtgt ggcgaaaccg gttcacgtgt taacgccgat cgcatcggtg cgtcgtatcg 4020

tcaacatggt ggcgctggcc gtggtagaag cgcaaaccca accgctgtaa ggtaccaa 4078

<210> 6

<211> 1058

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaggtacctt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60

aaatatacca tggcaagtat tacggataag gatcaccaaa aagttattct cgttggtgat 120

ggcgccgttg gttcaagcta tgcctatgca atggttttgc aaggtatcgc tcaagaaatc 180

gggattgttg acattttcaa ggacaagacg aaaggtgacg caattgattt aagcaacgcg 240

ctcccattca ccagtcctaa gaagatttat tctgctgaat acagcgatgc caaggatgct 300

gatctggttg ttatcactgc tggtgctcct caaaagcctg gcgaaactcg cttggatctg 360

gttaacaaga acttgaagat tttgaagtcc attgttgatc cgatcgtgga ttctggcttt 420

aacggtatct tcttggttgc tgctaaccca gttgatatct tgacttatgc tacttggaag 480

ctttccggat tcccgaagag ccgggttgtt ggttcaggta cttctctgga caccgctcgt 540

ttccgtcaat ccattgctga aatggttaac gttgatgctc gttccgtcca cgcatatatc 600

atgggtgaac acggcgacac agaattccct gtatggtccc acgctaacat tggtggcgtt 660

accatcgctg aatgggttaa agcacatcca gaaatcaaag aagacaaact tgttaagatg 720

tttgaagacg ttcgtgacgc tgcttacgaa atcatcaaac tcaagggtgc aaccttctac 780

ggtatcgcaa ctgctttggc acggatttcc aaagcaattc ttaacgatga aaatgcggta 840

ctcccattgt ccgtttacat ggacggccaa tatggcttga acgacatcta cattggtaca 900

cctgctgtga tcaaccgcaa tggtattcag aacattctgg aaatcccatt gaccgaccac 960

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gctaagaacg acatcgaaac acgtcagtaa tctagaaa 1058

<210> 7

<211> 1424

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgtcagaac gtttcccaaa tgacgtggat ccgatcgaaa ctcgcgactg gctccaggcg 60

gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120

ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 180

tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 240

agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 300

agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 360

caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 420

gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 480

agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 540

gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 600

ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 660

agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 720

gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg 780

tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 840

gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 900

ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct 960

tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt 1020

actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt 1080

gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 1140

tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg 1200

ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg 1260

cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct 1320

agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg gaatgcccgt ttcattacca 1380

tcattaacaa cacgctgtct gacattcgcc gtctggtgat gtaa 1424

<210> 8

<211> 1424

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgaaacaaa cggttgcagc ttatatcgcc aaaacactcg aatcggcagg ggtgaaacgc 60

gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120

ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 180

tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 240

agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 300

agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 360

caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 420

gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 480

agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 540

gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 600

ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 660

agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 720

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tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 840

gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 900

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tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt 1020

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gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 1140

tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg 1200

ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg 1260

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<210> 9

<211> 1424

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

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gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120

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agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 360

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agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 540

gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 600

ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 660

agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 720

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tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 840

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tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt 1020

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<210> 10

<211> 1424

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60

gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120

ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 180

tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 240

agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 300

agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 360

caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 420

gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 480

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gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 600

ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 660

agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 720

gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg 780

tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 840

gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 900

ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct 960

tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt 1020

actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt 1080

gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 1140

tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg 1200

ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg 1260

cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct 1320

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gcaatctgga aaaaggcgaa acctgcccga acgaactggt ttaa 1424

<210> 11

<211> 1424

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgattattt ccgcagccag cgattatcgc gccgcagcgc aacgcattct gccgccgttc 60

gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120

ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 180

tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 240

agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 300

agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 360

caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 420

gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 480

agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 540

gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 600

ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 660

agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 720

gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg 780

tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 840

gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 900

ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct 960

tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt 1020

actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt 1080

gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 1140

tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg 1200

ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg 1260

cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct 1320

agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg gaatgggctg ggtaaagagt 1380

tgcctgcggc actggctccc atggcgaaag ggaatgcggc atag 1424

<210> 12

<211> 652

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

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Val Ile Phe Gly Gly Phe Ser Pro Glu Ala Val Ala Gly Arg Ile Ile

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Asp Ser Asn Ser Arg Leu Val Ile Thr Ser Asp Glu Gly Val Arg Ala

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Asp Lys Ala Ile Glu Gly Thr Asp Arg Ser Ser Leu Arg Ile Leu Gly

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<210> 13

<211> 400

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Met Ser Ser Lys Leu Val Leu Val Leu Asn Cys Gly Ser Ser Ser Leu

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Leu Ala Glu Cys Phe His Leu Pro Glu Ala Arg Ile Lys Trp Lys Met

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Asp Gly Asn Lys Gln Glu Ala Ala Leu Gly Ala Gly Ala Ala His Ser

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Glu Ala Leu Asn Phe Ile Val Asn Thr Ile Leu Ala Gln Lys Pro Glu

65 70 75 80

Leu Ser Ala Gln Leu Thr Ala Ile Gly His Arg Ile Val His Gly Gly

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Ile Lys Asp Ala Ala Ser Phe Ala Pro Leu His Asn Pro Ala His Leu

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Ile Gly Ile Glu Glu Ala Leu Lys Ser Phe Pro Gln Leu Lys Asp Lys

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Ala Ala Lys Met Leu Asn Lys Pro Val Glu Glu Leu Asn Ile Ile Thr

