CN102070724A - 一种中性龙眼多糖级分的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种龙眼多糖级分的分离方法，含以下步骤：(1)选取龙眼果肉水提取物，将龙眼果肉水提取物经D301-F阴离子交换树脂除去大部分蛋白质和色素得到龙眼粗多糖；(2)将龙眼粗多糖采用DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离纯化，以去离子水洗脱，收集龙眼多糖洗脱液，浓缩和真空冷冻干燥得中性龙眼多糖粉末；(3)将中性龙眼多糖经SephadexG-100凝胶渗透层析柱，以去离子水洗脱，收集不同龙眼多糖级分洗脱液，浓缩和真空冷冻干燥得中性龙眼多糖级分。采用该方法可分离制得中性的多糖单一组分。
Description
技术领域
本发明属于农产品加工技术领域，具体涉及一种中性龙眼多糖级分的分离方法。
背景技术
龙眼主要分布于我国的广东、广西、福建和台湾等地，是典型的亚热带经济作物。龙眼是国家***公布的药食两用植物，《本草纲目》中记载有“资益以龙眼为良”，并指出龙眼肉有“开胃健脾，补虚益智”的功效。且龙眼果肉在民间常用于治疗心血不足、心悸怔忡、失眠健忘、贫血、脾虚泄泻等症状。
目前，龙眼多糖的分离制备方法主要为水提醇沉，一般可以通过Sevag法、透析和醇沉等技术去除龙眼果肉水提液中的蛋白质和色素等杂质，但还是很难达到较高的纯度。如贾琦等分离得到的龙眼多糖中总糖含量为64.4％，凌雪萍等分离得到的龙眼多糖纯度也只达到80.96％。离子交换层析能有效分离粗多糖中的中性组分和酸性组分，再经凝胶过滤层析可实现不同分子量的多糖单体分离。杨翠娴等证实微波前处理-热水浸提的龙眼多糖是酸性杂多糖，贾琦等结合DEAE-纤维素和SephacrylS-300柱层析法得到一种酸性龙眼多糖均一组分。但关于龙眼多糖中性组分的分离纯化还鲜见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中性龙眼多糖级分的分离方法，通过该方法可以得到单一组分的中性龙眼多糖。
本发明的上述目的可以通过如下技术方案来实现：一种中性龙眼多糖级分的分离方法，含以下步骤：
(1)选取龙眼果肉水提取物，将龙眼果肉水提取物经D301-F阴离子交换树脂除去大部分蛋白质和色素得到龙眼粗多糖；
(2)将龙眼粗多糖采用DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离纯化，以去离子水洗脱，收集龙眼多糖洗脱液，浓缩和真空冷冻干燥得中性龙眼多糖粉末；
(3)将中性龙眼多糖经SephadexG-100凝胶渗透层析柱，以去离子水洗脱，收集不同龙眼多糖级分洗脱液，浓缩和真空冷冻干燥得中性龙眼多糖级分。
在上述步骤中：
步骤(1)中所述的龙眼果肉水提物通过如下步骤制备获得：选择新鲜龙眼原料，烘干，除去皮及核，粉碎，得龙眼果肉；在龙眼果肉中加入30-40倍重量的水，加热至70-80℃，置于200-300W的超声波强度下浸提30-50min，取消超声继续浸提100-120min；浸提液经过滤与果肉残渣分离后，将滤液于60-70℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼果肉水提物。
步骤(1)中所述的龙眼粗多糖的具体制备过程是：在龙眼果肉水提物中加入水和D301-F阴离子交换树脂，调节溶液pH值、温度及振荡器的转速，振荡后，过滤收集龙眼粗多糖溶液，再经真空浓缩和真空冷冻干燥得龙眼粗多糖。
步骤(1)中龙眼粗多糖制备过程中的各项参数为：水的用量为龙眼果肉提取物的20-30倍，D301-F阴离子交换树脂的用量为龙眼果肉水提取物的3-4倍，调节溶液pH值为5.0-6.0，温度为45-55℃，调节振荡器转速为100-120r/min振荡2-3h。分离溶液于55-65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼粗多糖。
步骤(1)中所述的D301-F阴离子交换树脂需经预处理，预处理过程为：先经水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质，再用重量百分含量为4-5％的NaCl溶液浸泡3-4h后水洗；接着用重量百分含量为4-5％的NaOH溶液浸泡3-4h，水洗至近中性pH值，最后50-55℃烘干备用。
步骤(2)中DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离纯化的条件为：所述DEAE-52纤维素离子交换层析柱的有效柱体积为30-210mL，所述DEAE-52纤维素离子交换层析柱有效交换容积即多糖/有效柱体积约为1.0mg/mL；所述DEAE-52纤维素离子交换层析柱的有效柱体积与进样溶液体积比值为6.0-8.0∶1；去离子水清洗体积与DEAE-52纤维素离子交换层析柱所述DEAE-52纤维素离子交换层析柱有效柱体积比为2-3∶1；洗脱液流速(mL/min)与有效柱体积(L)的比值为1∶3-4。
步骤(2)中所述的DEAE-52纤维素离子交换层析柱需经预处理，所述的预处理过程是：DEAE-52填料经去离子水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质；用0.4-0.5mol/L NaOH溶液浸泡30-40min，水洗至近中性pH值；用0.4-0.5mol/L HCl溶液浸泡30-40min，水洗至近中性pH值；用0.4-0.5mol/LNaOH溶液浸泡30-40min，水洗至近中性pH值，采用湿法装柱即得OH-型层析柱。
步骤(3)中所述的SephadexG-100凝胶渗透层析柱分离龙眼多糖级分的条件为：选取的SephadexG-100凝胶渗透层析柱的有效柱体积30-100mL；多糖的进样浓度为2-8mg/mL；SephadexG-100凝胶渗透层析柱的有效柱体积与进样溶液体积比值为20-30∶1；去离子水洗脱流速(mL/min)与有效柱体积(L)的比值为3-4∶1。
步骤(3)中所述的SephadexG-100凝胶渗透层析柱需经预处理，所述的预处理过程是：将SephadexG-100填料经去离子水浸泡，除去上层悬浮颗粒和杂质，并以沸水处理25-35min，采用湿法装柱即得SephadexG-100凝胶层析柱。
步骤(2)中将龙眼多糖洗脱液在55-65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得粉末状龙眼多糖；步骤(3)中将龙眼多糖级分洗脱液在55-65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即制备得中性龙眼蛋白多糖级分。
本发明具有的优点是：本发明对龙眼粗多糖进行分离纯化，得到中性的多糖单一组分。该多糖主要由葡萄糖和甘露糖组成，分子量约为1.4×104g/moL，且具有一定的免疫调节活性，为龙眼的精深加工开拓了新的途径。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
图1是实施例1中制备的中性龙眼多糖级分的洗脱曲线；
图2是实施例2中制备的中性龙眼多糖级分的洗脱曲线；
图3是实施例3中制备的中性龙眼多糖级分的洗脱曲线。
具体实施方式
实施例1
选择新鲜龙眼原料，烘干，除去皮及核，粉碎，得龙眼果肉；在龙眼果肉中加入30倍重量的水，加热至80℃，置于300W的超声波强度下浸提30min，取消超声继续浸提120min；浸提液经过滤与果肉残渣分离后，60℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼果肉水提物。
D301-F阴离子交换树脂先经水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质，再用重量百分含量为4％的NaCl溶液浸泡4h后水洗；接着用重量百分含量为4％的NaOH溶液浸泡4h，水洗至近中性pH值，最后50℃烘干备用。
将龙眼果肉提取物溶于20倍重量的水，加入3倍龙眼果肉水提取物重量的D301-F阴离子交换树脂，调节溶液pH值为5.0，温度为55℃，调节振荡器转速为120r/min振荡3h。分离溶液于55℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼粗多糖。