195 200 205

Cys His Leu Gly Asn Gly Gly Ser Val Ser Ala Ile Arg Asn Gly Lys

210 215 220

Cys Val Asp Thr Ser Met Gly Leu Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met

225 230 235 240

Gly Thr Arg Ser Gly Asp Ile Asp Pro Ala Ile Ile Phe His Leu His

245 250 255

Asp Thr Leu Gly Met Ser Val Asp Ala Ile Asn Lys Leu Leu Thr Lys

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Glu Ser Gly Leu Leu Gly Leu Thr Glu Val Thr Ser Asp Cys Arg Tyr

275 280 285

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Val Tyr Cys His Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Thr Ala Leu

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Met Asp Gly Arg Leu Asp Ala Val Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Glu

325 330 335

Asn Ala Ala Met Val Arg Glu Leu Ser Leu Gly Lys Leu Gly Val Leu

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Gly Phe Glu Val Asp His Glu Arg Asn Leu Ala Ala Arg Phe Gly Lys

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<210> 14

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Val Ser Arg Ile Ile Met Leu Ile Pro Thr Gly Thr Ser Val Gly Leu

1 5 10 15

Thr Ser Val Ser Leu Gly Val Ile Arg Ala Met Glu Arg Lys Gly Val

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Arg Leu Ser Val Phe Lys Pro Ile Ala Gln Pro Arg Thr Gly Gly Asp

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Thr Ala Ala Glu Pro Leu Lys Met Ser Tyr Val Glu Gly Leu Leu Ser

65 70 75 80

Ser Asn Gln Lys Asp Val Leu Met Glu Glu Ile Val Ala Asn Tyr His

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Gly Ala Lys Asn Thr Asn Ile Thr Gly Val Ile Val Asn Lys Leu Asn

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Ala Pro Val Asp Glu Gln Gly Arg Thr Arg Pro Asp Leu Ser Glu Ile

180 185 190

Phe Asp Asp Ser Ser Lys Ala Lys Val Asn Asn Val Asp Pro Ala Lys

195 200 205

Leu Gln Glu Ser Ser Pro Leu Pro Val Leu Gly Ala Val Pro Trp Ser

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Phe Asp Leu Ile Ala Thr Arg Ala Ile Asp Met Ala Arg His Leu Asn

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Ala Thr Ile Ile Asn Glu Gly Asp Ile Asn Thr Arg Arg Val Lys Ser

245 250 255

Val Thr Phe Cys Ala Arg Ser Ile Pro His Met Leu Glu His Phe Arg

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Ala Gly Ser Leu Leu Val Thr Ser Ala Asp Arg Pro Asp Val Leu Val

275 280 285

Ala Ala Cys Leu Ala Ala Met Asn Gly Val Glu Ile Gly Ala Leu Leu

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Leu Thr Gly Gly Tyr Glu Met Asp Ala Arg Ile Ser Lys Leu Cys Glu

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Arg Ala Phe Ala Thr Gly Leu Pro Val Phe Met Val Asn Thr Asn Thr

325 330 335

Trp Gln Thr Ser Leu Ser Leu Gln Ser Phe Asn Leu Glu Val Pro Val

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Asp Asp His Glu Arg Ile Glu Lys Val Gln Glu Tyr Val Ala Asn Tyr

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Ile Asn Ala Asp Trp Ile Glu Ser Leu Thr Ala Thr Ser Glu Arg Ser

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Arg Arg Leu Ser Pro Pro Ala Phe Arg Tyr Gln Leu Thr Glu Leu Ala

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Arg Lys Ala Gly Lys Arg Ile Val Leu Pro Glu Gly Asp Glu Pro Arg

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Thr Val Lys Ala Ala Ala Ile Cys Ala Glu Arg Gly Ile Ala Thr Cys

420 425 430

Val Leu Leu Gly Asn Pro Ala Glu Ile Asn Arg Val Ala Ala Ser Gln

435 440 445

Gly Val Glu Leu Gly Ala Gly Ile Glu Ile Val Asp Pro Glu Val Val

450 455 460

Arg Glu Ser Tyr Val Gly Arg Leu Val Glu Leu Arg Lys Asn Lys Gly

465 470 475 480

Met Thr Glu Thr Val Ala Arg Glu Gln Leu Glu Asp Asn Val Val Leu

485 490 495

Gly Thr Leu Met Leu Glu Gln Asp Glu Val Asp Gly Leu Val Ser Gly

500 505 510

Ala Val His Thr Thr Ala Asn Thr Ile Arg Pro Pro Leu Gln Leu Ile

515 520 525

Lys Thr Ala Pro Gly Ser Ser Leu Val Ser Ser Val Phe Phe Met Leu

530 535 540

Leu Pro Glu Gln Val Tyr Val Tyr Gly Asp Cys Ala Ile Asn Pro Asp

545 550 555 560

Pro Thr Ala Glu Gln Leu Ala Glu Ile Ala Ile Gln Ser Ala Asp Ser

565 570 575

Ala Ala Ala Phe Gly Ile Glu Pro Arg Val Ala Met Leu Ser Tyr Ser

580 585 590

Thr Gly Thr Ser Gly Ala Gly Ser Asp Val Glu Lys Val Arg Glu Ala

595 600 605

Thr Arg Leu Ala Gln Glu Lys Arg Pro Asp Leu Met Ile Asp Gly Pro

610 615 620

Leu Gln Tyr Asp Ala Ala Val Met Ala Asp Val Ala Lys Ser Lys Ala

625 630 635 640

Pro Asn Ser Pro Val Ala Gly Arg Ala Thr Val Phe Ile Phe Pro Asp

645 650 655

Leu Asn Thr Gly Asn Thr Thr Tyr Lys Ala Val Gln Arg Ser Ala Asp

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Leu Ile Ser Ile Gly Pro Met Leu Gln Gly Met Arg Lys Pro Val Asn