DEAE-52填料经去离子水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质；用0.4mol/L NaOH溶液浸泡40min，水洗至近中性pH值；用0.4mol/L HCl溶液浸泡40min，水洗至近中性pH值；用0.4mol/L NaOH溶液浸泡40min，水洗至近中性pH值，采用湿法装于2.5×50cm中压层析柱中(有效柱体积约为210mL)，并采用去离子水以0.60mL/min流速平衡1天。
取210mg龙眼粗多糖溶于35mL去离子水中，4500rmp离心10min，取上清液进样；过DEAE-52纤维素离子交换层析柱，用去离子水以0.60mL/min流速洗脱，采用苯酚硫酸法监测洗脱液中多糖，从反应呈阳性开始收集洗脱液至反应呈阴性；将洗脱液在55℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得粉末状中性龙眼多糖粉末。
SephadexG-100填料经去离子水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质，并以沸水处理约30min，湿法装于1.6×60cm中压层析柱中(有效柱体积约为100mL)并采用去离子水以0.30mL/min流速平衡1天。
取40mg中性龙眼多糖溶于5mL去离子水中(浓度为8mg/mL，有效柱体积与进样溶液体积比值为20∶1)，4500rmp离心10min，取上清液进样；用去离子以0.30mL/min流速洗脱(洗脱流速与有效柱体积(L)的比值为3∶1)，采用苯酚硫酸法监测洗脱液中多糖，从反应呈阳性开始收集洗脱液至反应呈阴性；不同多糖级分洗脱液分别在55℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得中性龙眼多糖级分。
实施例2
选择新鲜龙眼原料，烘干，除去皮及核，粉碎，得龙眼果肉；在龙眼果肉中加入35倍重量的水，加热至75℃，置于250W的超声波强度下浸提40min，取消超声继续浸提110min；浸提液经过滤与果肉残渣分离后，65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼果肉水提物。
D301-F阴离子交换树脂先经水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质，再用重量百分含量为4.5％的NaCl溶液浸泡3.5h后水洗；接着用重量百分含量为4.5％的NaOH溶液浸泡3.5h，水洗至近中性pH值，最后52.5℃烘干备用。
将龙眼果肉提取物溶于25倍重量的水中，加入3.5倍龙眼果肉水提取物重量的D301-F阴离子交换树脂，调节溶液pH值为5.5，温度为50℃，调节振荡器转速为110r/min振荡2.5h。分离溶液于60℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼粗多糖。
DEAE-52填料经去离子水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质；用0.45mol/L NaOH溶液浸泡35min，水洗至近中性pH值；用0.45mol/L HCl溶液浸泡35min，水洗至近中性pH值；用0.45mol/L NaOH溶液浸泡35min，水洗至近中性pH值，采用湿法装于2.0×40cm中压层析柱中(有效柱体积约为120mL)，并采用去离子水以0.36mL/min流速平衡1天。
取120mg龙眼粗多糖溶于15mL去离子水中，4500rmp离心10min，取上清液进样，过DEAE-52纤维素离子交换层析柱；用去离子水以0.36mL/min流速洗脱，采用苯酚硫酸法监测洗脱液中多糖，从反应呈阳性开始收集洗脱液至反应呈阴性；多糖洗脱液在55℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得粉末状中性龙眼多糖。
SephadexG-100填料经去离子水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质，并以沸水处理约30min，湿法装于1.6×40cm中压层析柱中(有效柱体积约为65mL)并采用去离子水以0.23mL/min流速平衡1天。