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<210> 15

<211> 434

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Met Lys Thr Arg Thr Gln Gln Ile Glu Glu Leu Gln Lys Glu Trp Thr

1 5 10 15

Gln Pro Arg Trp Glu Gly Ile Thr Arg Pro Tyr Ser Ala Glu Asp Val

20 25 30

Val Lys Leu Arg Gly Ser Val Asn Pro Glu Cys Thr Leu Ala Gln Leu

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Gly Ala Ala Lys Met Trp Arg Leu Leu His Gly Glu Ser Lys Lys Gly

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Tyr Ile Asn Ser Leu Gly Ala Leu Thr Gly Gly Gln Ala Leu Gln Gln

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Ala Lys Ala Gly Ile Glu Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln Val Ala

85 90 95

Ala Asp Ala Asn Leu Ala Ala Ser Met Tyr Pro Asp Gln Ser Leu Tyr

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Pro Ala Asn Ser Val Pro Ala Val Val Glu Arg Ile Asn Asn Thr Phe

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Arg Arg Ala Asp Gln Ile Gln Trp Ser Ala Gly Ile Glu Pro Gly Asp

130 135 140

Pro Arg Tyr Val Asp Tyr Phe Leu Pro Ile Val Ala Asp Ala Glu Ala

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Gly Phe Gly Gly Val Leu Asn Ala Phe Glu Leu Met Lys Ala Met Ile

165 170 175

Glu Ala Gly Ala Ala Ala Val His Phe Glu Asp Gln Leu Ala Ser Val

180 185 190

Lys Lys Cys Gly His Met Gly Gly Lys Val Leu Val Pro Thr Gln Glu

195 200 205

Ala Ile Gln Lys Leu Val Ala Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Thr Gly

210 215 220

Val Pro Thr Leu Leu Val Ala Arg Thr Asp Ala Asp Ala Ala Asp Leu

225 230 235 240

Ile Thr Ser Asp Cys Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Phe Ile Thr Gly Glu

245 250 255

Arg Thr Ser Glu Gly Phe Phe Arg Thr His Ala Gly Ile Glu Gln Ala

260 265 270

Ile Ser Arg Gly Leu Ala Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Val Trp Cys

275 280 285

Glu Thr Ser Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Arg Arg Phe Ala Gln Ala

290 295 300

Ile His Ala Lys Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Ala Tyr Asn Cys Ser Pro

305 310 315 320

Ser Phe Asn Trp Gln Lys Asn Leu Asp Asp Lys Thr Ile Ala Ser Phe

325 330 335

Gln Gln Gln Leu Ser Asp Met Gly Tyr Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu

340 345 350

Ala Gly Ile His Ser Met Trp Phe Asn Met Phe Asp Leu Ala Asn Ala

355 360 365

Tyr Ala Gln Gly Glu Gly Met Lys His Tyr Val Glu Lys Val Gln Gln

370 375 380

Pro Glu Phe Ala Ala Ala Lys Asp Gly Tyr Thr Phe Val Ser His Gln

385 390 395 400

Gln Glu Val Gly Thr Gly Tyr Phe Asp Lys Val Thr Thr Ile Ile Gln

405 410 415

Gly Gly Thr Ser Ser Val Thr Ala Leu Thr Gly Ser Thr Glu Glu Ser

420 425 430

Gln Phe

<210> 16

<211> 578

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Met Pro Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Ala Gln Thr Ile Leu Gln Gly

1 5 10 15

Phe Asp Ala Gln Tyr Gly Arg Phe Leu Glu Val Thr Ser Gly Ala Gln

20 25 30

Gln Arg Phe Glu Gln Ala Asp Trp His Ala Val Gln Gln Ala Met Lys

35 40 45

Asn Arg Ile His Leu Tyr Asp His His Val Gly Leu Val Val Glu Gln

50 55 60

Leu Arg Cys Ile Thr Asn Gly Gln Ser Thr Asp Ala Ala Phe Leu Leu

65 70 75 80

Arg Val Lys Glu His Tyr Thr Arg Leu Leu Pro Asp Tyr Pro Arg Phe

85 90 95

Glu Ile Ala Glu Ser Phe Phe Asn Ser Val Tyr Cys Arg Leu Phe Asp

100 105 110

His Arg Ser Leu Thr Pro Glu Arg Leu Phe Ile Phe Ser Ser Gln Pro

115 120 125

Glu Arg Arg Phe Arg Thr Ile Pro Arg Pro Leu Ala Lys Asp Phe His

130 135 140

Pro Asp His Gly Trp Glu Ser Leu Leu Met Arg Val Ile Ser Asp Leu

145 150 155 160

Pro Leu Arg Leu Arg Trp Gln Asn Lys Ser Arg Asp Ile His Tyr Ile

165 170 175

Ile Arg His Leu Thr Glu Thr Leu Gly Thr Asp Asn Leu Ala Glu Ser

180 185 190

His Leu Gln Val Ala Asn Glu Leu Phe Tyr Arg Asn Lys Ala Ala Trp

195 200 205

Leu Val Gly Lys Leu Ile Thr Pro Ser Gly Thr Leu Pro Phe Leu Leu

210 215 220

Pro Ile His Gln Thr Asp Asp Gly Glu Leu Phe Ile Asp Thr Cys Leu

225 230 235 240

Thr Thr Thr Ala Glu Ala Ser Ile Val Phe Gly Phe Ala Arg Ser Tyr

245 250 255

Phe Met Val Tyr Ala Pro Leu Pro Ala Ala Leu Val Glu Trp Leu Arg

260 265 270

Glu Ile Leu Pro Gly Lys Thr Thr Ala Glu Leu Tyr Met Ala Ile Gly

275 280 285

Cys Gln Lys His Ala Lys Thr Glu Ser Tyr Arg Glu Tyr Leu Val Tyr

290 295 300

Leu Gln Gly Cys Asn Glu Gln Phe Ile Glu Ala Pro Gly Ile Arg Gly

305 310 315 320

Met Val Met Leu Val Phe Thr Leu Pro Gly Phe Asp Arg Val Phe Lys

325 330 335

Val Ile Lys Asp Arg Phe Ala Pro Gln Lys Glu Met Ser Ala Ala His

340 345 350

Val Arg Ala Cys Tyr Gln Leu Val Lys Glu His Asp Arg Val Gly Arg

355 360 365

Met Ala Asp Thr Gln Glu Phe Glu Asn Phe Val Leu Glu Lys Arg His

370 375 380

Ile Ser Pro Ala Leu Met Glu Leu Leu Leu Gln Glu Ala Ala Glu Lys

385 390 395 400

Ile Thr Asp Leu Gly Glu Gln Ile Val Ile Arg His Leu Tyr Ile Glu

405 410 415

Arg Arg Met Val Pro Leu Asn Ile Trp Leu Glu Gln Val Glu Gly Gln

420 425 430

Gln Leu Arg Asp Ala Ile Glu Glu Tyr Gly Asn Ala Ile Arg Gln Leu

435 440 445

Ala Ala Ala Asn Ile Phe Pro Gly Asp Met Leu Phe Lys Asn Phe Gly

450 455 460

Val Thr Arg His Gly Arg Val Val Phe Tyr Asp Tyr Asp Glu Ile Cys

465 470 475 480

Tyr Met Thr Glu Val Asn Phe Arg Asp Ile Pro Pro Pro Arg Tyr Pro

485 490 495

Glu Asp Glu Leu Ala Ser Glu Pro Trp Tyr Ser Val Ser Pro Gly Asp

500 505 510

Val Phe Pro Glu Glu Phe Arg His Trp Leu Cys Ala Asp Pro Arg Ile

515 520 525

Gly Pro Leu Phe Glu Glu Met His Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Tyr

530 535 540

Trp Arg Ala Leu Gln Asn Arg Ile Arg Glu Gly His Val Glu Asp Val

545 550 555 560

Tyr Ala Tyr Arg Arg Arg Gln Arg Phe Ser Val Arg Tyr Gly Glu Met

565 570 575

Leu Phe

<210> 17

<211> 533

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Met Thr Glu Gln Ala Thr Thr Thr Asp Glu Leu Ala Phe Thr Arg Pro