取13mg中性龙眼多糖溶于2.6mL去离子水中(浓度为5mg/mL，有效柱体积与进样溶液体积比值为25∶1)，4500rmp离心10min，取上清液进样；用去离子以0.23mL/min流速洗脱(洗脱流速与有效柱体积(L)的比值为3.5∶1)，采用苯酚硫酸法监测洗脱液中多糖，从反应呈阳性开始收集洗脱液至反应呈阴性；不同多糖级分洗脱液分别在55℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得中性龙眼多糖级分。
实施例3
选择新鲜龙眼原料，烘干，除去皮及核，粉碎，得龙眼果肉；在龙眼果肉中加入40倍重量的水，加热至70℃，置于200W的超声波强度下浸提50min，取消超声继续浸提100min；浸提液经过滤与果肉残渣分离后，70℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼果肉水提物。
D301-F阴离子交换树脂先经水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质，再用重量百分含量为5％的NaCl溶液浸泡3h后水洗；接着用重量百分含量为5％的NaOH溶液浸泡3h，水洗至近中性pH值，最后55℃烘干备用。
将龙眼果肉提取物溶于30倍重量的水，加入4倍龙眼果肉水提取物的D301-F阴离子交换树脂，调节溶液pH值为6.0，温度为45℃，调节振荡器转速为100r/min振荡2h。分离溶液于65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼粗多糖。
DEAE-52填料经去离子水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质；用0.50mol/L NaOH溶液浸泡30min，水洗至近中性pH值；用0.50mol/L HCl溶液浸泡30min，水洗至近中性pH值；用0.50mol/L NaOH溶液浸泡30min，水洗至近中性pH值，采用湿法装于1.5×20cm中压层析柱中(有效柱体积约为30mL)，并采用去离子水以0.12mL/min流速平衡1天。
取30mg龙眼粗多糖溶于4mL去离子水中，4500rmp离心10min，取上清液进样，过DEAE-52纤维素离子交换层析柱；用去离子水以0.12mL/min流速洗脱，采用苯酚硫酸法监测洗脱液中多糖，从反应呈阳性开始收集洗脱液至反应呈阴性；多糖洗脱液在55℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得粉末状中性龙眼多糖。
SephadexG-100填料经去离子水浸泡，倒去上层悬浮颗粒和杂质，并以沸水处理30min，湿法装于1.6×30cm中压层析柱中(有效柱体积约为30mL)并采用去离子水以0.12mL/min流速平衡1天。
取2mg中性龙眼多糖溶于1mL去离子水中(浓度为2mg/mL，有效柱体积与进样溶液体积比值为30∶1)，4500rmp离心10min，取上清液进样；用去离子以0.12mL/min流速洗脱(洗脱流速与有效柱体积(L)的比值为4∶1)，采用苯酚硫酸法监测洗脱液中多糖，从反应呈阳性开始收集洗脱液至反应呈阴性；不同多糖级分洗脱液分别在55℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得中性龙眼多糖级分。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种中性龙眼多糖级分的分离方法，其特征是含以下步骤：
(1)选取龙眼果肉水提取物，将龙眼果肉水提取物经D301-F阴离子交换树脂除去大部分蛋白质和色素得到龙眼粗多糖；
(2)将龙眼粗多糖采用DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离纯化，以去离子水洗脱，收集龙眼多糖洗脱液，浓缩和真空冷冻干燥得中性龙眼多糖粉末；
(3)将中性龙眼多糖经SephadexG-100凝胶渗透层析柱，以去离子水洗脱，收集不同龙眼多糖级分洗脱液，浓缩和真空冷冻干燥得中性龙眼多糖级分。