1 5 10 15

Tyr Gly Glu Gln Glu Lys Gln Ile Leu Thr Ala Glu Ala Val Glu Phe

20 25 30

Leu Thr Glu Leu Val Thr His Phe Thr Pro Gln Arg Asn Lys Leu Leu

35 40 45

Ala Ala Arg Ile Gln Gln Gln Gln Asp Ile Asp Asn Gly Thr Leu Pro

50 55 60

Asp Phe Ile Ser Glu Thr Ala Ser Ile Arg Asp Ala Asp Trp Lys Ile

65 70 75 80

Arg Gly Ile Pro Ala Asp Leu Glu Asp Arg Arg Val Glu Ile Thr Gly

85 90 95

Pro Val Glu Arg Lys Met Val Ile Asn Ala Leu Asn Ala Asn Val Lys

100 105 110

Val Phe Met Ala Asp Phe Glu Asp Ser Leu Ala Pro Asp Trp Asn Lys

115 120 125

Val Ile Asp Gly Gln Ile Asn Leu Arg Asp Ala Val Asn Gly Thr Ile

130 135 140

Ser Tyr Thr Asn Glu Ala Gly Lys Ile Tyr Gln Leu Lys Pro Asn Pro

145 150 155 160

Ala Val Leu Ile Cys Arg Val Arg Gly Leu His Leu Pro Glu Lys His

165 170 175

Val Thr Trp Arg Gly Glu Ala Ile Pro Gly Ser Leu Phe Asp Phe Ala

180 185 190

Leu Tyr Phe Phe His Asn Tyr Gln Ala Leu Leu Ala Lys Gly Ser Gly

195 200 205

Pro Tyr Phe Tyr Leu Pro Lys Thr Gln Ser Trp Gln Glu Ala Ala Trp

210 215 220

Trp Ser Glu Val Phe Ser Tyr Ala Glu Asp Arg Phe Asn Leu Pro Arg

225 230 235 240

Gly Thr Ile Lys Ala Thr Leu Leu Ile Glu Thr Leu Pro Ala Val Phe

245 250 255

Gln Met Asp Glu Ile Leu His Ala Leu Arg Asp His Ile Val Gly Leu

260 265 270

Asn Cys Gly Arg Trp Asp Tyr Ile Phe Ser Tyr Ile Lys Thr Leu Lys

275 280 285

Asn Tyr Pro Asp Arg Val Leu Pro Asp Arg Gln Ala Val Thr Met Asp

290 295 300

Lys Pro Phe Leu Asn Ala Tyr Ser Arg Leu Leu Ile Lys Thr Cys His

305 310 315 320

Lys Arg Gly Ala Phe Ala Met Gly Gly Met Ala Ala Phe Ile Pro Ser

325 330 335

Lys Asp Glu Glu His Asn Asn Gln Val Leu Asn Lys Val Lys Ala Asp

340 345 350

Lys Ser Leu Glu Ala Asn Asn Gly His Asp Gly Thr Trp Ile Ala His

355 360 365

Pro Gly Leu Ala Asp Thr Ala Met Ala Val Phe Asn Asp Ile Leu Gly

370 375 380

Ser Arg Lys Asn Gln Leu Glu Val Met Arg Glu Gln Asp Ala Pro Ile

385 390 395 400

Thr Ala Asp Gln Leu Leu Ala Pro Cys Asp Gly Glu Arg Thr Glu Glu

405 410 415

Gly Met Arg Ala Asn Ile Arg Val Ala Val Gln Tyr Ile Glu Ala Trp

420 425 430

Ile Ser Gly Asn Gly Cys Val Pro Ile Tyr Gly Leu Met Glu Asp Ala

435 440 445

Ala Thr Ala Glu Ile Ser Arg Thr Ser Ile Trp Gln Trp Ile His His

450 455 460

Gln Lys Thr Leu Ser Asn Gly Lys Pro Val Thr Lys Ala Leu Phe Arg

465 470 475 480

Gln Met Leu Gly Glu Glu Met Lys Val Ile Ala Ser Glu Leu Gly Glu

485 490 495

Glu Arg Phe Ser Gln Gly Arg Phe Asp Asp Ala Ala Arg Leu Met Glu

500 505 510

Gln Ile Thr Thr Ser Asp Glu Leu Ile Asp Phe Leu Thr Leu Pro Gly

515 520 525

Tyr Arg Leu Leu Ala

530

<210> 18

<211> 565

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Met Glu Pro Lys Thr Lys Lys Gln Arg Ser Leu Tyr Ile Pro Tyr Ala

1 5 10 15

Gly Pro Val Leu Leu Glu Phe Pro Leu Leu Asn Lys Gly Ser Ala Phe

20 25 30

Ser Met Glu Glu Arg Arg Asn Phe Asn Leu Leu Gly Leu Leu Pro Glu

35 40 45

Val Val Glu Thr Ile Glu Glu Gln Ala Glu Arg Ala Trp Ile Gln Tyr

50 55 60

Gln Gly Phe Lys Thr Glu Ile Asp Lys His Ile Tyr Leu Arg Asn Ile

65 70 75 80

Gln Asp Thr Asn Glu Thr Leu Phe Tyr Arg Leu Val Asn Asn His Leu

85 90 95

Asp Glu Met Met Pro Val Ile Tyr Thr Pro Thr Val Gly Ala Ala Cys

100 105 110

Glu Arg Phe Ser Glu Ile Tyr Arg Arg Ser Arg Gly Val Phe Ile Ser

115 120 125

Tyr Gln Asn Arg His Asn Met Asp Asp Ile Leu Gln Asn Val Pro Asn

130 135 140

His Asn Ile Lys Val Ile Val Val Thr Asp Gly Glu Arg Ile Leu Gly

145 150 155 160

Leu Gly Asp Gln Gly Ile Gly Gly Met Gly Ile Pro Ile Gly Lys Leu

165 170 175

Ser Leu Tyr Thr Ala Cys Gly Gly Ile Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Pro

180 185 190

Val Val Leu Asp Val Gly Thr Asn Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Pro

195 200 205

Leu Tyr Met Gly Trp Arg Asn Pro Arg Ile Thr Asp Asp Glu Tyr Tyr

210 215 220

Glu Phe Val Asp Glu Phe Ile Gln Ala Val Lys Gln Arg Trp Pro Asp

225 230 235 240

Val Leu Leu Gln Phe Glu Asp Phe Ala Gln Lys Asn Ala Met Pro Leu

245 250 255

Leu Asn Arg Tyr Arg Asn Glu Ile Cys Ser Phe Asn Asp Asp Ile Gln

260 265 270

Gly Thr Ala Ala Val Thr Val Gly Thr Leu Ile Ala Ala Ser Arg Ala

275 280 285

Ala Gly Gly Gln Leu Ser Glu Lys Lys Ile Val Phe Leu Gly Ala Gly

290 295 300

Ser Ala Gly Cys Gly Ile Ala Glu Met Ile Ile Ser Gln Thr Gln Arg

305 310 315 320

Glu Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Arg Gln Lys Val Phe Met Val Asp

325 330 335

Arg Phe Gly Leu Leu Thr Asp Lys Met Pro Asn Leu Leu Pro Phe Gln

340 345 350

Thr Lys Leu Val Gln Lys Arg Glu Asn Leu Ser Asp Trp Asp Thr Asp

355 360 365

Ser Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Val Val Arg Asn Val Lys Pro Asp

370 375 380

Ile Leu Ile Gly Val Ser Gly Gln Thr Gly Leu Phe Thr Glu Glu Ile

385 390 395 400

Ile Arg Glu Met His Lys His Cys Pro Arg Pro Ile Val Met Pro Leu

405 410 415

Ser Asn Pro Thr Ser Arg Val Glu Ala Thr Pro Gln Asp Ile Ile Ala

420 425 430

Trp Thr Glu Gly Asn Ala Leu Val Ala Thr Gly Ser Pro Phe Asn Pro

435 440 445

Val Val Trp Lys Asp Lys Ile Tyr Pro Ile Ala Gln Cys Asn Asn Ala

450 455 460

Phe Ile Phe Pro Gly Ile Gly Leu Gly Val Ile Ala Ser Gly Ala Ser

465 470 475 480

Arg Ile Thr Asp Glu Met Leu Met Ser Ala Ser Glu Thr Leu Ala Gln

485 490 495

Tyr Ser Pro Leu Val Leu Asn Gly Glu Gly Met Val Leu Pro Glu Leu

500 505 510

Lys Asp Ile Gln Lys Val Ser Arg Ala Ile Ala Phe Ala Val Gly Lys

515 520 525

Met Ala Gln Gln Gln Gly Val Ala Val Lys Thr Ser Ala Glu Ala Leu

530 535 540

Gln Gln Ala Ile Asp Asp Asn Phe Trp Gln Ala Glu Tyr Arg Asp Tyr

545 550 555 560

Arg Arg Thr Ser Ile

565

<210> 19

<211> 759

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Met Asp Asp Gln Leu Lys Gln Ser Ala Leu Asp Phe His Glu Phe Pro

1 5 10 15

Val Pro Gly Lys Ile Gln Val Ser Pro Thr Lys Pro Leu Ala Thr Gln

20 25 30

Arg Asp Leu Ala Leu Ala Tyr Ser Pro Gly Val Ala Ala Pro Cys Leu

35 40 45

Glu Ile Glu Lys Asp Pro Leu Lys Ala Tyr Lys Tyr Thr Ala Arg Gly

50 55 60

Asn Leu Val Ala Val Ile Ser Asn Gly Thr Ala Val Leu Gly Leu Gly

65 70 75 80

Asn Ile Gly Ala Leu Ala Gly Lys Pro Val Met Glu Gly Lys Gly Val

85 90 95

Leu Phe Lys Lys Phe Ala Gly Ile Asp Val Phe Asp Ile Glu Val Asp

100 105 110

Glu Leu Asp Pro Asp Lys Phe Ile Glu Val Val Ala Ala Leu Glu Pro

115 120 125

Thr Phe Gly Gly Ile Asn Leu Glu Asp Ile Lys Ala Pro Glu Cys Phe

130 135 140

Tyr Ile Glu Gln Lys Leu Arg Glu Arg Met Asn Ile Pro Val Phe His

145 150 155 160

Asp Asp Gln His Gly Thr Ala Ile Ile Ser Thr Ala Ala Ile Leu Asn

165 170 175

Gly Leu Arg Val Val Glu Lys Asn Ile Ser Asp Val Arg Met Val Val

180 185 190

Ser Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ile Ala Cys Met Asn Leu Leu Val Ala

195 200 205

Leu Gly Leu Gln Lys His Asn Ile Val Val Cys Asp Ser Lys Gly Val

210 215 220

Ile Tyr Gln Gly Arg Glu Pro Asn Met Ala Glu Thr Lys Ala Ala Tyr

225 230 235 240

Ala Val Val Asp Asp Gly Lys Arg Thr Leu Asp Asp Val Ile Glu Gly

245 250 255

Ala Asp Ile Phe Leu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Val Leu Thr Gln Glu

260 265 270

Met Val Lys Lys Met Ala Arg Ala Pro Met Ile Leu Ala Leu Ala Asn

275 280 285

Pro Glu Pro Glu Ile Leu Pro Pro Leu Ala Lys Glu Val Arg Pro Asp

290 295 300

Ala Ile Ile Cys Thr Gly Arg Ser Asp Tyr Pro Asn Gln Val Asn Asn

305 310 315 320

Val Leu Cys Phe Pro Phe Ile Phe Arg Gly Ala Leu Asp Val Gly Ala

325 330 335

Thr Ala Ile Asn Glu Glu Met Lys Leu Ala Ala Val Arg Ala Ile Ala

340 345 350

Glu Leu Ala His Ala Glu Gln Ser Glu Val Val Ala Ser Ala Tyr Gly

355 360 365

Asp Gln Asp Leu Ser Phe Gly Pro Glu Tyr Ile Ile Pro Lys Pro Phe

370 375 380

Asp Pro Arg Leu Ile Val Lys Ile Ala Pro Ala Val Ala Lys Ala Ala

385 390 395 400

Met Glu Ser Gly Val Ala Thr Arg Pro Ile Ala Asp Phe Asp Val Tyr

405 410 415

Ile Asp Lys Leu Thr Glu Phe Val Tyr Lys Thr Asn Leu Phe Met Lys

420 425 430

Pro Ile Phe Ser Gln Ala Arg Lys Ala Pro Lys Arg Val Val Leu Pro

435 440 445

Glu Gly Glu Glu Ala Arg Val Leu His Ala Thr Gln Glu Leu Val Thr

450 455 460

Leu Gly Leu Ala Lys Pro Ile Leu Ile Gly Arg Pro Asn Val Ile Glu

465 470 475 480

Met Arg Ile Gln Lys Leu Gly Leu Gln Ile Lys Ala Gly Val Asp Phe

485 490 495

Glu Ile Val Asn Asn Glu Ser Asp Pro Arg Phe Lys Glu Tyr Trp Thr

500 505 510

Glu Tyr Phe Gln Ile Met Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Glu Gln Ala

515 520 525

Gln Arg Ala Leu Ile Ser Asn Pro Thr Val Ile Gly Ala Ile Met Val

530 535 540

Gln Arg Gly Glu Ala Asp Ala Met Ile Cys Gly Thr Val Gly Asp Tyr

545 550 555 560

His Glu His Phe Ser Val Val Lys Asn Val Phe Gly Tyr Arg Asp Gly

565 570 575

Val His Thr Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Leu Leu Pro Ser Gly Asn