2.根据权利要求1所述的中性龙眼多糖级分的分离方法，其特征是：步骤(1)中所述的龙眼果肉水提物通过如下步骤制备获得：选择新鲜龙眼原料，烘干，除去皮及核，粉碎，得龙眼果肉；在龙眼果肉中加入30-40倍重量的水，加热至70-80℃，置于200-300W的超声波强度下浸提30-50min，取消超声继续浸提100-120min；浸提液经过滤与果肉残渣分离后，将滤液于60-70℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼果肉水提物。
3.根据权利要求1所述的中性龙眼多糖级分的分离方法，其特征是：步骤(1)中所述的龙眼粗多糖的具体制备过程是：在龙眼果肉水提物中加入水和D301-F阴离子交换树脂，调节溶液pH值、温度及振荡器的转速，振荡后，过滤收集龙眼粗多糖溶液，再经真空浓缩和真空冷冻干燥得龙眼粗多糖。
4.根据权利要求3所述的中性龙眼多糖级分的分离方法，其特征是：龙眼粗多糖制备过程中的各项参数为：水的用量为龙眼果肉水提取物总重量的20-30倍，D301-F阴离子交换树脂的用量为龙眼果肉水提取物总重量的3-4倍，调节溶液的pH值为5.0-6.0，温度为45-55℃，振荡器的转速100-120r/min振荡2-3h，分离溶液于55-65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得龙眼粗多糖。
5.根据权利要求1所述的中性龙眼多糖级分的分离方法，其特征是：步骤(1)中所述的D301-F阴离子交换树脂需经预处理，预处理过程是：将D301-F填料经水浸泡，除去上层悬浮颗粒和杂质；用重量百分含量为4-5％的NaCl溶液浸泡3-4h后水洗；用重量百分含量为4-5％的NaOH溶液浸泡3-4h，水洗至近中性，50-55℃烘干备用。
6.根据权利要求1所述的中性龙眼多糖级分的分离方法，其特征是：步骤(2)中DEAE-52纤维素离子交换层析柱分离中性龙眼多糖的条件为：所述的DEAE-52纤维素离子交换层析柱的有效柱体积为30-210mL，DEAE-52纤维素离子交换层析柱的有效交换容积即多糖/有效柱体积为1.0mg/mL；DEAE-52纤维素离子交换层析柱有效柱体积与进样溶液体积比值为6.0-8.0∶1；去离子水清洗体积与DEAE-52纤维素离子交换层析柱所述DEAE-52纤维素离子交换层析柱有效柱体积比为2-3∶1；洗脱液流速与有效柱体积的比值为1∶3-4。
7.根据权利要求1所述的中性龙眼多糖级分的分离方法，其特征是：步骤(2)中所述的DEAE-52纤维素层析柱需经预处理，预处理过程是：DEAE-52填料经去离子水浸泡，除去上层悬浮颗粒和杂质；用0.4-0.5mol/L NaOH溶液浸泡30-40min，水洗至近中性；用0.4-0.5mol/L HCl溶液浸泡30-40min，水洗至近中性；用0.4-0.5mol/LNaOH溶液浸泡30-40min，水洗至近中性，采用湿法装柱即得OH-型的DEAE-52纤维素层析柱。
8.根据权利要求1所述的中性龙眼多糖级分的制备方法，其特征是：步骤(3)中所述的SephadexG-100凝胶渗透层析柱分离龙眼多糖级分的条件为：选取的SephadexG-100凝胶渗透层析柱的有效柱体积30-100mL；多糖的进样浓度为2-8mg/mL；SephadexG-100凝胶渗透层析柱的有效柱体积与进样溶液体积比值为20-30∶1；去离子水洗脱流速与有效柱体积的比值为3-4∶1。
9.根据权利要求1所述的中性龙眼多糖级分的制备方法，其特征是：步骤(3)中所述的SephadexG-100凝胶渗透层析柱需经预处理，所述的预处理过程是：将SephadexG-100填料经去离子水浸泡，除去上层悬浮颗粒和杂质，并以沸水处理25-35min，采用湿法装柱即得SephadexG-100凝胶层析柱。
10.根据权利要求1所述的中性龙眼多糖级分的制备方法，其特征是：步骤(2)中将龙眼多糖洗脱液在55-65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即得粉末状龙眼多糖；步骤(3)中将龙眼多糖级分洗脱液在55-65℃下真空浓缩至微粘稠状，收集浓缩液真空冷冻干燥即制备得中性龙眼蛋白多糖级分。
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