580 585 590

Thr Phe Ile Ala Asp Thr Tyr Val Asn Asp Glu Pro Asp Ala Glu Glu

595 600 605

Leu Ala Glu Ile Thr Leu Met Ala Ala Glu Thr Val Arg Arg Phe Gly

610 615 620

Ile Glu Pro Arg Val Ala Leu Leu Ser His Ser Asn Phe Gly Ser Ser

625 630 635 640

Asp Cys Pro Ser Ser Ser Lys Met Arg Gln Ala Leu Glu Leu Val Arg

645 650 655

Glu Arg Ala Pro Glu Leu Met Ile Asp Gly Glu Met His Gly Asp Ala

660 665 670

Ala Leu Val Glu Ala Ile Arg Asn Asp Arg Met Pro Asp Ser Ser Leu

675 680 685

Lys Gly Ser Ala Asn Ile Leu Val Met Pro Asn Met Glu Ala Ala Arg

690 695 700

Ile Ser Tyr Asn Leu Leu Arg Val Ser Ser Ser Glu Gly Val Thr Val

705 710 715 720

Gly Pro Val Leu Met Gly Val Ala Lys Pro Val His Val Leu Thr Pro

725 730 735

Ile Ala Ser Val Arg Arg Ile Val Asn Met Val Ala Leu Ala Val Val

740 745 750

Glu Ala Gln Thr Gln Pro Leu

755

<210> 20

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 20

Met Ala Ser Ile Thr Asp Lys Asp His Gln Lys Val Ile Leu Val Gly

1 5 10 15

Asp Gly Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Tyr Ala Met Val Leu Gln Gly

20 25 30

Ile Ala Gln Glu Ile Gly Ile Val Asp Ile Phe Lys Asp Lys Thr Lys

35 40 45

Gly Asp Ala Ile Asp Leu Ser Asn Ala Leu Pro Phe Thr Ser Pro Lys

50 55 60

Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Asp Ala Lys Asp Ala Asp Leu Val

65 70 75 80

Val Ile Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp

85 90 95

Leu Val Asn Lys Asn Leu Lys Ile Leu Lys Ser Ile Val Asp Pro Ile

100 105 110

Val Asp Ser Gly Phe Asn Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val

115 120 125

Asp Ile Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Leu Ser Gly Phe Pro Lys Ser

130 135 140

Arg Val Val Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Gln

145 150 155 160

Ser Ile Ala Glu Met Val Asn Val Asp Ala Arg Ser Val His Ala Tyr

165 170 175

Ile Met Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Val Trp Ser His Ala

180 185 190

Asn Ile Gly Gly Val Thr Ile Ala Glu Trp Val Lys Ala His Pro Glu

195 200 205

Ile Lys Glu Asp Lys Leu Val Lys Met Phe Glu Asp Val Arg Asp Ala

210 215 220

Ala Tyr Glu Ile Ile Lys Leu Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Ala

225 230 235 240

Thr Ala Leu Ala Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu Asn Ala

245 250 255

Val Leu Pro Leu Ser Val Tyr Met Asp Gly Gln Tyr Gly Leu Asn Asp

260 265 270

Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Ala Val Ile Asn Arg Asn Gly Ile Gln Asn

275 280 285

Ile Leu Glu Ile Pro Leu Thr Asp His Glu Glu Glu Ser Met Gln Lys

290 295 300

Ser Ala Ser Gln Leu Lys Lys Val Leu Thr Asp Ala Phe Ala Lys Asn

305 310 315 320

Asp Ile Glu Thr Arg Gln

325

Claims (10)

1.重组菌的构建方法，包括对受体菌进行下述A1-A14的改造，得到所述重组菌；

A1、敲除所述受体菌的poxB基因或抑制所述poxB基因的表达或抑制所述poxB基因编码的蛋白质的活性；

A2、敲除所述受体菌的pflB基因或抑制所述pflB基因的表达或抑制所述pflB基因编码的蛋白质的活性；

A3、敲除所述受体菌的aceEF基因或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性；

A4、敲除所述受体菌的ldhA基因或抑制所述ldhA基因的表达或抑制所述ldhA基因编码的蛋白质的活性；

A5、敲除所述受体菌的lldD基因或抑制所述lldD基因的表达或抑制所述lldD基因编码的蛋白质的活性；

A6、增加所述受体菌中acs基因编码蛋白质的含量或增强所述acs基因编码蛋白质的活性；

A7、增加所述受体菌中pta基因编码蛋白质的含量或增强所述pta基因编码蛋白质的活性；

A8、增加所述受体菌中ackA基因编码蛋白质的含量或增强所述ackA基因编码蛋白质的活性；

A9、增加所述受体菌中aceA基因编码蛋白质的含量或增强所述aceA基因编码蛋白质的活性；

A10、增加所述受体菌中aceK基因编码蛋白质的含量或增强所述aceK基因编码蛋白质的活性；

A11、增加所述受体菌中aceB基因编码蛋白质的含量或增强所述aceB基因编码蛋白质的活性；

A12、增加所述受体菌中maeA基因编码蛋白质的含量或增强所述maeA基因编码蛋白质的活性；

A13、增加所述受体菌中maeB基因编码蛋白质的含量或增强所述maeB基因编码蛋白质的活性；

A14、增加所述受体菌中ldh2基因编码蛋白质的含量或增强所述ldh2基因编码蛋白质的活性；

所述受体菌为含有所述poxB基因、所述pflB基因、所述aceEF基因、所述ldhA基因和所述lldD基因的细菌或真菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受体菌为1)或2)：

1)大肠杆菌；

2)大肠杆菌MG1655。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述acs基因编码蛋白质为下述a1)或a2)的蛋白质：

a1)序列表中序列12所示的蛋白质；

a2)将序列表中序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述ackA基因编码蛋白质为下述b1)或b2)的蛋白质：

b1)序列表中序列13所示的蛋白质；

b2)将序列表中序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述pta基因编码蛋白质为下述c1)或c2)的蛋白质：

c1)序列表中序列14所示的蛋白质；

c2)将序列表中序列14的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述aceA基因编码蛋白质为下述d1)或d2)的蛋白质：

d1)序列表中序列15所示的蛋白质；

d2)将序列表中序列15的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述aceK基因编码蛋白质为下述e1)或e2)的蛋白质：

e1)序列表中序列16所示的蛋白质；

e2)将序列表中序列16的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述aceB基因编码蛋白质为下述f1)或f2)的蛋白质：

f1)序列表中序列17所示的蛋白质；

f2)将序列表中序列17的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述maeA基因编码蛋白质为下述g1)或g2)的蛋白质：

g1)序列表中序列18所示的蛋白质；

g2)将序列表中序列18的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述maeB基因编码蛋白质为下述h1)或h2)的蛋白质：

h1)序列表中序列19所示的蛋白质；

h2)将序列表中序列19的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述ldh2基因编码蛋白质为下述i1)或i2)的蛋白质：

i1)序列表中序列20所示的蛋白质；

i2)将序列表中序列20的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

A1通过向所述受体菌中导入含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段实现；

和/或，A2通过向所述受体菌中导入含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段实现；

和/或，A3通过向所述受体菌中导入含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段实现；

和/或，A4通过向所述受体菌中导入含有所述ldhA基因上下游同源臂的DNA片段实现；

和/或，A5通过向所述受体菌中导入含有所述lldD基因上下游同源臂的DNA片段实现；

和/或，A6通过向所述受体菌中导入含有所述acs基因的acs基因表达盒实现；

和/或，A7通过向所述受体菌中导入含有所述pta基因的pta基因表达盒实现；

和/或，A8通过向所述受体菌中导入含有所述ackA基因的ackA基因表达盒实现；

和/或，A9通过向所述受体菌中导入含有所述aceA基因的aceA基因表达盒实现；

和/或，A10通过向所述受体菌中导入含有所述aceK基因的aceK基因表达盒实现；

和/或，A11通过向所述受体菌中导入含有所述aceB基因的aceB基因表达盒实现；

和/或，A12通过向所述受体菌中导入含有所述maeA基因的maeA基因表达盒实现；

和/或，A13通过向所述受体菌中导入含有所述maeB基因的maeB基因表达盒实现；

和/或，A14通过向所述受体菌中导入含有所述ldh2基因的ldh2基因表达盒实现。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列8所示的DNA分子；

所述含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列9所示的DNA分子；

所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列7所示的DNA分子；

所述含有所述ldhA基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列10所示的DNA分子；

所述含有所述lldD基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列11所示的DNA分子；

和/或，所述acs基因表达盒、所述pta基因表达盒、所述ackA基因表达盒、所述aceA基因表达盒、所述aceK基因表达盒、所述aceB基因表达盒、所述maeA基因表达盒、所述maeB基因表达盒和所述ldh2基因表达盒中启动子为下述j1)或j2)：

j1)序列表中序列1的第9-51位所示的DNA分子；

j2)与j1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；

和/或，所述acs基因表达盒中所述acs基因为下述k1)或k2)：

k1)序列表中序列1的第70-2028位所示的DNA分子；

k2)与k1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述pta基因表达盒中所述pta基因为下述l1)或l2)：

l1)序列表中序列2的第1347-3491位所示的DNA分子；

l2)与l1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述ackA基因表达盒中所述ackA基因为下述m1)或m2)：

m1)序列表中序列2的第70-1272位所示的DNA分子；

m2)与m1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述aceA基因表达盒中所述aceA基因为下述n1)或n2)：

n1)序列表中序列3的第70-1374位所示的DNA分子；

n2)与n1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述aceK基因表达盒中所述aceK基因为下述o1)或o2)：

o1)序列表中序列3的第1436-3172位所示的DNA分子；

o2)与o1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述aceB基因表达盒中所述aceB基因为下述p1)或p2)：

p1)序列表中序列4的第70-1671位所示的DNA分子；

p2)与p1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述maeA基因表达盒中所述maeA基因为下述q1)或q2)：

q1)序列表中序列5的第70-1767位所示的DNA分子；

q2)与q1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述maeB基因表达盒中所述maeB基因为下述r1)或r2)：

r1)序列表中序列5的第1791-4070位所示的DNA分子；

r2)与r1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

和/或，所述ldh2基因表达盒中所述ldh2基因为下述s1)或s2)：

s1)序列表中序列6的第70-1050位所示的DNA分子；

s2)与s1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：

所述acs基因表达盒为序列表中序列1的第9-2028位所示的DNA分子；

所述pta基因表达盒和所述ackA基因表达盒为序列中序列2的第9-3491位所示的DNA分子；

所述aceA基因表达盒和所述aceK基因表达盒为序列表中序列3的第9-3172位所示的DNA分子；

所述aceB基因表达盒为序列表中序列4的第9-1671位所示的DNA分子；

所述maeA基因表达盒和所述maeB基因表达盒为序列表中序列5的第9-4070位所示的DNA分子；

所述ldh2基因表达盒为序列表中序列6的第9-1050位所示的DNA分子。

7.利用权利要求1-6中任一所述方法制备的重组菌。

8.成套试剂，由权利要求4-6中任一所述含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述ldhA基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述lldD基因上下游同源臂的DNA片段、所述acs基因表达盒、所述pta基因表达盒、所述ackA基因表达盒、所述aceA基因表达盒、所述aceK基因表达盒、所述aceB基因表达盒、所述maeA基因表达盒、所述maeB基因表达盒和所述ldh2基因表达盒组成。

9.权利要求8所述成套试剂或利用权利要求1-6中任一所述方法制备的重组菌的下述任一应用：

X1、生产L-乳酸；

X2、制备生产L-乳酸产品；

X3、降解乙酸；

X4、制备降解乙酸产品。

10.L-乳酸的制备方法，包括：以乙酸为碳源，利用权利要求1-6中任一所述的方法制备的重组菌进行生物转化，制备得到L-乳酸。